JP6660718B2 - 枯草菌変異株及びその利用 - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
しかしながら、AbrBを恒常的に発現させた枯草菌変異株については全く報告されていない。
また、枯草菌AlsS及びAlsDは、それぞれアセト乳酸シンターゼ及びアセト乳酸デカルボキシラーゼであり、共にアセトイン合成に関わる酵素群として知られている。
しかしながら、KinAやAlsS及びAlsDが、枯草菌におけるPGAの生産に如何なる影響を及ぼすかを検討した報告は全く知られていない。
(1)枯草菌変異株であって、
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7領域(yrkM−yraK、又はyrkS-yraK)、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有し、
abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つkinA遺伝子が欠失又は不活性化され、且つalsS遺伝子及びalsD遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株。
(2)(1)の枯草菌変異株において、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、又はポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が発現可能に強化又は導入された組換え枯草菌。
(3)枯草菌変異株の製造方法であって、
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7領域(yrkM−yraK、又はyrkS-yraK)、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子を恒常的に発現するように遺伝子構築する工程、kinA遺伝子を欠失又は不活性化する工程、及びalsS遺伝子及びalsD遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子を欠失又は不活性化する工程を含む、方法。
(4)組換え枯草菌の製造方法であって、
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7領域(yrkM−yraK、又はyrkS-yraK)、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子を恒常的に発現するように遺伝子構築する工程、kinA遺伝子を欠失又は不活性化する工程、alsS遺伝子及びalsD遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子を欠失又は不活性化する工程、及びポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、又はポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子を発現可能に強化又は導入する工程を含む、方法。
(5)(2)の組換え枯草菌を培養し、培養物からポリ−γ−グルタミン酸を回収する工程を含む、ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
また、本明細書において、目的遺伝子であるPGA合成に関わる遺伝子若しくはPGA分解に関わる遺伝子を導入した枯草菌変異株を組換え枯草菌といい、目的遺伝子は導入されていないが、目的遺伝子の発現能が優れた宿主として改良された枯草菌を枯草菌変異株という。
また、本明細書において、「遷移期」とは細菌の増殖において、対数増殖期又は指数増殖期から定常期又は静止期へと移行する間を意味する。
本発明の枯草菌変異株は、枯草菌野生株のゲノム上の大領域が欠失したゲノムを有し、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築されており、且つkinA遺伝子が欠失又は不活性化され、且つalsS遺伝子及びalsD遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株である。
本発明の枯草菌変異株は、該ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株に対して、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子を恒常的に発現させる遺伝子改変と、kinA遺伝子を欠失又は不活性化させる改変と、更にalsS遺伝子及びalsD遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子を欠失又は不活性化させる改変を加えることによって作製することができる。
本発明の枯草菌変異株の親株となる、ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株は、枯草菌野生株(例えば、Bacillus subtilis Marburg No.168;本明細書において以下、枯草菌168株又は単に168株、あるいは野生株と称する)のゲノムと比べて、そのゲノム中の大領域が欠失したゲノムを有する。すなわち、当該枯草菌変異株のゲノムにおいては、枯草菌野生株のゲノム中の、prophage6(yoaV−yobO)領域、prophage1(ybbU−ybdE)領域、prophage4(yjcM−yjdJ)領域、PBSX(ykdA−xlyA)領域、prophage5(ynxB−dut)領域、prophage3(ydiM−ydjC)領域、spb(yodU−ypqP)領域、pks(pksA−ymaC)領域、skin(spoIVCB−spoIIIC)領域、pps(ppsE−ppsA)領域、prophage2(ydcL−ydeJ)領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7(yrkM−yraK、又はyrkS-yraK)領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される領域の1以上が欠失している。
ここで示す「領域が欠失」とは、上記記載の遺伝子を両端として挟み込まれる領域を、両端の遺伝子を含めて欠失していることである。
なお、本明細書記載のMGB874株の欠失領域であるskin(spoIVCB−spoIIIC)領域及びprophage7(yrkS−yraK)領域は、隣接した領域であり、特開2007−130013号公報に記載されているSKIN−Pro7(spoIVCB−yraK)領域と同じ領域である。
MGB469株及びMGB874株は国立遺伝学研究所NBRP(ナショナルバイオリソースプロジェクト)より分譲可能となっている(http://www.shigen.nig.ac.jp/bsub/kaoListAction.do)。
本発明の枯草菌変異株においては、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築されている。
枯草菌において、abrB遺伝子は転写因子AbrBをコードする遺伝子であり、対数増殖期に発現し、定常期へと移行する間の遷移期、および定常期において抑制される。本転写因子AbrBは対数増殖期において、胞子形成やコンピテンス、或いは栄養源獲得等に関する多数の遺伝子を直接的あるいは間接的に発現抑制する。遷移期および定常期においては、AbrBによる発現抑制が解除され、上述の多数の遺伝子が発現誘導される。
枯草菌abrB遺伝子は、遺伝子番号:BG10204として特定され、配列番号1に示すヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質AbrBをコードする。
(a)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号1に示すヌクレオチド配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつAbrBと同様の、遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつAbrBと同様の、遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号2に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつAbrBと同様の遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号2に示すアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつAbrBと同様の、遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
ここで、配列番号9に示される塩基配列において20〜49番目の塩基からなる領域又は73〜89番目の塩基からなる領域に相当する領域としては、上述した配列番号9に示される塩基配列からなるDNAと相同な塩基配列からなり転写開始制御領域又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域としての機能を有するDNAにおいて、配列番号9に示される塩基配列と比較した場合に当該領域に相当する領域であって、抑制性制御因子の結合部位として機能するものが挙げられる。
上記部位を不活性化する手段としては、該部位のヌクレオチド配列上の1つ以上のヌクレオチドに対する突然変異導入、又は該ヌクレオチド配列に対する別のヌクレオチド配列の置換若しくは挿入、あるいは該部位の配列の一部若しくは全部の削除などが挙げられる。ここで、一部とは、1〜40個、好ましくは5〜30個、又は10〜17個の塩基からなる部分配列が挙げられる。このうち、好ましくは、配列番号9に示される塩基配列において、20〜49番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域、又は/及び73〜89番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域を全て削除することが挙げられ、より好ましくは73〜89番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域を全て削除することである。
上記突然変異導入や、ヌクレオチド配列の置換若しくは挿入のための具体的な手法としては、紫外線照射、部位特異的変異導入、及び上記[1−1.ゲノム領域欠失枯草菌変異株]にて説明したSOE−PCR法や相同組換え法、などを挙げることができる。
本発明の枯草菌変異株においては、kinA遺伝子又はそれに相当する遺伝子が欠失又は不活性化されている。abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するよう遺伝子構築がなされた枯草菌変異株において、kinA遺伝子又はそれに相当する遺伝子の欠失又は不活性化により、培地中での溶菌現象を抑制することが見出された。
kinA遺伝子は、遺伝子番号:BG10204(配列番号3)として特定され、斯かる遺伝子がコードするタンパク質は、胞子形成初期に関わる多成分制御系のセンサーヒスチジンキナーゼ(two−component sensor histidine kinase involved in the initiation of sporulation)であるとされている。
(g)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(h)配列番号3に示すヌクレオチド配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のセンサーヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(i)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(j)配列番号3に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(k)配列番号4に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(l)配列番号4に示すアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
本発明の枯草菌変異株においては、alsS遺伝子及びalsD遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子が欠失又は不活性化されている。
ここで、alsS遺伝子及びalsD遺伝子は、アセトイン合成に関わる枯草菌遺伝子である。alsS遺伝子とalsD遺伝子は、アセトイン合成遺伝子群(alsSD)として1つのオペロンを形成している。本発明においては、alsS遺伝子及びalsD遺伝子が共に欠失又は不活性化されるのが好ましい。
(m)配列番号5に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(n)配列番号5に示すヌクレオチド配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(o)配列番号5に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(p)配列番号6に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(q)配列番号6に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(r)配列番号6に示すアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(s)配列番号7に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(t)配列番号7に示すヌクレオチド配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(u)配列番号7に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(v)配列番号8に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(w)配列番号8に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(x)配列番号8に示すアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
本発明の組換え枯草菌は、上述したabrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つkinA遺伝子が欠失又は不活性化され、且つalsS遺伝子及びalsD遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子が欠失又は不活性化され、さらに目的とするPGA合成酵素遺伝子、又はPGA合成酵素遺伝子及びPGA分解酵素遺伝子(以下、「目的遺伝子」という)が発現可能なように強化又は導入されたものであるのが好ましい。
PGA合成酵素遺伝子としては、例えば、枯草菌遺伝子pgsB(配列番号16)、pgsC(配列番号18)、pgsA(配列番号20)及びpgsE(配列番号22)、ならびにそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子が挙げられ、好ましくは、少なくとも枯草菌pgsB遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌pgsC遺伝子又はその相当遺伝子とを含む組み合わせであり、より好ましくは、枯草菌pgsB遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌pgsC遺伝子又はその相当遺伝子との組み合わせ、あるいは枯草菌pgsB遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌pgsC遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌pgsA遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌pgsE遺伝子又はその相当遺伝子との組み合わせである。
(a)配列番号16に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号16に示すヌクレオチド配列と少なくとも62%、例えば、62%以上、好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号16に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号17に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号17に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号17に示すアミノ酸配列と少なくとも55%、例えば、55%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(a')配列番号18に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b')配列番号18に示すヌクレオチド配列と少なくとも59%、例えば、59%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌pgsB遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c')配列番号18に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌pgsB遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d')配列番号19に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e')配列番号19に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌pgsB遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f')配列番号19に示すアミノ酸配列と少なくとも51%、例えば、51%以上、好ましくは55%以上、より好ましくは60%以上、より好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌pgsB遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でPGAを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(a'')配列番号20に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b'')配列番号20に示すヌクレオチド配列と少なくとも48%、例えば、48%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは60%以上、より好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌pgsB遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌pgsC遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、PGAを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c'')配列番号20に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌pgsB遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌pgsC遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、PGAを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d'')配列番号21に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e'')配列番号21に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌pgsB遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌pgsC遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、PGAを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f'')配列番号21に示すアミノ酸配列と少なくとも30%、例えば、30%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは60%以上、より好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌pgsB遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌pgsC遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、PGAを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(a''')配列番号22に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b''')配列番号22に示すヌクレオチド配列と少なくとも51%、例えば、51%以上、好ましくは55%以上、より好ましくは60%以上、より好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌pgsB遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌pgsC遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌pgsA遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、PGAを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c''')配列番号22に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌pgsB遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌pgsC遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌pgsA遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、PGAを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d''')配列番号23に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e''')配列番号23に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌pgsB遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌pgsC遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌pgsA遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、PGAを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f''')配列番号23に示すアミノ酸配列と少なくとも35%、例えば、35%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは60%以上、より好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌pgsB遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌pgsC遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌pgsA遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、PGAを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
所定の微生物におけるPGA生産能の評価は、例えば、グルタミン酸又はその塩を含有するPGA生産寒天培地に培養したときにコロニー周辺に形成される半透明の粘性物質を目視によって観察する方法;SDS−PAGEによってPGAを検出する方法(Biosci.Biotechnol.Biochem.,1996,60:255−258);酸加水分解後にアミノ酸分析装置を用いて定量する方法(Biosci.Biotechnol.Biochem.,1997,61:1684−1687);培養液から精製し乾燥重量を求める定量法(Biochem.Biophys.Res.Commun.,1999,263:6−12);ゲルろ過カラムを用いたHPLC(高速液体クロマトグラフィー)による定量/定性法(Biosci.Biotechnol.Biochem.,1993,57:1212−1213)等によって行うことができる。
PGA合成酵素遺伝子が発現可能に強化又は導入された組換え枯草菌においては、さらにPGA分解酵素をコードする遺伝子が発現可能に強化又は導入されるのが好ましい。微生物がPGAを高生産すると培地の粘度が高まり、その結果、微生物の生存やPGAの生産性に悪影響が及ぶ場合がある。例えば、枯草菌pgdS遺伝子又はそれに相当する遺伝子が発現可能に強化又は導入されることで、低分子化されたPGAが生産され、培養液の粘度を抑制することにより、PGAの高生産に伴う上記課題を解決することができる。
したがって、PGA分解酵素をコードする遺伝子としては、枯草菌pgdS遺伝子(配列番号24)又はそれに相当する遺伝子が挙げられる。
(g)配列番号24に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(h)配列番号24に示すヌクレオチド配列と少なくとも62%、例えば、62%以上、好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつPGA分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(i)配列番号24に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつPGA分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(j)配列番号25に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(k)配列番号25に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつPGA分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(l)配列番号25に示すアミノ酸配列と少なくとも57%、例えば、57%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつPGA分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
斯かる目的遺伝子の発現可能な強化又は導入は、親株のゲノム上の目的遺伝子(例えば、pgsBCAE遺伝子)の制御領域配列を強制御領域に置換すること、あるいは、強制御領域と作動可能に連結された目的遺伝子を含む断片を、親株のゲノム中若しくはプラスミド中に導入することによって成すことができる。またあるいは、親株中に複数の目的遺伝子を発現可能に存在させる改変により成すこともできる。
目的遺伝子を発現可能なように強化又は導入するための手順の一例を以下に記載する。
斯くして得られた本発明の組換え枯草菌は、親株となるゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株に対し、PGA合成酵素遺伝子の発現を強化した組換え枯草菌と比べて、遥かに高いPGA生産能を有している。
よって、本発明の組換え枯草菌を培養することによって、当該菌外に効率よくPGAを生産することが可能になる。
本発明のPGAの製造方法においては、先ず、適切な培地において上記本発明の組換え枯草菌を培養し、菌体外に生産されたPGAを培地から回収する。培地としては、グリセロール、グルコース、フルクトース、マルトース、キシロース、アラビノース、各種有機酸等の炭素源、各種アミノ酸、ポリペプトン、トリプトン、硫酸アンモニウムや尿素等の窒素源、ナトリウム塩等の無機塩類及びその他必要な栄養源、微量金属塩等を含有する組成の培地を使用できる。当該培地は、合成培地であっても天然培地であってもよい。
培地中に蓄積されたPGAを回収する際には、PGAを生産させた菌体と分離する必要がある。PGAを分離する手段としては、遠心分離、限外濾過膜、電気透析法、pHをPGAの等電点付近に維持することで沈殿として回収する方法、さらに上記手法の組み合わせ等が挙げられる。
<1>枯草菌変異株であって、
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7領域(yrkM−yraK、又はyrkS-yraK)、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有し、
abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つkinA遺伝子が欠失又は不活性化され、且つalsS遺伝子及びalsD遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株。
<2>prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7領域(yrkS−yraK)、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域を欠失したゲノムを有する、<1>の枯草菌変異株。
<3>abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子を恒常的が恒常的に発現するような遺伝子構築が、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位における抑制性制御因子の結合部位を不活性化することによりなされる、<1>又は<2>の枯草菌変異株。
<4>abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域における抑制性制御因子の結合部位が、配列番号9に示される塩基配列において20〜49番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域、又は73〜89番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域である<3>の枯草菌変異株。
<5>配列番号9に示される塩基配列において73〜89番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域を削除するものである、<4>の枯草菌変異株。
<6>枯草菌のabrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記の(a)〜(f)からなる群より選択される、<1>〜<5>のいずれかの枯草菌変異株。
(a)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号1に示すヌクレオチド配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつAbrBと同様の遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつAbrBと同様の遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号2に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつAbrBと同様の遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号2に示すアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつAbrBと同様の遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
<7>kinA遺伝子が、下記の(g)〜(l)からなる群より選択される、<1>〜<6>のいずれかの枯草菌変異株。
(g)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(h)配列番号3に示すヌクレオチド配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のセンサーヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(i)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(j)配列番号3に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(k)配列番号4に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(l)配列番号4に示すアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
<8>alsS遺伝子が、下記の(m)〜(r)からなる群より選択される、<1>〜<7>のいずれかの枯草菌変異株。
(m)配列番号5に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(n)配列番号5に示すヌクレオチド配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(o)配列番号5に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(p)配列番号6に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(q)配列番号6に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(r)配列番号6に示すアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
<9>alsD遺伝子が、下記の(s)〜(x)からなる群より選択される、<1>〜<8>のいずれかの枯草菌変異株。
(s)配列番号7に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(t)配列番号7に示すヌクレオチド配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(u)配列番号7に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(v)配列番号8に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(w)配列番号8に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(x)配列番号8に示すアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
<10>alsS遺伝子及びalsD遺伝子が共に欠失又は不活性化されている<1>〜<9>のいずれかの枯草菌変異株。
<11><1>〜<10>のいずれかの枯草菌変異株において、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、又はポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が発現可能に強化又は導入された組換え枯草菌。
<12>ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素をコードする遺伝子が、枯草菌のpgsB遺伝子、pgsC遺伝子、pgsA遺伝子及びpgsE遺伝子、並びにそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子であり、ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が枯草菌pgdS遺伝子又はそれに相当する遺伝子である<11>の組換え枯草菌。
<13>ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が、枯草菌のpgsB遺伝子、pgsC遺伝子、pgsA遺伝子、pgsE遺伝子及びpgdS遺伝子、又はこれらに相当する遺伝子である<12>の組換え枯草菌。
<14>枯草菌変異株の製造方法であって、
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7領域(yrkM−yraK、又はyrkS-yraK)、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子を恒常的に発現するように遺伝子構築する工程、kinA遺伝子欠失又は不活性化する工程、及びalsS遺伝子及びalsD遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子を欠失又は不活性化する工程を含む、方法。
<15>組換え枯草菌の製造方法であって、
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7領域(yrkM−yraK、又はyrkS-yraK)、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子を恒常的に発現するように遺伝子構築する工程、kinA遺伝子を欠失又は不活性化する工程、alsS遺伝子及びalsD遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子を欠失又は不活性化する工程、及びポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、又はポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が発現可能に強化又は導入する工程を含む、方法。
<16><11>〜<13>のいずれかの組換え枯草菌を培養し、培養物からポリ−γ−グルタミン酸を回収する工程を含む、ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
(1−1)トリプトファン要求性解除株の作製
枯草菌野生株ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株(MGB874株;特開2007−130013号公報)におけるトリプトファン要求性を解除した。枯草菌変異株MGB874株の元株である枯草菌168株は、遺伝子型としてtrpC2を所持している。つまり168株はトリプトファン合成に関与するインドール−3−グリセロールリン酸シンターゼをコードするtrpC遺伝子変異のためトリプトファン合成要求性である。また、枯草菌ATCC6051T株はトリプトファン非要求性であることが知られている(Albertini,A.M.&Galizzi,A.Microbiology,1999,145(Pt12):3319−3320)。枯草菌168株とATCC6051T株のtrpC遺伝子を比較したところ、328番目から330番目のヌクレオチドATTが枯草菌168株では存在しないことがわかった。そこで、ATCC6051T株ゲノムを鋳型とし、表4記載のtrpC_F1及びtrpC_R1のプライマーを用いてPCRを行い、PCR産物を構築した。このPCR産物を用いて枯草菌変異株MGB874株をコンピテント法(J.Bacteriol.,1960,81:741−746)で形質転換し、トリプトファン非添加のSMA寒天培地(0.2%硫酸アンモニウム、1.4%リン酸水素2カリウム、0.6%リン酸2水素カリウム、0.1%クエン酸3ナトリウム-2水和物、0.5%グルコース、0.035%硫酸マグネシウム7水和物、1.5%寒天)に生育したコロニーを形質転換体として分離した。こうしてトリプトファン非要求性の枯草菌変異株MGB874T株を得た。
abrB遺伝子恒常発現変異の導入を行った。枯草菌野生株168株のゲノムDNAを鋳型とし、表5記載のプライマーDspo0Abox−FF及びDspo0Abox−FRを用いて、abrB遺伝子上流領域断片(A)をPCRにより増幅した。また、表5記載のプライマーDspo0Abox−PF及びDspo0Abox−PRを用いて、abrB遺伝子上流領域断片(B)をPCRにより増幅した。また、表5記載のプライマーDspo0Abox−BF及びDspo0Abox−BRを用いて、abrB遺伝子上流域・中流領域断片(C)をPCRにより増幅した。次いで、クロラムフェニコール耐性遺伝子保有のプラスミドpDLT3(Morimoto T.et al.,Microbiology,2002,148:3539−3552)を鋳型とし、表5記載のプライマーrPCR−CmF2及びrPCR−CmR2を用いて、PCR増幅を行い、クロラムフェニコール耐性遺伝子の断片(D)をPCR増幅した。
kinA遺伝子の欠失変異導入を行った。枯草菌野生株168株のゲノムDNAを鋳型とし、表5記載のプライマーkinA−uF1及びkinA−uR1を用いて、kinA遺伝子上流領域の断片(A)をPCRにより増幅した。また、表5記載のプライマーkinA−dF1及びkinA−dR1を用いて、kinA遺伝子下流領域の断片(B)をPCRにより増幅した。次いで、カナマイシン耐性遺伝子保有のプラスミドpAPNCK(Yoshimura M.et al.,BMC Microbiology,2007,7:69)を鋳型とし、表5記載のプライマーrPCR−KmF及びrPCR−KmRを用いて、PCR増幅を行い、カナマイシン耐性遺伝子の断片(C)をPCR増幅した。
枯草菌変異株168_abrB*株のゲノムDNAを用いてコンピテント法(J.Bacteriol.,1960,81:741−746)により枯草菌変異株168_ΔkinA株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株168_abrB*ΔkinA株として構築した。
始めに、枯草菌が本来ゲノム上に有するPGA合成酵素遺伝子群(pgsBCAE)及びPGA分解酵素をコードする遺伝子の欠失変異導入を行った。本変異株の作製は、IPTG制御領域と遊離のmRNA切断リボヌクレアーゼであるmazF遺伝子を融合したカセットを使用するマーカーフリーの欠失法にて構築した(Morimoto,T. et al.,In Strain Engineering,pp345−358.Springer)。
始めに、枯草菌変異株168_abrB*ΔkinA株のゲノムDNAを用いてコンピテント法(J.Bacteriol.,1960,81:741−746)により枯草菌変異株MGB874T_PGA株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株MGB874T_PGA_abrB*株、及びカナマイシンを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを枯草菌変異株MGB874T_PGA_ΔkinA株としてそれぞれ構築した。
実施例1にて得られた枯草菌変異株を2%グルコースMYCプレオート培地(2%グルコース、1.8%塩化アンモニウム、0.15%リン酸水素2カリウム、0.035%硫酸マグネシウム7水和物、0.005%硫酸マンガン5水和物、50mM MOPS(モノホリノプロパンスルホン酸)緩衝剤(pH7.0)、その他微量金属、0.05%酵母エキス、0.02%カザミノ酸、2%寒天)で30℃にて24時間培養を行い、得られたコロニーを30mLの5%グルコースM改変培地(5%グルコース、1.2%塩化アンモニウム、0.15%リン酸水素2カリウム、0.035%硫酸マグネシウム7水和物、0.005%硫酸マンガン5水和物、50mM MOPS(モノホリノプロパンスルホン酸)緩衝剤(pH7.0)、その他微量金属)にOD600が0.02〜0.1となるように接種し30℃にて12〜16時間振盪培養を行い、さらに得られた培養液を、30mLの5%グルコースM改変培地(5%グルコース、1.2%塩化アンモニウム、0.15%リン酸水素2カリウム、0.035%硫酸マグネシウム7水和物、0.005%硫酸マンガン5水和物、50mM MOPS(モノホリノプロパンスルホン酸)緩衝剤(pH7.0)、その他微量金属、4.0%炭酸カルシウム)にOD600が0.05となるように接種し、37℃、200rpmで1日〜2日間、振盪培養を行った。培養終了後、下記測定例に示す分析条件にてPGA生産量を測定した。各株の到達PGA生産量は、MGB874T_PGA株における到達PGA生産量を100%とした場合の相対値で示した。
培養終了後の培養液試料を、室温にて14,800rpmで30分間の遠心分離(日立工機、himacCF15RX)に供し、得られた遠心分離後の試料上清中に含まれるPGAについて、HPLC法にて定量分析及び分子量分析を行った。使用したHPLC装置は、送液ポンプ(島津、LC−9A)、オートサンプラー(日立計測機器、AS−2000)、カラムオーブン(島津、CTO−6A)、UV検出計(島津、SPD−10A)、脱ガス装置(GLサイエンス、DG660B)及びクロマトデータ解析装置(日立計測機器、D−2500)を接続して用いた。分析カラムは、排除限界の異なる2種類の東ソー製の親水性ポリマー用ゲルろ過カラムTSKgel G6000PWXL(7.8mm I.D.×30cm、排除限界>5×107)及びTSKgel G4000PWXL(7.8mm I.D.×30cm、排除限界1×106)を用い、これら分析カラムの直前にガードカラムTSK guardcolumn PWXL(6.0mm I.D.×4.0cm)を接続した。溶離液には0.1M硫酸ナトリウム、流速1.0mL/分、カラム温度は50℃、溶出ピークの検出波長は210nmを用いた。試料注入量はサンプルループ(レオダイン)を用い、1分析あたり50μLとした。HPLC分析に供するサンプルは、不溶物を除くための前処理としてMULTI SCREEN MNHV45(MILLIPORE製、0.45μmデュラポア膜)にてフィルターろ過処理し調製した。濃度検定には分子量80万のPGA(明治フードマテリアル)を用いて検量線を作成した。
abrB遺伝子恒常発現変異によりabrB遺伝子が恒常的に発現されていることを確認するために、lacZ遺伝子とその直前にプロモーター領域を導入した変異株を構築し、βガラクトシダーゼアッセイを行った。
(1−1)lacZ遺伝子が導入された枯草菌変異株(OC−014株)の構築
まず、枯草菌amyE遺伝子領域にlacZ遺伝子の導入を行った。pDL2プラスミド(Fukuchi K. et al., Microbiology,2000,146:1573-1583)を用いて枯草菌野生株168株を形質転換し、amyE遺伝子領域にlacZ遺伝子、及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を持つ枯草菌変異株OC−014株を構築した。
(1−2)にて構築した枯草菌変異株OA−021株及び枯草菌変異株OA−022をスペクチノマイシンを含むLB寒天培地上に画線塗布し、得られたコロニーをS7(50)培地(Jaacks K.,et al.,J.Bacteriol.,1989,171:4121−4129)に接種し、37℃で振盪培養した。培養後、遠心分離によって菌体を集菌し、得られた菌体を用いてβガラクトシダーの活性を測定した。
βガラクトシダーゼ活性測定は、集菌した菌体を1mLのZバッファー(60mMNa2HPO4、40mM NaH2PO4、10mM KCl、1mM MgSO4・7H2O及び1mM DTT)にて懸濁し、得られたサンプル溶液10μLを0.63mLのZバッファーと混合した。次いで、得られた混合溶液にZバッファーに溶解したリゾチーム・DNaseI溶液(2.5mg/mLリゾチーム及び0.05mg/mL DNaseI)0.16mLを添加し、37℃で5分間保温した。次いで、8μLの10% Trition−X100を加え攪拌し、氷上に静置した。調製した最終サンプル溶液を30℃で3分間保温し、Zバッファーに溶解したONPG溶液(4.0mg/mL o−Nitrophenyl−B−D−galactoside(ONPG))0.2mLを加え混合し、黄色く呈色するまで保温した。最後に0.4mLのNa2CO3溶液を加え反応を停止させ、420nmにおける吸光度(OD420nm)を測定し、以下の式(1)より算出される活性値を求めた。
Miller unit = (1000×OD420nm) / (T× V ×OD600 unit of cell)
T:反応時間(min)
V:活性測定に使用した培養液量(mL)
Claims (12)
- 枯草菌変異株であって、
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7領域(yrkS−yraK)、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域を欠失したゲノムを有し、
ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が発現可能に強化又は導入され、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するように遺伝子構築され、且つkinA遺伝子が欠失又は不活性化され、且つalsS遺伝子及びalsD遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株であって、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記の(a)〜(b)、(d)〜(f)からなる群より選択される、枯草菌変異株。
(a)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号1に示すヌクレオチド配列と90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつAbrBと同様の遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号2に示すアミノ酸配列において1〜9個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつAbrBと同様の遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号2に示すアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつAbrBと同様の遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子を恒常的に発現するような遺伝子構築が、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域における抑制性制御因子の結合部位を不活性化することである、請求項1記載の枯草菌変異株。
- abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域及びリボソーム結合部位、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域における抑制性制御因子の結合部位が、配列番号9に示される塩基配列において20〜49番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域、又は/及び73〜89番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域である請求項2載の枯草菌変異株。
- abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が恒常的に発現するような遺伝子構築が、配列番号9に示される塩基配列において73〜89番目の塩基からなる領域又はこれに相当する領域を削除するものである、請求項3記載の枯草菌変異株。
- kinA遺伝子が、下記の(g)〜(h)、(j)〜(l)からなる群より選択される、請求項1〜4のいずれか1項記載の枯草菌変異株。
(g)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(h)配列番号3に示すヌクレオチド配列と90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(j)配列番号4に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(k)配列番号4に示すアミノ酸配列において1〜9個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(l)配列番号4に示すアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ胞子形成初期に関わる多成分制御系のヒスチジンキナーゼとしての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - alsS遺伝子が、下記の(m)〜(n)、(p)〜(r)からなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか1項記載の枯草菌変異株。
(m)配列番号5に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(n)配列番号5に示すヌクレオチド配列と90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(p)配列番号6に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(q)配列番号6に示すアミノ酸配列において1〜9個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(r)配列番号6に示すアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - alsD遺伝子が、下記の(s)〜(t)、(v)〜(x)からなる群より選択される、請求項1〜6のいずれか1項記載の枯草菌変異株。
(s)配列番号7に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(t)配列番号7に示すヌクレオチド配列と90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(v)配列番号8に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(w)配列番号8に示すアミノ酸配列において1〜9個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(x)配列番号8に示すアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - alsS遺伝子及びalsD遺伝子が共に欠失又は不活性化されている、請求項1〜7いずれか1項記載の枯草菌変異株。
- ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素をコードする遺伝子が、枯草菌のpgsB遺伝子、pgsC遺伝子、pgsA遺伝子及びpgsE遺伝子、並びにそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子であり、ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が枯草菌pgdS遺伝子又はそれに相当する遺伝子である請求項8載の組換え枯草菌。
- ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が、枯草菌のpgsB遺伝子、pgsC遺伝子、pgsA遺伝子、pgsE遺伝子及びpgdS遺伝子、又はこれらに相当する遺伝子である請求項9記載の組換え枯草菌。
- 組換え枯草菌の製造方法であって、
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、prophage7領域(yrkS−yraK)、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域を欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子を恒常的に発現するように遺伝子構築する工程、kinA遺伝子を欠失又は不活性化する工程、alsS遺伝子及びalsD遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子を欠失又は不活性化する工程、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子を発現可能に強化又は導入する工程を含む、方法であって、abrB遺伝子又はそれに相当する遺伝子が、下記の(a)〜(b)、(d)〜(f)からなる群より選択される、方法。
(a)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号1に示すヌクレオチド配列と90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつAbrBと同様の遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号2に示すアミノ酸配列において1〜9個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつAbrBと同様の遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号2に示すアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつAbrBと同様の遷移期及び定常期に誘導される遺伝子の転写因子としての活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 請求項1〜10のいずれか1項記載の組換え枯草菌を培養し、培養物からポリ−γ−グルタミン酸を回収する工程を含む、ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
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