JP5799394B2 - Neil3ペプチドおよびそれを含むワクチン - Google Patents
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Description
本発明は、生物科学の分野、より具体的にはがん治療の分野に関連する。特に本発明は、がんワクチンとして極めて有効な新規ペプチド、ならびに腫瘍を治療および予防するための薬物に関連する。
強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導する新規TAAの同定により、様々な種類のがんにおけるペプチドワクチン接種戦略のさらなる発展および臨床的適用が保証される(非特許文献3/Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55;非特許文献4/Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42;非特許文献5/Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9;非特許文献6/van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14;非特許文献7/Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8;非特許文献8/Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72;非特許文献9/Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66;非特許文献10/Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94)。これまでに、これらの腫瘍関連抗原由来ペプチドを用いた臨床試験がいくつか報告されている。残念ながらこれまでのところ、これらのがんワクチン試験では低い客観的奏功率しか観察できていない(非特許文献11/Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80;非特許文献12/Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42;非特許文献13/Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15)。
その一方で、NeiエンドヌクレアーゼVIII様3(Nei endonuclease VIII-like 3: NEIL3)は、細菌Fpg/Neiファミリーと相同であるDNAグリコシラーゼのクラスに属するメンバーとして単離されている(非特許文献14/Bandaru et al., DNA Repair (Amst). 2002 Jul 17;1(7):517-29)。これらのグリコシラーゼは、活性酸素種によって損傷を受けた塩基を切断し、関連リアーゼ反応を介してDNA鎖切断を導入することにより、塩基除去修復の第1段階を開始する。NEIL3はDNA修復機構において役割を果たす可能性があるが、発がんとのその関連性は解明されていない。
さらに本発明は、本発明の任意のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドは、本発明のペプチドと同様に、CTL誘導能を有するAPCを誘導もしくは調製するために、またはがんに対する免疫応答を誘導するために対象に投与するために、用いることができる。
本発明はまた、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、NSCLC、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、SCLC、軟部組織腫瘍、AML、およびCMLなどの癌を含むがこれらに限定されないがんを診断する方法も提供する。
本発明は、癌などの、NEIL3過剰発現に関連する任意の疾患に適用することができ、例示的な癌には、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、NSCLC、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、SCLC、軟部組織腫瘍、AML、およびCMLが含まれる。
[本発明1001]
HLA抗原に結合し、かつ細胞傷害性Tリンパ球(CTL)誘導能を有する、単離されたペプチドであって、SEQ ID NO:45のアミノ酸配列またはその免疫学的活性断片からなる、単離されたペプチド。
[本発明1002]
HLA抗原がHLA−A2である、本発明1001の単離されたペプチド。
[本発明1003]
SEQ ID NO:3、4、5、6、11、15、17、21、および22からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1001または1002の単離されたペプチド。
[本発明1004]
1個、2個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、または付加された、SEQ ID NO:3、4、5、6、11、15、17、21、および22からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、本発明1001、1002、および1003のいずれかの単離されたペプチド。
[本発明1005]
以下の特徴の一方または両方を有する、SEQ ID NO:3、4、5、6、11、15、17、21、および22からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、本発明1004の単離されたペプチド:
(a)N末端から2番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選択される;ならびに
(b)C末端のアミノ酸が、バリンおよびロイシンからなる群より選択される。
[本発明1006]
HLA抗原がHLA−A24である、本発明1001の単離されたペプチド。
[本発明1007]
SEQ ID NO:24、33、35、41、および43からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1001または1006の単離されたペプチド。
[本発明1008]
1個、2個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、または付加された、SEQ ID NO:24、33、35、41、および43からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、本発明1001、1006、および1007のいずれかの単離されたペプチド。
[本発明1009]
以下の特徴の一方または両方を有する、SEQ ID NO:24、33、35、41、および43からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、本発明1008の単離されたペプチド:
(a)N末端から2番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、およびトリプトファンからなる群より選択される;ならびに
(b)C末端のアミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、およびメチオニンからなる群より選択される。
[本発明1010]
ノナペプチドまたはデカペプチドである、本発明1001〜1009のいずれかの単離されたペプチド。
[本発明1011]
本発明1001〜1010のいずれかのペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1012]
CTLを誘導するための組成物であって、本発明1001〜1010のいずれかの1種もしくは複数種のペプチド、または本発明1011の1種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、組成物。
[本発明1013]
がんの治療および/もしくは予防、ならびに/またはその術後再発の防止のための薬学的組成物であって、本発明1001〜1010のいずれかの1種もしくは複数種のペプチド、または本発明1011の1種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、薬学的組成物。
[本発明1014]
HLA−A24またはHLA−A2であるHLA抗原を有する対象への投与が意図される、本発明1013の薬学的組成物。
[本発明1015]
がんを治療することが意図される、本発明1013または1014の薬学的組成物。
[本発明1016]
以下からなる群より選択される1つの段階を含む、CTL誘導能を有する抗原提示細胞(APC)を誘導するための方法:
(a)APCを本発明1001〜1010のいずれかのペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階、および
(b)本発明1001〜1010のいずれかのペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階。
[本発明1017]
以下からなる群より選択される1つの段階を含む方法によって、CTLを誘導するための方法:
(a)CD8陽性T細胞を、HLA抗原と本発明1001〜1010のいずれかのペプチドとの複合体をその表面上に提示するAPCと共培養する段階;
(b)CD8陽性T細胞を、HLA抗原と本発明1001〜1010のいずれかのペプチドとの複合体をその表面上に提示するエキソソームと共培養する段階;および
(c)本発明1001〜1010のいずれかのペプチドに結合するT細胞受容体(TCR)サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をT細胞に導入する段階。
[本発明1018]
HLA抗原と本発明1001〜1010のいずれかのペプチドとの複合体をその表面上に提示する、単離されたAPC。
[本発明1019]
本発明1016の方法によって誘導される、本発明1018のAPC。
[本発明1020]
本発明1001〜1010のいずれかのペプチドのいずれかを標的とする、単離されたCTL。
[本発明1021]
本発明1017の方法によって誘導される、本発明1020のCTL。
[本発明1022]
本発明1001〜1010のいずれかのペプチド、その免疫学的活性断片、または該ペプチドもしくは該断片をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を、対象に投与する段階を含む、対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法。
[本発明1023]
本発明1001〜1010のいずれかのペプチドのいずれかおよびHLA抗原を含む複合体を提示する、エキソソーム。
[本発明1024]
本発明1001〜1010のいずれかのペプチドのいずれかに対する抗体またはその断片。
[本発明1025]
本発明1001〜1010のいずれかのペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
[本発明1026]
本発明1025の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
[本発明1027]
本発明1001〜1010のいずれかのペプチドのいずれか、本発明1011のヌクレオチド、または本発明1024の抗体を含む診断キット。
[本発明1028]
以下の段階を含む、がんを診断するための方法:
(a)(i)NEIL3の配列を含むmRNAを検出すること、
(ii)NEIL3のアミノ酸配列を含むタンパク質を検出すること、および
(iii)NEIL3のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性を検出すること
からなる群より選択される方法のいずれか1つにより、対象由来の生物学的試料中のNEIL3遺伝子の発現レベルを測定する段階;ならびに
(b)該遺伝子の正常対照レベルと比較した、段階(a)で測定された発現レベルの上昇を、がんの存在と相関させる段階。
[本発明1029]
段階(a)で測定された発現レベルが正常対照レベルよりも少なくとも10%高い、本発明1028の方法。
[本発明1030]
がんが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、NSCLC、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、SCLC、軟部組織腫瘍、AML、およびCMLの群より選択される、本発明1028の方法。
[本発明1031]
段階(a)で測定される発現レベルを、前記遺伝子の遺伝子転写産物に対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することにより測定する、本発明1028の方法。
[本発明1032]
段階(a)で測定される発現レベルを、NEIL3のタンパク質に対する抗体の結合を検出することにより測定する、本発明1028の方法。
[本発明1033]
対象由来の生物学的試料が生検標本、痰、血液、胸水、または尿を含む、本発明1028の方法。
[本発明1034]
NEIL3遺伝子が、SEQ ID NO:45に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、本発明1028の方法。
[本発明1035]
NEIL3のアミノ酸がSEQ ID NO:45である、本発明1028の方法。
[本発明1036]
NEIL3の転写産物または翻訳産物と結合する検出試薬を含む、キット。
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等な任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料をここに記載する。しかしながら、本材料および方法について記載する前に、本明細書に記載の特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣行的な実験法および/または最適化に従って変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載に使用する専門用語は特定の型または態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも、同様に理解されるべきである。
本明細書で用いる「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」という単語は、特に他に具体的に指示がない限り「少なくとも1つ」を意味する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、1個または複数個のアミノ酸残基が修飾された残基であり得るかまたは対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基であり得るアミノ酸ポリマーと、天然アミノ酸ポリマーとに適用される。
アミノ酸は、本明細書において、IUPAC−IUB生化学命名法委員会(Biochemical Nomenclature Commission)の推奨する、一般に公知の3文字表記または1文字表記により参照されてもよい。
特記しない限り、「がん」という用語はNEIL3遺伝子を過剰発現しているがんを指し、その例には、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、NSCLC、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、SCLC、軟部組織腫瘍、AML、およびCMLが含まれるが、これらに限定されない。
特記しない限り、「細胞傷害性Tリンパ球」、「細胞傷害性T細胞」、および「CTL」という用語は本明細書において互換的に用いられ、特に別段の定めのない限り、非自己細胞(例えば、腫瘍/がん細胞、ウイルス感染細胞)を認識すること、およびそのような細胞の死滅を誘導することができるTリンパ球のサブグループを指す。
特記しない限り、本明細書で使用する「HLA−A2」という用語は、典型的には、HLA−A*0201およびHLA−A*0206などのサブタイプを指す。
特記しない限り、本明細書で使用する「キット」という用語は、試薬および他の物質の組み合わせに関して用いられる。本明細書では、キットはマイクロアレイ、チップ、マーカー等を含み得ることが企図される。「キット」という用語は、試薬および/または物質の特定の組み合わせに限定されないことが意図される。
特記しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。
NEIL3由来のペプチドが、CTLによって認識される抗原として機能することを実証するために、NEIL3(SEQ ID NO:45)由来のペプチドを解析して、それらが、一般的に見られるHLAアリルであるHLA−A24またはA2によって拘束される抗原エピトープであるかどうかを決定した(Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996;Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995;Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994)。
NEIL3由来のHLA−A2結合ペプチドの候補を、HLA−A2に対するそれらの結合親和性の情報を用いて同定した。候補ペプチドは、SEQ ID NO:1〜23からなる群より選択されるペプチドである。
NEIL3−A2−9−585(SEQ ID NO:3)、
NEIL3−A2−9−127(SEQ ID NO:4)、
NEIL3−A2−9−416(SEQ ID NO:5)、
NEIL3−A2−9−71(SEQ ID NO:6)、
NEIL3−A2−9−271(SEQ ID NO:11)、
NEIL3−A2−10−198(SEQ ID NO:15)、
NEIL3−A2−10−340(SEQ ID NO:17)、
NEIL3−A2−10−590(SEQ ID NO:21)、および
NEIL3−A2−10−378(SEQ ID NO:22)。
NEIL3由来のHLA−A24結合ペプチドの候補を、HLA−A24に対するこれらの結合親和性に基づいて同定した。該候補ペプチドは、SEQ ID NO:24〜43からなる群より選択されるペプチドである。
NEIL3−A24−9−545(SEQ ID NO:24)、
NEIL3−A24−9−362(SEQ ID NO:33)、
NEIL3−A24−10−320(SEQ ID NO:35)、
NEIL3−A24−10−544(SEQ ID NO:41)、および
NEIL3−A24−10−87(SEQ ID NO:43)。
樹立されたこれらのCTLは、それぞれのペプチドをパルスした標的細胞に対して強力な特異的CTL活性を示した。これらの結果から、NEIL3がCTLによって認識される抗原であること、および試験された該ペプチドがHLA−A24拘束性またはHLA−A2拘束性のNEIL3のエピトープペプチドであることが実証される。
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リジン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、スレオニン(T);および
8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい)。
必要なCTL誘導能を保持するために、少数の(例えば、1個、2個、または数個の)またはわずかな割合のアミノ酸を改変する(付加または置換する)ことができる。本明細書において、「数個」という用語は、5個またはそれ未満のアミノ酸、例えば3個、またはそれ未満を意味する。改変するアミノ酸の割合は、20%もしくはそれ未満、例えば15%もしくはそれ未満、例えば10%、または1〜5%である。
例えば、高いHLA−A2結合親和性を示すペプチドは、N末端から2番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンで置換されており、バリンまたはロイシンで置換されたC末端アミノ酸を有するペプチドもまた、好ましく使用することができる。したがって、アミノ酸配列のN末端から2番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンで置換されている、および/またはアミノ酸配列のC末端がバリンもしくはロイシンで置換されている、SEQ ID NO:3、4、5、6、11、15、17、21、および22からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドは、本発明によって包含される。
さらに、1個、2個、または数個のアミノ酸が、本ペプチドのN末端および/またはC末端へと付加されてもよい。高いHLA抗原結合親和性を有し、かつCTL誘導能を保持するそのような改変ペプチドもまた、本発明に包含される。
さらに、相同性解析の結果から、これらのペプチドが、任意の他の公知のヒト遺伝子産物に由来するペプチドと有意な相同性を有していないことが示された。このため、免疫療法に用いた場合の未知または望ましくない免疫応答の可能性は低くなる。したがって、この局面からもまた、これらのペプチドはがん患者においてNEIL3に対する免疫を誘発するのに使用される。よって、本発明のペプチドは、好ましくはSEQ ID NO:3、4、5、6、11、15、17、21、22、24、33、35、41、および43からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
例えば、HLAクラスIおよび/またはクラスIIを介する免疫応答を増大させるために、NEIL3でない腫瘍関連抗原ペプチドを実質的に同時に使用することもできる。がん細胞が2種以上の腫瘍関連遺伝子を発現できることは、十分に証明されている。特定の対象が付加的な腫瘍関連遺伝子を発現しているかどうかを判定すること、ならびに次に、本発明によるNEIL3組成物またはワクチン中に、そのような遺伝子の発現産物に由来するHLAクラスIおよび/またはHLAクラスII結合ペプチドを含めることは、当業者の日常的な実験法の範囲内である。
したがって、そのような「ポリトープ」は、様々な配置で(例えば、連鎖状に、重複して)共に連結され得る、2つまたはそれ以上の潜在的な免疫原性もしくは免疫応答刺激性のペプチドの群である。ポリトープ(または該ポリトープをコードする核酸)を標準的な免疫化プロトコールで例えば動物に投与して、免疫応答の促進、増強、および/または誘発におけるポリトープの有効性を試験することができる。
また本発明のペプチドは、CTL誘導能を保持する限り、他の物質にさらに連結させてもよい。そのような物質には、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマー等が含まれ得る。本ペプチドは、修飾によって本明細書に記載のペプチドの生物学的活性が損なわれない限り、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含み得る。付加的な機能(例えば、標的化機能および送達機能)が付与されるかまたはポリペプチドが安定化されるように、これらの種類の修飾を実施することができる。
a:本発明のペプチドの少なくとも1つのアミノ酸残基を置換、欠失、または付加する段階、
b:該ペプチドの活性を決定する段階、および
c:元と比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有するペプチドを選択する段階。
本明細書において、活性には、MHC結合活性、APCまたはCTLの誘導能、および細胞傷害活性が含まれ得る。
本明細書において、本発明のペプチドはまた、「NEIL3ペプチド」または「NEIL3ポリペプチド」とも記載され得る。
周知の技法を用いて、本発明のペプチドを調製することができる。例えば、組換えDNA技術または化学合成により、ペプチドを合成的に調製することができる。本発明のペプチドは、個々に、または2つもしくはそれ以上のペプチドを含むより長いポリペプチドとして、合成することができる。他の天然の宿主細胞タンパク質およびそれらの断片、または任意の他の化学物質を実質的に含まないペプチドを単離、すなわち精製または単離することができる。
本発明のペプチドは、本明細書に記載したペプチドの生物学的活性が修飾によって損なわれない限り、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含み得る。他の修飾には、例えばペプチドの血清半減期を延長させるために用いることができる、D−アミノ酸または他のアミノ酸模倣体の取り込みが含まれる。
(i)Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;
(ii)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;
(iii)ペプチド合成, 丸善, 1975;
(iv)ペプチド合成の基礎と実験, 丸善, 1985;
(v)医薬品の開発(続 第14巻)ペプチド合成, 広川書店, 1991;
(vi)WO99/67288;および
(vii)Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, 「Solid Phase Peptide Synthesis」, Academic Press, New York, 1980, 100-118。
本発明は、前述の本発明のペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらは、天然NEIL3遺伝子(GenBankアクセッション番号NM_018248(例えば、SEQ ID NO:44))由来のポリヌクレオチド、およびその保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。本明細書において「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、数多くの機能的に同一な核酸が任意の特定のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。したがって、あるコドンによってアラニンが指定されるあらゆる位置において、コードされるポリペプチドを変化させることなく、該コドンを記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。このような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の一種である。ペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列は、該核酸の可能性のあるあらゆるサイレント変異をも表す。核酸中の各コドン(通常メチオニンに対する唯一のコドンであるAUG、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるTGGを除く)を改変して、機能的に同一な分子を得ることができることを、当業者は認識するであろう。したがって、ペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、公開した各配列において非明示的に記載されている。
本発明のポリヌクレオチドは、介在するアミノ酸配列を伴って、または伴わずに、本発明の複数のペプチドをコードし得る。例えば、介在するアミノ酸配列は、ポリヌクレオチドまたは翻訳されたペプチドの切断部位(例えば、酵素認識配列)を提供し得る。さらに、ポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするコード配列に対する任意の付加的配列を含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、ペプチドの発現に必要な調節配列を含む組換えポリヌクレオチドであってよく、またはマーカー遺伝子等を有する発現ベクター(プラスミド)であってもよい。一般に、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いる従来の組換え技法によりポリヌクレオチドを操作することによって、そのような組換えポリヌクレオチドを調製することができる。
本発明は、本発明のペプチドとHLA抗原との間で形成される複合体を自身の表面上に提示する、エキソソームと称される細胞内小胞をさらに提供する。エキソソームは、例えば公表特許公報特表平11−510507号およびWO99/03499に詳述されている方法を用いることによって調製することができ、治療および/または予防の対象となる患者から得られたAPCを用いて調製することができる。本発明のエキソソームは、本発明のペプチドと同様に、ワクチンとして接種することができる。
代替的に、本発明のエキソソームに対してA24型HLA抗原を用いる場合、SEQ ID NO:24、33、35、41、43、および61のいずれか1つの配列を有するペプチドが使用される。
本発明はまた、HLA抗原と本発明のペプチドにより形成される複合体を自身の表面上に提示する単離されたAPCを提供する。APCは、治療および/または予防の対象となる患者に由来していてもよく、かつ、単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはCTLを含む他の薬物と組み合わせて、ワクチンとして投与することができる。
前記APCは、特定の種類の細胞に限定されず、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られているDC、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、B細胞、および活性化T細胞を含む。DCは、APCの中で最も強力なCTL誘導活性を有する代表的なAPCであるため、DCは本発明のAPCとして使用される。
a:第1の対象からAPCを回収する段階、
b:段階aのAPCをペプチドと接触させる段階、および
c:段階bのAPCを第2の対象に投与する段階。
第1の対象と第2の対象は同一の個体であってもよく、または異なる個体であってもよい。段階bによって得られたAPCは、がん、例えば膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、NSCLC、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、SCLC、軟部組織腫瘍、AML、およびCMLを治療および/または予防するためのワクチンであってもよい。
本発明のペプチドのいずれかに対して誘導されたCTLは、インビボでがん細胞を標的とする免疫応答を増強させ、かつしたがって、ペプチドと同様にワクチンとして用いられ得る。したがって本発明は、本発明のペプチドのいずれかによって特異的に誘導または活性化された、単離されたCTLを提供する。
そのようなCTLは、(1)本発明のペプチドを対象に投与すること;または(2)対象由来のAPCおよびCD8陽性細胞もしくは末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させる(で刺激する)こと;または(3)CD8陽性細胞もしくは末梢血単核白血球を、HLA抗原と本ペプチドとの複合体をその表面上に提示するAPCもしくはエキソソームとインビトロで接触させること;または(4)本発明のペプチドに結合するT細胞受容体(TCR)サブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を導入することによって、得ることができる。そのようなAPCまたはエキソソームは上記の方法によって調製することができ、(4)の方法は下記「VIII.T細胞受容体(TCR)」の章において記載する。
本発明はまた、T細胞受容体(TCR)のサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードする核酸を含む組成物、およびそれを用いる方法を提供する。TCRサブユニットは、NEIL3を提示する腫瘍細胞に対する特異性をT細胞に付与するTCRを形成する能力を有する。当技術分野における公知の方法を用いることにより、本発明の1つまたは複数のペプチドを用いて誘導されたCTLのTCRサブユニットとしてのα鎖およびβ鎖の核酸を同定することができる(WO2007/032255、およびMorgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003))。例えば、TCRを解析するためにはPCR法が好ましい。解析のためのPCRプライマーは、例えば、5'側プライマーとしての5'−Rプライマー(5'−gtctaccaggcattcgcttcat−3')(SEQ ID NO:48)、および3'側プライマーとしての、TCRα鎖C領域に特異的な3−TRa−Cプライマー(5'−tcagctggaccacagccgcagcgt−3')(SEQ ID NO:49)、TCRβ鎖C1領域に特異的な3−TRb−C1プライマー(5'−tcagaaatcctttctcttgac−3')(SEQ ID NO:50)、またはTCRβ鎖C2領域に特異的な3−TRβ−C2プライマー(5'−ctagcctctggaatcctttctctt−3')(SEQ ID NO:51)であり得るが、これらに限定されない。TCR誘導体は、NEIL3ペプチドを提示する標的細胞と高い結合力で結合することができ、かつ任意で、NEIL3ペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺傷をインビボおよびインビトロで媒介することができる。
形質導入されたCTLは、インビボでがん細胞にホーミングすることができ、かつインビトロで周知の培養法によって増殖させることができる(例えば、Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989))。本発明のCTLは、治療または防御を必要としている患者におけるがんの治療または予防に有用な免疫原性組成物を形成するために使用することができる(WO2006/031221)。
予防(preventionおよびprophylaxis)は、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減させる任意の行為を含む。予防(preventionおよびprophylaxis)は、「第一次、第二次、および第三次の予防レベルで」行われ得る。第一次の予防(preventionおよびprophylaxis)は、疾患の発生を回避するのに対し、第二次および第三次レベルの予防(preventionおよびprophylaxis)は、疾患の進行および症状の出現を予防(preventionおよびprophylaxis)することに加え、機能を回復させ、かつ疾患関連の合併症を減少させることによって、既存の疾患の悪影響を低下させることを目的とした行為を包含する。あるいは、予防(preventionおよびprophylaxis)は、特定の障害の重症度を軽減すること、例えば腫瘍の増殖および転移を減少させること、血管形成を減少させることを目的とした広範囲の予防的治療を含む。
本発明の薬剤または組成物は、ヒト、ならびに非限定的にマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、ヒヒ、およびチンパンジー、特に商業的に重要な動物または家畜を含む任意の他の哺乳動物を含む対象または患者において、がんを治療および/もしくは予防するために、ならびに/または術後のその再発を予防するために用いることができる。
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療または予防するための薬学的な組成物または物質の製造における、以下の中より選択される有効成分の使用を提供する:
(a)本発明のペプチド;
(b)本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸;
(c)本発明のペプチドをその表面上に提示するAPCまたはエキソソーム;および
(d)本発明の細胞傷害性T細胞。
(a)本発明のペプチド;
(b)本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸;
(c)本発明のペプチドをその表面上に提示するAPCまたはエキソソーム;および
(d)本発明の細胞傷害性T細胞。
(a)本発明のペプチド;
(b)本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸;
(c)本発明のペプチドをその表面上に提示するAPCまたはエキソソーム;および
(d)本発明の細胞傷害性T細胞。
(a)本発明のペプチド;
(b)本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸;
(c)本発明のペプチドをその表面上に提示するAPCまたはエキソソーム;および
(d)本発明の細胞傷害性T細胞。
本発明の薬学的な物質または組成物は、前述の有効成分に加えて、がん性細胞に対するCTLを誘導する能力を有するその他のペプチド、該その他のペプチドをコードするその他のポリヌクレオチド、該その他のペプチドを提示するその他の細胞等を含み得る。本明細書において、がん性細胞に対するCTLを誘導する能力を有するその他のペプチドは、がん特異的抗原(例えば、同定されたTAA)によって例示されるが、これに限定されない。
本明細書において特に言及される成分に加えて、本発明の薬学的な物質または組成物は、当該製剤の種類を考慮して、当技術分野において慣例的な他の組成物も含み得ることが理解されるべきである。
必要に応じて、有効成分を含む1つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置にて、薬学的な組成物を提供することができる。該パックは、例えば、ブリスターパックのように金属またはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する指示書が添付され得る。
本発明のペプチドは、薬学的な物質もしくは組成物として直接投与することができ、または必要であれば、従来の製剤方法によって製剤化される。後者の場合、本発明のペプチドに加えて、薬物に通常用いられる担体、賦形剤等が特に制限なく適宜含まれ得る。そのような担体の例は、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液等である。さらに、薬学的な物質または組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、保存剤、界面活性剤等を含み得る。本発明の薬学的な物質または組成物は、抗がん目的に用いることができる。
さらに、リポソーム製剤、直径数マイクロメートルのビーズにペプチドが結合している顆粒製剤、およびペプチドに脂質が結合している製剤が好都合に用いられ得る。
いくつかの態様において、本発明の薬学的な物質または組成物は、CTLを刺激する(prime)成分を含む。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでCTLを刺激し得る物質または組成物として同定された。例えば、パルミチン酸残基をリジン残基のεアミノ基およびαアミノ基に付着させ、次に本発明のペプチドに連結させることができる。次いで、脂質付加したペプチドを、ミセルもしくは粒子の状態で直接投与すること、リポソーム中に取り込ませること、またはアジュバント中に乳化させることができる。CTL応答の脂質による刺激の別の例として、トリパルミトイル−S−グリセリルシステイニル−セリル−セリン(P3CSS)などの大腸菌(E.coli)リポタンパク質を、適切なペプチドに共有結合させて、CTLを刺激するために用いることができる(例えば、Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4を参照されたい)。
本発明の薬学的な物質または組成物はまた、本明細書に開示するペプチドをコードする核酸を発現可能な形態で含み得る。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞内に導入された場合に抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現され得ることを意味する。例示的な態様において、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、該ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチドには、標的細胞のゲノム中への安定的な組み込みが達成されるように、必要なものを備えさせることができる(相同組換えカセットベクターの説明に関しては、例えばThomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい。また例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8;米国特許第5,580,859号;第5,589,466号;第5,804,566号;第5,739,118号;第5,736,524号;第5,679,647号;およびWO 98/04720も参照されたい)。DNAに基づく送達技術の例には、「裸のDNA」、促進された(ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性)送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性(「遺伝子銃」)または圧力媒介性の送達が含まれる(例えば、米国特許第5,922,687号を参照されたい)。
遺伝子治療の方法の一般的な総説に関しては、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505;Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95;Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96;Mulligan, Science 1993, 260: 926-32;Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217;Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215を参照されたい。本発明にも用いることのできる、組換えDNA技術の分野において一般に公知の方法は、eds. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993;およびKrieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990に記載されている。
APCおよびCTLを調製または誘導するために、本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドを用いることができる。CTLを誘導するために、本発明のエキソソームおよびAPCを用いることもできる。ペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、およびAPCは、任意の他の化合物がそれらのCTL誘導能を阻害しない限り、該化合物と組み合わせて用いることができる。したがって、前述の本発明の薬学的な物質または組成物のいずれかをCTLを誘導するために用いることができ、それに加えて、前記ペプチドおよびポリヌクレオチドを含むものを、以下に説明されるように、APCを誘導するために用いることもできる。
本発明は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを用いた、高いCTL誘導能を有するAPCを誘導する方法を提供する。
本発明の方法は、APCを本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階を含む。例えば、APCを該ペプチドとエクスビボで接触させる方法は、以下の段階を含み得る:
a:対象からAPCを回収する段階、および
b:段階aのAPCをペプチドと接触させる段階。
前記APCは特定の種類の細胞に限定されず、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られているDC、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、B細胞、および活性化T細胞を含む。好ましくはDCが、APCの中で最も強力なCTL誘導能を有するので、使用可能である。本発明の任意のペプチドを、単独で、または本発明の他のペプチドと共に用いることができる。
a:対象からAPCを回収する段階、および
b:本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する段階。
段階bは、上記「VI.抗原提示細胞」の章に記述した通りに行うことができる。
あるいは、本発明は、NEIL3に対するCTL活性を特異的に誘導する抗原提示細胞(APC)を調製するための方法であって、以下の段階の1つを含み得る方法を提供する:
(a)APCを本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階;および
(b)本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階。
さらに本発明は、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、またはAPCを用いてCTLを誘導するための方法を提供する。
本発明はまた、本発明のペプチドとHLA抗原との複合体を認識するT細胞受容体(TCR)サブユニットを形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、CTLを誘導するための方法を提供する。好ましくは、CTLを誘導するための方法は、以下からなる群より選択される少なくとも1つの段階を含む:
a)CD8陽性T細胞を、HLA抗原と本発明のペプチドとの複合体をその表面上に提示する抗原提示細胞および/またはエキソソームと接触させる段階;ならびに
b)本発明のペプチドとHLA抗原との複合体を認識するTCRサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、CD8陽性細胞に導入する段階。
本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、APC、またはエキソソームを対象に投与した場合、該対象の体内でCTLが誘導され、がん細胞を標的とする免疫応答の強度が増強される。したがって本発明の方法は、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、APC、またはエキソソームを対象に投与する段階を含む。
a:対象からAPCを回収する段階;
b:段階aのAPCをペプチドと接触させる段階;および
c:段階bのAPCをCD8陽性細胞と共培養する段階。
上記の段階cにおいてCD8陽性細胞と共培養するAPCは、上記「VI.抗原提示細胞」の章に記述した通りに、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子をAPCに導入することによって調製することもできるが、これに限定されず、HLA抗原と本発明のペプチドとの複合体をその表面上に効率的に提示する任意のAPCを本方法に用いることができる。
さらに、本発明のペプチドに結合するTCRサブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をCD8陽性細胞に導入することによって、CTLを誘導することができる。そのような形質導入は、上記「VIII.T細胞受容体(TCR)」の章に記述した通りに行うことができる。
加えて、本発明は、本発明のペプチドを薬学的に許容される担体と共に混合または製剤化する段階を含む方法である、CTLを誘導する薬学的な物質または組成物を製造するための方法または工程を提供する。
さらに本発明は、NEIL3に関連する疾患に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。適切な疾患にはがん、例えば、これらに限定されるわけではないが膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、NSCLC、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、SCLC、軟部組織腫瘍、AML、およびCMLが含まれる。
本方法は、本発明のペプチドまたはそれらをコードするポリヌクレオチドのいずれかを含む物質または組成物を投与する段階を含み得る。本発明の方法はまた、本発明のペプチドのいずれかを提示するエキソソームまたはAPCの投与も意図し得る。詳細については、「IX.薬学的な物質または組成物」の項目、特にワクチンとしての本発明の薬学的な物質または組成物の使用について記載している部分を参照されたい。加えて、免疫応答を誘導するための本発明の方法に用いることができるエキソソームおよびAPCは、上記「V.エキソソーム」、「VI.抗原提示細胞(APC)」、ならびに「X.ペプチド、エキソソーム、APC、およびCTLを用いる方法」の(1)および(2)の項目において詳述されている。
あるいは、本発明の方法は、以下を含むワクチンまたは薬学的組成物を投与する段階を含み得る:
(a)本発明のペプチド;
(b)本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸;
(c)本発明のペプチドをその表面上に提示するAPCまたはエキソソーム;および
(d)本発明の細胞傷害性T細胞。
i)治療すべきがんを有する対象から得られた細胞または組織において、NEIL3の発現レベルを決定する段階;
ii)NEIL3の発現レベルを正常対照と比較する段階;および
iii)上記の(a)〜(d)からなる群より選択される少なくとも1つの成分を、正常対照と比較してNEIL3を過剰発現するがんを有する対象に投与する段階。
本発明の方法によって治療される対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、および雌ウシが含まれるが、これらに限定されない。
具体的には、本発明の方法のために用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、または低ストリンジェントな条件の下で、NEIL3のmRNAにハイブリダイズする。本明細書において使用する場合、「ストリンジェントな(ハイブリダイゼーション)条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、より短い配列よりも高い温度で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、規定のイオン強度およびpHにおける特定の配列の融解温度(Tm)よりも約5℃低くなるように選択される。Tmとは、平衡時に、標的配列に相補的なプローブの50%が標的配列とハイブリダイズする(規定のイオン強度、pH、および核酸濃度における)温度である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Tmでは、平衡時に、プローブの50%が占有される。典型的には、ストリンジェントな条件とは、pH7.0〜8.3において、塩濃度が約1.0 M未満のナトリウムイオン、典型的には約0.01〜1.0 Mのナトリウムイオン(または他の塩)であり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー(例えば、10〜50ヌクレオチド)の場合は少なくとも約30℃であり、より長いプローブまたはプライマーの場合は少なくとも約60℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの脱安定化物質を添加することによって達成してもよい。
がん細胞における標的遺伝子、例えばNEIL3遺伝子の発現レベルは、そのレベルが、標的遺伝子の対照レベル(例えば、正常細胞におけるレベル)よりも例えば10%、25%、もしくは50%上昇しているか、または1.1倍超、1.5倍超、2.0倍超、5.0倍超、10.0倍超、もしくはそれ以上に上昇している場合に、上昇していると決定することができる。
より具体的には、本発明は、(i)対象が、治療すべきがんを有することが疑われるかどうかを診断する、および/または(ii)がん治療のための対象を選択する方法であって、以下の段階を含み得る方法を提供する:
a)治療すべきがんを有する疑いのある対象から得られた細胞または組織におけるNEIL3の発現レベルを決定する段階;
b)NEIL3の発現レベルを正常対照レベルと比較する段階;
c)NEIL3の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇している場合に、該対象を、治療すべきがんを有すると診断する段階;および
d)段階c)において、対象が、治療すべきがんを有すると診断された場合に、がん治療のために該対象を選択する段階。
a)治療すべきがんを有する疑いのある対象から得られた細胞または組織におけるNEIL3の発現レベルを決定する段階;
b)NEIL3の発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階;
c)NEIL3の発現レベルががん性対照レベルと比較して類似しているか、または同等である場合に、該対象を、治療すべきがんを有すると診断する段階;および
d)段階c)において、対象が、治療すべきがんを有すると診断された場合に、がん治療のために該対象を選択する段階。
(a)NEIL3遺伝子のmRNAを検出するための試薬;
(b)NEIL3タンパク質またはその免疫学的な断片を検出するための試薬;および
(c)NEIL3タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
本発明のタンパク質の部分ペプチドの例には、本発明のタンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも8個、好ましくは15個、およびより好ましくは20個の連続したアミノ酸からなるポリペプチドが含まれる。本発明のタンパク質またはペプチド(ポリペプチド)を用いて試料(例えば、血液、組織)中の抗体を検出することにより、がんを診断することができる。本発明のタンパク質およびペプチドを調製するための方法は、上記の通りである。
別の態様において、本発明の診断キットは、本発明のペプチドおよびそれに結合するHLA分子を含み得る。抗原性ペプチドおよびHLA分子を使用して抗原特異的CTLを検出するための方法は、既に確立されている(例えば、Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6)。したがって、腫瘍抗原特異的CTLを検出するための検出法に、本発明のペプチドとHLA分子との複合体を適用することができ、それによってがんのより早期の検出、再発、および/または転移が可能になる。さらに、本発明のペプチドを有効成分として含む医薬を適用できる対象を選択するために、または該医薬の治療効果を評価するために、これを使用することができる。
本発明はさらに、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。好ましい抗体は本発明のペプチドに特異的に結合し、本発明のペプチドでないものには結合しない(または弱く結合する)。あるいは、抗体は本発明のペプチドおよびその相同体に結合する。本発明のペプチドに対する抗体は、がんの診断アッセイおよび予後診断アッセイ、ならびに画像化手法において使用され得る。同様に、そのような抗体は、NEIL3がやはりがん患者において発現または過剰発現する限り、他のがんの治療、診断、および/または予後診断において使用され得る。さらに、細胞内で発現する抗体(例えば、一本鎖抗体)は、例えば膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、NSCLC、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、SCLC、軟部組織腫瘍、AML、およびCMLなどの、NEIL3の発現が関与する癌の治療において治療的に使用され得る。
抗体を得るために抗原として用いられる本発明のペプチドは、任意の動物種に由来し得るが、好ましくはヒト、マウス、またはラットなどの哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。ヒト由来のペプチドは、本明細書に開示するヌクレオチドまたはアミノ酸配列から得ることができる。
本明細書では、抗体を、NEIL3ペプチドの全長または断片のいずれかと反応するタンパク質と定義する。好ましい態様において、本発明の抗体は、SEQ ID NO:3、4、5、6、11、15、17、21、22、24、33、35、41、および43からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるNEIL3の断片ペプチドを認識し得る。オリゴペプチドを合成するための方法は、当技術分野において周知である。合成後、免疫原として使用する前にペプチドを任意に精製することができる。本発明において、免疫原性を高めるために、オリゴペプチド(例えば、9マーまたは10マー)を担体と結合または連結させてもよい。担体としてキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)が周知である。KLHとペプチドを結合するための方法もまた、当技術分野において周知である。
任意の哺乳動物を抗原で免疫化することができるが、細胞融合に用いる親細胞との適合性を考慮に入れることが好ましい。一般に、齧歯目(Rodentia)、ウサギ目(Lagomorpha)、または霊長目(Primate)の動物を使用することができる。齧歯目の動物には、例えばマウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目の動物には、例えばウサギが含まれる。霊長目の動物には、例えば、カニクイザル(Macaca fascicularis)、アカゲザル、マントヒヒ、およびチンパンジーなどの狭鼻下目(Catarrhini)のサル(旧世界サル)が含まれる。
上記の免疫細胞および骨髄腫細胞は、公知の方法、例えば、Milstein et al. (Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981))の方法に従って融合させることができる。
ハイブリドーマを調製するために非ヒト動物を抗原で免疫化する上記の方法に加えて、EBウイルスに感染したリンパ球などのヒトリンパ球を、ペプチド、ペプチド発現細胞、またはそれらの溶解物でインビトロにおいて免疫化することもできる。その後、免疫化したリンパ球を、無限に***可能なU266などのヒト由来骨髄腫細胞と融合させて、該ペプチドに結合し得る所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる(特開昭63−17688号)。
続いて、得られたハイブリドーマをマウスの腹腔内に移植し、腹水を抽出する。得られたモノクローナル抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインAもしくはプロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、または本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムにより、精製することができる。本発明の抗体は、本発明のペプチドの精製および検出のためだけでなく、本発明のペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの候補としても使用することができる。
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子操作技法を用いて組換えにより調製することもできる(例えば、MacMillan Publishers LTD (1990)により英国で刊行された、Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodiesを参照されたい)。例えば、抗体をコードするDNAを、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、適切なベクターに挿入し、宿主細胞に導入して、組換え抗体を調製することができる。本発明はまた、上記のようにして調製された組換え抗体を提供する。
あるいは、本発明の抗体を、非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト抗体に由来する定常領域との間のキメラ抗体として、または、非ヒト抗体に由来する相補性決定領域(CDR)、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域(FR)および定常領域を含むヒト化抗体として、得ることができる。そのような抗体は、公知の技術に従って調製することができる。ヒト化は、齧歯類のCDRまたはCDR配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行うことができる(例えば、Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)を参照されたい)。したがって、そのようなヒト化抗体は、実質的に完全には満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換された、キメラ抗体である。
例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、酵素免疫測定法(EIA)、放射免疫測定法(RIA)、および/または免疫蛍光法を用いて、本発明の抗体の抗原結合活性を測定することができる。ELISAの場合、本発明の抗体をプレート上に固定化し、本発明のペプチドをプレートに添加し、次に、抗体産生細胞の培養上清または精製抗体などの所望の抗体を含む試料を添加する。次いで、一次抗体を認識しかつアルカリホスファターゼなどの酵素で標識された二次抗体を添加し、プレートをインキュベートする。次に、洗浄後に、p−ニトロフェニルリン酸などの酵素基質をプレートに添加し、吸光度を測定して、試料の抗原結合活性を評価する。抗体の結合活性を評価するために、C末端断片またはN末端断片などのペプチドの断片を抗原として用いてもよい。本発明による抗体の活性を評価するために、BIAcore(Pharmacia)を用いてもよい。
本発明によるペプチドを検出または測定する方法はペプチドを特異的に検出または測定することができるため、該方法は、該ペプチドを使用する種々の実験において使用され得る。
本発明はまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチドが導入されたベクターおよび宿主細胞も提供する。本発明のベクターは、宿主細胞中で本発明のヌクレオチド、特にDNAを維持するため、本発明のペプチドを発現させるため、または遺伝子治療用に本発明のヌクレオチドを投与するために使用され得る。
大腸菌が宿主細胞であり、ベクターを大腸菌(例えば、JM109、DH5α、HB101、またはXL1Blue)内で増幅して大量に生成する場合、ベクターは、大腸菌内で増幅するための「複製起点」、および形質転換された大腸菌を選択するためのマーカー遺伝子(例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等の薬物によって選択される薬物耐性遺伝子)を有する必要がある。例えば、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR−Script等を用いることができる。加えて、pGEM−T、pDIRECT、およびpT7もまた上記のベクターと同様に、cDNAのサブクローニングおよび抽出に用いることができる。ベクターを用いて本発明のタンパク質を産生する場合には、発現ベクターが使用され得る。例えば、大腸菌内で発現させるべき発現ベクターは、大腸菌内で増幅するための上記の特徴を有する必要がある。JM109、DH5α、HB101、またはXL1 Blueなどの大腸菌を宿主細胞として用いる場合、ベクターは、大腸菌内で所望の遺伝子を効率的に発現し得るプロモーター、例えば、lacZプロモーター(Ward et al., Nature 341: 544-6 (1989);FASEB J 6: 2422-7 (1989))、araBプロモーター(Better et al., Science 240: 1041-3 (1988))、T7プロモーター等を有する必要がある。この点に関して、例えば、pGEX−5X−1(Pharmacia)、「QIAexpressシステム」(Qiagen)、pEGFP、およびpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現するBL21であることが好ましい)を、上記のベクターの代わりに用いることができる。さらにベクターは、ペプチド分泌のためのシグナル配列を含んでもよい。分泌させるべきペプチドを大腸菌のペリプラズムに指向させる例示的なシグナル配列は、pelBシグナル配列(Lei et al., J Bacteriol 169: 4379 (1987))である。ベクターを標的宿主細胞に導入する手段には、例えば塩化カルシウム法およびエレクトロポレーション法が含まれる。
本発明はまた、がんを診断する方法も提供する。NEIL3の発現がいくつかの種類のがん細胞において特異的に上昇することが、見出された(表1および図5)。したがって、本明細書において同定された遺伝子、ならびにそれらの転写産物および翻訳産物は、がんのマーカーとしての診断的有用性を有しており、生物学的試料(例えば、細胞試料)中のNEIL3の発現を測定することによってがんを診断することができる。具体的には、本発明は、対象におけるNEIL3の発現レベルを測定することによりがんを診断するための方法を提供する。本発明の方法によって診断することのできるがんには、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、NSCLC、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、SCLC、軟部組織腫瘍、AML、およびCMLが含まれるが、これらに限定されない。さらに、肺腺癌および肺扁平上皮癌(SCC)を含むNSCLCもまた、本発明により診断または検出することができる。
[1]以下の段階を含む、がんを診断するための方法:
(a)生物学的試料中のNEIL3のアミノ酸配列をコードする遺伝子の発現レベルを検出する段階;および
(b)該遺伝子の正常対照レベルと比較して、検出された発現レベルの上昇を、疾患の存在と相関させる段階。
[2]前記発現レベルが前記正常対照レベルより少なくとも10%高い、[1]記載の方法。
[3]以下の中より選択される方法によって前記発現レベルを検出する、[1]記載の方法:
(a)NEIL3の配列を含むmRNAを検出すること、
(b)NEIL3のアミノ酸配列を含むタンパク質を検出すること、および
(c)NEIL3のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性を検出すること。
[4]前記がんが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、NSCLC、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、SCLC、軟部組織腫瘍、AML、およびCMLの群より選択される、[1]記載の方法。
[5]前記遺伝子の遺伝子転写産物に対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することにより、前記発現レベルを測定する、[3]記載の方法。
[6]遺伝子によってコードされる前記タンパク質に対する抗体の結合を、該遺伝子の前記発現レベルとして検出することにより、前記発現レベルを測定する、[3]記載の方法。
[7]前記生物学的試料が生検標本、痰、血液、胸水、または尿を含む、[1]記載の方法。
[8]前記対象由来の生物学的試料が上皮細胞を含む、[1]記載の方法。
[9]前記対象由来の生物学的試料ががん細胞を含む、[1]記載の方法。
[10]前記対象由来の生物学的試料が癌性上皮細胞を含む、[1]記載の方法。
そのような結果を付加的な情報と組み合わせて、対象が疾患に罹患していると診断する際に、医師、看護師、または他の医療関係者を補助することができる。換言すれば、本発明は、対象が疾患に罹患していると診断するために有用な情報を医師に提供し得る。例えば、対象から採取された組織中のがん細胞の存在に関する疑いがある場合には、本発明に従って、NEIL3遺伝子の発現レベルに加えて、組織病理学、公知の腫瘍マーカーの血中レベル、および該対象の臨床経過等を含む疾患の様々な局面を考慮することにより、臨床決定に至ることができる。
膀胱癌;SCC、TPA、またはIAP
乳癌;BCA225、TPA、CEA、IAP、またはCA15−3
子宮頸癌;SCC、TPA、またはCA125
胆管細胞癌;CA19−9、またはCEA
結腸直腸癌;CEA
子宮内膜症;CA125
食道癌;CEA、DUPAN−2、IAP、NSE、SCC、SLX、または Span−1
肝癌;AFP、またはICDH
NSCLC;CEA
骨肉腫;ALP
膵癌;BFP、CA19−9、CA125、またはCEA
前立腺癌;PSA、またはPAP
腎細胞癌;IAP
SCLC;ProGRPまたはNSE
AML;TK活性
CML;TK活性
別の態様において、本発明は、がんの診断マーカーを検出するための方法を提供し、該方法は、これらに限定されないが、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、肝癌、NSCLC、骨肉腫、膵癌、前立腺癌、腎癌、SCLC、軟部組織腫瘍、AML、およびCMLの診断マーカーとして、対象由来の生物学的試料中のNEIL3遺伝子の発現を検出する段階を含む。
本発明の方法によって診断すべき対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれるが、これらに限定されない。
診断を行うために、診断すべき対象から生物学的試料を採取することが好ましい。目的であるNEIL3の転写産物または翻訳産物を含む限り、任意の生体材料を、測定のための生物学的試料として使用することができる。生物学的試料には、身体組織、ならびに血液、痰、および尿などの体液が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、生物学的試料は、上皮細胞、より好ましくは癌性上皮細胞、または癌性であると疑われる組織に由来する上皮細胞を含む、細胞群を含む。さらに、必要に応じて、得られた身体組織および体液から細胞を精製した後、生物学的試料として用いてもよい。
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下で、中程度にストリンジェントな条件下で、または低ストリンジェントな条件下で、NEIL3のmRNAとハイブリダイズする。
NEIL3遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出する別の方法として、NEIL3タンパク質に対する抗体を用いた免疫組織化学的解析により、染色強度を観察してもよい。すなわち、強い染色が観察されることは、該タンパク質の存在の増加を示し、かつ同時にNEIL3遺伝子の高い発現レベルを示す。
生物学的試料中のNEIL3遺伝子を含むがんマーカー遺伝子の発現レベルは、対応するがんマーカー遺伝子の対照レベルよりも例えば10%、25%、もしくは50%上昇しているか、または1.1倍超、1.5倍超、2.0倍超、5.0倍超、10.0倍超、もしくはそれ以上まで上昇している場合に、上昇していると見なすことができる。
試験生物学的試料の発現レベルと対照レベルの間の差を、細胞の癌性状態または非癌性状態次第でその発現レベルが相違しないことが判明している対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化することができる。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素、およびリボソームタンパク質P1が含まれるが、これらに限定されない。
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、これは、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
細胞株
T2(HLA−A2)、ヒトBリンパ芽球様細胞株、COS7、およびアフリカミドリザル腎細胞株はATCCから購入し、PSCCA0922(HLA−*A0206)は財団法人ヒューマンサイエンス振興財団から購入した。TISI、HLA−A*2402陽性Bリンパ芽球様細胞株は、IHWG Cell and Gene Bank(Seattle,WA)から購入した。
HLA−A*0201分子に結合するNEIL3由来の9merおよび10merのペプチドを、結合予測ソフトウェア「BIMAS」(www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind)(Parker et al.(J Immunol 1994, 152(1): 163-75)、Kuzushima et al.(Blood 2001, 98(6): 1872-81))を用いて予測した。HLA−A*2402分子に結合するNEIL3由来の9merおよび10merのペプチドを、「NetMHC3.0」結合予測サーバ(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)(Buus et al.(Tissue Antigens., 62:378-84, 2003)、Nielsen et al.(Protein Sci., 12:1007-17, 2003、Bioinformatics, 20(9):1388-97, 2004))を用いて予測した。これらのペプチドは、標準的な固相合成法に従ってBiosynthesis Inc.(Lewisville,TX)によって合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって精製した。ペプチドの純度(>90%)および同一性を、それぞれ分析用HPLCおよび質量分析によって決定した。ペプチドをジメチルスルホキシド(DMSO)に20 mg/mlで溶解し、−80℃で保存した。
単球由来の樹状細胞(DC)を抗原提示細胞(APC)として用いて、ヒト白血球抗原(HLA)上に提示されたペプチドに対する細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を誘導した。他所に記載されているように、DCをインビトロで作製した(Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8)。具体的には、Ficoll−Plaque(Pharmacia)溶液によって健常なボランティア(HLA−A*0201陽性またはHLA−A*0206陽性)から単離した末梢血単核細胞(PBMC)を、プラスチック製の組織培養ディッシュ(Becton Dickinson)へ付着させることによって分離し、それらを単球画分として濃縮した。2%の加熱非働化した自己血清(AS)を含むAIM−V培地(Invitrogen)中で、1,000U/mlの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)(R&D System)および1,000U/mlのインターロイキン(IL)−4(R&D System)の存在下で、単球を濃縮させた群を培養した。培養7日後、サイトカインで誘導したDCに、AIM−V培地中で3時間、37℃にて、3μg/mlのβ2−ミクログロブリンの存在下で20μg/mlの各合成ペプチドをパルスした。作製した細胞は、その細胞表面上に、CD80、CD83、CD86、およびHLAクラスIIなどのDC関連分子を発現しているようであった(データは示さず)。次いで、ペプチドをパルスしたこれらのDCを、X線照射(20Gy)によって不活化し、CD8 Positive Isolation Kit(Dynal)を用いた陽性選択によって得られた自己CD8+T細胞と1:20の比率で混合した。これらの培養物を48ウェルプレート(Corning)中に準備し;各ウェルは、0.5mlのAIM−V/2%AS培地中に、1.5×104個のペプチドパルスしたDC、3×105個のCD8+T細胞、および10ng/mlのIL−7(R&D System)を含んだ。3日後、これらの培養物に、IL−2(CHIRON)を最終濃度20IU/mlまで補充した。7日目および14日目に、ペプチドパルスした自己DCでT細胞をさらに刺激した。該DCは上記と同じ方法によって毎回調製した。21日目に、3回目のペプチド刺激後、ペプチドパルスしたT2細胞またはPSCCA0922細胞に対してCTLを試験した(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506)。
Riddellら(Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44;Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23)によって記載されている方法と類似の方法を用いて、CTLを培養下で増殖させた。40ng/mlの抗CD3モノクローナル抗体(Pharmingen)の存在下で、MMCによって不活化した2種類のヒトBリンパ芽球様細胞株と共に、合計5×104個のCTLを25mlのAIM−V/5%AS培地中に懸濁した。培養開始1日後に、120IU/mlのIL−2を該培養物に添加した。5、8、および11日目に、30IU/mlのIL−2を含む新たなAIM−V/5%AS培地を、該培養物に供給した(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506)。
96丸底マイクロタイタープレート(Nalge Nunc International)において0.3個、1個、および3個のCTL/ウェルとなるように、希釈を行った。CTLを、1×104個の細胞/ウェルの2種類のヒトBリンパ芽球様細胞株、30ng/mlの抗CD3抗体、および125U/mlのIL−2と共に、合計150μl/ウェルの5%AS含有AIM−V培地中で培養した。10日後、50μl/ウェルのIL−2を、125U/mlのIL−2の最終濃度に到達するように培地に添加した。14日目にCTL活性を試験し、上記と同じ方法を用いてCTLクローンを増殖させた(Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86;Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9;Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506)。
特異的CTL活性を調べるために、インターフェロン(IFN)−γ酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイおよびIFN−γ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を行った。具体的には、ペプチドパルスしたT2(1×104個/ウェル)を刺激細胞として調製した。48ウェル中の培養細胞を応答細胞として使用した。IFN−γ ELISPOTアッセイおよびIFN−γ ELISAアッセイは、製造業者の手順に従って行った。
標的遺伝子、HLA−A*0201、HLA−A*0206、またはHLA−A*2402のオープンリーディングフレームをコードするcDNAをPCRによって増幅した。PCR増幅産物をベクターにクローニングした。製造業者の推奨手順に従ってリポフェクタミン2000(Invitrogen)を用いて、標的遺伝子陰性かつHLA−A2およびHLA−A24に陰性の細胞株であるCOS7にプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから2日後、トランスフェクトした細胞をversene(Invitrogen)を用いて回収し、CTL活性アッセイのための標的細胞(5×104個の細胞/ウェル)として使用した。
製造業者のプロトコールに従ってQiagen RNeasyキット(Qiagen)またはTrizol試薬(Life Technologies,Inc.)を用いて、全RNAを抽出した。Superscript II逆転写酵素(Life Technologies)と共にポリdT12−18プライマー(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて、全RNAの10μgアリコートを逆転写して一本鎖cDNAとした。各一本鎖cDNA調製物を、12μl容量のPCR緩衝液(TAKARA)中で行う標準的なRT−PCR実験によるその後のPCR増幅のために希釈した。増幅は、GeneAmp PCRシステム9700(Perkin−Elmer、Foster City,CA)において、94℃で4分間の変性に続き、94℃で30秒、60℃で30秒、および72℃で60秒を28サイクル行って進行させた。プライマー配列は以下の通りであった:NEIL3に関して:フォワード、5'−TTGGTCCTCCTCTGTTTCATAGA−3'(SEQ ID NO:46)およびリバース、5'−GCTTCTCCCCAGTTACAAGAGAC−3'(SEQ ID NO:47)。
がんにおけるNEIL3発現の増強
cDNAマイクロアレイを用いて様々ながんから得られた包括的遺伝子発現プロファイルデータから、NEIL3(GenBankアクセッション番号NM_018248;SEQ ID NO:44)発現が上昇していることが明らかになった。NEIL3発現は、対応する正常組織と比較して、AML 20例中4例、膀胱癌6例中5例、乳癌11例中10例、子宮頸癌8例中8例、胆管細胞癌1例中1例、CML 12例中12例、結腸直腸癌6例中3例、子宮内膜症1例中1例、食道癌8例中4例、肝癌10例中6例、NSCLC 7例中7例、骨肉腫16例中16例、膵癌1例中1例、前立腺癌10例中10例、腎癌2例中2例、SCLC 12例中12例、および軟部組織腫瘍12例中12例において確かに上昇していた(表1)。
NEIL3由来のHLA−A2結合ペプチドの予測
表2は、NEIL3のHLA−A2結合ペプチドを、結合親和性の高い順に示す。潜在的なHLA−A2結合能を有する全23種のペプチドを選択して、エピトープペプチドを決定するために調べた(表2)。
NEIL3由来の上記ペプチドに対するCTLを、「材料および方法」に記載したプロトコールに従って作製した。IFN−γ ELISPOTアッセイによって、ペプチド特異的なCTL活性を測定した(図1a〜j)。それにより、NEIL3−A2−9−585(SEQ ID NO:3)で刺激したウェル番号#8(a)、NEIL3−A2−9−127(SEQ ID NO:4)で刺激した#2(b)、NEIL3−A2−9−416(SEQ ID NO:5)で刺激した#4および5(c)、NEIL3−A2−9−71(SEQ ID NO:6)で刺激した#3(d)、NEIL3−A2−9−271(SEQ ID NO:11)で刺激した#1(e)、NEIL3−A2−10−198(SEQ ID NO:15)で刺激した#3(f)、NEIL3−A2−10−340(SEQ ID NO:17)で刺激した#1(g)、NEIL3−A2−10−590(SEQ ID NO:21)で刺激した#2および3(h)、ならびにNEIL3−A2−10−378(SEQ ID NO:22)で刺激した#6(i)が、対照ウェルと比較して強力なIFN−γ産生を示すことが示された。加えて、NEIL3−A2−9−416(SEQ ID NO:5)で刺激したウェル番号#9、10、12、および13(j)が、ペプチドパルスしたA0206陽性PSCCA0922細胞に対して強力なIFN−γ産生を示した。さらに、NEIL3−A2−9−585(SEQ ID NO:3)で刺激した陽性ウェル番号#8、NEIL3−A2−9−127(SEQ ID NO:4)で刺激した#2、NEIL3−A2−9−416(SEQ ID NO:5)で刺激した#4および5、NEIL3−A2−9−71(SEQ ID NO:6)で刺激した#3、NEIL3−A2−9−271(SEQ ID NO:11)で刺激した#1、NEIL3−A2−10−198(SEQ ID NO:15)で刺激した#3、ならびにNEIL3−A2−10−590(SEQ ID NO:21)で刺激した#2および3中の細胞を拡大してCTL株を樹立し、かつ、A0206に対するNEIL3−A2−9−416(SEQ ID NO:5)で刺激した#10および12も同様に拡大してCTL株を樹立した。これらCTL株のCTL活性を、IFN−γ ELISAアッセイによって測定した(図2a〜k)。それにより、すべてのCTL株が、ペプチドパルスしなかった標的細胞と比較して、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対して強力なIFN−γ産生を示すことが示された。一方、表2に示した他のペプチドはHLA−A*0201との結合活性を有する可能性があるものの、それらのペプチドによる刺激によってCTL株を樹立することはできなかった(データは示さず)。結果として、これにより、NEIL3由来の7種のペプチドが、強力なCTL株を誘導し得るペプチドとしてスクリーニングされたことが示された。
「材料および方法」に記載した通りに、CTL株から限界希釈によりCTLクローンを樹立し、ペプチドをパルスした標的細胞に対するCTLクローンからのIFN−γ産生をIFN−γ ELISAアッセイによって測定した。図3において、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:15、およびSEQ ID NO:21で刺激したCTLクローンから強力なIFN−γ産生が測定された。
これらのペプチドに対して産生された樹立CTL株を、NEIL3およびHLA−A*0201またはHLA−A*0206分子を内因的に発現する標的細胞を認識するそれらの能力について試験した。全長NEIL3およびHLA−A*0201またはHLA−A*0206分子の遺伝子の双方をトランスフェクトしたCOS7細胞(NEIL3およびHLA−A*0201またはHLA−A*0206遺伝子とを外因的に発現する標的細胞の特異的モデル)に対する特異的CTL活性を、対応するペプチドによって産生されたCTL株をエフェクター細胞として用いて試験した。全長のNEIL3遺伝子、HLA−A*0201遺伝子、またはHLA−A*0206遺伝子のいずれかをトランスフェクトしたCOS7細胞を対照として調製した。図4において、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、およびSEQ ID NO:15で刺激したCTLは、NEIL3およびHLA−A*0201の両方を発現するCOS7細胞に対して強力なCTL活性を示し、SEQ ID NO:5で刺激したCTLはまた、NEIL3およびHLA−A*0206の両方を発現するCOS7細胞に対しても強力なCTL活性を示した。一方、対照に対する有意な特異的CTL活性は検出されなかった。したがってこれらのデータにより、NEIL3−A2−9−416(SEQ ID NO:5)、NEIL3−A2−9−71(SEQ ID NO:6)、およびNEIL3−A2−10−198(SEQ ID NO:15)は天然でHLA−A*0201分子と共に標的細胞上に発現され、CTLによって認識され、かつNEIL3−A2−9−416(SEQ ID NO:5)もまた、天然でHLA−A*0206分子と共に標的細胞上に発現され、CTLによって認識されることが明確に実証された。これらの結果から、NEIL3に由来するこれらのペプチドは、NEIL3を発現する腫瘍を有する患者に対してがんワクチンを適用するのに利用可能であり得ることが示された。
NEIL3−A2−9−585(SEQ ID NO:3)、NEIL3−A2−9−127(SEQ ID NO:4)、NEIL3−A2−9−416(SEQ ID NO:5)、NEIL3−A2−9−71(SEQ ID NO:6)、NEIL3−A2−9−271(SEQ ID NO:11)、NEIL3−A2−10−198(SEQ ID NO:15)、NEIL3−A2−10−340(SEQ ID NO:17)、NEIL3−A2−10−590(SEQ ID NO:21)、およびNEIL3−A2−10−378(SEQ ID NO:22)で刺激したCTLは、有意かつ特異的なCTL活性を示した。この結果は、NEIL3−A2−9−585(SEQ ID NO:3)、NEIL3−A2−9−127(SEQ ID NO:4)、NEIL3−A2−9−416(SEQ ID NO:5)、NEIL3−A2−9−71(SEQ ID NO:6)、NEIL3−A2−9−271(SEQ ID NO:11)、NEIL3−A2−10−198(SEQ ID NO:15)、NEIL3−A2−10−340(SEQ ID NO:17)、NEIL3−A2−10−590(SEQ ID NO:21)、およびNEIL3−A2−10−378(SEQ ID NO:22)の配列が、ヒト免疫系を感作することが知られている他の分子に由来するペプチドに対する相同性を有するという事実に起因する可能性がある。この可能性を排除するため、BLASTアルゴリズム(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)を用いて、クエリーとしてのこれらのペプチド配列に対する相同性解析を行ったが、有意な相同性を有する配列は認められなかった。相同性解析の結果から、NEIL3−A2−9−585(SEQ ID NO:3)、NEIL3−A2−9−127(SEQ ID NO:4)、NEIL3−A2−9−416(SEQ ID NO:5)、NEIL3−A2−9−71(SEQ ID NO:6)、NEIL3−A2−9−271(SEQ ID NO:11)、NEIL3−A2−10−198(SEQ ID NO:15)、NEIL3−A2−10−340(SEQ ID NO:17)、NEIL3−A2−10−590(SEQ ID NO:21)、およびNEIL3−A2−10−378(SEQ ID NO:22)の配列は固有のものであることが示され、したがって本発明者らの知る限りでは、これらの分子が何らかの非関連分子に対して予期しない免疫応答を引き起こす可能性は、ほとんどない。
結論として、NEIL3由来の新規HLA−A2エピトープペプチドが同定された。さらに、NEIL3のエピトープペプチドはがん免疫療法に適用可能であり得ることが実証された。
その後の半定量的RT−PCR解析から、マイクロアレイ解析に供したICC 8例のうち7例におけるNEIL3発現の上昇が明らかになった(図5a)。
NEIL3由来のHLA−A24結合ペプチドの予測
表3aおよび3bは、NEIL3の9merおよび10merのHLA−A24結合ペプチドを、結合親和性の高い順に示す。潜在的なHLA−A24結合能を有する合計21種のペプチドを選択して、エピトープペプチドを決定するために試験した。
開始位置は、NEIL3のN末端からのアミノ酸残基の数を示す。
結合スコアおよび解離定数[Kd(nM)]は、「BIMAS」および「NetMHC 3.0」から導き出している。
NEIL3由来のペプチドに対するCTLを、「材料および方法」に記載したプロトコールに従って作製した。IFN−γ ELISPOTアッセイによって、ペプチド特異的なCTL活性を決定した(図6a〜e)。それにより、NEIL3−A24−9−545(SEQ ID NO:24)で刺激したウェル番号#7(a)、NEIL3−A24−9−362(SEQ ID NO:33)で刺激した#6(b)、NEIL3−A24−10−320(SEQ ID NO:35)で刺激した#2および#8 (c)、NEIL3−A24−10−544(SEQ ID NO:41)で刺激した#8(d)、ならびにNEIL3−A24−10−87(SEQ ID NO:43)で刺激した#1および#4(e)が、対照ウェルと比較して強力なIFN−γ産生を示すことが示された。一方、表3aおよび3bに示した他のペプチドはHLA−A*2402との結合活性を有する可能性があったにもかかわらず、それらのペプチドを用いた刺激では特異的CTL活性は測定されなかった。例えば、ペプチドをパルスした標的細胞に対する、NEIL3−A24−9−364(SEQ ID NO:25)で刺激したCTL応答の典型的な陰性データ(f)。その結果、NEIL3由来の5種のペプチドが、強力なCTLを誘導し得るペプチドとしてスクリーニングされたことが示された。
NEIL3−A24−9−545(SEQ ID NO:24)で刺激したウェル番号#7(a)、NEIL3−A24−9−362(SEQ ID NO:33)で刺激した#6(b)、NEIL3−A24−10−320(SEQ ID NO:35)で刺激した#8(c)、NEIL3−A24−10−544(SEQ ID NO:41)で刺激した#8(d)、ならびにNEIL3−A24−10−87(SEQ ID NO:43)で刺激した#1(e)中の、IFN−γ ELISPOTアッセイによって検出されるペプチド特異的なCTL活性を示した細胞を増殖させて、CTL株を樹立した。これらのCTL株のCTL活性を、IFN−γ ELISAアッセイによって決定した(図7a〜e)。それにより、すべてのCTL株が、ペプチドをパルスしなかった標的細胞と比較して、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対して強力なIFN−γ産生を示すことが示された。さらに、CTL株から限界希釈することによりCTLクローンを樹立し、ペプチドをパルスした標的細胞に対するCTLクローンからのIFN−γ産生を、IFN−γ ELISAアッセイによって決定した。図8において、NEIL3−A24−9−545(SEQ ID NO:24)(a)、NEIL3−A24−10−320(SEQ ID NO:35)(b)、およびNEIL3−A24−10−544(SEQ ID NO:41)(c)で刺激したCTLクローンから強力なIFN−γ 産生が測定された。
各ペプチドに対して産生された樹立CTL株およびCTLクローンを、NEIL3およびHLA−A*2402遺伝子を内因的に発現する標的細胞を認識する能力について試験した。全長NEIL3およびHLA−A*2402遺伝子の両方をトランスフェクトしたCOS7細胞(NEIL3およびHLA−A*2402遺伝子を外因的に発現する標的細胞の特定のモデル)に対する特異的CTL活性を、対応するペプチドによって産生されたCTL株およびCTLクローンをエフェクター細胞として用いて試験した。全長NEIL3遺伝子またはHLA−A*2402のいずれかをトランスフェクトしたCOS7細胞を、対照として調製した。図9において、NEIL3−A24−9−545(SEQ ID NO:24)で刺激したCTLは、NEIL3およびHLA−A*2402の両方を発現するCOS7細胞に対する強力なCTL活性を示した。一方、対照に対する有意な特異的CTL活性は検出されなかった。したがってこれらのデータにより、NEIL3−A24−9−545(SEQ ID NO:24)は、HLA−A*2402分子と共に標的細胞上に天然に発現し、CTLによって認識されることが明確に実証された。これらの結果から、NEIL3に由来するこのペプチドが、NEIL3を発現する腫瘍を有する患者に対してがんワクチンを適用するために利用可能であり得ることが示された。
NEIL3−A24−9−545(SEQ ID NO:24)、NEIL3−A24−9−362(SEQ ID NO:33)、NEIL3−A24−10−320(SEQ ID NO:35)、NEIL3−A24−10−544(SEQ ID NO:41)、およびNEIL3−A24−10−87(SEQ ID NO:43)で刺激したCTLは、有意でかつ特異的なCTL活性を示した。この結果は、NEIL3−A24−9−545(SEQ ID NO:24)、NEIL3−A24−9−362(SEQ ID NO:33)、NEIL3−A24−10−320(SEQ ID NO:35)、NEIL3−A24−10−544(SEQ ID NO:41)、およびNEIL3−A24−10−87(SEQ ID NO:43)の配列が、ヒト免疫系を感作することが知られている他の分子に由来するペプチドと相同的であるという事実に起因する可能性がある。この可能性を排除するため、BLASTアルゴリズム(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)を用いて、クエリーとしてのこのペプチド配列に対して相同性解析を行ったが、有意な相同性を有する配列は認められなかった。相同性解析の結果から、NEIL3−A24−9−545(SEQ ID NO:24)、NEIL3−A24−9−362(SEQ ID NO:33)、NEIL3−A24−10−320(SEQ ID NO:35)、NEIL3−A24−10−544(SEQ ID NO:41)、およびNEIL3−A24−10−87(SEQ ID NO:43)の配列は固有のものであることが示され、したがって、本発明者らの知る限りでは、この分子が、ある非関連分子に対して意図しない免疫応答を引き起こす可能性はほとんどない。
結論として、NEIL3由来の新規なHLA−A*2402エピトープペプチドが同定された。さらに、NEIL3ががん免疫療法に適用可能であり得ることが実証された。
本発明は、新規TAA、特に強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し得、多種多様ながんのタイプに対する適用性を有し得る、NEIL3由来の新規TAAを提供する。このようなTAAは、がんの診断および治療において有用であり得る。
Claims (20)
- 1個または2個のアミノ酸が置換された、SEQ ID NO:24、33、35、41、および43からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)誘導能を有する単離されたペプチドであって、該置換が以下の一方または両方である、単離されたペプチド:
(a)SEQ ID NO:24、33、35、41、または43のN末端から2番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、およびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている;ならびに
(b)SEQ ID NO:24、33、35、41、または43のC末端のアミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、およびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。 - 1個または2個のアミノ酸が置換された、SEQ ID NO:5、3、4、6、11、15、17、21、および22からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)誘導能を有する単離されたペプチドであって、該置換が以下の一方または両方である、単離されたペプチド:
(a)SEQ ID NO:5、3、4、6、11、15、17、21、または22のN末端から2番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている;ならびに
(b)SEQ ID NO:5、3、4、6、11、15、17、21、または22のC末端のアミノ酸が、バリンおよびロイシンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。 - SEQ ID NO:24、5、3、4、6、11、15、17、21、22、33、35、41、および43からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、単離されたペプチド。
- 請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- CTLを誘導するための組成物であって、請求項1〜3のいずれか一項記載の1種もしくは複数種のペプチド、または請求項4記載の1種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、組成物。
- がんの治療および/もしくは予防、ならびに/またはその術後再発の防止のための薬学的組成物であって、請求項1〜3のいずれか一項記載の1種もしくは複数種のペプチド、または請求項4記載の1種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、薬学的組成物。
- HLA−A24またはHLA−A2であるHLA抗原を有する対象への投与が意図される、請求項6記載の薬学的組成物。
- がんを治療することが意図される、請求項6または7記載の薬学的組成物。
- 以下からなる群より選択される1つの段階を含む、CTL誘導能を有する抗原提示細胞(APC)をインビトロで誘導するための方法:
(a)APCを請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドとインビトロで接触させる段階、および
(b)請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階。 - 以下からなる群より選択される1つの段階を含む方法によって、CTLをインビトロで誘導するための方法:
(a)CD8陽性T細胞を、HLA抗原と請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドとの複合体をその表面上に提示するAPCと共培養する段階;
(b)CD8陽性T細胞を、HLA抗原と請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドとの複合体をその表面上に提示するエキソソームと共培養する段階;および
(c)請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドに結合するT細胞受容体(TCR)サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をT細胞に導入する段階。 - HLA抗原と請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドとの複合体をその表面上に提示する、単離されたAPC。
- 請求項9記載の方法によって誘導される、請求項11記載のAPC。
- 請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドのいずれかを標的とする、単離されたCTL。
- 請求項10記載の方法によって誘導される、請求項13記載のCTL。
- 対象においてがんに対する免疫応答を誘導するための剤であって、請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチド、または該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、剤。
- 請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドのいずれかおよびHLA抗原を含む複合体を提示する、エキソソーム。
- 請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドのいずれかに対する抗体またはその断片。
- 請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
- 請求項18記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
- 請求項1〜3のいずれか一項記載のペプチドのいずれか、請求項4記載のポリヌクレオチド、または請求項17記載の抗体を含む、診断キット。
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