JP5871279B2 - アミロイドβペプチド蓄積を伴う疾患の診断の為の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質770β切断産物の検出方法 - Google Patents
アミロイドβペプチド蓄積を伴う疾患の診断の為の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質770β切断産物の検出方法 Download PDFInfo
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Description
[1]下記の工程:
(1)被験者由来の生体試料と、可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体又はアミロイドβ前駆体タンパク質770特異的抗体とを接触させる工程;及び
(2)工程(1)で形成された複合体中の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質770βを検出する工程;
を含む、血管内皮細胞由来の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質770βの検出方法。
[2]工程(1)において、可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体又はアミロイドβ前駆体タンパク質770特異的抗体のいずれか一方を使用し、
工程(2)が、
(2a)工程(1)で形成された複合体中の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質770βと、工程(1)で使用しなかった他方の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体又はアミロイドβ前駆体タンパク質770特異的抗体とを接触させる工程;及び
(2b)工程(2a)で形成された複合体を検出する工程;
である、[1]に記載の検出方法。
[3]生体試料が血液、血漿又は血清である[1]又は[2]に記載の方法。
[4]生体試料が脳脊髄液である[1]又は[2]に記載の方法。
[5]生体試料が血管内皮細胞の培養上清である[1]又は[2]に記載の方法。
[6] 工程(1)、(2)に加えて、下記の工程:
(3)アミロイドβペプチドの蓄積を伴う疾患が疑われる被験者由来の生体試料と、可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体又は可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質695β特異的抗体とを接触させる工程;及び
(4)工程(3)で形成された複合体中の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質695βを検出する工程;
を含み、可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質695βの検出も含めた、[1]から[5]のいずれか1つに記載の方法。
[7]工程(3)において、可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体又はアミロイドβ前駆体タンパク質695特異的抗体のいずれか一方を使用し、
工程(4)が、
(4a)工程(3)で形成された複合体中の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質695βと、工程(3)で使用しなかった他方の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体又は可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質695β特異的抗体とを接触させる工程;及び
(4b)工程(4a)で形成された複合体を検出する工程;
である、[6]に記載の検出方法。
[8] 工程(1)における生体試料が血液、血漿、血清、血管内皮細胞の培養上清又は脳脊髄液であり、工程(3)における生体試料が脳脊髄液である[6]又は[7]に記載の方法。
[9] アミロイドβ前駆体タンパク質770特異的抗体がOX2ドメインを認識する抗体である[1]から[8]のいずれか1つに記載の方法。
[10]被験者がアミロイドβペプチドの蓄積を伴う疾患の罹患を疑われる、[1]から[9]のいずれか1つに記載の方法。
[11]疾患が脳血管アミロイドアンギオパチー、脳血管性痴呆症、脳梗塞、アルツハイマー病の少なくともいずれか一つである[10]に記載の方法。
[12]被験者が脳血管アミロイドアンギオパチー、脳血管性痴呆症、脳梗塞の少なくともいずれか一つと、アルツハイマー病の併発を疑われる[1]から[9]のいずれか1つに記載の方法。
[13]可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体及び/又はアミロイドβ前駆体タンパク質770特異的抗体を有効成分とする、アミロイドβペプチドの蓄積を伴う疾患の診断薬。
[14]可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体及びアミロイドβ前駆体タンパク質770特異的抗体を含む、アミロイドβペプチドの蓄積を伴う疾患の診断用キット。
[15]可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質695β特異的抗体を更に含む、[14]の診断用キット。
[16]疾患が脳血管アミロイドアンギオパチー、脳血管性痴呆症、脳梗塞、アルツハイマー病の少なくともいずれか一つを対象とする[13]に記載の診断薬又は[14]若しくは[15]に記載のキット。
[17]疾患が、脳血管アミロイドアンギオパチー、脳血管性痴呆症、脳梗塞の少なくともいずれか一つと、アルツハイマー病の併発を対象とする[16]に記載の診断薬又はキット。
[18]下記の工程:
(1)被験者より採取された生体試料と、可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体又はアミロイドβ前駆体タンパク質770特異的抗体とを接触させる工程;及び
(2)工程(1)で形成された複合体中の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質770βを検出する工程;
を含む、血管内皮細胞由来の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質770βを検出してアミロイドβペプチドの蓄積を伴う疾患に罹患している可能性を判定する方法。
[19]工程(1)において、可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体又はアミロイドβ前駆体タンパク質770特異的抗体のいずれか一方を使用し、
工程(2)が、
(2a)工程(1)で形成された複合体中の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質770βと、工程(1)で使用しなかった他方の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体又はアミロイドβ前駆体タンパク質770特異的抗体とを接触させる工程;及び
(2b)工程(2a)で形成された複合体を検出する工程;
である、[18]に記載の検出方法。
[20]生体試料が血液、血漿又は血清である[18]又は[19]に記載の方法。
[21]生体試料が脳脊髄液である[18]又は[19]に記載の方法。
[22]生体試料が血管内皮細胞の培養上清である[18]又は[19]に記載の方法。
[23]工程(1)、(2)に加えて、下記の工程:
(3)被験者より採取された生体試料と、可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体又は可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質695β特異的抗体とを接触させる工程;及び
(4)工程(3)で形成された複合体中の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質695βを検出する工程;
を含み、可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質695βの検出も含めた、[18]から[22]のいずれか1項に記載の方法。
[24]工程(3)において、可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体又はアミロイドβ前駆体タンパク質695特異的抗体のいずれか一方を使用し、
工程(4)が、
(4a)工程(3)で形成された複合体中の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質695βと、工程(3)で使用しなかった他方の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体又は可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質695β特異的抗体とを接触させる工程;及び
(4b)工程(4a)で形成された複合体を検出する工程;
である、[23]に記載の検出方法。
[25]工程(1)における生体試料が血液、血漿血清、血管内皮細胞の培養上清又は脳脊髄液であり、工程(3)における生体試料が脳脊髄液である[23]又は[24]に記載の方法。
[26]アミロイドβ前駆体タンパク質770特異的抗体がOX2ドメインを認識する抗体である[18]から[25]のいずれか1項に記載の方法。
[27]アミロイドβペプチドの蓄積を伴う疾患が脳血管アミロイドアンギオパチー、脳血管性痴呆症、脳梗塞、アルツハイマー病の少なくとも何れか一つである[18]から[26]のいずれか1項に記載の方法。
[28]可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質770βの検出から脳血管アミロイドアンギオパチー、脳血管性痴呆症、脳梗塞の少なくともいずれか一つの疾患の罹患の可能性を判定する[18]から[26]のいずれか1つに記載の方法。
[29]下記の工程:
(1’)アミロイドβペプチドの蓄積を伴う疾患が疑われる被験者由来の生体試料と、アミロイドβ前駆体タンパク質770特異的抗体又は可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体を接触させる工程;及び
(2’)工程(1’)で形成された複合体中の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質770を検出する(好ましくは定量的に検出する)工程
を含む、血管内皮細胞由来の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質770βの検出方法。
本発明の診断用キット及び診断薬は、上記の本発明の検出方法に適しており、アミロイドβペプチドの蓄積を伴う疾患の、効率的な診断を可能にする。
本発明において、アミロイドβ前駆体タンパク質(APP)とは、βセクレターゼ(BACE1)により切断され、アミロイドβペプチド(本明細書中、Aβペプチド、又は単にAβとも言う)を産生する分子を意味する。APPとしては、検出する対象に応じて、対象と同じ種由来のAPPを用いることが望ましい。一例として、ヒトAPPには3種類のスプライシングバリアント、APP695、APP751及びAPP770が知られている。
また、可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質α(sAPPα)とは、Aβ非産生経路として知られるαセクレターゼによるAPPの切断(α切断と呼ばれる)で産生されたAPPのN末端側の断片を意味し、α部位はその切断部位を意味する。
生体内におけるAβレベルが高い対象においては、典型的には、Aβの脳実質部分への蓄積(老人斑と呼ばれる)や脳血管内への蓄積(脳血管アミロイドアンギオパチー(CAA)と呼ばれる)がみられる。さらに神経細胞の破壊、脳血管障害などが起こり、これらが進行した状態においては認知症として症状が顕在化する。加齢が進むに従って生体内のAβレベルは上昇すると考えられることから、生体内におけるAβレベルが高い状態は、正常な老化現象によっても起こり得るが、アルツハイマー病においてはより急速な上昇がみられる。したがって、アミロイドβペプチドの蓄積を伴う疾患には、典型的には、症状が顕在化しているかいないかに関わらず、アルツハイマー病、脳血管アミロイドアンギオパチー、脳血管性痴呆症、その他の認知症、脳梗塞等が含まれる。脳血管内のAβ蓄積は、アルツハイマー病の初期段階に見出される、との報告もあることから、可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質770βの増加は、毒性の高いAβオリゴマーの増加に先立って起きる可能性がある。
本発明の内皮細胞由来の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質770βの検出方法は、下記の工程:
(1)アミロイドβペプチドの蓄積を伴う疾患が疑われる被験者由来の生体試料と、可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体又はアミロイドβ前駆体タンパク質770特異的抗体とを接触させる工程;及び
(2)工程(1)で形成された複合体中の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質770βを検出する(好ましくは定量的に検出する)工程;
を含むことを特徴とする(以下、検出方法Iとも言う)。
(3)アミロイドβペプチドの蓄積を伴う疾患が疑われる被験者由来の生体試料と、可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体又は可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質695β特異的抗体とを接触させる工程;及び
(4)工程(3)で形成された複合体中の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質695βを検出する工程;
を含み、可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質695βも検出することができる。
「sAPP695β特異的抗体」とは、上記sAPP695βと結合する能力があり、且つsAPP770β及びsAPP751βに結合しない抗体を意味する。このような抗体は、sAPP695βのアミノ酸配列、又は糖鎖付加状態等の情報に基づき、自体公知の方法により調製することができる。具体的には例えば、sAPP695βを特異的に認識する抗体は、配列番号2の配列中、KPI領域とOX2領域が存在する288〜364番目のアミノ酸配列が除かれて287番目と365番目が連結した部分を含む40アミノ酸の配列、好ましくは30アミノ酸の配列、より好ましくは10から20アミノ酸の配列を認識する抗体であれば良い。これらの配列の抗原ペプチドを設計して当該ペプチドを用いて抗体を作製することで、sAPP770β及びsAPP751βは認識せずにsAPP695βを特異的に認識する抗体を得ることができる。このような抗体は、APP695を特異的に結合し、APP770及びAPP751には結合しない能力も併せ持つ。
また、神経細胞でのAβ産生と対比することを目的としてsAPP695β、更にはsAPP751βを検出した場合には、神経細胞でのAβの蓄積を伴う疾患、好適にはアルツハイマー病に罹患しているか又は該疾患を発症する蓋然性が高いと判定することができる。sAPP770βの検出での対象疾患がアルツハイマー病であった場合、前記判定はアルツハイマー病の発症状態をより詳細に判定することができる。
(2a)工程(1)で形成された複合体中の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質770βと、工程(1)で使用しなかった他方の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体又はアミロイドβ前駆体タンパク質770特異的抗体とを接触する工程;及び
(2b)工程(2a)で形成された複合体を検出する工程;
である。
また、sAPP695βを抗体を利用して検出する方法を採用する場合、前記工程(4)は、好ましくは、
(4a)工程(3)で形成された複合体中の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質695βと、工程(3)で使用しなかった他方の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体又は可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質695β特異的抗体とを接触させる工程;及び
(4b)工程(4a)で形成された複合体を検出する工程;
である。
抗体の標識、sAPP770βとの接触方法及び接触条件についての説明は、上記工程(1)における抗体の標識、生体試料との接触方法及び接触条件ついての対応する記載を適用することができる。
蛍光物質としては、APC、PE、Cy2、Cy3、Cy5、ECD、FITC、PerCP、Alexa(登録商標)Fluor、フルオレセイン、ローダミンなどの化学物質を好ましく利用することができる。これらの化学物質による標識は、自体公知の方法で行なうことができる。
蛍光は、市販の測定機器、蛍光顕微鏡などを用いて検出することができる。
神経細胞でのAβ産生と対比して血管内皮細胞でのAβ産生につき判別する目的の為に、検出対象としてsAPP695βの検出を加えた場合は、上述の工程(2a)及び(2b)でのsAPP770βの扱いと同様にsAPP695βを扱うことができる。更にはsAPP751βを検出する場合も同様である。
血管内皮細胞でのAβ産生の指標となるsAPP770βレベルは、Aβ蓄積を伴う疾患、好適には脳血管アミロイドアンギオパチー、脳血管性痴呆症、脳梗塞若しくはアルツハイマー病、より好ましくは脳血管内でのAβ蓄積を病因とする脳血管アミロイドアンギオパチー、脳血管性痴呆症、脳梗塞に罹患しているか又は該疾患を発症する蓋然性が高いとする判定に利用される。神経細胞でのAβ産生の指標となるsAPP695βレベルは、脳実質部分でのAβ蓄積を伴う疾患、好適にはアルツハイマー病に罹患しているか又は該疾患を発症する蓋然性が高いとする判定に利用される。
従って、本発明でのsAPP770βの検出は、脳微小血管から移行したAβの蓄積する可能性、或いは脳血管アミロイドアンギオパチーとの相関よりアルツハイマー病の診断を可能にするものである。sAPP695βの検出によるアルツハイマー病の診断は神経細胞から産生された脳実質部分でのAβ蓄積に着目しているので、sAPP770βの検出によるアルツハイマー病の診断は、sAPP695βの検出による診断とは異なる原理によってアルツハイマー病の診断を可能とする。これは、sAPP770βの検出とsAPP695βの検出を併せたアルツハイマー病の診断は、それぞれを単独で行うよりも詳細にアルツハイマー病の病状を診断できることも意味する。
(1’)アミロイドβペプチドの蓄積を伴う疾患が疑われる被験者由来の生体試料と、アミロイドβ前駆体タンパク質770特異的抗体又は可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体を接触させる工程;及び
(2’)工程(1’)で形成された複合体中の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質770を検出する(好ましくは定量的に検出する)工程
を含む、検出方法であり得る(以下、検出方法IIとも言う)。
本発明は、アミロイドβ前駆体タンパク質770特異的抗体及び/又は可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体を有効成分とする、アミロイドβペプチドの蓄積を伴う疾患の診断薬を提供する。本発明の診断薬の有効成分である抗体は、「1.可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質770βの検出方法」に記載の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体及び/又はアミロイドβ前駆体タンパク質770特異的抗体である。
本発明は、アミロイドβ前駆体タンパク質770特異的抗体及び可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体を有効成分とする、アミロイドβペプチドの蓄積を伴う疾患の診断用キットを提供する。本発明の診断用キットの有効成分である抗体は、「1.可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質770βの検出方法」に記載の抗体である。
本研究において使用した材料の供給源は次の通りである:組織培養培地及び試薬(DMEMを含む)はInvitrogenから;組換えペプチドN−グリコシダーゼF(PNGase)はNew England BioLabsから;O−グリコシダーゼはRocheから;Arthrobacter ureafaciensシアリダーゼはナカライテスクから;プロテインA−セファロースFast FlowはGE Healthcareから;タンパク質分子量スタンダードはBio-Radから;一連のレクチン結合アガロースは生化学工業株式会社から;Aβ40はPeptide Instituteから;BCAプロテインアッセイ試薬及びsulfo-NHS-LC-biotinはThermo Fisher Scientific Inc.から;他の全ての化学製品はSigma又はWako Chemicalsから。オリゴDNAプライマーは、Invitrogenより入手した。使用したプライマーを表1に示す。内因性膜結合(インタクトな)APPに対する抗APPウサギポリクローナル抗体(C15抗体)は、丸山敬先生(埼玉医科大学、埼玉、日本)から提供していただいた。使用した商業的に入手可能な抗体は次の通りである:マウスモノクローナル抗−APP 22C11抗体(Chemicon);抗ヒトsAPPα抗体(6E10;Signet Laboratories);抗GAPDH抗体(Chemicon);抗KPI抗体(Chemicon);抗OX2抗体(Chemicon);抗ヒトsAPPβ抗体(IBL Co.);ヤギポリクローナル抗PECAM抗体(Santa Cruz Biotechnology)。臨床研究は、理化学研究所及び福島県立医科大学の倫理委員会の承認を受けた。全ての動物実験は、理化学研究所の動物実験のためのガイドラインに従って実施した。
ヒトAPP770 FLAG−pEFは、PCR(プライマー1及び2を使用)により増幅したヒトAPP770配列を(ベクターの)SalI及びHindIII部位に挿入することにより構築し、FLAG領域断片は、プライマー3及び4をHindIII及びXbaI部位にアニールさせることにより作製した。ViraPowerアデノウイルス発現系(Invitrogen)を製造者のプロトコールに従って使用し、ヒトAPP−FLAGを保持する組換えアデノウイルスを作製した。一連のAPP770−pcDNA3.1変異体は、QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)を使用して作製した。APPOX2All変異体(OX2領域において全ての可能性のあるO型糖鎖付加部位を欠失させた)を作製するために、まずAPPS346,348Aを構築し、その後、APPS346,348Aを鋳型として使用し、プライマーとしてAPPSOX2Aforward及びreverseを使用して、APPOX2All変異体を作製した。APPAll変異体(APP770領域全体において全ての報告されているO型糖鎖付加部位(J Proteome Res 2009 8(2):631-642)を欠失させた)を作製するために、本発明者らは鋳型としてAPPOX2All変異体を使用し、プライマーとしてAPPT291,292Aforward及びreverse並びにAPPT651Aforward及びreverseを使用して、Thr291、Thr292及びThr651をAlaに置換した。ヒト脳血管内皮細胞(BMEC、Applied Cell Biology Research Institute)は、10% FBSを含む又は含まないCS−C完全培地で培養し、継代4代以内に使用した。HUVEC(TaKaRa)は、2% FBS及びEGMTM-2 SingleQuotsを含むEMB−2(TaKaRa)で培養し、継代4代以内に使用した。初代肝臓類洞内皮細胞(LSEC)は、CD146 MicroBeads(Miltenyi Biotec)を製造者のプロトコールに従って使用してマウス肝臓から調製した。COS−7細胞は、10%FBSを含むDMEMで培養した。
非ケトン性高浸透圧性昏睡により死亡した患者(60歳)を本試験に採用した。CSF試料は、ADを有する患者から採取した。本試験は、福島県立医科大学の倫理委員会による承認を受けた(No.613)。
Sepasol試薬(ナカライテスク株式会社)を使用して、細胞から全RNAを単離し、5μgの単離したRNAを、Super Script III RT Kit(Invitrogen)を製造者のプロトコールに従って使用してランダムヘキサマーを用いて逆転写した。得られたcDNA試料を、APP695、APP751及びAPP770についてはプライマーA及びD、APP751及びAPP770についてはプライマーB及びD、並びにAPP770についてはプライマーC及びDを用いてPCR解析に供した。PCRは、28サイクル実施した(95℃で40秒、56℃で40秒、72℃で90秒)。
脳組織を、リン酸緩衝15%ホルマリン溶液で固定し、パラフィルムに包埋した。1組の連続切片(厚さ5μm)について、一方をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。他方を37℃で一晩、抗OX2抗体(1:100)でインキュベートした後、ビオチン化抗ウサギIgG(1:200)でインキュベートした。結合した抗原を、アビジン・ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体法(ABCキット;Vector Laboratories)を用いて可視化した。
細胞ライセートを、プロテアーゼインヒビターカクテル(Roche)を含むT−PER緩衝液中で可溶化し、SDS−PAGE(5〜20%勾配ゲル)に供した後、ニトロセルロース膜に移した。次いで膜を、抗APP 22C11(1:1,000希釈)、抗APP C15(1:1,000希釈)、抗sAPPβ(1:500希釈)、抗sAPPα(1:1,000希釈)、抗KPI(1:250希釈)及び抗OX2抗体(1:250希釈)とインキュベートした。適切な、西洋ワサビペルオキシダーゼ−ロバ抗ヤギIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)、抗マウス及び抗ウサギIgG(GE Healthcare)抗体を、二次抗体(1:1,000希釈)として使用した。化学発光基質(Thermo Fisher Scientific Inc.)を、結合した抗体の検出に使用した。ローディングコントロールとして、同じ膜を使用して、抗GAPDH抗体(1:250希釈;Chemicon)とインキュベートすることにより、GAPDHを検出した。検出されたシグナルを、Luminoimage Analyzer LAS-1000 PLUS(富士フイルム)を使用して定量した。BMECからの培地は、SSA−又はConA−アガロースと16時間インキュベートした。ヒトCSF(0.2〜0.5ml)又は培養した細胞からの培地は、ヘパリン−セファロース(Thermo Fisher Scientific Inc.)とインキュベートした。沈殿は、SDS−PAGEの前に、PBSで3回洗浄した。
BMECを、APP770−FLAG過剰発現用アデノウイルス調製物で感染させ、Opti-MEMで8時間培養した。培地中のAβ40及びAβ42のレベルは、BMECについてはHuman Amyloid β(1-40) or (1-42) Assay Kit (IBL Co.)を、マウスニューロンについてはHuman/Rat βAmyloid (40) or (42) ELISA Kit(Wako Chemicals)を使用して決定した。
細胞ライセート又は培地からヘパリンにより沈殿させた試料を、Arthrobacter ureafaciensシアリダーゼ(4μU)及び/又はO−グリカナーゼ(2mU)の存在下又は非存在下で18時間インキュベートした。
10cm培養皿で増殖させたBMECを、Sulfo-NHS-LC-Biotinで4℃にて30分間標識した。0.1Mグリシンを含むPBS(pH8.0)で3回、PBSで1回、細胞を洗浄した後、細胞ライセートを調製した。更なる分析のために、ビオチン化した細胞表面タンパク質を、ストレプトアビジン−セファロース(GE Healthcare)でプルダウンした。
10cm組織培養皿で増殖させたサブコンフルエントなBMECを、ベンジルGalNAc(2mM)の存在下で18時間インキュベートし、その後、更なる分析のために、細胞ライセート及び培地試料を調製した。
本実施例に、APPの選択的スプライシングによる3種類のアイソフォームの細胞型特異的な発現を説明する。
ヒト脳は、3種類の選択的スプライスによるAPP mRNAアイソフォーム、APP695、APP751及びAPP770を発現する(Nature 1988 331(6156):525-527; Nature 1988 331(6156):528-530)(図1A)が、ニューロンはAPP695に限って発現する(Proc Natl Acad Sci U S A 1993 90(20):9513-9517; Proc Natl Acad Sci U S A 1990 87(4):1561-1565; Proc Natl Acad Sci U S A 1989 86(16):6338-6342)。これらの情報から、脳において細胞型特異的なAPPのスプライシング現象が起こることが示唆される。本実施例において、本発明者らは脳内皮細胞に着目し、確立した初代ヒト脳微小血管内皮細胞(BMEC)を使用し、脳内皮APPを解析した。抗APP C末端抗体(C15)を使用したウェスタンブロット解析により、BMECが、初代ニューロンと比較して同等のレベルの、又はむしろ高いレベルのAPPを発現することを示した(図1B)。内皮APPは、SDS−PAGE後のゲル移動度の異なる、2つの別々のバンドを示した。抗KPI抗体及び抗OX2抗体も、2つの内皮型APPを検出したことから、内皮細胞がAPP770を発現すると結論付けた。抗KPI抗体も抗OX2抗体も、ニューロンのAPPを検出しなかったことから、ニューロンはAPP695のみを発現するという以前の報告(Proc Natl Acad Sci U S A 1993 90(20):9513-9517; Proc Natl Acad Sci U S A 1990 87(4):1561-1565)が確認された。抗KPI抗体又は抗OX2抗体でBMECライセートを分析した場合には、2つのAPPのバンドの間にさらに1つのバンドが見出された。このバンドは、APPのC末端配列を欠く、APP又はsAPPのプロセスされた形態である可能性が高い。ヒト臍帯血由来血管内皮細胞(HUVEC)も、発現レベルはBMECにおけるものよりも顕著に低かったものの、2種類の型のAPPを発現し、APP770が内皮細胞において広く発現していることが示された。
APP転写産物を分析するために、本発明者らは、内皮細胞及び初代ニューロンからRNAを単離した。次いで、逆転写したcDNA試料を、一連のオリゴヌクレオチドプライマーを使用するPCRにより分析し、APP695、APP751及びAPP770を検出した。図1Cに示すように、ニューロンがAPP695を発現したのに対し、内皮細胞はAPP770を発現し、APP695を発現しなかった。これらの結果から、細胞型特異的APP発現が確認された。
本実施例に、APP770の糖鎖付加状態について説明する。
APPは、2つのN結合型、及び複数のO結合型糖鎖を有する可能性がある(Biochim Biophys Acta 1999 1472(1-2):344-358; J Proteome Res 2009 8(2):631-642; J Biol Chem 1998 273(11):6277-6284)ことから、本発明者らは、高分子量APP770(APP−H)は高度に糖鎖付加されていると予想した。一連のレクチンプルダウンアッセイの結果(図2)に基づき、APP−H及び低分子量APP770(APP−L)を、それぞれSambucus sieboldiana凝集素(SSA)−及びコンカナバリンA(ConA)−アガロースにより分離し、ペプチドN−グリコシダーゼ(PNGase)で消化し、N結合型糖鎖を除去した。図4Aに示すように、PNGase処理後、2つの形態のAPPはいずれも、処理前よりもSDS−PAGEゲル内でわずかに早く移動した。したがって、両形態がN結合型糖鎖を有すること、及び両形態の分子量の違いはN結合型糖鎖のみでは説明できないことが示された。
APP−Hは、Siaα2,6Gal/GalNAcを認識するSSAレクチンに対して親和性を有することから、本発明者らは、APP−Hがシアル酸残基を有するO結合型糖鎖を含むと予想した。シアリダーゼ処理の後、APP−Hの移動度は顕著に変化し、APP−Lのものに近くなった(図4B)。シアリダーゼとO−グリコシダーゼでの処理の後、APP−Hの移動度はAPP−Lのものと完全に一致した。O−グリコシダーゼは置換されていないコア1型O結合型糖鎖のみを切断することから、本発明者らは、APP−Hがシアル酸化されたコア1型O結合型糖鎖を有すると結論付けた。COS細胞においてAPP695、APP751又はAPP770を過剰発現させた場合、APPの2つの形態の間の移動度の差は、APP770の場合には常に明確に見られた(図3)。これらのデータは、OX2領域におけるO結合型糖鎖の存在を示唆する。
そこで本発明者らは、OX2領域内の各Ser/Thr残基を個別にAlaに置換した、一連のAPP770変異体を作製した(図4C)。次いで、野生型APP770及びその変異体を、COS細胞において過剰発現させた。O結合型糖鎖付加機構はCOS細胞においては十分には発達していないが、本発明者らは、低レベルのAPP−Hを検出した(図4D)。Ser346、Ser348及びThr352における変異は、SDS−PAGEゲルにおけるAPP変異体の移動度には影響しなかったが、APPT353A変異体(Thr353をAlaに置換した)は、野生型APPよりも速く移動した(図4D)。これらの結果は、O結合型糖鎖がThr353に付加されていることを示唆する。
APPT353A及びAPPOX2all(OX2領域内の全てのSer/Thr残基をAlaへと変異させた)の両方がなおも2つの別々のバンドを示したという知見は、APP770のOX2領域以外の領域にO結合型糖鎖付加部位がさらに存在することを示唆する。Perdivaraら(J Proteome Res 2009 8(2):631-642)は最近、APP695が、Thr291、Thr292及びThr576においてO結合型糖鎖で修飾されることを示した。そこで本発明者らは次に、APP770変異体APPall(APPOX2allからさらに、Thr291、Thr292、Thr651(APP695についてはThr576)及びThr652をAlaに置換した)を作製した。APPallはほぼ単一のバンドを示し(図4D)、このことは本発明者らが、APPall変異体においてAPP770の全てのO結合型糖鎖付加部位を変異させたことを示す。
本実施例に、脳血管内皮細胞BMECから分泌されるsAPPの糖鎖付加状態について説明する。
本発明者らは、内皮細胞におけるAPP代謝産物を分析するために、抗APP 22C11抗体(APPのN末端領域を認識する)を用いて、BMECライセート及び培地試料のウェスタンブロット解析を行なった。図5Aに示すように、培地において、細胞ライセートにおいて見られた2つのAPP(APP−H及びAPP−L)のバンドの間の移動度を有する単一のsAPPのバンドを検出した。このことはsAPPがAPP−Hのみに由来することを示唆する。実際、sAPPは、シアリダーゼ及びO−グリコシダーゼ処理の両方に感受性であり(図5B)、このことはsAPPが、シアル酸化されたコア1型O結合型糖鎖鎖を含むことを示す。
本発明者らが、O結合型糖鎖を有さないsAPPを検出できなかったことは、注目すべき点である。α部位におけるAPPの切断は細胞表面において起こるように見える一方、β部位における切断はエンドサイトーシス経路の間に起こる(J Cell Biol 2003 160(1):113-123)という一般的側面を考慮すると、O結合型糖鎖付加のないAPPは細胞表面に移動できず、α−セクレターゼとβ−セクレターゼのいずれにも接触できないという可能性も考えられた。しかしながら、細胞表面ビオチン化実験により、APP−H及びAPP−Lの両方が細胞表面に到達することが示された(図5C)。さらに、ベンジルGalNAc(O結合型糖鎖鎖伸長の阻害剤)は、培地へのsAPPの分泌を阻害しなかった(図5D)。これらのことは、APP770が分泌経路に入るためには、APP770に1つのGalNAcが付加されれば十分であることを示唆する。
本実施例において、APP770がヒト脳血管において発現し、α及びβ部位において切断され、CSFへと分泌されることを説明する。
APP770のプロセシングについて、内皮のαセクレターゼ及びβセクレターゼの発現レベル及び活性に関しては限られた情報しか存在しないことから、本発明者らはBMECから分泌される可溶性sAPP770を解析した。sAPPα及びsAPPβに対する特異的抗体を使用したところ、sAPPα及びsAPPβの両方が検出された(図6A)。
内皮細胞にはアミロイド産生性のβセクレターゼ経路が存在することから、これらの細胞がγセクレターゼ活性も有し、Aβペプチドを産生すると考えることができる。APP770を過剰発現するBMECの培地において、Aβ40及びAβ42の両方が検出され、内皮のAβ42/Aβ40の比は、ニューロンにおけるものと同様であった(図6B)。
APP770が脳血管において実際に発現しているか否かを明らかにするために、本発明らはまず大脳皮質切片を抗OX2抗体を用いて分析し、APP770の局在を決定した。静脈及び細静脈の内皮細胞の内腔領域は抗OX2抗体で染色されたが、平滑筋細胞は染色されなかった(図6C)。くも膜の血管においては免疫組織化学的シグナルは観察されなかった。
次に、CSFがsAPP770β(APP770のN末端側のβセクレターゼ切断産物)を含むか否か調べた。ヘパリン−アガロースを用いてsAPPをCSFからプルダウンし、次いで抗APP22C11抗体、抗OX2抗体及び抗sAPPβ抗体を用いて免疫染色を行なった。抗APP22C11抗体により2つのバンドが検出され、それらのうち上のバンドのみが抗OX2抗体により検出された(図6D)。このことは、上のバンドがAPP770由来であることを示す。上下のバンドが両方とも抗sAPPβ抗体により検出されたことは、両形態ともにβセクレターゼ切断産物を含むことを示す。これらの結果は、対象から採取したCSFが、生体内の内皮細胞によるsAPP770βの産生の有無を調べるための試料として採用され得ることを示す。
Claims (12)
- 下記の工程:
(1)脳血管アミロイドアンギオパチーの罹患を疑われる被験者由来の生体試料と、可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体又はアミロイドβ前駆体タンパク質770特異的抗体とを接触させる工程;及び
(2)工程(1)で形成された複合体中の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質770βを検出する工程、ここで可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質770βレベルが基準値と比較して高い場合に、被験者は脳血管アミロイドアンギオパチーに罹患しているか又は脳血管アミロイドアンギオパチーを発症する蓋然性が高い;
を含む、血管内皮細胞由来の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質770βの検出方法。 - 工程(1)において、可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体又はアミロイドβ前駆体タンパク質770特異的抗体のいずれか一方を使用し、
工程(2)が、
(2a)工程(1)で形成された複合体中の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質770βと、工程(1)で使用しなかった他方の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体又はアミロイドβ前駆体タンパク質770特異的抗体とを接触させる工程;及び
(2b)工程(2a)で形成された複合体を検出する工程、ここで検出された可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質770βレベルが基準値と比較して高い場合に、被験者が脳血管アミロイドアンギオパチーに罹患しているか又は脳血管アミロイドアンギオパチーを発症する蓋然性が高い;
である、請求項1に記載の検出方法。 - 生体試料が血液、血漿又は血清である請求項1又は2に記載の方法。
- 生体試料が脳脊髄液である請求項1又は2に記載の方法。
- 生体試料が血管内皮細胞の培養上清である請求項1又は2に記載の方法。
- 工程(1)、(2)に加えて、下記の工程:
(3)前記生体試料と、可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体又は可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質695β特異的抗体とを接触させる工程;及び
(4)工程(3)で形成された複合体中の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質695βを検出する工程;
を含み、可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質695βの検出も含めた、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。 - 工程(3)において、可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体又はアミロイドβ前駆体タンパク質695特異的抗体のいずれか一方を使用し、
工程(4)が、
(4a)工程(3)で形成された複合体中の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質695βと、工程(3)で使用しなかった他方の可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体又は可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質695β特異的抗体とを接触させる工程;及び
(4b)工程(4a)で形成された複合体を検出する工程;
である、請求項6に記載の検出方法。 - 工程(1)における生体試料が血液、血漿、血清、血管内皮細胞の培養上清又は脳脊髄液であり、工程(3)における生体試料が脳脊髄液である請求項6又は7に記載の方法。
- アミロイドβ前駆体タンパク質770特異的抗体がOX2ドメインを認識する抗体である請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
- 可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体及び/又はアミロイドβ前駆体タンパク質770特異的抗体を有効成分とする、脳血管アミロイドアンギオパチーの診断薬。
- 可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質βを認識する抗体及びアミロイドβ前駆体タンパク質770特異的抗体を含む、脳血管アミロイドアンギオパチーの診断用キット。
- 可溶型アミロイドβ前駆体タンパク質695β特異的抗体を更に含む、請求項11の診断用キット。
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