JP5904996B2 - 単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラム - Google Patents
単一発光粒子検出を用いた光分析装置、光分析方法並びに光分析用コンピュータプログラム Download PDFInfo
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Description
2…光源
3…シングルモードオプティカルファイバー
4…コリメータレンズ
5…ダイクロイックミラー
6、7、11…反射ミラー
8…対物レンズ
9…マイクロプレート
10…ウェル(試料溶液容器)
12…コンデンサーレンズ
13…ピンホール
14…バリアフィルター
15…マルチモードオプティカルファイバー
16…光検出器
17…ミラー偏向器
17a…ステージ位置変更装置
18…コンピュータ
本発明による光分析技術は、基本的な構成に於いて、図1(A)に模式的に例示されている如き、FCS、FIDA等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。図1(A)を参照して、光分析装置1は、光学系2〜17と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ18とから構成される。光分析装置1の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源2から放射されシングルモードファイバー3内を伝播したレーザー光(Ex)が、ファイバーの出射端に於いて固有のNAにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター4によって平行光となり、ダイクロイックミラー5、反射ミラー6、7にて反射され、対物レンズ8へ入射される。対物レンズ8の上方には、典型的には、1〜数十μLの試料溶液が分注される試料容器又はウェル10が配列されたマイクロプレート9が配置されており、対物レンズ8から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル10内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域(励起領域)が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されており、発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光(Em)は、対物レンズ8、ダイクロイックミラー5を通過し、ミラー11にて反射してコンデンサーレンズ12にて集光され、ピンホール13を通過する。なお、当業者に於いて知られている如く、ピンホール13は、対物レンズ8の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図1(B)に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール13を通過し、焦点面以外からの光は遮断される。図1(B)に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、1〜10fL程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり、コンフォーカル・ボリュームと称される。コンフォーカル・ボリュームに於いては、典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となり、その実効体積は、光強度が1/e2となる面を境界とする略楕円球体の体積である。かくして、ピンホール13を通過した光は、ダイクロイックミラー14aを経て、バリアフィルター14を透過して(ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。)、マルチモードファイバー15に導入されて、対応する光検出器16に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ18へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。光検出器16としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられ、これにより、単一の発光粒子からの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出可能となる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎(BIN TIME)に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。
「発明の概要」の欄に記載されている如く、本発明の光分析技術に於いては、端的に述べれば、走査分子計数法に於いて、時系列光強度データに於ける光強度の発生頻度の分布(信号発生頻度積算値分布)を参照して、ノイズを排除して発光粒子の信号を検出するための基準を容易に決定することが試みられる。以下、本発明の走査分子計数法及びノイズ排除の原理について説明する。
FCS、FIDA等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、FCS、FIDA等の分光分析技術では、原理的に、発光粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度が、図8(A)に模式的に描かれているように、蛍光強度の計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域CV内に存在するレベルであり、同図の右側に示されている如く、計測時間中に常に有意な光強度(フォトンカウント)が検出されることが要求される。もし発光粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、図8(B)に描かれているように、発光粒子がたまにしか光検出領域CV内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度の信号(フォトンカウント)が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも発光粒子の濃度が大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。
既に述べた如く、上記の走査分子計数法により光検出器16により経時的に取得された光強度のデータ(時系列光強度データ)上には、発光粒子の信号の他、光検出器の熱ノイズや背景光等に起因にするノイズが存在する。従って、発光粒子の信号の検出に際しては、時系列光強度データからの発光粒子の信号の抽出のための処理が必要となる。発光粒子の信号の抽出処理としては、典型的には、時系列光強度データ上の信号の強度を参照して、所定の強度範囲内に入る強度を有する信号、より具体的には、所定の閾値以上の又はその閾値を上回る強度を有する信号を発光粒子の信号として抽出するといった処理が為される。しかしながら、従前、ノイズが排除された状態で発光粒子の信号を抽出する明確な基準は見出されておらず、従って、前記の所定の強度範囲若しくは閾値は、試行錯誤又は装置の使用者の経験等により定められており、このことは、発光粒子の信号の検出のための労力、時間を要し、或いは、発光粒子の信号の検出結果の精度の悪化の要因ともなり得た。
P=cSutNA …(2)
となる(NAは、アボガドロ数)。ここで、光強度I以上の光強度を与える小領域の断面積Sが近似的にS=πr2により与えられるとすると(より厳密には、光検出領域の断面は楕円であるが、演算の簡略化のため、円にて近似する。以下同様。)、半径rは、
図1(A)に例示の光分析装置1を用いた本発明に従った走査分子計数法の実施形態に於いては、具体的には、(1)発光粒子を含む試料溶液の調製、(2)試料溶液の光強度の測定処理、及び(3)測定された光強度の分析処理が実行される。図3は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理を示している。
本発明の方法に於いて観測対象となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的粒子などであってよい(試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。)。また、観測対象となる粒子は、それ自体が発光する粒子であってもよく、或いは、発光標識(蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子)が任意の態様にて付加された粒子であってよい。
本実施形態の走査分子計数法による光分析に於ける光強度の測定処理では、ミラー偏向器17を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動(試料溶液内の走査)を行いながら、光強度の測定が為される(図4−ステップ100)。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート9のウェル10に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ18に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ18は、記憶装置(図示せず)に記憶されたプログラム(光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順)に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。計測が開始されると、まず、コンピュータ18のプログラムに従った処理動作の制御下、光源2から、試料溶液中の発光粒子の励起波長の光が出射されると共に、ミラー偏向器17がミラー7(ガルバノミラー)を駆動して、ウェル10内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器16は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ18へ送信し、コンピュータ18は、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。典型的には、光検出器16は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎(BIN TIME)に、例えば、10μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
(2Wo)2=6D・Δt …(9)
から、
Δt=(2Wo)2/6D …(10)
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度(拡散移動速度)Vdifは、概ね、
Vdif=2r/Δτ=3D/r …(11)
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるVdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、発光粒子の拡散係数が、D=2.0×10−10m2/s程度であると予想される場合には、Woが、0.62μm程度だとすると、Vdifは、1.0×10−3m/sとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その10倍以上の15mm/sと設定されてよい。なお、発光粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル(典型的には、励起光強度分布と略同様)となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
上記の処理により時系列光強度データが得られると、コンピュータ18に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、時系列光強度データ上に於ける信号の検出、発光粒子の信号の抽出のための閾値の決定、発光粒子の信号の抽出、発光粒子のカウンティング、濃度算出等の各種分析が実行される。
既に触れた如く、時系列光強度データに於いて、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図4(B)に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、(光学系により決定される)光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する。従って、走査分子計数法では、基本的には、適宜設定される閾値Ithを超える光強度値が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、光強度が閾値Ithを超えないか、時間幅Δτが所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布:
I=A・exp(−2t2/a2) …(12)
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル(バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル)に対して式(12)をフィッティングして算出された強度A及び幅aが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。(強度A及び幅aが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。)
上記のステップ130〜160の処理により、時系列光強度データ上に於いてパルス信号が検出されると、その信号発生頻度積算値分布に基づいて、ノイズを実質的に排除した状態での発光粒子の信号の抽出のための真の閾値が決定される。具体的には、まず、時系列光強度データ上にて検出されたパルス信号についての信号発生頻度積算値分布の調製が為される(ステップ200)。即ち、光強度I毎にその光強度I以上の強度を有する信号数P(I)が計数される。しかる後、信号数P(I)の平方根又はそれから式(3)を用いて算出される最大強度点からの放射方向距離(半径)r(ただし、半径rは、発光粒子濃度cが既知の場合のみ算定可能である。)に対する光強度Iの分布が調製される(ステップ210−図6(A)参照。)。ここに於いて、信号発生頻度積算値分布、或いは、信号数P(I)の平方根又はそれから算出される半径rに対する光強度Iの分布は、コンピュータ18の表示装置の画面上に表示され、装置の使用者に、信号発生頻度積算値分布及び/又は信号数P(I)の平方根若しくは最大強度点からの半径rに対する光強度Iの分布が容易に視覚的に把握できるようになっていてよい。しかる後、信号発生頻度積算値分布及び/又は信号数P(I)の平方根若しくは最大強度点からの半径rに対する光強度Iの分布を参照して、ノイズ信号を排除して発光粒子の信号の抽出を行うための閾値の決定が為される。閾値の決定の手法としては、例えば、下記のいずれかにより為されてよい。
かくして、光強度Iに対する閾値が、上記のいずれかの手法により決定されると、ステップ110〜160の処理により時系列光強度データから検出された信号の群のうち、前記の決定された閾値以上のピーク強度を有する信号が発光粒子の信号として抽出され(ステップ230)、これにより、単一の発光粒子が個別に検出されたこととなる。なお、かかる抽出処理と共に、抽出された信号の数が発光粒子の信号として計数されてよい。
時系列光強度データに於ける発光粒子の数密度又は濃度は、発光粒子の信号の数と、時系列光強度データの取得の間に光検出領域の通過した領域の総体積を用いて決定可能である。しかしながら、光検出領域の実効体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に依存して変動するため、設計値から算定することは、一般に困難であり、従って、光検出領域の通過した領域の総体積を算定することも簡単ではない。また、既に触れたように、閾値の設定によって光検出領域内に於ける検出対象となる領域が変化するので、かかる領域の総体積を理論的に算定することは困難である。そこで、典型的には、発光粒子の濃度が既知の溶液(参照溶液)について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行い、検出された発光粒子の数と参照溶液の発光粒子の濃度とから、光検出領域の通過した領域のうちの検出対象となる領域の総体積、即ち、発光粒子の検出数と濃度との関係が決定されるようになっていてよい。参照溶液の発光粒子としては、好ましくは、各発光粒子と同様の波長特性を有する発光標識(蛍光色素等)であってよい。具体的には、例えば、発光粒子の濃度(数密度)Cの参照溶液について、その発光粒子の検出数がNであったとすると、検出対象となる領域の通過した領域の総体積Vtは、
Vt=N/C …(13)
により与えられる。また、参照溶液として、複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたVtの平均値が光検出領域のうちの検出対象となる領域の通過した領域の総体積Vtとして採用されるようになっていてよい。そして、Vtが与えられると、粒子のカウンティング結果がnの試料溶液の発光粒子の濃度(数密度)cは、
c=n/Vt …(14)
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、FCS、FIDAを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Cと粒子の数Nとの関係(式(13))の情報をコンピュータ18の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
20μ秒<パルス幅<400μ秒
ピーク強度>1[pc/10μs] …(A)
相関係数>0.95
を満たすパルス信号のみを抽出した。次いで、光強度I毎に、光強度Iを超える強度を有する信号数を計数し(信号発生頻度積算値分布の調製)、しかる後、信号数の平方根に対する光強度Iの分布を調製し、更に、信号数の平方根に対する光強度Iの分布に対して、式(8)をフィッティングした。
Claims (32)
- 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、
前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の各々からの信号を個別に検出する信号処理部とを含み、
前記信号処理部が、前記時系列の光強度データに於いて検出された信号の群から、前記発光粒子の信号として、前記時系列の光強度データに於いて検出された信号の強度を変数として該変数以上の強度を有する前記信号の発生頻度の積算値の分布である信号発生頻度積算値分布に基づいて設定された光強度範囲内の光強度を有する信号を抽出することにより前記発光粒子の各々からの信号を検出することを特徴とする装置。 - 請求項1の装置であって、前記信号処理部が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される閾値を上回る強度を有する前記時系列の光強度データ上の信号を、前記発光粒子の信号として抽出することを特徴とする装置。
- 請求項1の装置であって、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて設定された光強度範囲が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置に対する信号の強度分布が前記光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布に実質的に合致している光強度範囲であることを特徴とする装置。
- 請求項1の装置であって、前記信号処理部が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて前記時系列の光強度データに於けるノイズ強度の上限を決定可能であることを特徴とする装置。
- 請求項1の装置であって、前記信号処理部が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布及び/又は前記信号発生頻度積算値分布を表示可能な表示部を有していることを特徴とする装置。
- 請求項5の装置であって、前記表示部に於いて表示された前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布又は前記信号発生頻度積算値分布上にて、前記発光粒子の信号として抽出されるべき前記時系列の光強度データ上の信号の前記光強度範囲を、前記装置の使用者が設定可能であることを特徴とする装置。
- 請求項1の装置であって、前記発光粒子の信号として抽出されるべき前記時系列の光強度データ上の信号の前記光強度範囲が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布に対して釣鐘型関数をフィッティングしたときのフィッティング誤差に基づいて設定可能であることを特徴とする装置。
- 請求項1の装置であって、前記発光粒子の信号として抽出されるべき前記時系列の光強度データ上の信号の前記光強度範囲が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布の形状に基づいて又は前記信号発生頻度積算値分布の形状に基づいて設定可能であることを特徴とする装置。
- 請求項1の装置であって、前記発光粒子の信号として抽出されるべき前記時系列の光強度データ上の信号の前記光強度範囲が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布に於ける前記位置の関数値に対する前記信号の強度の傾きに基づいて設定可能であることを特徴とする装置。
- 請求項1乃至9のいずれかの装置であって、前記光検出領域移動部が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
- 請求項1乃至10のいずれかの装置であって、前記信号処理部が前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定することを特徴とする装置。
- 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、
前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光の強度を測定して時系列の光強度データを生成する過程と、
前記時系列の光強度データ上に於いて発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程とを含み、
前記発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、前記時系列の光強度データに於いて検出された信号の群から、前記発光粒子の信号として、前記時系列の光強度データに於いて検出された信号の強度を変数として該変数以上の強度を有する前記信号の発生頻度の積算値の分布である信号発生頻度積算値分布に基づいて設定された光強度範囲内の光強度を有する信号を抽出することにより前記発光粒子の各々からの信号を検出することを特徴とする方法。 - 請求項12の方法であって、前記発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される閾値を上回る強度を有する前記時系列の光強度データ上の信号を、前記発光粒子の信号として抽出することを特徴とする方法。
- 請求項12の方法であって、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて設定された光強度範囲が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置に対する信号の強度分布が前記光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布に実質的に合致している光強度範囲であることを特徴とする方法。
- 請求項12の方法であって、前記発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて前記時系列の光強度データに於けるノイズ強度の上限を決定することを特徴とする方法。
- 請求項12の方法であって、前記発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、表示装置上に表示された前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布又は前記信号発生頻度積算値分布上にて、前記発光粒子の信号として抽出されるべき前記時系列の光強度データ上の信号の前記光強度範囲を設定することを特徴とする方法。
- 請求項12の方法であって、前記発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、前記発光粒子の信号として抽出されるべき前記時系列の光強度データ上の信号の前記光強度範囲が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布に対して釣鐘型関数をフィッティングしたときのフィッティング誤差に基づいて設定されることを特徴とする方法。
- 請求項12の方法であって、前記発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、前記発光粒子の信号として抽出されるべき前記時系列の光強度データ上の信号の前記光強度範囲が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布の形状に基づいて又は前記信号発生頻度積算値分布の形状に基づいて設定されることを特徴とする方法。
- 請求項12の方法であって、前記発光粒子の光を表す信号を個別に検出する過程に於いて、前記発光粒子の信号として抽出されるべき前記時系列の光強度データ上の信号の前記光強度範囲が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布に於ける前記位置の関数値に対する前記信号の強度の傾きに基づいて設定されることを特徴とする方法。
- 請求項12乃至19のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置が前記試料溶液中の発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。
- 請求項12乃至20のいずれかの方法であって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、該発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程を含むことを特徴とする方法。
- 共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出するための光分析用コンピュータプログラムであって、
前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於ける前記光学系の光検出領域の位置を移動する手順と、
前記試料溶液内に於ける前記光検出領域の位置の移動中に前記光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順と、
前記時系列の光強度データに於いて個々の発光粒子からの信号を個別に検出する手順にして、前記時系列の光強度データに於いて検出された信号の群から、前記発光粒子の信号として、前記時系列の光強度データに於いて検出された信号の強度を変数として該変数以上の強度を有する前記信号の発生頻度の積算値の分布である信号発生頻度積算値分布に基づいて設定された光強度範囲内の光強度を有する信号を抽出することにより前記発光粒子の各々からの信号を検出する手順と
をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。 - 請求項22のコンピュータプログラムであって、前記個々の発光粒子からの信号を個別に検出する手順に於いて、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される閾値を上回る強度を有する前記時系列の光強度データ上の信号を、前記発光粒子の信号として抽出することを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項22のコンピュータプログラムであって、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて設定された光強度範囲が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置に対する信号の強度分布が前記光検出領域内に於ける発光粒子から放出され検出される光の強度分布に実質的に合致している光強度範囲であることを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項22のコンピュータプログラムであって、前記個々の発光粒子からの信号を個別に検出する手順に於いて、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて前記時系列の光強度データに於けるノイズ強度の上限が決定されることを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項22のコンピュータプログラムであって、更に、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布及び/又は前記信号発生頻度積算値分布を表示装置上に表示する手順をコンピュータに実行させることを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項26のコンピュータプログラムであって、前記個々の発光粒子からの信号を個別に検出する手順に於いて、前記表示装置上に表示された前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布又は前記信号発生頻度積算値分布上にて、前記発光粒子の信号として抽出されるべき前記時系列の光強度データ上の信号の前記光強度範囲が設定可能であることを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項22のコンピュータプログラムであって、前記発光粒子の信号として抽出されるべき前記時系列の光強度データ上の信号の前記光強度範囲が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布に対して釣鐘型関数をフィッティングしたときのフィッティング誤差に基づいて設定されることを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項22のコンピュータプログラムであって、前記発光粒子の信号として抽出されるべき前記時系列の光強度データ上の信号の前記光強度範囲が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布の形状に基づいて又は前記信号発生頻度積算値分布の形状に基づいて設定されることを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項22のコンピュータプログラムであって、前記発光粒子の信号として抽出されるべき前記時系列の光強度データ上の信号の前記光強度範囲が、前記信号発生頻度積算値分布に基づいて決定される前記光検出領域内の位置の関数値に対する前記信号の強度の分布に於ける前記位置の関数値に対する前記信号の強度の傾きに基づいて設定されることを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項22乃至30のいずれかのコンピュータプログラムであって、前記光学系の光検出領域の位置を移動する手順に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とするコンピュータプログラム。
- 請求項22乃至31のいずれかのコンピュータプログラムであって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する手順を含むことを特徴とするコンピュータプログラム。
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