JP5884104B2 - 改変melkペプチドおよびそれを含むワクチン - Google Patents
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Description
優先権
本出願は、2010年1月25日に出願された米国仮出願第61/297,996号の恩典を主張し、それらの内容はその全体が、目的を問わず、参照により本明細書に組み入れられる。
ぺプチドの免疫原性を高めるために、MHCまたはT細胞受容体との相互作用に極めて重要であるペプチドのアミノ酸残基を改変することに関する複数の研究が報告されている(非特許文献20、21)。
本発明はまた、改変ペプチドが元のペプチドの必要な元のCTL誘導能を保持する限り、1つ、2つ、またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、または付加されている、SEQ ID NO:35〜45のアミノ酸配列を有する改変ペプチドも意図する。
対象に投与した場合、本ペプチドは、各ペプチドを標的とするCTLを誘導するように、APCの表面上に提示される。したがって、CTLを誘導する物質であって、本発明の1つもしくは複数のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む物質を提供することは、本発明の1つの目的である。本発明は、本発明のペプチドの1つもしくは複数またはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む薬学的物質をさらに意図し、そのような組成物は、子宮内膜症、ならびに乳がん、膀胱がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、CML、結腸直腸がん、食道がん、胃がん、肝がん、NSCLC、リンパ腫、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびSCLCを含むがこれらに限定されないがんの治療および/もしくは予防、ならびに/または術後のその再発の予防に用いることができる。したがって、子宮内膜症もしくはがんの治療および/もしくは予防、ならびに/または術後のその再発の予防のために製剤化された薬学的な組成物または物質であって、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかを含む薬学的な組成物または物質を提供することは、本発明のさらに別の目的である。本ペプチドまたはポリヌクレオチドの代わりに、またはそれに加えて、本物質または本発明の物質の調剤は、有効成分として、本発明のペプチドのいずれかを提示するAPCまたはエキソソームを任意に含んでもよい。
本発明の適用性は、子宮内膜症およびがんを含む、MELK過剰発現に関連するか、またはMELK過剰発現から生じるいくつかの疾患のいずれにも及び、がんの例には、乳がん、膀胱がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、CML、結腸直腸がん、食道がん、胃がん、肝がん、NSCLC、リンパ腫、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびSCLCが含まれるが、これらに限定されない。
[1] HLA抗原に結合し、かつ細胞傷害性Tリンパ球(CTL)誘導能を有する単離されたペプチドであって、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列からなるか、またはSEQ ID NO:6のアミノ酸配列中に1つもしくは複数のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列からなる、単離されたペプチド、
[2] HLA抗原がHLA−A24である、[1]記載の単離されたペプチド、
[3] ポリペプチドが、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列中の以下(a)〜(d):
(a) N末端アミノ酸、
(b) N末端から3番目のアミノ酸、
(c) C末端から3番目のアミノ酸、および
(d) C末端アミノ酸
からなる群より選択される位置に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、[1]記載の単離されたペプチド、
[4] ポリペプチドが、以下(i)〜(iv):
(i) SEQ ID NO:6のアミノ酸配列中のN末端アミノ酸における、EからKまたはRへのアミノ酸置換、
(ii) SEQ ID NO:6のアミノ酸配列中のN末端から3番目のアミノ酸における、CからE、I、L、M、N、またはPへのアミノ酸置換、
(iii) SEQ ID NO:6のアミノ酸配列中のC末端から3番目のアミノ酸における、EからNまたはQへのアミノ酸置換、および
(iv) SEQ ID NO:6のアミノ酸配列中のC末端アミノ酸における、FからLへのアミノ酸置換
からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、[3]記載の単離されたペプチド、
[5] 単一のアミノ酸置換を含む、[4]記載の単離されたペプチド、
[6] 2つのアミノ酸置換を含む、[4]記載の単離されたペプチド、
[7] 3つのアミノ酸置換を含む、[4]記載の単離されたペプチド、
[8] 4つのアミノ酸置換を含む、[4]記載の単離されたペプチド、
[9] SEQ ID NO:35〜45からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、[4]〜[5]記載の単離されたペプチド、
[10] HLA抗原に結合し、かつ細胞傷害性Tリンパ球(CTL)誘導能を有する単離されたペプチドであって、1個、2個、または数個のアミノ酸が挿入、置換、欠失、または付加されている、SEQ ID NO:35〜45からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、単離されたペプチド、
[11] 以下の特徴:
(a) N末端から2番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、およびトリプトファンの群より選択される;ならびに
(b) C末端アミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、およびメチオニンの群より選択される
の一方または両方を有する、[10]記載のペプチド、
[12] [1]〜[11]のいずれか一項記載のペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド、
[13] CTLを誘導するための物質であって、[1]〜[11]のいずれか一項記載の1つもしくは複数のペプチドまたは[12]記載の1つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、物質、
[14] がんもしくは子宮内膜症の治療および/もしくは予防、ならびに/または術後のその再発の予防のための薬学的組成物であって、[1]〜[11]のいずれか一項記載の1つもしくは複数のペプチドまたは[12]記載の1つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、薬学的組成物、
[15] HLA抗原がHLA−A24である対象に投与するために製剤化される、[14]記載の薬学的組成物、
[16] がんまたは子宮内膜症を治療するために製剤化される、[14]または[15]記載の薬学的組成物、
[17] CTL誘導能を有する抗原提示細胞(APC)を誘導するための方法であって、以下:
(a) APCを[1]〜[11]のいずれか一項記載のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階;および
(b) [1]〜[9]のいずれか一項記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階、
の1つを含む、方法、
[18] 以下:
(a) HLA抗原と[1]〜[11]のいずれか一項記載のペプチドとの複合体をその表面上に提示するAPCと、CD8陽性T細胞を共培養する段階;
(b) HLA抗原と[1]〜[11]のいずれか一項記載のペプチドとの複合体をその表面上に提示するエキソソームと、CD8陽性T細胞を共培養する段階;および
(c) [1]〜[9]のいずれか一項記載のペプチドに結合するT細胞受容体(TCR)サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をT細胞に導入する段階
の少なくとも1つを含む方法のいずれかによって、CTLを誘導するための方法、
[19] HLA抗原と[1]〜[11]のいずれか一項記載のペプチドとの複合体をその表面上に提示する単離されたAPC、
[20] [17]記載の方法によって誘導される、[19]記載のAPC、
[21] [1]〜[11]のいずれか一項記載のペプチドを標的とする単離されたCTL、
[22] [18]記載の方法によって誘導される、[21]記載のCTL、ならびに
[23] 対象においてがんまたは子宮内膜症に対する免疫応答を誘導する方法であって、[1]〜[11]のいずれか一項記載のペプチド、その免疫学的活性断片、または該ペプチドもしくは該断片をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を対象に投与する段階を含む、方法。
上記に加え、本発明のその他の目的および特徴は、添付の図面および実施例と併せて以下の詳細な説明を読むことによって、より十分に明らかになるであろう。しかし、前述の発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも例示的な態様であり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。特に、本発明をいくつかの特定の態様を参照して本明細書において説明するが、その説明は本発明を例証するものであり、本発明を限定するものとして構成されていないことが理解されよう。添付の特許請求の範囲によって記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者は様々な変更および適用に想到することができる。同様に、本発明のその他の目的、特徴、利益、および利点は、本概要および以下に記載する特定の態様から明らかになり、当業者には容易に明白になるであろう。そのような目的、特徴、利益、および利点は、添付の実施例、データ、図面、およびそれらから引き出されるあらゆる妥当な推論と併せて上記から、単独で、または本明細書に組み入れられる参考文献を考慮して、明らかになるであろう。
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等のいかなる方法および材料も用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料をここに記載する。しかし、本発明の材料および方法について記載する前に、本明細書に記載の特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣例的な実験法および最適化に応じて変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載に使用する専門用語は特定の型または態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図しないことも、また理解されるべきである。
別段の定めのない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている用語と同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含め、本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および例は、単に例証するためのものであり、限定することは意図しない。
本明細書で用いる「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」という単語は、特に別段の指定のない限り「少なくとも1つ」を意味する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、1個または複数個のアミノ酸残基が修飾された残基であるか、または対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーに適用される。
本明細書で時として用いる「オリゴペプチド」という用語は、長さが20残基またはそれ未満、典型的には15残基またはそれ未満の本発明のペプチド、および典型的には約8〜約11残基、しばしば約9または10残基から構成される本発明のペプチドを指すのに用いられる。
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、特に別段の指定のない限り、アミノ酸と同様に、一般に受け入れられている1文字コードにより参照される。
本発明の薬学的な剤または組成物は、特にワクチンとして使用される。本発明との関連において、「ワクチン」という語句(「免疫原性組成物」とも称される)は、動物に接種した際に抗腫瘍免疫を誘導する機能を有する物質を指す。
別段の定めのない限り、「子宮内膜症」という用語はMELK遺伝子を過剰発現している子宮内膜症を指し、その例には、米国不妊学会修正分類によって分類される子宮内膜症の病期I(微症)、II(軽度)、III(中等度)、またIV(重度)が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、子宮内膜症の例には、ビーチャム分類によって分離される子宮内膜症の病期I、II、III、またはIVが含まれるが、これらに限定されない。
別段の定めのない限り、本明細書で用いる「HLA−A24」という用語は、HLA−A*2402などのサブタイプを含むHLA−A24タイプを指す。
対象または患者との関連において、本明細書で用いる「HLA−A24陽性」という語句は、その対象または患者がHLA−A24抗原遺伝子をホモ接合的またはヘテロ接合的に保有し、HLA−A24抗原が対象または患者の細胞においてHLA抗原として発現していることを指す。
MELK由来の改変ペプチドがCTLによって認識される抗原として機能することを実証するために、MELK−A24−9−87_WT (SEQ ID NO:6)由来の改変ペプチドを解析して、それらが、通常見られるHLAアリルであるHLA−A24拘束性の抗原エピトープであるかどうかを判定した(Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996;Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995;Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994)。
野生型MELK−A24−9−87 (MELK−A24−9−87_WT) (SEQ ID NO:6)よりも効率的に特異的CTLを誘導する潜在的能力を有するMELK由来のHLA−A24結合改変ペプチドの候補を、HLA−A24に対するそれらの結合親和性に基づいて同定した。すなわち、本発明に従って、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列中に1つまたは複数のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む改変ペプチドが提供される。
(a) N末端アミノ酸、
(b) N末端から3番目のアミノ酸、
(c) C末端から3番目のアミノ酸、および
(d) C末端アミノ酸。
(i) SEQ ID NO:6のアミノ酸配列中のN末端アミノ酸における、EからKまたはRへのアミノ酸置換、
(ii) SEQ ID NO:6のアミノ酸配列中のN末端から3番目のアミノ酸における、CからE、I、L、M、N、またはPへのアミノ酸置換、
(iii) SEQ ID NO:6のアミノ酸配列中のC末端から3番目のアミノ酸における、EからNまたはQへのアミノ酸置換、および
(iv) SEQ ID NO:6のアミノ酸配列中のC末端アミノ酸における、FからLへのアミノ酸置換。
MELK−A24−9−87_1K (SEQ ID NO:35)、
MELK−A24−9−87_1R (SEQ ID NO:36)、
MELK−A24−9−87_9L (SEQ ID NO:37)、
MELK−A24−9−87_3E (SEQ ID NO:38)、
MELK−A24−9−87_3I (SEQ ID NO:39)、
MELK−A24−9−87_3L (SEQ ID NO:40)、
MELK−A24−9−87_3M (SEQ ID NO:41)、
MELK−A24−9−87_3N (SEQ ID NO:42)、
MELK−A24−9−87_3P (SEQ ID NO:43)、
MELK−A24−9−87_7N (SEQ ID NO:44)、および
MELK−A24−9−87_7Q (SEQ ID NO:45)。
MELK−A24−9−87_1K (SEQ ID NO:35)、
MELK−A24−9−87_3M (SEQ ID NO:41)、および
MELK−A24−9−87_7N (SEQ ID NO:44)。
樹立されたこれらのCTLは、各ペプチドをパルスした標的細胞に対して強力な特異的CTL活性を示す。本明細書におけるこれらの結果から、前記ペプチドが、HLA−A24拘束性の、MELKの改変エピトープペプチドであることが実証される。
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リジン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、スレオニン(T);および
8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton,Proteins 1984を参照されたい)。
このような保存的改変ペプチドもまた、本発明のペプチドと見なされる。しかし、本発明のペプチドはこれらに限定されず、得られた改変ペプチドが元のペプチドのCTL誘導能を保持する限り、非保存的な改変を含み得る。さらに、改変ペプチドは、MELKの多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子のCTL誘導可能なペプチドを排除しない。
本発明はまた、記載されたペプチドのN末端および/またはC末端に対する1個、2個、または数個のアミノ酸の付加も企図する。高いHLA抗原結合親和性を有し、かつCTL誘導能を保持するそのような改変ペプチドもまた、本発明に含まれる。
より高い結合親和性を達成するために、上述のように、ペプチドの、N末端から2番目のアミノ酸、ならびにN末端および/またはC末端における改変が報告されているものの、N末端から7番目のアミノ酸における改変の効果については、未だ明らかになっていないことに留意されたい。
上記のようにペプチドのCTL誘導能を調べた結果、SEQ ID NO:35〜45によって示されるアミノ酸配列を有するペプチドの中より選択されるノナペプチドが、HLAに対する高い結合親和性に加えて、特に高いCTL誘導能を示すことが判明した。したがって、これらのペプチドは本発明の好ましい態様として例示される。
a:本発明のペプチドの少なくとも1個のアミノ酸残基を置換、欠失、または付加する段階、
b:ペプチドの活性を測定する段階、および
c:元のものと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有するペプチドを選択する段階。
本明細書において、アッセイされる活性には、MHC結合活性、APCまたはCTL誘導能、および細胞傷害活性が含まれ得る。
本明細書において、本発明のペプチドはまた、「MELKペプチド」または「MELKポリペプチド」と記載され得る。
周知の技法を用いて、本発明のペプチドを調製することができる。例えば、組換えDNA技術または化学合成を用いて、ペプチドを合成的に調製することができる。本発明のペプチドは、個々に、または2つもしくはそれ以上のペプチドから構成されるより長いポリペプチドとして、合成することができる。その後ペプチドを単離する、すなわち、他の天然の宿主細胞タンパク質およびそれらの断片、または他のいかなる化学物質も実質的に含まないように精製または単離することができる。
本発明のペプチドは、修飾によって元のペプチドの生物学的活性が損なわれない限り、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含み得る。他の例示的な修飾には、例えばペプチドの血清半減期を延長させるために用いることができる、D−アミノ酸または他のアミノ酸模倣体の取り込みが含まれる。
(i)Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;
(ii)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;
(iii)「ペプチド合成」(日本語), 丸善, 1975;
(iv)「ペプチド合成の基礎と実験」(日本語), 丸善, 1985;
(v)「続医薬品の開発」(日本語), 第14巻(ペプチド合成), 広川書店, 1991;
(vi)WO99/67288;および
(vii)Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118。
本発明はまた、前述の本発明のペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらには、天然MELK遺伝子(GenBankアクセッション番号NM_014791(例えば、SEQ ID NO:46))由来の改変ポリヌクレオチド、およびその保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。本明細書において「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、数多くの機能的に同一の核酸が任意の特定のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。したがって、あるコドンによってアラニンが指定される任意の位置において、コードされるポリペプチドを変化させることなく、該コドンを、記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の一種である。ペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列は、該核酸のあらゆる可能なサイレント変異をも表す。核酸中の各コドン(通常メチオニンに対する唯一のコドンであるAUG、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるTGGを除く)を改変して、機能的に同一の分子を得ることができることを、当業者は認識するであろう。したがって、ペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、開示した各配列において非明示的に説明されている。
本発明のポリヌクレオチドは、DNA、RNA、およびそれらの誘導体から構成され得る。DNAはA、T、C、およびGなどの塩基から適切に構成され、RNAではTはUに置き換えられる。当業者は、非天然塩基もまたポリヌクレオチドに含まれることを認識する。
本発明はさらに、本発明のペプチドとHLA抗原との間に形成された複合体を自身の表面上に提示する、エキソソームと称される細胞内小胞を提供する。エキソソームは、例えば公表特許公報 特表平11−510507号およびWO99/03499に詳述されている方法を用いて調製することができ、治療および/または予防の対象となる患者から得られたAPCを用いて調製することができる。本発明のエキソソームは、本発明のペプチドと同様の様式で、ワクチンとして接種することができる。
本発明のエキソソームに対してA24型HLA抗原を用いる場合、SEQ ID NO:35〜45のうちのいずれか1つの配列を有するペプチドが使用される。
本発明はまた、HLA抗原と本発明のペプチドとの間に形成された複合体を自身の表面上に提示する単離されたAPCを提供する。APCは、治療および/または予防の対象となる患者に由来してもよく、かつ単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはCTLを含む他の薬物と組み合わせて、ワクチンとして投与することができる。
例えば、末梢血単球からDCを誘導し、次にそれらをインビトロ、エクスビボ、またはインビボで本発明のペプチドと接触させる(で刺激する)ことによって、本発明のAPCを得ることができる。本発明のペプチドを対象に投与する場合、本発明のペプチドを提示するAPCが該対象の体内で誘導される。「APCを誘導する」という語句は、HLA抗原と本発明のペプチドとの間に形成された複合体を細胞表面に提示するために、細胞を、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードするヌクレオチドと接触させる(で刺激する)ことを含む。したがって、本発明のAPCは、本発明のペプチドを対象に投与した後、該対象からAPCを回収することによって得ることができる。あるいは、本発明のAPCは、対象から回収されたAPCを本発明のペプチドと接触させることによって得ることもできる。
a:第1の対象からAPCを回収する段階、
b:段階aのAPCをペプチドと接触させる段階、および
c:段階bのAPCを第2の対象に投与する段階。
本発明の一局面によると、APCは高レベルのCTL誘導能を有する。「高レベルのCTL誘導能」という用語における高レベルとは、ペプチドと接触させていないAPC、またはCTLを誘導することができないペプチドと接触させたAPCによるCTL誘導能のレベルと比較したものである。高レベルのCTL誘導能を有するそのようなAPCは、上記の方法に加え、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをインビトロでAPCに導入する段階を含む方法によって調製することができる。導入する遺伝子は、DNAまたはRNAの形態であってよい。導入の方法の例には、特に限定されることなく、リポフェクション、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム法などの、当分野において従来より実施されている様々な方法が含まれる。より具体的には、Cancer Res 1996, 56: 5672-7;J Immunol 1998, 161: 5607-13;J Exp Med 1996, 184: 465-72;公表特許公報第2000−509281号に記載されているように、それを実施することができる。遺伝子をAPCに導入することによって、該遺伝子は細胞内で転写、翻訳等を受け、次いで、得られたタンパク質はMHCクラスIまたはクラスIIによってプロセシングされて、提示経路を経て本発明のペプチドが提示される。
本発明のペプチドのいずれかに対して誘導されたCTLは、インビボでがん細胞を標的とする免疫応答を増強するため、ペプチド自体と同様の様式でワクチンとして用いることができる。したがって本発明はまた、本発明のペプチドのいずれかによって特異的に誘導または活性化された、単離されたCTLも提供する。
そのようなCTLは、(1)本発明のペプチドを対象に投与し、対象からCTLを回収すること、または(2)対象由来のAPC、およびCD8陽性細胞、もしくは末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させ(で刺激し)、次にCTLを単離すること、または(3)CD8陽性細胞もしくは末梢血単核白血球を、HLA抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するAPCもしくはエキソソームとインビトロで接触させ、次にCTLを単離すること、または(4)本発明のペプチドに結合するT細胞受容体(TCR)サブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をCTLに導入することによって得ることができる。前述のAPCおよびエキソソームは上記の方法によって調製することができ、(4)の方法は「VIII.T細胞受容体(TCR)」の章において以下に詳述する。
本発明はまた、T細胞受容体(TCR)のサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードする核酸を含む組成物、およびそれを使用する方法を提供する。TCRサブユニットは、MELKを発現する腫瘍細胞に対する特異性をT細胞に付与するTCRを形成する能力を有する。当技術分野における公知の方法を用いることにより、本発明の1種または複数種のペプチドで誘導されたCTLのTCRサブユニットとしてα鎖およびβ鎖の核酸を同定することができる(WO2007/032255、およびMorgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003))。例えば、TCRを解析するためにはPCR法が好ましい。解析のためのPCRプライマーは、例えば、5'側プライマーとしての5'−Rプライマー(5'−gtctaccaggcattcgcttcat−3')(SEQ ID NO:49)、および3'側プライマーとしての、TCRα鎖C領域に特異的な3−TRa−Cプライマー(5'−tcagctggaccacagccgcagcgt−3')(SEQ ID NO:50)、TCRβ鎖C1領域に特異的な3−TRb−C1プライマー(5'−tcagaaatcctttctcttgac−3')(SEQ ID NO:51)、またはTCRβ鎖C2領域に特異的な3−TRβ−C2プライマー(5'−ctagcctctggaatcctttctctt−3')(SEQ ID NO:52)であってよいが、これらに限定されない。TCR誘導体は、改変MELKペプチドを提示する標的細胞と高い結合力で結合することができ、かつ任意で、改変MELKペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺傷をインビボおよびインビトロで媒介する。
MELKの発現は、正常組織と比較して、子宮内膜症、ならびに乳がん、膀胱がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、CML、結腸直腸がん、食道がん、胃がん、肝がん、NSCLC、リンパ腫、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびSCLCを含むがんにおいて特異的に上昇するため、本発明のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを、子宮内膜症およびがんまたは腫瘍の治療および/もしくは予防、ならびに/または術後のその再発の予防に用いることができる。したがって、本発明は、本発明のペプチドまたはそれらのペプチドをコードするポリヌクレオチドの1種または複数種を有効成分として含む、がん、腫瘍、子宮内膜症の治療および/もしくは予防のための、ならびに/または術後のその再発の予防のための薬学的な物質または組成物を提供する。あるいは、薬学的な物質または組成物として用いるために、本発明のペプチドを、前述のエキソソームまたはAPCなどの細胞のいずれかの表面上に発現させることができる。加えて、本発明のペプチドのいずれかを標的とする前述のCTLもまた、本発明の薬学的な物質または組成物の有効成分として用いることができる。
本発明の薬学的な組成物は、ヒト、ならびに非限定的にマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、ヒヒ、およびチンパンジー、特に商業的に重要な動物または家畜を含む任意の他の哺乳動物を含む対象または患者において、がんまたは子宮内膜症を治療および/もしくは予防するため、ならびに/または術後のその再発を予防するために用いることができる。
(a)本発明のペプチド;
(b)本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸;
(c)本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPCまたはエキソソーム;および
(d)本発明の細胞傷害性T細胞。
(a)本発明のペプチド;
(b)本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸;
(c)本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPCまたはエキソソーム;および
(d)本発明の細胞傷害性T細胞。
(a)本発明のペプチド;
(b)本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸;
(c)本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPCまたはエキソソーム;および
(d)本発明の細胞傷害性T細胞。
(a)本発明のペプチド;
(b)本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸;
(c)本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPCまたはエキソソーム;および
(d)本発明の細胞傷害性T細胞。
あるいは、薬学的な組成物または物質または本発明を、がん、腫瘍、または子宮内膜症の予防、および術後のその再発の予防のいずれかまたは両方のために用いてもよい。
本発明の薬学的な物質または組成物は、ヒト、ならびに非限定的にマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、ヒヒ、およびチンパンジー、特に商業的に重要な動物または家畜を含む任意の他の哺乳動物を含む対象または患者において、がん、腫瘍、または子宮内膜症を治療および/もしくは予防するため、ならびに/または術後のその再発を予防するために用いることができる。
必要に応じて、有効成分を含む1つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置にて、薬学的な物質または組成物を提供することができる。該パックは、例えば、ブリスターパックのように金属ホイルまたはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する説明書が添付され得る。
本発明のペプチドは、薬学的な物質または組成物として直接投与してもよく、または必要であれば、従来の製剤化法によって製剤化してもよい。後者の場合、本発明のペプチドに加えて、薬物に通常用いられる担体、賦形剤等が特に制限なく必要に応じて含まれ得る。そのような担体の例は、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液等である。さらに、薬学的な物質または組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、保存剤、界面活性剤等を含み得る。本発明の薬学的な物質または組成物は、抗がん目的に用いることができる。
さらに、リポソーム製剤、直径数マイクロメートルのビーズにペプチドが結合している顆粒製剤、およびペプチドに脂質が結合している製剤を好都合に用いてもよい。
本発明の薬学的な物質または組成物はまた、本明細書に開示するペプチドを発現可能な形態でコードする核酸を含み得る。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞に導入された場合に、抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現することを意味する。例示的な態様において、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、該ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチドには、標的細胞のゲノムへの安定した挿入が達成されるように、必要なものを備えさせることができる(相同組換えカセットベクターの説明に関しては、例えばThomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい)。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8;米国特許第5,580,859号;第5,589,466号;第5,804,566号;第5,739,118号;第5,736,524号;第5,679,647号;およびWO98/04720を参照されたい。DNAに基づく送達技術の例には、「裸のDNA」、促進された(ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性)送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性(「遺伝子銃」)または圧力媒介性の送達が含まれる(例えば、米国特許第5,922,687号を参照されたい)。
ポリヌクレオチドの対象内への送達は、直接的であってもよく、この場合にはポリヌクレオチドを保有するベクターに対象を直接曝露し、または間接的であってもよく、この場合にはまずインビトロで細胞を関心対象のポリヌクレオチドで形質転換し、次いで該細胞を対象内に移植する。これら2つのアプローチはそれぞれ、インビボおよびエクスビボの遺伝子治療として公知である。
本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドを用いて、APCおよびCTLを誘導することができる。本発明のエキソソームおよびAPCを用いて、CTLを誘導することもできる。ペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、およびAPCは、CTL誘導能を他の化合物が阻害しない限り、該化合物と組み合わせて用いることができる。したがって、前述の本発明の薬学的な物質または組成物のいずれかを用いてCTLを誘導することができる。それに加えて、前記ペプチドおよびポリヌクレオチドを含むものを用いて、以下に説明するように、APCを誘導することもできる。
本発明は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、高いCTL誘導能を有するAPCを誘導する方法を提供する。
本発明の方法は、APCを本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階を含む。例えば、APCを該ペプチドとエクスビボで接触させる方法は、以下の段階を含み得る:
a:対象からAPCを回収する段階;および
b:段階aのAPCを該ペプチドと接触させる段階。
APCは特定の種類の細胞に限定されず、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られているDC、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、B細胞、および活性化T細胞を含む。APCの中で最も強力なCTL誘導能であることから、好ましくはDCを用いることができる。本発明の任意のペプチドを単独で、または本発明の他のペプチドと組み合わせて、段階bのペプチドとして用いることができる。
a:対象からAPCを回収する段階;および
b:本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する段階。
段階bは、「VI.抗原提示細胞」の章に上述したように行うことができる。
a:APCを、本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階;および
b:本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階。
本発明はまた、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、またはエキソソーム、またはAPCを用いてCTLを誘導する方法を提供する。
a:HLA抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する抗原提示細胞および/またはエキソソームと、CD8陽性T細胞を接触させる段階;ならびに
b:本発明のペプチドとHLA抗原との複合体を認識するTCRサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをCD8陽性細胞に導入する段階。
本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、APC、またはエキソソームを対象に投与すると、該対象の体内でCTLが誘導され、がん細胞を標的とする免疫応答の強度が増強される。したがって本発明はまた、CTLを誘導するために本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、APC、またはエキソソームを対象に投与する段階を含む方法も企図する。
a:対象からAPCを回収する段階;
b:段階(a)のAPCをペプチドと接触させる段階;および
c:段階(b)のAPCをCD8陽性細胞と共培養する段階。
上記の段階(c)においてCD8陽性細胞と共培養するAPCは、「VI.抗原提示細胞」の章に上述したように、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子をAPCに導入することによって調製することもできるが、本発明はこれに限定されず、HLA抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に効果的に提示するAPCが、本方法に関して使用できる。
さらに、本発明のペプチドに結合するTCRサブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をCD8陽性細胞に導入することによって、CTLを誘導することができる。そのような形質導入は、「VIII.T細胞受容体(TCR)」の章に上述したように行うことができる。
加えて、本発明は、CTLを誘導する薬学的な物質または組成物を製造するための方法または過程であって、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体とともに混合または製剤化する段階を含む方法を提供する。
さらに本発明は、MELKに関連する疾患に対して免疫応答を誘導するための方法を提供する。適切な疾患には子宮内膜症およびがんが含まれ、その例には、乳がん、膀胱がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、CML、結腸直腸がん、食道がん、胃がん、肝がん、NSCLC、リンパ腫、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびSCLCが含まれるが、これらに限定されない。
本方法は、本発明のペプチドのいずれかまたはそれらをコードするポリヌクレオチドのいずれかを含む物質または組成物を投与する段階を含む。本発明の方法はまた、本発明のペプチドのいずれかを提示するエキソソームまたはAPCの投与も企図する。詳細については、「IX.薬学的な物質または組成物」の項、特に本発明の薬学的な物質および組成物のワクチンとしての使用について記載している部分を参照されたい。加えて、免疫応答を誘導するために本発明の方法に使用することができるエキソソームおよびAPCは、上記「V.エキソソーム」、「VI.抗原提示細胞(APC)」、ならびに「X.ペプチド、エキソソーム、APC、およびCTLを用いる方法」の(1)および(2)の項において詳述している。
本方法は、以下を含む本発明のワクチンを投与する段階を含む:
a:1種または複数種の本発明のエピトープペプチドまたはその免疫学的に活性な断片;
b:(a)のエピトープペプチドまたはその免疫学的に活性な断片をコードする1種または複数種のポリペプチド;
c:1種または複数種の本発明の単離されたCTL;または
d:1種または複数種の本発明の単離された抗原提示細胞。
i)治療すべきがんを有する対象から得られたがんもしくは子宮内膜症の細胞または組織中のMELKの発現レベルを決定する段階;
ii)MELKの発現レベルを正常対照と比較する段階;および
iii)上記の(a)〜(d)からなる群より選択される少なくとも1つの成分を、正常対照と比較してMELKを過剰発現するがんまたは子宮内膜症を有する対象に投与する段階。
あるいは本発明はまた、MELKを過剰発現するがんまたは子宮内膜症を有する対象への投与に使用するための、上記の(a)〜(d)からなる群より選択される少なくとも1つの成分を含むワクチンまたは薬学的組成物を提供する。換言すれば、本発明はさらに、本発明のMELKポリペプチドで治療すべき対象を同定するための方法であって、対象由来のがんまたは子宮内膜症の細胞または組織中のMELKの発現レベルを決定する段階を含み得、該レベルが、該遺伝子の正常対照レベルと比較して上昇していることにより、該対象が本発明のMELKポリペプチドで治療され得るがんまたは子宮内膜症を有していることが示される方法を提供する。本発明のがんまたは子宮内膜症を治療する方法を、以下、より詳細に説明する。
本発明の方法によって治療すべき対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれるが、これらに限定されない。
さらに、増幅に基づく検出法(例えば、RT−PCR)によりプライマーを用いて、MELK(SEQ ID NO:46)の転写産物を定量してもよい。そのようなプライマーはまた、該遺伝子の入手可能な配列情報に基づいて調製してもよい。
プローブまたはプライマーは特定のサイズのものであってよい。サイズは少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも12ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチドの範囲であってよく、プローブおよびプライマーのサイズは5〜10ヌクレオチド、10〜15ヌクレオチド、15〜20ヌクレオチド、20〜25ヌクレオチド、および25〜30ヌクレオチドの範囲にわたってよい。
MELK遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出する別の方法として、MELKタンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学的解析により、染色の強度を測定してもよい。すなわちこの測定では、強力な染色により、該タンパク質の存在/レベルの増加が示され、それと同時にMELK遺伝子の高発現レベルが示される。
がんまたは子宮内膜症の細胞における、例えばMELK遺伝子を含む標的遺伝子の発現レベルは、そのレベルが、標的遺伝子の対照レベル(例えば、正常細胞中のレベル)から例えば10%、25%、もしくは50%上昇するか;または1.1倍超、1.5倍超、2.0倍超、5.0倍超、10.0倍超、もしくはそれ以上まで上昇する場合に、上昇していると判定され得る。
MELK遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇しているか、または罹患対照レベルと類似している/同等である場合、該対象は治療すべき疾患を有すると診断され得る。
a:治療すべきがんまたは子宮内膜症を有する疑いのある対象から得られたがん細胞または組織中のMELKの発現レベルを決定する段階;
b:MELKの発現レベルを正常対照レベルと比較する段階;
c:MELKの発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合に、該対象を治療すべきがんまたは子宮内膜症を有すると診断する段階;および
d:段階(c)において対象が治療すべきがんまたは子宮内膜症を有すると診断される場合に、がんまたは子宮内膜症治療のために該対象を選択する段階。
a:治療すべきがんを有する疑いのある対象から得られたがんもしくは子宮内膜症の細胞または組織中のMELKの発現レベルを決定する段階;
b:MELKの発現レベルを罹患対照レベルと比較する段階;
c:MELKの発現レベルが罹患対照レベルと類似しているか、または同等である場合に、該対象を治療すべきがんもしくは子宮内膜症を有すると診断する段階;および
d:段階(c)において対象が治療すべきがんもしくは子宮内膜症を有すると診断される場合に、がんもしくは子宮内膜症の治療のために該対象を選択する段階。
(a)MELK遺伝子のmRNAを検出するための試薬;
(b)MELKタンパク質を検出するための試薬;および
(c)MELKタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
一態様において、本発明はさらに、本発明の抗体またはその断片を特異的に認識することができるタンパク質またはその部分タンパク質を含む診断キットを提供する。
抗MELK抗体の量と、上記のような対応する対照試料中の抗MELK抗体の量との差を測定することにより、本発明のがんまたは子宮内膜症を診断する方法を実施することができる。対象の細胞または組織が該遺伝子の発現産物(MELK)に対する抗体を含み、この抗MELK抗体の量が正常対照中の抗MELK抗体の量と比較してカットオフ値のレベルよりも高いと判定される場合に、該対象ががんまたは子宮内膜症に罹患していることが疑われる。
詳細には、公知の方法に従って(例えば、Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6を参照されたい)、放射標識HLA分子と本発明のペプチドとのオリゴマー複合体、例えば四量体などを調製することができる。この複合体を用いて、例えば、がんに罹患している疑いのある対象に由来する末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的CTLを定量することにより、診断を行うことができる。
例えば、いくつかの態様において、本発明は、本発明のMELKペプチドの少なくとも1つを投与された対象の免疫学的応答を診断または評価するための方法を提供し、該方法は以下の段階を含む:
a:免疫原を、該免疫原に対して特異的なCTLの誘導に適した条件下で免疫担当細胞と接触させる段階;
b:段階(a)で誘導されたCTLの誘導レベルを検出または決定する段階;および
c:対象の免疫学的応答をCTL誘導レベルと相関させる段階。
本発明によれば、免疫原特異的CTLの誘導が対照と比較して増強されていることにより、評価または診断される対象が、投与された免疫原に対して免疫学的に応答したことが示される。免疫学的応答を評価するのに適した対照には、例えば、免疫担当細胞をペプチドと接触させていない場合の、またはいかなるMELKペプチドとも異なるアミノ酸配列(例えば、ランダムなアミノ酸配列)を有する対照ペプチドと接触させている場合の、CTL誘導レベルが含まれる。
本発明はさらに、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。好ましい抗体は本発明のペプチドに特異的に結合し、本発明のペプチドではないものには結合しない(または弱く結合する)。あるいは、抗体は本発明のペプチドおよびその相同体に結合する。本発明のペプチドに対する抗体は、がんまたは子宮内膜症の診断および予後診断のアッセイ、ならびに画像化方法論において使用され得る。同様に、そのような抗体は、MELKががんもしくは子宮内膜症患者において同じく発現または過剰発現する限り、他のがんもしくは子宮内膜症の治療、診断、および/または予後診断において使用され得る。さらに、細胞内で発現する抗体(例えば、一本鎖抗体)は、MELKの発現が関与する子宮内膜症またはがんの治療において治療的に使用することができ、そのようながんの例には、乳がん、膀胱がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、CML、結腸直腸がん、食道がん、胃がん、肝がん、NSCLC、リンパ腫、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびSCLCが含まれるが、これらに限定されない。
抗体を得るための抗原として用いられる本発明のペプチドは、任意の動物種に由来し得るが、好ましくはヒト、マウス、またはラットなどの哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。ヒト由来のペプチドは、本明細書に開示するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から得ることができる。
本発明によれば、免疫抗原として用いられるペプチドは、完全なタンパク質または該タンパク質の部分ペプチドであってよい。部分ペプチドは、例えば、本発明のペプチドのアミノ(N)末端断片またはカルボキシ(C)末端断片を含み得る。
あるいは、本発明のペプチドまたはその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクターに挿入することができ、次にこれを用いて本明細書に記載のように宿主細胞を形質転換する。所望のペプチドまたはその断片を、任意の標準的な方法により宿主細胞の外部または内部から回収することができ、後にこれを抗原として用いることができる。あるいは、ペプチドを発現する細胞全体もしくはそれらの溶解物、または化学合成したペプチドを抗原として用いてもよい。
モノクローナル抗体を調製するには、抗原で免疫した哺乳動物から免疫細胞を回収し、上記のように血清中の所望の抗体のレベル上昇について確かめた上で、細胞融合に供する。細胞融合に用いる免疫細胞は、好ましくは脾臓から得ることができる。上記の免疫細胞と融合させる別の好ましい親細胞には、例えば、哺乳動物の骨髄腫細胞、およびより好ましくは薬物による融合細胞の選択のための特性を獲得した骨髄腫細胞が含まれる。
細胞融合によって結果として得られたハイブリドーマは、それらをHAT培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地)などの標準的な選択培地中で培養することによって選択することができる。細胞培養は典型的に、HAT培地中で、所望のハイブリドーマを除く他のすべての細胞(非融合細胞)が死滅するのに十分な期間である数日間から数週間にわたって継続する。その後、標準的な限界希釈を行い、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよびクローニングすることができる。
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子操作技法を用いて組換えにより調製することもできる(例えば、MacMillan Publishers LTD (1990)により英国で刊行された、Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodiesを参照されたい)。例えば、抗体をコードするDNAを、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、適切なベクターに挿入した上で、宿主細胞に導入して、組換え抗体を調製することができる。本発明はまた、上記のようにして調製された組換え抗体を提供する。
抗体は、ポリエチレングリコール(PEG)などの様々な分子との結合によって修飾することができる。本発明は、そのような修飾抗体を提供する。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。これらの修飾法は、当技術分野で慣例的である。
例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、酵素免疫測定法(EIA)、放射免疫測定法(RIA)、および/または免疫蛍光法を用いて、本発明の抗体の抗原結合活性を測定することができる。ELISAの場合、本発明の抗体をプレート上に固定化し、本発明のペプチドを該プレートに添加し、次に抗体産生細胞の培養上清または精製抗体といった所望の抗体を含む試料を添加する。次いで、一次抗体を認識し、アルカリホスファターゼなどの酵素で標識された二次抗体を添加し、プレートをインキュベートする。続いて洗浄後に、p−ニトロフェニルリン酸などの酵素基質を該プレートに添加し、吸光度を測定して、試料の抗原結合活性を評価する。抗体の結合活性を評価するために、C末端またはN末端断片などのペプチド断片を抗原として用いてもよい。本発明の抗体の活性を評価するために、BIAcore(Pharmacia)を用いてもよい。
本発明によるペプチドを検出または測定する方法はペプチドを特異的に検出または測定することができるため、この方法は、該ペプチドを使用する種々の実験において使用され得る。
本発明はまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチドが導入されたベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明のベクターは、宿主細胞中に本発明のヌクレオチド、特にDNAを保持するため、本発明のペプチドを発現させるため、または遺伝子治療用に本発明のヌクレオチドを投与するために使用することができる。
細胞株
ヒト白血球抗原(HLA)−A*2402陽性Bリンパ芽球様細胞株であるTISIは、IHWG Cell and Gene Bank(Seattle, WA)から購入した。COS7、MDA−MB−435S、およびT47Dは、ATCCから購入した。KLM−1およびKP−1Nはそれぞれ、RIKEN細胞バンクおよびJCRB細胞バンクから購入した。
HLA−A*2402分子と結合するMELK由来の9merおよび10merペプチドを、結合予測ソフトウエア「BIMAS」(www−bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind)を用いて予測した。このアルゴリズムは、Parker KC et al.(J Immunol 1994, 152(1): 163-75)、およびKuzushima K et al.(Blood 2001, 98(6): 1872-81)によって記載されている。HLA−A*2402拘束性のHIVペプチド(RYLRQQLLGI(SEQ ID NO:48))を、対照として使用した。これらのペプチドは、Biosynthesis Inc.(Lewisville, TX)により、標準的な固相合成法によって合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって精製した。該ペプチドの純度(>90%)および同一性を、それぞれ分析用HPLCおよび質量分析によって決定した。ペプチドをジメチルスルホキシド(DMSO)に20mg/mlで溶解し、−80℃で保存した。
単球由来の樹状細胞(DC)を抗原提示細胞(APC)として用いて、HLA上に提示されたペプチドに対する細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を誘導した。他所に記載されているように、DCをインビトロで作製した(Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8)。具体的には、Ficoll−Plaque(Pharmacia)溶液によって、ドナーA、B、およびCと命名された3名の健常ドナー(HLA−A*2402陽性)から単離した末梢血単核細胞(PBMC)を、プラスチック製の組織培養ディッシュ(Becton Dickinson)へ付着させることによって分離し、それらを単球画分として濃縮した。2%の加熱非動化した自己血清(AS)を含むAIM−V培地(Invitrogen)中、1000U/mlの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)(R&D System)および1000U/mlのインターロイキン(IL)−4(R&D System)の存在下で、単球が濃縮された集団を培養した。7日間の培養後、サイトカインで誘導したDCに、AIM−V培地中で37℃で3時間、3μg/mlのβ2−ミクログロブリンの存在下で20μg/mlの各合成ペプチドをパルスした。作製された細胞は、自身の細胞表面上に、CD80、CD83、CD86、およびHLAクラスIIなどのDC関連分子を発現しているようであった(データは示さず)。次いで、ペプチドパルスしたこれらのDCをX線照射(20Gy)により不活化し、CD8 Positive Isolation Kit(Dynal)を用いた陽性選択によって得られた自己CD8+T細胞と1:20の比率で混合した。これらの培養物を48ウェルプレート(Corning)中に準備し、各ウェルは、0.5mlのAIM−V/2%AS培地中に、1.5×104個のペプチドパルスしたDC、3×105個のCD8+T細胞、および10ng/mlのIL−7(R&D System)を含んだ。3日後、これらの培養物に、IL−2(CHIRON)を最終濃度20IU/mlまで添加した。7日目および14日目に、ペプチドパルスした自己DCでT細胞をさらに刺激した。
DCは上記と同じ方法によって毎回調製した。21日目に、3回目のペプチド刺激後、ペプチドパルスしたA24 LCL細胞に対してCTLを試験した(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9;Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7;Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86;Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9;Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506)。
Riddellら(Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44;Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23)によって記載されている方法と類似の方法を用いて、CTLを培養下で増殖させた。40ng/mlの抗CD3モノクローナル抗体(Pharmingen)の存在下で、MMCによって不活化した2種類のヒトBリンパ芽球様細胞株と共に、合計5×104個のCTLを25mlのAIM−V/5%AS培地中に懸濁した。培養開始1日後に、120IU/mlのIL−2を該培養物に添加した。5、8、および11日目に、30IU/mlのIL−2を含む新たなAIM−V/5%AS培地を、該培養物に供給した(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9;Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7;Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86;Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9;Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506)。
96丸底マイクロタイタープレート(Nalge Nunc International)においてCTL0.3個、1個、および3個/ウェルとなるように、希釈を行った。CTLを、1×104個細胞/ウェルの2種類のヒトBリンパ芽球様細胞株、30ng/mlの抗CD3抗体、および125U/mlのIL−2と共に、合計150μl/ウェルの5%AS含有AIM−V培地中で培養した。10日後、50μl/ウェルのIL−2を、IL−2の最終濃度が125U/mlに到達するように該培地に添加した。14日目にCTL活性を試験し、上記と同じ方法を用いてCTLクローンを増殖させた(Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86;Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9;Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506)。
特異的CTL活性を調べるために、インターフェロン(IFN)−γ酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイおよびIFN−γ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を行った。具体的には、ペプチドパルスしたA24 LCL(1×104個/ウェル)および腫瘍細胞株(5×104個/ウェル)を刺激細胞として調製した。48ウェル中の培養細胞、すなわちCTL株およびクローンを、応答細胞として使用した。IFN−γ ELISPOTアッセイおよびIFN−γ ELISAアッセイは、製造業者の手順に従って行った。
標的遺伝子、またはHLA−A*2402のオープンリーディングフレームをコードするcDNAをPCRによって増幅した。PCR増幅産物をpCAGGSベクターにクローニングした。製造業者の推奨する手順に従ってリポフェクタミン2000(Invitrogen)を用いて、標的遺伝子およびHLA−A24陰性細胞株であるCOS7に該プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから2日後、トランスフェクトした細胞をベルセン(Invitrogen)を用いて回収し、CTL活性アッセイのための刺激細胞(5×104個細胞/ウェル)として使用した。
HLA−クラスI拘束性のCTL活性を確認するため、刺激細胞を、10μg/mlの抗HLAクラスIモノクローナル抗体W6/32(BioLegend)または標準マウスIgG(Santa Cruz Biotechnology)と共に4℃で30分間インキュベートした。処理細胞を刺激物質として用いて、CTL活性を調べた。
MELK由来のHLA−A24結合ペプチドの予測
表1Aおよび1Bは、MELKに由来する9merおよび10merのHLA−A24結合ペプチドを、結合親和性の高い順に示す。潜在的なHLA−A24結合能を有する合計34種類のペプチドを選択し、エピトープペプチドを決定するために調べた。
MELK由来のペプチドに対するドナーAのPBMC由来のCTLを、「材料および方法」に記載したプロトコールに従って作製した。IFN−γ ELISPOTアッセイによって、ペプチド特異的なCTL活性を測定した(図1)。以下のウェル番号は、対照ウェルと比較して強力なIFN−γ産生を示した:MELK−A24−9−87 (SEQ ID NO:6)で刺激したウェル番号#2 (a)、MELK−A24−10−637 (SEQ ID NO:23)で刺激した#1および#3 (b)、MELK−A24−9−199 (SEQ ID NO:1)で刺激した#8 (d)、ならびにMELK−A24−9−78 (SEQ ID NO:21)で刺激した#4 (e)は、対照ウェルと比較して強力なIFN−γ産生を示した。一方、表1に示した他のペプチドはHLA−A*2402との結合活性を有すると考えられたにもかかわらず、該ペプチドによる刺激によって強力なIFNγ産生は検出され得なかった。例えば、MELK−A24−9−96 (SEQ ID NO:2)で刺激したCTL応答の典型的な陰性データを図1に示した(c)。結果として、これにより、MELK由来の4種のペプチドが、強力なCTLを誘導し得るペプチドとしてスクリーニングされたことが示された。
MELK−A24−9−87 (SEQ ID NO:6)で刺激したウェル番号#2、およびMELK−A24−10−637 (SEQ ID NO:23)で刺激した#3中の、IFN−γ ELISPOTアッセイによって検出されるペプチド特異的CTL活性を示した細胞を増殖させ、CTL株を樹立した。それらのCTL株のCTL活性を、IFN−γ ELISAアッセイによって測定した(図2)。すべてのCTL株が、ペプチドをパルスしなかった標的細胞と比較して、MELK−A24−9−87 (SEQ ID NO:6) (a)、MELK−A24−10−637 (SEQ ID NO:23) (b)、およびMELK−A24−9−199 (SEQ ID NO:1) (c)をパルスした標的細胞に対して強力なIFN−γ産生を示した。さらに、「材料および方法」に記載したように、CTL株を希釈し培養して、CTLクローンを樹立した。同族ペプチドをパルスした標的細胞に対するCTLクローンからのIFN−γ産生を、IFN−γ ELISAアッセイによって測定した。図3において、MELK−A24−9−87 (SEQ ID NO:6)およびMELK−A24−9−199 (SEQ ID NO:1)で刺激したCTLクローンから、強力なIFN−γ産生が測定された。
MELK−A24−9−87 (SEQ ID NO:6)に対して産生された樹立CTLクローンを、MELKおよびHLA−A*2402を発現する標的細胞を認識するそれらの能力について調べた。MELKの全長およびHLA−A*2402を両方ともトランスフェクトしたCOS7細胞(MELKおよびHLA−A*2402を発現する標的細胞の特異的モデル)に対する特異的CTL活性を、MELK−A24−9−87 (SEQ ID NO:6)で刺激したCTLクローンを用いて試験した。MELKの全長またはHLA−A*2402のいずれかをトランスフェクトしたCOS7細胞を対照として調製した。図4において、MELK−A24−9−87 (SEQ ID NO:6)で刺激したCTLクローンは、MELKおよびHLA− A*2402を両方とも発現するCOS7細胞に対して強力なCTL活性を示した。一方、対照に対して有意な特異的CTL活性は検出されなかった。したがって、これらのデータにより、MELK−A24−9−87 (SEQ ID NO:6)のペプチドが内因的にプロセシングされ、HLA−A*2402分子と共に標的細胞上に提示され、CTLによって認識されることが明確に実証された。
続いて、本発明者らは、野生型MELK−A24−9−87 (MELK−A24−9−87_WT) (SEQ ID NO:6)よりも効率的にMELK−A24−9−87特異的CTLを誘導する潜在的能力を有する、MELK−A24−9−87 (SEQ ID NO:6)からアミノ酸残基を1つ置換する改変ペプチドを調べた。表2は、MELK−A24−9−87_WT (SEQ ID NO:6)の配列が改変された候補ペプチドを、結合親和性の高い順に示す。MELK−A24−9−87_WT (SEQ ID NO:6)と比較してより高い結合能を有すると予測された合計11種類のペプチドを選択し、免疫原性を調べた。
表2中の改変ペプチドに対して反応性のあるCTLを、「材料および方法」に記載したプロトコールに従って作製した。IFN−γ ELISPOTアッセイによって、ペプチド特異的なCTL活性を測定した。図5Aは、ドナーBのPBMCから誘導されたCTLにおけるIFN−γ ELISPOTアッセイの結果を示す。以下のウェル番号は、対照ウェルと比較して強力なIFN−γ産生を示した:MELK−A24−9−87_1K (SEQ ID NO:35)で刺激したウェル番号#1、#3、および#12 (a)、MELK−A24−9−87_3M (SEQ ID NO:41)で刺激した#2 (b)、ならびにMELK−A24−9−87_7N (SEQ ID NO:44)で刺激した#10および#12 (c)。一方、MELK−A24−9−87_WT (SEQ ID NO:6) (d)で刺激したPBMCからは、特異的IFN−γ産生は検出されなかった。
これらの結果から、MELK−A24−9−87_1K (SEQ ID NO:35)、MELK−A24−9−87_3M (SEQ ID NO:41)、およびMELK−A24−9−87_7N (SEQ ID NO:44)が、MELK−A24−9−87_WT (SEQ ID NO:6)と比較して優れた免疫原性を有することが示された。
IFN−γ ELISPOTアッセイによって検出されるペプチド特異的CTL活性を示した、ドナーB由来の、MELK−A24−9−87_1K (SEQ ID NO:35)で刺激したウェル番号#1、MELK−A24−9−87_3M (SEQ ID NO:41)で刺激した#2、およびMELK−A24−9−87_7N (SEQ ID NO:44)で刺激した#12の細胞、ならびにドナーC由来の、MELK−A24−9−87_7N (SEQ ID NO:44)で刺激した#14の細胞、を増殖させて、CTL株を樹立した。微量なIFN−γ産生を示した、MELK−A24−9−87_WT (SEQ ID NO:6)で刺激したウェル番号#4中の細胞もまた増殖させた。
これら2名のドナーのCTL誘導の結果をまとめると、これにより、MELK−A24−9−87_1K (SEQ ID NO:35)、MELK−A24−9−87_3M (SEQ ID NO:41)、およびMELK−A24−9−87_7N (SEQ ID NO:44)が、MELK−A24−9−87_WT (SEQ ID NO:6)と比較して、強力なMELK−A24−9−87反応性CTLを誘導するための優れた免疫原性を有することが実証された。
樹立されたCTL株およびCTLクローンを、MELKおよびHLA−A*2402を発現する標的細胞を認識するそれらの能力について調べた。図8aにおいて、MELK−A24−9−87_7N (SEQ ID NO:44)で刺激したCTL株は、T47D(MELK+、A24−)およびKP−1N(MELK+、A24−)に対してはCTL活性を示すことなく、腫瘍細胞株MDA−MB−435S(MELK+、A24+)およびKLM−1(MELK+、A24+)に対して強力なCTL活性を示した。このCTL活性がHLA−クラスI拘束性様式で生じたことを確認するため、CTLの抗原特異的応答を阻止するために抗HLA−クラスIモノクローナル抗体を用いて、阻害アッセイを行った。図8bにおいて、KLM−1(MELK+、A24+)に対するCTLのIFN−γ産生は、標準マウスIgGと比較して、抗HLA−クラスIモノクローナル抗体によって完全に阻害された。これらの結果から、MELK−A24−9−87_7N (SEQ ID NO:44)を用いて誘導されたCTLが、HLA−A*2402分子と共に標的細胞上に天然に提示されたMELKエピトープペプチドをHLA−クラスI拘束性様式で認識し得ることが明らかに実証された。典型的な陰性データとして、図9は、MELK−A24−9−199 (SEQ ID NO:1)をパルスした標的細胞(a)、ならびに腫瘍細胞株KLM−1(MELK+、A24+)およびKP−1N(MELK+、A24−)(b)に対するMELK−A24−9−199 (SEQ ID NO:1)特異的CTLクローンのIFN−γ産生を示す。MELK−A24−9−199 (SEQ ID NO:1)特異的CTLクローンは、該ペプチドをパルスした標的細胞を認識する能力を有したが、これは腫瘍細胞株KLM−1(MELK+、A24+)に対してIFN−γ産生を示さなかった。これらの結果から、MELK−A24−9−199 (SEQ ID NO:1)は、MELKを発現する腫瘍細胞上に天然に提示されないことが示唆された。
MELK−A24−9−87 (SEQ ID NO:6)、MELK−A24−10−637 (SEQ ID NO:23)、MELK−A24−9−87_1K (SEQ ID NO:35)、MELK−A24−9−87_3M (SEQ ID NO:41)、およびMELK−A24−9−87_7N (SEQ ID NO:44)で刺激したCTLは、有意でかつ特異的なCTL活性を示した。この結果は、MELK−A24−9−87 (SEQ ID NO:6)、MELK−A24−10−637 (SEQ ID NO:23)、MELK−A24−9−87_1K (SEQ ID NO:35)、MELK−A24−9−87_3M (SEQ ID NO:41)、およびMELK−A24−9−87_7N (SEQ ID NO:44)の配列が、ヒト免疫系を感作することが知られている他の分子に由来するペプチドと相同的であるという事実に起因する可能性がある。この可能性を排除するため、BLASTアルゴリズム(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)を用いて、これらのペプチド配列をクエリーとして相同性解析を行ったが、有意な相同性を有する配列は認められなかった。相同性解析の結果から、MELK−A24−9−87 (SEQ ID NO:6)、MELK−A24−10−637 (SEQ ID NO:23)、MELK−A24−9−87_1K (SEQ ID NO:35)、MELK−A24−9−87_3M (SEQ ID NO:41)、およびMELK−A24−9−87_7N (SEQ ID NO:44)の配列は固有のものであり、したがって、本発明者らの知る限りでは、これらの分子が、ある非関連分子に対して予期しない免疫応答を引き起こす可能性はほとんどないことが示される。
結論として、MELK由来のMELK−A24−9−87 (SEQ ID NO:6)の改変配列を有する新規エピトープペプチドが同定された。本明細書に示される結果から、MELK−A24−9−87 (SEQ ID NO:6)からの改変ペプチドであるMELK−A24−9−87_7N (SEQ ID NO:44)が、MELK−A24−9−87 (SEQ ID NO:6)と比較して、MELK発現標的細胞を認識し、強力なCTL活性を示すCTLを効率的に誘導することが実証された。
本発明は、強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し、がんを含む幅広い疾患に対する適用性を有する新規TAA、特に改変MELKペプチド由来の新規TAAについて記載する。このようなTAAは、MELK過剰発現に関連した疾患、例えば子宮内膜症またはがん、より詳細には乳がん、膀胱がん、子宮頸がん、胆管細胞がん、CML、結腸直腸がん、食道がん、胃がん、肝がん、NSCLC、リンパ腫、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、腎がん、およびSCLCに対するペプチドワクチンとして有用である。
Claims (14)
- 細胞傷害性Tリンパ球(CTL)誘導能を有する単離されたペプチドであって、SEQ ID NO:6のアミノ酸配列中の、以下(a)〜(c):
(a) C末端から3番目のアミノ酸における、EからNへのアミノ酸置換、
(b) N末端アミノ酸における、EからKへのアミノ酸置換、および
(c) N末端から3番目のアミノ酸における、CからMへのアミノ酸置換
からなる群より選択される1つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列からなる、単離されたペプチド。 - SEQ ID NO:44のアミノ酸配列からなる、請求項1記載の単離されたペプチド。
- 細胞傷害性Tリンパ球(CTL)誘導能を有する単離されたペプチドであって、SEQ ID NO:44、35および41からなる群より選択されるアミノ酸配列中の1個または2個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含み、該置換が、
(a) SEQ ID NO:44、35または41のアミノ酸配列のN末端から2番目のアミノ酸の、フェニルアラニン、メチオニン、およびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸への置換;ならびに
(b) SEQ ID NO:44、35または41のアミノ酸配列のC末端アミノ酸の、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、およびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸への置換
の一方または両方である、15アミノ酸未満の単離されたペプチド。 - 請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- CTLを誘導するための組成物であって、請求項1〜3のいずれか一項記載の1つもしくは複数のペプチドまたは請求項4記載の1つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、組成物。
- がんもしくは子宮内膜症の治療および/もしくは予防、ならびに/または術後のその再発の予防のための薬学的組成物であって、請求項1〜3のいずれか一項記載の1つもしくは複数のペプチドまたは請求項4記載の1つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、薬学的組成物。
- HLA抗原がHLA−A24である対象に投与するために製剤化される、請求項6記載の薬学的組成物。
- がんまたは子宮内膜症を治療するために製剤化される、請求項6または7記載の薬学的組成物。
- CTL誘導能を有する抗原提示細胞(APC)を誘導するためのインビトロの方法であって、以下:
(a) APCを請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドとインビトロで接触させる段階;および
(b) 請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階
の1つを含む、方法。 - 以下:
(a) HLA抗原と請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドとの複合体をその表面上に提示するAPCと、CD8陽性T細胞を共培養する段階;
(b) HLA抗原と請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドとの複合体をその表面上に提示するエキソソームと、CD8陽性T細胞を共培養する段階;および
(c) 請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドに結合するT細胞受容体(TCR)サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをT細胞に導入する段階
の少なくとも1つを含む方法のいずれかによって、CTLを誘導するためのインビトロの方法。 - HLA抗原と請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドとの複合体をその表面上に提示する、単離されたAPC。
- 請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドを標的とする、単離されたCTL。
- 対象においてがんまたは子宮内膜症に対する免疫応答を誘導するための組成物であって、請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチド、または該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物。
- 請求項1〜3のいずれか一項記載の1つもしくは複数のペプチド、または請求項4記載の1つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、抗原提示細胞誘導剤。
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