JP7280610B2 - 細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の、診断用マーカー、診断を補助する方法、診断のためにデータを収集する方法、罹患可能性を評価する方法、及び診断用キット - Google Patents
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特許法第３０条第２項適用 ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｂｓｔｒａｃｔｓｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍ／ｐｐ８／＃！／７８８３／ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ／６３３１９（令和１年９月２１日公開）
本発明は、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の、診断用マーカー、診断を補助する方法、診断のためにデータを収集する方法、罹患可能性を評価する方法、及び診断用キットに関する。
１９０６年にドイツの精神科医であるアロイス・アルツハイマーによってアルツハイマー病患者の第一例が報告された。既に１００年以上が経過したが、未だに根本的治療法は確立していない。しかし、ここ二十数年の間に、アルツハイマー病研究は長足の進歩を遂げ、発症メカニズムの枠組みはほぼ理解されたと考えられている。すなわち、アルツハイマー病における二大病理である老人班及び神経原線維変化の構成蛋白質が、それぞれ、アミロイドベータ蛋白（Ａβ）及びタウ蛋白（τ）であると同定され、家族性アルツハイマー病を引き起こす原因遺伝子が複数同定されて、それら原因遺伝子や原因蛋白質の解析が進んだ。アルツハイマー病分子病態を引き起こす病的カスケードが明らかにされた結果、科学的根拠に基づいた治療法開発が可能になり、発症機構に介入する根本的な治療法開発が数多く試みられている。一方、１９９３年には、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ：Ｈｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）新生を通してコレステロール代謝を司るアポリポ蛋白Ｅ（ＡｐｏＥ）の対立遺伝子ε４が遺伝的な危険因子であることが明らかになり、血中コレステロール高値がアルツハイマー病の発症と相関すること、血中のコレステロール値を降下させる薬剤であるスタチンがアルツハイマー病発症率を低下させることなどが報告され、コレステロール代謝とアルツハイマー病との関連が注目された。その後も、Ａβ産生に関わる基質であるアミロイド前駆体蛋白（ＡＰＰ：Ａｍｙｌｏｉｄ－β ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）や切断酵素もすべて膜タンパク質であることから、膜を構成する他の脂質代謝との関連にも関心が寄せられ、疾患発症との関係で報告が相次いでいる。脳内の事象（アルツハイマー病分子病態）と脳外事象（体循環系や食物摂取など）とがどのように関連し、脳内脂質代謝がどのようにしてアルツハイマー病分子病態に関連するかについては、いまだに未解明の部分が残っている。アルツハイマー病は、弧発例がほとんどであることから、予防・治療法開発の観点から危険因子及び関連分子・現象の解析とその応用の意義は益々重要になってきている（非特許文献１）。
道川誠、「脂質とアルツハイマー病」、日本老年医学会雑誌、２０１４年、第５１巻、第２号、ｐ．１０９－１１６
人体で必要なコレステロールの約６０％は、主として肝臓等の細胞で合成され、残りは食物から摂取される。血中のコレステロール値は、細胞内コレステロールレベルをダイレクトに反映したものではないことから、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患のバイオマーカーとして最適とはいえない。
そこで、本発明は、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の、診断用マーカー、診断を補助する方法、診断のためにデータを収集する方法、罹患可能性を評価する方法、及び診断用キットを提供することを課題とする。
［１］ エクソソームマーカーからなる細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカー。
［２］ 前記エクソソームマーカーが、フロチリン、ＣＤ６３、ＨＳＰ９０及びエクソソームからなる群から選択される少なくとも１つである、［１］に記載の診断用マーカー。
［３］ 前記細胞内コレステロールレベルに関連する疾患が、アルツハイマー病、糖尿病、脂質異常症、高血圧症、高尿酸血症、肥満症、耐糖能異常、脳血管疾患、心臓病、心血管疾患及び動脈硬化症からなる群から選択される少なくとも１つである、［１］又は［２］に記載の診断用マーカー。
［４］ 細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断を補助する方法であって、
被験者から採取した血液検体中の、［１］～［３］のいずれか１つに記載の診断用マーカーの濃度を測定し、
前記濃度を基準値と比較する、方法。
［５］ 細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断のためにデータを収集する方法であって、
被験者から採取した血液検体中の、［１］～［３］のいずれか１つに記載の診断用マーカーの濃度を測定する、方法。
［６］ 細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の罹患可能性を評価する方法であって、
被験者から採取した血液検体中の、［１］又は［２］に記載の診断用マーカーの濃度を測定し、
前記濃度を基準濃度と比較し、
前記濃度が前記基準濃度と比較して低い場合には、前記被験者が前記細胞内コレステロールレベルに関連する疾患に罹患している可能性が高いと評価する、方法。
［７］ 前記細胞内コレステロールレベルに関連する疾患が、アルツハイマー病、糖尿病、脂質異常症、高血圧症、高尿酸血症、肥満症、耐糖能異常、脳血管疾患、心臓病及び心血管疾患からなる群から選択される少なくとも１つである、［６］に記載の方法。
［８］ ［１］～［３］のいずれか１つに記載の診断用マーカーに特異的な抗体を含む、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用キット。
［２］ 前記エクソソームマーカーが、フロチリン、ＣＤ６３、ＨＳＰ９０及びエクソソームからなる群から選択される少なくとも１つである、［１］に記載の診断用マーカー。
［３］ 前記細胞内コレステロールレベルに関連する疾患が、アルツハイマー病、糖尿病、脂質異常症、高血圧症、高尿酸血症、肥満症、耐糖能異常、脳血管疾患、心臓病、心血管疾患及び動脈硬化症からなる群から選択される少なくとも１つである、［１］又は［２］に記載の診断用マーカー。
［４］ 細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断を補助する方法であって、
被験者から採取した血液検体中の、［１］～［３］のいずれか１つに記載の診断用マーカーの濃度を測定し、
前記濃度を基準値と比較する、方法。
［５］ 細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断のためにデータを収集する方法であって、
被験者から採取した血液検体中の、［１］～［３］のいずれか１つに記載の診断用マーカーの濃度を測定する、方法。
［６］ 細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の罹患可能性を評価する方法であって、
被験者から採取した血液検体中の、［１］又は［２］に記載の診断用マーカーの濃度を測定し、
前記濃度を基準濃度と比較し、
前記濃度が前記基準濃度と比較して低い場合には、前記被験者が前記細胞内コレステロールレベルに関連する疾患に罹患している可能性が高いと評価する、方法。
［７］ 前記細胞内コレステロールレベルに関連する疾患が、アルツハイマー病、糖尿病、脂質異常症、高血圧症、高尿酸血症、肥満症、耐糖能異常、脳血管疾患、心臓病及び心血管疾患からなる群から選択される少なくとも１つである、［６］に記載の方法。
［８］ ［１］～［３］のいずれか１つに記載の診断用マーカーに特異的な抗体を含む、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用キット。
本発明によれば、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の、診断用マーカー、診断を補助する方法、診断のためにデータを収集する方法、罹患可能性を評価する方法、及び診断用キットを提供できる。
「～」を用いて表す数値範囲には、「～」の両側の数値を含むものとする。
「発症前アルツハイマー病」は、脳内Ａβの蓄積が認められるが、認知障害の症状は無い病態をいう。
血液は、全血、血漿又は血清のいずれでもよいが、血漿又は血清が好ましく、血清がより好ましい。
細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカーを、単に「診断用マーカー」という場合がある。
細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断を補助する方法を、単に「診断を補助する方法」という場合がある。
細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断のためにデータを収集する方法を、単に「診断のためにデータを収集する方法」という場合がある。
細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の罹患可能性を評価する方法を、単に「罹患可能性を評価する方法」という場合がある。
細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用キットを、単に「診断用キット」という場合がある。
バイオマーカーとは「通常の生物学的過程、病理学的過程、もしくは治療的介入に対する薬理学的応答の指標として、客観的に測定され評価される特性」である（定義）。
ＳＤは標準偏差（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）の意味である。標準偏差は、正規分布しているデータに対して、各データが平均値を挟んでどの程度散らばっているかという情報を提供する。平均値の上下、１ＳＤの範囲（±１ＳＤと略す）には、全データの６８．２６％が含まれる。±２ＳＤには９５．４４％が含まれる。±３ＳＤには９９．７４％が含まれる。
「発症前アルツハイマー病」は、脳内Ａβの蓄積が認められるが、認知障害の症状は無い病態をいう。
血液は、全血、血漿又は血清のいずれでもよいが、血漿又は血清が好ましく、血清がより好ましい。
細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカーを、単に「診断用マーカー」という場合がある。
細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断を補助する方法を、単に「診断を補助する方法」という場合がある。
細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断のためにデータを収集する方法を、単に「診断のためにデータを収集する方法」という場合がある。
細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の罹患可能性を評価する方法を、単に「罹患可能性を評価する方法」という場合がある。
細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用キットを、単に「診断用キット」という場合がある。
バイオマーカーとは「通常の生物学的過程、病理学的過程、もしくは治療的介入に対する薬理学的応答の指標として、客観的に測定され評価される特性」である（定義）。
ＳＤは標準偏差（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）の意味である。標準偏差は、正規分布しているデータに対して、各データが平均値を挟んでどの程度散らばっているかという情報を提供する。平均値の上下、１ＳＤの範囲（±１ＳＤと略す）には、全データの６８．２６％が含まれる。±２ＳＤには９５．４４％が含まれる。±３ＳＤには９９．７４％が含まれる。
以下では、本発明を実施するための形態を説明するが、本発明は後述する実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない限り、種々の変形が可能である。
［診断用マーカー］
本発明の診断用マーカーは、エクソソームマーカーからなる。
本発明の診断用マーカーは、エクソソームマーカーからなる。
＜エクソソームマーカー＞
エクソソームマーカーは被験者の血液検体中のエクソソームを定量するために使用できるバイオマーカーであれば特に限定されないが、フロチリン、ＣＤ６３、ＨＳＰ９０及びエクソソームからなる群から選択される少なくとも１つが好ましい。
フロチリン、ＣＤ６３、ＨＳＰ９０及びエクソソームからなる群から選択される２つ以上を組み合わせることによって、より精度のよい診断が可能となる。
エクソソームマーカーは被験者の血液検体中のエクソソームを定量するために使用できるバイオマーカーであれば特に限定されないが、フロチリン、ＣＤ６３、ＨＳＰ９０及びエクソソームからなる群から選択される少なくとも１つが好ましい。
フロチリン、ＣＤ６３、ＨＳＰ９０及びエクソソームからなる群から選択される２つ以上を組み合わせることによって、より精度のよい診断が可能となる。
本発明の診断用マーカーはヒトの体液に含まれていると好ましい。本発明の診断用マーカーがヒトの体液に含まれていると、生体検査等に比べて、検体の採取が低侵襲であり、検査が簡便である。加えて、自宅等の医療機関以外の場所でも細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の検査を行うことができるという利点がある。
体液の具体例としては、血液、リンパ液、髄液、羊水等の体液が挙げられる。ただし、体液は、これらの例示に限定されない。
体液としては、前記体液から不要成分を除去する等の前処理を行った処理液、又は前記体液に含まれる細胞を培養して得られた培養液でもよい。
これらの中でも、採取が簡便で、エクソソームマーカー以外のバイオマーカーの測定にも使用できることから、体液としては血液が好ましい。血液は、全血であってもよいし、血漿又は血清であってもよい。
体液の具体例としては、血液、リンパ液、髄液、羊水等の体液が挙げられる。ただし、体液は、これらの例示に限定されない。
体液としては、前記体液から不要成分を除去する等の前処理を行った処理液、又は前記体液に含まれる細胞を培養して得られた培養液でもよい。
これらの中でも、採取が簡便で、エクソソームマーカー以外のバイオマーカーの測定にも使用できることから、体液としては血液が好ましい。血液は、全血であってもよいし、血漿又は血清であってもよい。
《フロチリン》
フロチリンは、エンドソーム結合タンパク質の１種であり、エクソソームが多胞性エンドソーム（ＭＶＥ）の内部にエンドソームの膜が陥没して形成される際に、エクソソームに取り込まれる。フロチリンは、一般的なエクソソームのマーカーの１つである。
フロチリンは、エンドソーム結合タンパク質の１種であり、エクソソームが多胞性エンドソーム（ＭＶＥ）の内部にエンドソームの膜が陥没して形成される際に、エクソソームに取り込まれる。フロチリンは、一般的なエクソソームのマーカーの１つである。
本発明者らは、ＡｐｏＥノックアウトマウス（アテローム性動脈硬化症の疾患モデルマウス）から培養したアストロサイト培養細胞の細胞内コレステロールレベルと培養液へのフロチリン分泌量について解析したところ、次の（１）～（４）の結果を得た。
（１）ＡｐｏＥノックアウトマウスから培養したアストロサイト培養細胞は、野生型のアストロサイト培養細胞に比べて、培養上清中のフロチリン濃度が低下していた。すなわち、フロチリン分泌が低下していた。
（２）ＡｐｏＥノックアウトマウスにＡｐｏＥ３又はＡｐｏＥ４をノックインしたマウスから培養したアストロサイト培養細胞では、フロチリン分泌の低下が認められなかった。
（３）ＡｐｏＥ欠損型マウスから培養したアストロサイト培養細胞を、コレステロール除去剤であるβ－シクロデキストリンで処理したところ、フロチリン分泌の低下は回復した。
（４）ＡｐｏＥノックアウトマウスにＡｐｏＥ３又はＡｐｏＥ４をノックインしたマウスから培養したアストロサイト培養細胞の培養液にコレステロールを添加したところ、（２）のアストロサイト培養細胞に比べて、培養上清中のフロチリン濃度が低下していた。すなわち、フロチリン分泌が低下していた。
これらの結果から、本発明者らは、細胞内コレステロールレベルが高い場合には、細胞からのフロチリン分泌が低下すること、すなわち、エクソソーム分泌が低下することを知見した。
（１）ＡｐｏＥノックアウトマウスから培養したアストロサイト培養細胞は、野生型のアストロサイト培養細胞に比べて、培養上清中のフロチリン濃度が低下していた。すなわち、フロチリン分泌が低下していた。
（２）ＡｐｏＥノックアウトマウスにＡｐｏＥ３又はＡｐｏＥ４をノックインしたマウスから培養したアストロサイト培養細胞では、フロチリン分泌の低下が認められなかった。
（３）ＡｐｏＥ欠損型マウスから培養したアストロサイト培養細胞を、コレステロール除去剤であるβ－シクロデキストリンで処理したところ、フロチリン分泌の低下は回復した。
（４）ＡｐｏＥノックアウトマウスにＡｐｏＥ３又はＡｐｏＥ４をノックインしたマウスから培養したアストロサイト培養細胞の培養液にコレステロールを添加したところ、（２）のアストロサイト培養細胞に比べて、培養上清中のフロチリン濃度が低下していた。すなわち、フロチリン分泌が低下していた。
これらの結果から、本発明者らは、細胞内コレステロールレベルが高い場合には、細胞からのフロチリン分泌が低下すること、すなわち、エクソソーム分泌が低下することを知見した。
したがって、細胞内コレステロールレベルが高ければ、フロチリンの分泌が低下し、細胞内コレステロールが低ければ、フロチリンの分泌が上昇すること、換言すれば、細胞内コレステロールレベルとフロチリン分泌とは逆相関するという知見が得られた。
このことから、フロチリンは細胞内コレステロールレベルのマーカーとして利用できること、さらには、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカーとして有用であることがわかる。
このことから、フロチリンは細胞内コレステロールレベルのマーカーとして利用できること、さらには、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカーとして有用であることがわかる。
《ＣＤ６３》
ＣＤ６３は、エクソソームの膜に発現する膜貫通タンパク質ファミリーであるテトラスパニンの１種であり、一般的なエクソソームのマーカーの１つである。
ＣＤ６３は、エクソソームの膜に発現する膜貫通タンパク質ファミリーであるテトラスパニンの１種であり、一般的なエクソソームのマーカーの１つである。
本発明者らは、ＡｐｏＥノックアウトマウス（アテローム性動脈硬化症の疾患モデルマウス）から培養したアストロサイト培養細胞の細胞内コレステロールレベルと培養液へのＣＤ６３分泌量について解析したところ、次の（１）～（４）の結果を得た。
（１）ＡｐｏＥノックアウトマウスから培養したアストロサイト培養細胞は、野生型のアストロサイト培養細胞に比べて、培養上清中のＣＤ６３濃度が低下していた。すなわち、ＣＤ６３分泌が低下していた。
（２）ＡｐｏＥノックアウトマウスにＡｐｏＥ３又はＡｐｏＥ４をノックインしたマウスから培養したアストロサイト培養細胞では、ＣＤ６３分泌の低下が認められなかった。
（３）ＡｐｏＥ欠損型マウスから培養したアストロサイト培養細胞を、コレステロール除去剤であるβ－シクロデキストリンで処理したところ、ＣＤ６３分泌の低下は回復した。
（４）ＡｐｏＥノックアウトマウスにＡｐｏＥ３又はＡｐｏＥ４をノックインしたマウスから培養したアストロサイト培養細胞の培養液にコレステロールを添加したところ、（２）のアストロサイト培養細胞に比べて、培養上清中のＣＤ６３濃度が低下していた。すなわち、ＣＤ６３分泌が低下していた。
これらの結果から、本発明者らは、細胞内コレステロールレベルが高い場合には、細胞からのＣＤ６３分泌が低下すること、すなわち、エクソソーム分泌が低下することを知見した。
（１）ＡｐｏＥノックアウトマウスから培養したアストロサイト培養細胞は、野生型のアストロサイト培養細胞に比べて、培養上清中のＣＤ６３濃度が低下していた。すなわち、ＣＤ６３分泌が低下していた。
（２）ＡｐｏＥノックアウトマウスにＡｐｏＥ３又はＡｐｏＥ４をノックインしたマウスから培養したアストロサイト培養細胞では、ＣＤ６３分泌の低下が認められなかった。
（３）ＡｐｏＥ欠損型マウスから培養したアストロサイト培養細胞を、コレステロール除去剤であるβ－シクロデキストリンで処理したところ、ＣＤ６３分泌の低下は回復した。
（４）ＡｐｏＥノックアウトマウスにＡｐｏＥ３又はＡｐｏＥ４をノックインしたマウスから培養したアストロサイト培養細胞の培養液にコレステロールを添加したところ、（２）のアストロサイト培養細胞に比べて、培養上清中のＣＤ６３濃度が低下していた。すなわち、ＣＤ６３分泌が低下していた。
これらの結果から、本発明者らは、細胞内コレステロールレベルが高い場合には、細胞からのＣＤ６３分泌が低下すること、すなわち、エクソソーム分泌が低下することを知見した。
したがって、細胞内コレステロールレベルが高ければ、ＣＤ６３の分泌が低下し、細胞内コレステロールが低ければ、ＣＤ６３の分泌が上昇すること、換言すれば、細胞内コレステロールレベルとＣＤ６３分泌とは逆相関するという知見が得られた。
このことから、ＣＤ６３は細胞内コレステロールレベルのマーカーとして利用できること、さらには、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカーとして有用であることがわかる。
このことから、ＣＤ６３は細胞内コレステロールレベルのマーカーとして利用できること、さらには、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカーとして有用であることがわかる。
《ＨＳＰ９０》
ＨＳＰ９０は、分子量約９０ｋＤａのタンパク質であり、エクソソームの内部に含まれている。ＨＳＰ９０は、一般的なエクソソームのマーカーの１つである。
ＨＳＰ９０は、分子量約９０ｋＤａのタンパク質であり、エクソソームの内部に含まれている。ＨＳＰ９０は、一般的なエクソソームのマーカーの１つである。
本発明者らは、ＡｐｏＥノックアウトマウス（アテローム性動脈硬化症の疾患モデルマウス）から培養したアストロサイト培養細胞の細胞内コレステロールレベルと培養液へのＨＳＰ９０分泌量について解析したところ、次の（１）～（４）の結果を得た。
（１）ＡｐｏＥノックアウトマウスから培養したアストロサイト培養細胞は、野生型のアストロサイト培養細胞に比べて、培養上清中のＨＳＰ９０濃度が低下していた。すなわち、ＨＳＰ９０分泌が低下していた。
（２）ＡｐｏＥノックアウトマウスにＡｐｏＥ３又はＡｐｏＥ４をノックインしたマウスから培養したアストロサイト培養細胞では、ＨＳＰ９０分泌の低下が認められなかった。
（３）ＡｐｏＥ欠損型マウスから培養したアストロサイト培養細胞を、コレステロール除去剤であるβ－シクロデキストリンで処理したところ、ＨＳＰ９０分泌の低下は回復した。
（４）ＡｐｏＥノックアウトマウスにＡｐｏＥ３又はＡｐｏＥ４をノックインしたマウスから培養したアストロサイト培養細胞の培養液にコレステロールを添加したところ、（２）のアストロサイト培養細胞に比べて、培養上清中のＨＳＰ９０濃度が低下していた。すなわち、ＨＳＰ９０分泌が低下していた。
これらの結果から、本発明者らは、細胞内コレステロールレベルが高い場合には、細胞からのＨＳＰ９０分泌が低下すること、すなわち、エクソソーム分泌が低下することを知見した。
（１）ＡｐｏＥノックアウトマウスから培養したアストロサイト培養細胞は、野生型のアストロサイト培養細胞に比べて、培養上清中のＨＳＰ９０濃度が低下していた。すなわち、ＨＳＰ９０分泌が低下していた。
（２）ＡｐｏＥノックアウトマウスにＡｐｏＥ３又はＡｐｏＥ４をノックインしたマウスから培養したアストロサイト培養細胞では、ＨＳＰ９０分泌の低下が認められなかった。
（３）ＡｐｏＥ欠損型マウスから培養したアストロサイト培養細胞を、コレステロール除去剤であるβ－シクロデキストリンで処理したところ、ＨＳＰ９０分泌の低下は回復した。
（４）ＡｐｏＥノックアウトマウスにＡｐｏＥ３又はＡｐｏＥ４をノックインしたマウスから培養したアストロサイト培養細胞の培養液にコレステロールを添加したところ、（２）のアストロサイト培養細胞に比べて、培養上清中のＨＳＰ９０濃度が低下していた。すなわち、ＨＳＰ９０分泌が低下していた。
これらの結果から、本発明者らは、細胞内コレステロールレベルが高い場合には、細胞からのＨＳＰ９０分泌が低下すること、すなわち、エクソソーム分泌が低下することを知見した。
したがって、細胞内コレステロールレベルが高ければ、ＨＳＰ９０の分泌が低下し、細胞内コレステロールが低ければ、ＨＳＰ９０の分泌が上昇すること、換言すれば、細胞内コレステロールレベルとＨＳＰ９０分泌とは逆相関するという知見が得られた。
このことから、ＨＳＰ９０は細胞内コレステロールレベルのマーカーとして利用できること、さらには、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカーとして有用であることがわかる。
このことから、ＨＳＰ９０は細胞内コレステロールレベルのマーカーとして利用できること、さらには、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカーとして有用であることがわかる。
《エクソソーム》
上述したフロチリン、ＣＤ６３及びＨＳＰ９０は、いずれも一般的なエクソソームのマーカーであることに鑑みれば、細胞内コレステロールレベルが高ければ、エクソソームの分泌が低下し、細胞内コレステロールが低ければ、エクソソームの分泌が上昇すること、換言すれば、細胞内コレステロールレベルとエクソソーム分泌とは逆相関するという知見が得られた。
このことから、エクソソームは細胞内コレステロールレベルのマーカーとして利用できること、さらには、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカーとして有用であることがわかる。
上述したフロチリン、ＣＤ６３及びＨＳＰ９０は、いずれも一般的なエクソソームのマーカーであることに鑑みれば、細胞内コレステロールレベルが高ければ、エクソソームの分泌が低下し、細胞内コレステロールが低ければ、エクソソームの分泌が上昇すること、換言すれば、細胞内コレステロールレベルとエクソソーム分泌とは逆相関するという知見が得られた。
このことから、エクソソームは細胞内コレステロールレベルのマーカーとして利用できること、さらには、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカーとして有用であることがわかる。
さらに、本発明者らは、培養上清中のエクソソームをＥＬＩＳＡ法又はウェスタンブロッティング法によって直接定量したところ、培養上清中のエクソソーム濃度と、細胞内コレステロールレベルとは、逆相関するという知見が得られた。
このことからも、エクソソームは細胞内コレステロールレベルのマーカーとして利用できること、さらには、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカーとして有用であることがわかる。
このことからも、エクソソームは細胞内コレステロールレベルのマーカーとして利用できること、さらには、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカーとして有用であることがわかる。
＜細胞内コレステロールレベルに関連する疾患＞
細胞内コレステロールレベルに関連する疾患は、例えば、アルツハイマー病、糖尿病、脂質異常症、高血圧症、高尿酸血症、肥満症、耐糖能異常、脳血管疾患、心臓病、心血管疾患及び動脈硬化症であり、これらの疾患からなる群から選択される少なくとも１つが好ましい。
細胞内コレステロールレベルに関連する疾患は、例えば、アルツハイマー病、糖尿病、脂質異常症、高血圧症、高尿酸血症、肥満症、耐糖能異常、脳血管疾患、心臓病、心血管疾患及び動脈硬化症であり、これらの疾患からなる群から選択される少なくとも１つが好ましい。
被験者から採取した検体中の、本発明の診断用マーカーの濃度が基準値よりも低い場合に、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患に罹患している可能性があると判断できる。
基準値は、例えば、健常者から採取した検体中の、本発明の診断用マーカーの濃度の平均値±１ＳＤである。
基準値は、例えば、健常者から採取した検体中の、本発明の診断用マーカーの濃度の平均値±１ＳＤである。
本発明の診断用マーカーの濃度が基準値よりも低いことに関連する疾患としては、例えば、アルツハイマー病、糖尿病、脂質異常症、高血圧症、高尿酸血症、肥満症、耐糖能異常、脳血管疾患、心臓病、心血管疾患及び動脈硬化症が挙げられる。
動脈硬化症としては、特に、アテローム性動脈硬化症が挙げられる。
脂質異常症としては、高コレステロール血症及び高脂血症が挙げられる。
動脈硬化症としては、特に、アテローム性動脈硬化症が挙げられる。
脂質異常症としては、高コレステロール血症及び高脂血症が挙げられる。
［診断を補助する方法］
本発明の細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断を補助する方法（単に「診断を補助する方法」という場合がある。）は、被験者から採取した血液検体中の、本発明の診断用マーカーの濃度を測定し、前記濃度を基準値と比較することを特徴とする。
本発明の細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断を補助する方法（単に「診断を補助する方法」という場合がある。）は、被験者から採取した血液検体中の、本発明の診断用マーカーの濃度を測定し、前記濃度を基準値と比較することを特徴とする。
本発明の診断を補助する方法は、被験者が細胞内コレステロールレベルに関連する疾患に罹患しているか否かの診断の補助となる判断材料を提供するものである。当該判断材料に基づいて、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断を行ってもよい。
本発明の診断を補助する方法においては、被験者から採取した血液検体中の、本発明の診断用マーカーの濃度を測定する。次いで、前記濃度を基準値と比較する。
被験者から血液検体を採取する方法は特に限定されない。一般的な検査で使用される方法でよい。例えば、静脈穿刺により血液を採取できる。
血液検体中の、本発明の診断用マーカーの検出及び定量は、前記診断用マーカーに特異的な抗体を用いることが好ましい。
血液検体中のフロチリンの検出及び定量は、抗フロチリン抗体を用いることが好ましい。
血液検体中のＣＤ６３の検出及び定量は、抗ＣＤ６３抗体を用いることが好ましい。
血液検体中のＨＳＰ９０の検出及び定量は、抗ＨＳＰ９０抗体を用いることが好ましい。
フロチリン、ＣＤ６３又はＨＳＰ９０の検出及び定量は、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ：エライザ）、ウェスタンブロッティング等、抗原抗体反応を利用したものが好ましく、ＥＬＩＳＡが特に好ましい。ＥＬＩＳＡは、直接吸着法、サンドイッチ法、競合法のいずれでもよい。
血液検体中のフロチリンの検出及び定量は、抗フロチリン抗体を用いることが好ましい。
血液検体中のＣＤ６３の検出及び定量は、抗ＣＤ６３抗体を用いることが好ましい。
血液検体中のＨＳＰ９０の検出及び定量は、抗ＨＳＰ９０抗体を用いることが好ましい。
フロチリン、ＣＤ６３又はＨＳＰ９０の検出及び定量は、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ：エライザ）、ウェスタンブロッティング等、抗原抗体反応を利用したものが好ましく、ＥＬＩＳＡが特に好ましい。ＥＬＩＳＡは、直接吸着法、サンドイッチ法、競合法のいずれでもよい。
エクソソームの検出及び定量は、例えば、固相化した抗ＣＤ９抗体でエクソソームを補足し、標識した抗ＣＤ６３抗体で検出及び定量を行う方法、固相化した抗ＣＤ９抗体でエクソソームを捕捉し、標識した抗ＣＤ９抗体で検出及び定量を行う方法、固相化した抗ＣＤ６３抗体でエクソソームを補足し、標識した抗ＣＤ６３抗体で検出及び定量を行う方法、固相化した抗ＨＳＰ９０抗体でエクソソームを補足し、標識した抗ＨＳＰ９０抗体で検出及び定量を行う方法、固相化した抗フロチリン抗体でエクソソームを補足し、標識した抗フロチリン抗体で検出及び定量を行う方法等により行うことが好ましい。また、血液検体からエクソソームを単離後、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ：蛍光活性化セルソーティング）を用いて検出及び定量を行う方法でもよい。また、血液検体からエクソソームを単離後、ウェスタンブロッティングによって検出及び定量を行ってもよい。エクソソームの検出及び定量のための抗体としては、抗フロチリン抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＨＳＰ９０抗体等が挙げられる。
次いで、血液検体中の、本発明の診断用マーカーの濃度を基準値と比較する。
基準値は、例えば、健常者から採取した検体中の、本発明の診断用マーカーの濃度の平均値±１ＳＤである。
基準値は、例えば、健常者から採取した検体中の、本発明の診断用マーカーの濃度の平均値±１ＳＤである。
血液検体中の、本発明の診断用マーカーの濃度が基準値よりも低い場合の細胞内コレステロールレベルに関連する疾患としては、例えば、アルツハイマー病、糖尿病、脂質異常症、高血圧症、高尿酸血症、肥満症、耐糖能異常、脳血管疾患、心臓病、心血管疾患及び動脈硬化症が挙げられる。動脈硬化症としては、特に、アテローム性動脈硬化症が挙げられる。脂質異常症としては、高コレステロール血症及び高脂血症が挙げられる。
本発明の診断を補助する方法によれば、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患を高精度で診断するための情報を取得できる。
本発明の診断を補助する方法によって得られた情報は、基準値との比較に使用できる。このように当該情報は、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患を診断するため判断材料の提供に有用である。
本発明の診断を補助する方法によって得られた情報は、基準値との比較に使用できる。このように当該情報は、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患を診断するため判断材料の提供に有用である。
［診断のためにデータを収集する方法］
本発明の細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断のためにデータを収集する方法（単に「診断のためにデータを収集する方法」という場合がある。）は、被験者から採取した血液検体中の、本発明の診断用マーカーの濃度を測定することを特徴とする。
本発明の細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断のためにデータを収集する方法（単に「診断のためにデータを収集する方法」という場合がある。）は、被験者から採取した血液検体中の、本発明の診断用マーカーの濃度を測定することを特徴とする。
本発明の診断用マーカーの濃度の測定方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
本発明の診断のためにデータを収集する方法によれば、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患を高精度で診断するための情報を取得できる。
本発明の診断のためにデータを収集する方法によって得られた情報は、基準値との比較に使用できる。このように当該情報は、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患を診断するため判断材料の提供に有用である。
基準値の具体的内容及び診断用マーカーの濃度の基準値との比較の方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
本発明の診断のためにデータを収集する方法によって得られた情報は、基準値との比較に使用できる。このように当該情報は、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患を診断するため判断材料の提供に有用である。
基準値の具体的内容及び診断用マーカーの濃度の基準値との比較の方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
［診断を補助するためのインビトロの方法］
本発明の細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断を補助するためのインビトロの方法（単に「診断を補助するためのインビトロの方法」という場合がある。）においては、被験者から採取した血液検体中の、本発明の診断用マーカーの濃度を測定する。
細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカーの検出及び定量の方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
本発明の細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断を補助するためのインビトロの方法（単に「診断を補助するためのインビトロの方法」という場合がある。）においては、被験者から採取した血液検体中の、本発明の診断用マーカーの濃度を測定する。
細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカーの検出及び定量の方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
本発明の診断を補助するためのインビトロの方法によれば、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患を高精度で診断するための情報を取得できる。
本発明の診断を補助するためのインビトロの方法によって得られた情報は、基準値との比較に使用できる。このように当該情報は、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患を診断するため判断材料の提供に有用である。
基準値の具体的内容及び診断用マーカーの濃度の基準値との比較の方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
本発明の診断を補助するためのインビトロの方法によって得られた情報は、基準値との比較に使用できる。このように当該情報は、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患を診断するため判断材料の提供に有用である。
基準値の具体的内容及び診断用マーカーの濃度の基準値との比較の方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
［診断方法］
本発明の細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断方法（単に「診断方法」という場合がある。）においては、被験者から採取した血液検体中の、本発明の診断用マーカーの濃度を測定し、前記濃度を基準値と比較する。
本発明の診断方法は、被験者が細胞内コレステロールレベルに関連する疾患に罹患しているか否かを診断する方法である。
細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカーの検出及び定量の方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
基準値の具体的内容及び診断用マーカーの発現量の基準値との比較の詳細及び好ましい態様は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
本発明の細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断方法（単に「診断方法」という場合がある。）においては、被験者から採取した血液検体中の、本発明の診断用マーカーの濃度を測定し、前記濃度を基準値と比較する。
本発明の診断方法は、被験者が細胞内コレステロールレベルに関連する疾患に罹患しているか否かを診断する方法である。
細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカーの検出及び定量の方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
基準値の具体的内容及び診断用マーカーの発現量の基準値との比較の詳細及び好ましい態様は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
本発明の診断方法においては、本発明の診断用マーカーの濃度を基準値と比較する。
［判定方法］
本発明の細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の判定方法（単に「判定方法」という場合がある。）においては、被験者から採取した血液検体中の、本発明の診断用マーカーの濃度を測定し、前記濃度を基準値と比較する。
本発明の判定方法は、被験者における細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の罹患の有無を判定する方法である。
細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカーの検出及び定量の方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
基準値の具体的内容及び診断用マーカーの濃度の基準値との比較の方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
本発明の細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の判定方法（単に「判定方法」という場合がある。）においては、被験者から採取した血液検体中の、本発明の診断用マーカーの濃度を測定し、前記濃度を基準値と比較する。
本発明の判定方法は、被験者における細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の罹患の有無を判定する方法である。
細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカーの検出及び定量の方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
基準値の具体的内容及び診断用マーカーの濃度の基準値との比較の方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
本発明の判定方法においては、本発明の診断用マーカーの濃度を基準値と比較する。
［試験方法］
本発明の細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の試験方法（単に「試験方法」という場合がる。）においては、被験者から採取した血液検体中の、本発明の診断用マーカーの濃度を測定し、前記濃度を基準値と比較する。
本発明の試験方法は、被験者における細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の有無を試験する方法である。
細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカーの検出及び定量の方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
基準値の具体的内容及び診断用マーカーの濃度の基準値との比較の方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
本発明の細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の試験方法（単に「試験方法」という場合がる。）においては、被験者から採取した血液検体中の、本発明の診断用マーカーの濃度を測定し、前記濃度を基準値と比較する。
本発明の試験方法は、被験者における細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の有無を試験する方法である。
細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカーの検出及び定量の方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
基準値の具体的内容及び診断用マーカーの濃度の基準値との比較の方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
本発明の試験方法においては、本発明の診断用マーカーの濃度を基準値と比較する。
［罹患可能性を評価する方法］
本発明の細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の罹患可能性を評価する方法（単に「罹患可能性を評価する方法」）の一実施形態においては、被験者から採取した血液検体中の、本発明の診断用マーカーの濃度を測定し、前記濃度を基準濃度と比較し、前記濃度が前記基準濃度と比較して低い場合には、前記被験者が前記細胞内コレステロールレベルに関連する疾患に罹患している可能性が高いと評価する。
本発明の細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の罹患可能性を評価する方法（単に「罹患可能性を評価する方法」）の一実施形態においては、被験者から採取した血液検体中の、本発明の診断用マーカーの濃度を測定し、前記濃度を基準濃度と比較し、前記濃度が前記基準濃度と比較して低い場合には、前記被験者が前記細胞内コレステロールレベルに関連する疾患に罹患している可能性が高いと評価する。
本発明の罹患可能性を評価する方法は、被験者における細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の罹患可能性を評価する方法である。
細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカーの検出及び定量の方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
基準値の具体的内容及び診断用マーカーの濃度の基準値との比較の方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカーの検出及び定量の方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
基準値の具体的内容及び診断用マーカーの濃度の基準値との比較の方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
本発明の罹患可能性を評価する方法においては、本発明の診断用マーカーの濃度を基準値と比較する。
血液検体中の診断用マーカーの濃度が基準値よりも低い場合の細胞内コレステロールレベルに関連する疾患としては、例えば、アルツハイマー病、糖尿病、脂質異常症、高血圧症、高尿酸血症、肥満症、耐糖能異常、脳血管疾患、心臓病、心血管疾患及び動脈硬化症が挙げられる。動脈硬化症としては、特に、アテローム性動脈硬化症が挙げられる。脂質異常症としては、高コレステロール血症及び高脂血症が挙げられる。
［治療方法］
本発明の細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の治療方法（単に「治療方法」という場合がる。）においては、被験者から採取した血液検体中の、本発明の診断用マーカーの濃度を測定し、前記濃度を基準値と比較し、前記濃度が前記基準値よりも低い場合に、前記被験者に前記疾患の治療薬を投与する。
本発明の治療方法は、被験者における細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の治療を目的とする方法である。
細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカーの検出及び定量の方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
基準値の具体的内容及び診断用マーカーの濃度の基準値との比較の方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
本発明の細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の治療方法（単に「治療方法」という場合がる。）においては、被験者から採取した血液検体中の、本発明の診断用マーカーの濃度を測定し、前記濃度を基準値と比較し、前記濃度が前記基準値よりも低い場合に、前記被験者に前記疾患の治療薬を投与する。
本発明の治療方法は、被験者における細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の治療を目的とする方法である。
細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用マーカーの検出及び定量の方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
基準値の具体的内容及び診断用マーカーの濃度の基準値との比較の方法は、上述の「診断を補助する方法」において述べたものと同様のものとすることができる。
本発明の治療方法においては、本発明の診断用マーカーが基準値よりも低値である被験者に対して、投薬治療を行う。
本発明の診断用マーカーの濃度が基準値よりも低く、細胞内コレステロールレベルが高い場合に投与する治療薬としては、例えば、ＨＭＧ－ＣｏＡ阻害薬（スタチン類）が挙げられる。ＨＭＧ－ＣｏＡ阻害薬は、細胞内でのコレステロール合成を阻害するため、細胞内コレステロールレベルを下げることができる。ＨＭＧ－ＣｏＡ阻害薬と、エゼチミブ、フィブラート等を併用してもよい。
［診断用キット］
本発明の細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用キット（単位「診断用キット」という場合がある。）は、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の有無を検査するために使用するキットである。本発明の診断用キットは、本発明の診断用マーカーに特異的な抗体を含む。このような特異的な抗体は、抗フロチリン抗体抗ＣＤ６３抗体、抗ＨＳＰ９０抗体及びエクソソームに特異的な抗体からなる群から選択される少なくとも１つが好ましい。
本発明の細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断用キット（単位「診断用キット」という場合がある。）は、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の有無を検査するために使用するキットである。本発明の診断用キットは、本発明の診断用マーカーに特異的な抗体を含む。このような特異的な抗体は、抗フロチリン抗体抗ＣＤ６３抗体、抗ＨＳＰ９０抗体及びエクソソームに特異的な抗体からなる群から選択される少なくとも１つが好ましい。
＜抗フロチリン抗体＞
抗フロチリン抗体は、フロチリンに対する特異的結合性を有する抗体である。抗フロチリン抗体は、フロチリンに対する特異的結合性を有する限り、その種類及び由来等は特に限定されない。また、ポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれでもよい。ポリクローナル抗体又はオリゴクローナル抗体としては、動物免疫して得た抗血清由来のＩｇＧ画分の他、抗原によるアフィニティー精製抗体を使用できる。抗フロチリン抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ抗体等の抗体断片であってもよい。
抗フロチリン抗体は、フロチリンに対する特異的結合性を有する抗体である。抗フロチリン抗体は、フロチリンに対する特異的結合性を有する限り、その種類及び由来等は特に限定されない。また、ポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれでもよい。ポリクローナル抗体又はオリゴクローナル抗体としては、動物免疫して得た抗血清由来のＩｇＧ画分の他、抗原によるアフィニティー精製抗体を使用できる。抗フロチリン抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ抗体等の抗体断片であってもよい。
抗フロチリン抗体は、免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法等を利用して調製できる。免疫学的手法によるポリクローナル抗体の調製は次の手順で行える。抗原（フロチリン又はその一部）を調製し、これを用いてウサギ等の動物に免疫を施す。抗原は生体試料を精製することにより得られる。また、組換え型抗原を用いることもできる。組換え型抗原は、例えば、フロチリンをコードする遺伝子（遺伝子の一部であってもよい）を、ベクターを用いて適当な宿主細胞に導入し、得られた組換え細胞内で遺伝子を発現させることにより調製できる。
免疫惹起作用を増強するために、キャリアタンパク質を結合させた抗原を用いてもよい。キャリアタンパク質としては、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＯＶＡ（オボアルブミン）等が使用される。キャリアタンパク質の結合には、カルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、ジアゾ縮合法、ＭＢＳ（マレイミドベンゾイルオキシコハク酸イミド）法等を使用できる。一方、フロチリン（又はその一部）を、ＧＳＴ（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ）、βガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク又はヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ等との融合タンパク質として発現させた抗体を用いることもできる。このような融合タンパク質は、汎用液な方法により簡便に精製できる。
必要に応じて免疫を繰り返し、充分に抗体価が上昇した時点で採決し、遠心処理等によって血清を得る。得られた抗血清をアフィニティー精製し、ポリクローナル抗体とする。
一方、モノクローナル抗体については次の手順で調製できる。まず、上記と同様の手順で免疫操作を実施する。必要に応じて免疫を繰り返し、充分に抗体価が上昇した時点で免疫細胞から抗体産生細胞を摘出する。次に、得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合してハイブリドーマを得る。続いて、このハイブリドーマをモノクローナル化した後、フロチリンに対して高い特異性を有する抗体を産生するクローンを選択する。選択されたクローンの培養液を精製して目的の抗体を得られる。一方、ハイブリドーマを所望数以上に増殖させた後、これを動物（例えばマウス）の腹腔内に移植し、腹水内で増殖させて腹水を精製しても目的の抗体を取得できる。培養液の精製又は腹水の精製には、プロテインＧ、プロテインＡ等を用いたアフィニティークロマトグラフィーが好適に用いられる。また、抗原（フロチリン）を固相化したアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。さらには、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、硫安分画又は遠心分離等の方法を用いることもできる。これらの方法は、単独で、又は組み合わせて、用いられる。
フロチリンへの特異的結合性を保持することを条件として、得られた抗体に種々の改変を施すことができる。このような改変抗体をフロチリンに特異的な抗体として用いてもよい。
抗フロチリン抗体として標識化抗体を使用すれば、標識量を指標に結合体量を直接検出することが可能である。従って、より簡便な検査法を構築できる。その反面、標識物質を結合させた抗フロチリン抗体を用意する必要があることに加えて、検出感度が一般に低くなるという問題点がある。そこで、標識物質を結合させた二次抗体を利用する方法、二次抗体と標識物質を結合させたポリマーを利用する方法等、間接的検出方法を利用することが好ましい。ここでの二次抗体とは、抗フロチリン抗体に特異的結合性を有する抗体であった、例えばウサギ抗体として抗ＨＳＰ抗体を調製した場合には、抗ウサギＩｇＧ抗体を使用できる。ウサギ、ヤギ又はマウス等、様々な種の抗体に対して使用可能な標識二次抗体が市販されており（例えばフナコシ社、コスモバイオ社等）、適切なものを適宜選択して使用できる。
標識物質としては、例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、オレゴングリーン等の蛍光色素、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ等の酵素、ルミノール、アクリジン色素等の化学又は生物発光化合物、３２Ｐ、３５Ｓ、１３１Ｉ、１２５Ｉ等の放射性同位体、及びビオチンが挙げられる。
一態様では、フロチリンに特異的な抗体はその用途に合わせて固相化されている。固相化に用いる不溶性支持体は特に限定されない。例えば、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂等の樹脂、又はガラス等の水に不溶性の物質からなる不溶性支持体を用いることができる。不溶性支持体への抗体の担持は、物理吸着又は化学吸着によって行える。
本発明の診断用キットは、被験者の血液中のフロチリンを測定する際に使用する、フロチリンに特異的な抗体以外の試薬を含んでもよい。このような試薬としては、緩衝液、部ロッキング用試薬、酵素の基質、発色試薬等が挙げられる。さらに、被験者の血液中のフロチリンを測定する際に使用する、容器、反応装置、蛍光リーダー等の器具又は装置を含んでもよい。また、標準試料として、フロチリンをキットに含めることが好ましい。
＜抗ＣＤ６３抗体＞
抗ＣＤ６３抗体は、ＣＤ６３に対する特異的結合性を有する限り、その種類及び由来等は特に限定されない。抗ＣＤ６３抗体は、抗フロチリン抗体の調製方法に準じて調製できる。
抗ＣＤ６３抗体は、ＣＤ６３に対する特異的結合性を有する限り、その種類及び由来等は特に限定されない。抗ＣＤ６３抗体は、抗フロチリン抗体の調製方法に準じて調製できる。
＜抗ＨＳＰ９０抗体＞
抗ＨＳＰ９０抗体は、ＨＳＰ９０に対する特異的結合性を有する限り、その種類及び由来等は特に限定されない。抗ＨＳＰ９０抗体は、抗ＨＳＰ９０抗体の調製方法に準じて調製できる。
抗ＨＳＰ９０抗体は、ＨＳＰ９０に対する特異的結合性を有する限り、その種類及び由来等は特に限定されない。抗ＨＳＰ９０抗体は、抗ＨＳＰ９０抗体の調製方法に準じて調製できる。
＜フロチリンに特異的な抗体＞
フロチリンに特異的な抗体は、上述した抗フロチリン抗体、抗ＣＤ６３抗体及び抗ＨＳＰ９０抗体の他、抗ＣＤ９抗体又は抗ＣＤ８１抗体等を利用できる。
フロチリンに特異的な抗体は、上述した抗フロチリン抗体、抗ＣＤ６３抗体及び抗ＨＳＰ９０抗体の他、抗ＣＤ９抗体又は抗ＣＤ８１抗体等を利用できる。
＜複数の抗体を含む場合＞
本発明の診断用キットは、抗フロチリン抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＨＳＰ９０抗体及びエクソソームに特異的な抗体のうち１種以上を含む。
本発明の診断用キットは、抗フロチリン抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＨＳＰ９０抗体及びエクソソームに特異的な抗体のうち１種以上を含む。
抗フロチリン抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＨＳＰ９０抗体及びエクソソームに特異的な抗体のうち２種以上を含む場合は、各抗体はそれぞれ別個の容器に収容されていてもよいし、同一の容器に収容されていてもよい。
本発明の診断用キットでは、抗体をはじめとする各試薬は、それぞれ別個の容器に収容されて、使用者が使用時に混合するようにして提供されてもよいし、少なくとも一部の試薬についてプレミックスとして予め混合した状態で提供されてもよい。
本発明の診断用キットには、さらに、取扱説明書（プロトコール）を添付することが好ましい。
以下では、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明は後述する実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない限り、種々の変形が可能である。
［例１］
＜ＡｐｏＥノックアウトマウスから培養したアストロサイトの馴化培養液中のフロチリン濃度は低下する＞
（１）細胞培養試験
生まれて１日目の野生型Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびＡｐｏＥ欠損Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから大脳皮質を採取したのち髄膜を除去し、メスを用い細切した。細切した脳組織をトリプシン（０．２５％）及びＤＮａｓｅ Ｉ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）にいれ、３７℃、１５分間インキュベートし組織を破砕した。その後、８００ｒｐｍで５分間遠心してから上清を吸引し、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ溶液を加え、培養フラスコに播き培養した（３７℃、５％ ＣＯ２）。細胞がコンフルーエントになり次第、恒温振とう機を用い３７℃、２００ｒｐｍの条件で１時間振とうし、接着力が弱いミクログリアを除去した。
次いで、６０ｍｍ ｄｉｓｈに１×１０６個のアストロサイトを播き、それぞれ無血清培地で７２時間培養後、上清を回収した。
次に、前記の手順で回収した上清を用いて、培養液中に分泌されたフロチリン（ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ）、ＡｐｏＥレベルをウエスタンブロット解析で検出した。
（２）ウエスタンブロット解析
１０％ポリアクリルアミドゲルに各サンプルの上清液１０μＬに４×ＳＤＳサンプルバッファー２．５μＬを加えた溶液を入れて電気泳動を行いタンパク質を分離した。分離されたタンパク質は、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンにトランスファーした後、室温で１時間ブロッキング（５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ－Ｔ）を行った。その後、メンブレンを洗浄バッファー（ＴＢＳ－Ｔ）で１０分間、３回洗浄し、ウサギ抗フロチリン－１抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及びヤギ抗アポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製，Ｃａｔ Ｎｏ． ＡＢ９４７）をＴＢＳ－Ｔバッファーで１，０００倍希釈した抗体溶液をメンブレンに入れ、４℃で１６時間反応を行った。メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識ｇｏａｔ二次抗体（２．５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０で５，０００倍希釈）を入れて室温で１時間反応させた後、化学発光をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ－６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）装置で検出した。
＜ＡｐｏＥノックアウトマウスから培養したアストロサイトの馴化培養液中のフロチリン濃度は低下する＞
（１）細胞培養試験
生まれて１日目の野生型Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびＡｐｏＥ欠損Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから大脳皮質を採取したのち髄膜を除去し、メスを用い細切した。細切した脳組織をトリプシン（０．２５％）及びＤＮａｓｅ Ｉ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）にいれ、３７℃、１５分間インキュベートし組織を破砕した。その後、８００ｒｐｍで５分間遠心してから上清を吸引し、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ溶液を加え、培養フラスコに播き培養した（３７℃、５％ ＣＯ２）。細胞がコンフルーエントになり次第、恒温振とう機を用い３７℃、２００ｒｐｍの条件で１時間振とうし、接着力が弱いミクログリアを除去した。
次いで、６０ｍｍ ｄｉｓｈに１×１０６個のアストロサイトを播き、それぞれ無血清培地で７２時間培養後、上清を回収した。
次に、前記の手順で回収した上清を用いて、培養液中に分泌されたフロチリン（ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ）、ＡｐｏＥレベルをウエスタンブロット解析で検出した。
（２）ウエスタンブロット解析
１０％ポリアクリルアミドゲルに各サンプルの上清液１０μＬに４×ＳＤＳサンプルバッファー２．５μＬを加えた溶液を入れて電気泳動を行いタンパク質を分離した。分離されたタンパク質は、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンにトランスファーした後、室温で１時間ブロッキング（５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ－Ｔ）を行った。その後、メンブレンを洗浄バッファー（ＴＢＳ－Ｔ）で１０分間、３回洗浄し、ウサギ抗フロチリン－１抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及びヤギ抗アポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製，Ｃａｔ Ｎｏ． ＡＢ９４７）をＴＢＳ－Ｔバッファーで１，０００倍希釈した抗体溶液をメンブレンに入れ、４℃で１６時間反応を行った。メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識ｇｏａｔ二次抗体（２．５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０で５，０００倍希釈）を入れて室温で１時間反応させた後、化学発光をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ－６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）装置で検出した。
図１に示す結果が得られた。
７２時間培養した馴化培養液（ＣＭ；Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ Ｍｅｄｉａ）中のフロチリン及びＡｐｏＥは、いずれも、ＡｐｏＥノックアウト細胞（ＡｐｏＥ－ＫＯ）において、野生型細胞（ＷＴ）よりも低濃度であった（図１Ａ、Ｂ）。
また、セル・ライセート中のフロチリンは、ＡｐｏＥノックアウト細胞（ＡｐｏＥ－ＫＯ）と野生型細胞（ＷＴ）との間で差が無かったが、ＡｐｏＥは、ＡｐｏＥノックアウト細胞（ＡｐｏＥ－ＫＯ）において、野生型細胞（ＷＴ）よりも低濃度であった（図１Ｃ、Ｄ）。
これらのことから、ＡｐｏＥノックアウト細胞では、エクソソームの分泌が低下することがわかった。
７２時間培養した馴化培養液（ＣＭ；Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ Ｍｅｄｉａ）中のフロチリン及びＡｐｏＥは、いずれも、ＡｐｏＥノックアウト細胞（ＡｐｏＥ－ＫＯ）において、野生型細胞（ＷＴ）よりも低濃度であった（図１Ａ、Ｂ）。
また、セル・ライセート中のフロチリンは、ＡｐｏＥノックアウト細胞（ＡｐｏＥ－ＫＯ）と野生型細胞（ＷＴ）との間で差が無かったが、ＡｐｏＥは、ＡｐｏＥノックアウト細胞（ＡｐｏＥ－ＫＯ）において、野生型細胞（ＷＴ）よりも低濃度であった（図１Ｃ、Ｄ）。
これらのことから、ＡｐｏＥノックアウト細胞では、エクソソームの分泌が低下することがわかった。
［例２］
＜野生型マウス、ＡｐｏＥノックアウトマウス、ＡｐｏＥ３ノックインマウス、ＡｐｏＥ４ノックインマウスから培養したアストロサイトの馴化培養液中のエクソソーム分泌の比較＞
（１）細胞培養試験
生まれて１日目の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＡｐｏＥ欠損Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＡｐｏＥ３－ノックインマウス、およびＡｐｏＥ４－ノックインマウスから大脳皮質を採取したのち髄膜を除去し、メスを用い細切した。細切した脳組織をトリプシン（０．２５％）及びＤＮａｓｅ Ｉ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ培地にいれ、３７℃、１５分間インキュベートし組織を破砕した。その後、８００ｒｐｍで５分間遠心してから上清を吸引し、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ溶液を加え、培養フラスコに播き培養した（３７℃、５％ ＣＯ２）。細胞がコンフルーエントになり次第、恒温振とう機を用い３７℃、２００ｒｐｍの条件で１時間振とうし、接着力が弱いミクログリアを除去した。
次いで、６０ｍｍ ｄｉｓｈに１×１０６個のアストロサイトを播き、それぞれ無血清培地で２４時間、４８時間、７２時間培養後、それぞれ上清を回収した。
次に、前記の手順で回収した上清を用いて、培養液中に分泌されたフロチリン（ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ）、ＡｐｏＥ、ＨＳＰ９０レベルをウエスタンブロット解析で検出した。
＜野生型マウス、ＡｐｏＥノックアウトマウス、ＡｐｏＥ３ノックインマウス、ＡｐｏＥ４ノックインマウスから培養したアストロサイトの馴化培養液中のエクソソーム分泌の比較＞
（１）細胞培養試験
生まれて１日目の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＡｐｏＥ欠損Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＡｐｏＥ３－ノックインマウス、およびＡｐｏＥ４－ノックインマウスから大脳皮質を採取したのち髄膜を除去し、メスを用い細切した。細切した脳組織をトリプシン（０．２５％）及びＤＮａｓｅ Ｉ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ培地にいれ、３７℃、１５分間インキュベートし組織を破砕した。その後、８００ｒｐｍで５分間遠心してから上清を吸引し、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ溶液を加え、培養フラスコに播き培養した（３７℃、５％ ＣＯ２）。細胞がコンフルーエントになり次第、恒温振とう機を用い３７℃、２００ｒｐｍの条件で１時間振とうし、接着力が弱いミクログリアを除去した。
次いで、６０ｍｍ ｄｉｓｈに１×１０６個のアストロサイトを播き、それぞれ無血清培地で２４時間、４８時間、７２時間培養後、それぞれ上清を回収した。
次に、前記の手順で回収した上清を用いて、培養液中に分泌されたフロチリン（ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ）、ＡｐｏＥ、ＨＳＰ９０レベルをウエスタンブロット解析で検出した。
（２）ウエスタンブロット解析
１０％ポリアクリルアミドゲルに各サンプルの上清液１０μＬに４×ＳＤＳサンプルバッファー２．５μＬを加えた溶液を入れて電気泳動を行いタンパク質を分離した。分離されたタンパク質は、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンにトランスファーした後、室温で１時間ブロッキング（５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ－Ｔ）を行った。その後、メンブレンを洗浄バッファー（ＴＢＳ－Ｔ）で１０分間、３回洗浄し、ウサギ抗フロチリン－１抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及びヤギ抗アポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製，Ｃａｔ Ｎｏ．ＡＢ９４７）およびマウス抗ＨＳＰ９０モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）をＴＢＳ－Ｔバッファーで１，０００倍希釈した抗体溶液をメンブレンに入れ、４℃で１６時間反応を行った。メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識ｇｏａｔ二次抗体（２．５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０で５，０００倍希釈）を入れて室温で１時間反応させた後、化学発光をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ－６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）装置で検出した。
１０％ポリアクリルアミドゲルに各サンプルの上清液１０μＬに４×ＳＤＳサンプルバッファー２．５μＬを加えた溶液を入れて電気泳動を行いタンパク質を分離した。分離されたタンパク質は、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンにトランスファーした後、室温で１時間ブロッキング（５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ－Ｔ）を行った。その後、メンブレンを洗浄バッファー（ＴＢＳ－Ｔ）で１０分間、３回洗浄し、ウサギ抗フロチリン－１抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及びヤギ抗アポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製，Ｃａｔ Ｎｏ．ＡＢ９４７）およびマウス抗ＨＳＰ９０モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）をＴＢＳ－Ｔバッファーで１，０００倍希釈した抗体溶液をメンブレンに入れ、４℃で１６時間反応を行った。メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識ｇｏａｔ二次抗体（２．５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０で５，０００倍希釈）を入れて室温で１時間反応させた後、化学発光をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ－６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）装置で検出した。
図２に示す結果が得られた。
２４時間、４８時間又は７２時間培養した馴化培養液（ＣＭ；Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ Ｍｅｄｉａ）中のフロチリン、ＨＳＰ９０、ＡｐｏＥの濃度は、ＡｐｏＥノックアウトマウスが、野生型マウス、ＡｐｏＥ３ノックインマウス及びＡｐｏＥ４ノックインマウスに比べて低かった。このことから、ＡｐｏＥノックアウト細胞ではエクソソーム分泌が低下するが、ＡｐｏＥ３又はＡｐｏＥ４をノックインすることにより、野生型と同等にまで回復することがわかった。
２４時間、４８時間又は７２時間培養した馴化培養液（ＣＭ；Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ Ｍｅｄｉａ）中のフロチリン、ＨＳＰ９０、ＡｐｏＥの濃度は、ＡｐｏＥノックアウトマウスが、野生型マウス、ＡｐｏＥ３ノックインマウス及びＡｐｏＥ４ノックインマウスに比べて低かった。このことから、ＡｐｏＥノックアウト細胞ではエクソソーム分泌が低下するが、ＡｐｏＥ３又はＡｐｏＥ４をノックインすることにより、野生型と同等にまで回復することがわかった。
［例３］
＜ＡｐｏＥノックアウトマウスから培養したアストロサイトではリン酸化Ａｋｔ、リン酸化ＰＩ３キナーゼが亢進している＞
（１）細胞培養試験
生まれて１日目の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＡｐｏＥ欠損Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＡｐｏＥ３－ノックインマウス、およびＡｐｏＥ４－ノックインマウスから大脳皮質を採取したのち髄膜を除去し、メスを用い細切した。細切した脳組織をトリプシン（０．２５％）及びＤＮａｓｅ Ｉ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ培地にいれ、３７℃、１５分間インキュベートし組織を破砕した。その後、８００ｒｐｍで５分間遠心してから上清を吸引し、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ溶液を加え、培養フラスコに播き培養した（３７℃、５％ ＣＯ２）。細胞がコンフルーエントになり次第、恒温振とう機を用い３７℃、２００ｒｐｍの条件で１時間振とうし、接着力が弱いミクログリアを除去した。
次いで、６０ｍｍ ｄｉｓｈに１×１０６個のアストロサイトを播き、それぞれ無血清培地で４８時間培養後、それぞれ上清を回収した。
次に、前記の手順で回収した上清を用いて、培養液中に分泌されたフロチリン（ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ）、リン酸化ＰＩ３キナーゼ、ＰＩ３キナーゼ、リン酸化Ａｋｔ、Ａｋｔレベルをウエスタンブロット解析で検出した。
＜ＡｐｏＥノックアウトマウスから培養したアストロサイトではリン酸化Ａｋｔ、リン酸化ＰＩ３キナーゼが亢進している＞
（１）細胞培養試験
生まれて１日目の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＡｐｏＥ欠損Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＡｐｏＥ３－ノックインマウス、およびＡｐｏＥ４－ノックインマウスから大脳皮質を採取したのち髄膜を除去し、メスを用い細切した。細切した脳組織をトリプシン（０．２５％）及びＤＮａｓｅ Ｉ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ培地にいれ、３７℃、１５分間インキュベートし組織を破砕した。その後、８００ｒｐｍで５分間遠心してから上清を吸引し、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ溶液を加え、培養フラスコに播き培養した（３７℃、５％ ＣＯ２）。細胞がコンフルーエントになり次第、恒温振とう機を用い３７℃、２００ｒｐｍの条件で１時間振とうし、接着力が弱いミクログリアを除去した。
次いで、６０ｍｍ ｄｉｓｈに１×１０６個のアストロサイトを播き、それぞれ無血清培地で４８時間培養後、それぞれ上清を回収した。
次に、前記の手順で回収した上清を用いて、培養液中に分泌されたフロチリン（ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ）、リン酸化ＰＩ３キナーゼ、ＰＩ３キナーゼ、リン酸化Ａｋｔ、Ａｋｔレベルをウエスタンブロット解析で検出した。
（２）ウエスタンブロット解析
１０％ポリアクリルアミドゲルに各サンプルの上清液１０μＬに４×ＳＤＳサンプルバッファー２．５μＬを加えた溶液を入れて電気泳動を行いタンパク質を分離した。分離されたタンパク質は、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンにトランスファーした後、室温で１時間ブロッキング（５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ－Ｔ）を行った。その後、メンブレンを洗浄バッファー（ＴＢＳ－Ｔ）で１０分間、３回洗浄し、ウサギ抗マウスリン酸化ＰＩ３キナーゼｐ８５／ｐ５５ポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ウサギ抗ヒトＰＩ３キナーゼｐ８５モノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ウサギ抗マウスリン酸化Ａｋｔポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ウサギ抗マウスＡｋｔポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）をＴＢＳ－Ｔバッファーで１，０００倍希釈した抗体溶液をメンブレンに入れ、４℃で１６時間反応を行った。メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識ｇｏａｔ二次抗体（２．５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０で５，０００倍希釈）を入れて室温で１時間反応させた後、化学発光をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ－６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）装置で検出した。
１０％ポリアクリルアミドゲルに各サンプルの上清液１０μＬに４×ＳＤＳサンプルバッファー２．５μＬを加えた溶液を入れて電気泳動を行いタンパク質を分離した。分離されたタンパク質は、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンにトランスファーした後、室温で１時間ブロッキング（５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ－Ｔ）を行った。その後、メンブレンを洗浄バッファー（ＴＢＳ－Ｔ）で１０分間、３回洗浄し、ウサギ抗マウスリン酸化ＰＩ３キナーゼｐ８５／ｐ５５ポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ウサギ抗ヒトＰＩ３キナーゼｐ８５モノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ウサギ抗マウスリン酸化Ａｋｔポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ウサギ抗マウスＡｋｔポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）をＴＢＳ－Ｔバッファーで１，０００倍希釈した抗体溶液をメンブレンに入れ、４℃で１６時間反応を行った。メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識ｇｏａｔ二次抗体（２．５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０で５，０００倍希釈）を入れて室温で１時間反応させた後、化学発光をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ－６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）装置で検出した。
図３に示す結果が得られた。
野生型、ＡｐｏＥノックアウト、ＡｐｏＥ３ノックイン及びＡｐｏＥ４ノックインの間では、Ａｋｔ量に有意差が無かったが、Ｐ－Ａｋｔ（リン酸化Ａｋｔ）量は、ＡｐｏＥノックアウトが最も多く、野生型が最も少なかった。
野生型、ＡｐｏＥノックアウト、ＡｐｏＥ３ノックイン及びＡｐｏＥ４ノックインの間では、ＰＩ３Ｋ（ＰＩ３キナーゼ）量に有意差が無かったが、Ｐ－ＰＩ３Ｋ（リン酸化ＰＩ３キナーゼ）量は、ＡｐｏＥノックアウトが最も多く、野生型が最も少なかった。
α－ｔｕｂｕｌｉｎ（α－チュブリン）は常時発現しており、ポジティブコントロールとして用いた。
野生型、ＡｐｏＥノックアウト、ＡｐｏＥ３ノックイン及びＡｐｏＥ４ノックインの間では、Ａｋｔ量に有意差が無かったが、Ｐ－Ａｋｔ（リン酸化Ａｋｔ）量は、ＡｐｏＥノックアウトが最も多く、野生型が最も少なかった。
野生型、ＡｐｏＥノックアウト、ＡｐｏＥ３ノックイン及びＡｐｏＥ４ノックインの間では、ＰＩ３Ｋ（ＰＩ３キナーゼ）量に有意差が無かったが、Ｐ－ＰＩ３Ｋ（リン酸化ＰＩ３キナーゼ）量は、ＡｐｏＥノックアウトが最も多く、野生型が最も少なかった。
α－ｔｕｂｕｌｉｎ（α－チュブリン）は常時発現しており、ポジティブコントロールとして用いた。
［例４］
＜ＡｐｏＥノックアウトマウスから培養したアストロサイトの細胞内コレステロールレベルは高い＞
（１）細胞培養試験
生まれて１日目の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＡｐｏＥ欠損Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＡｐｏＥ３－ノックインマウス、およびＡｐｏＥ４－ノックインマウスから大脳皮質を採取したのち髄膜を除去し、メスを用い細切した。細切した脳組織をトリプシン（０．２５％）及びＤＮａｓｅ Ｉ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ培地にいれ、３７℃、１５分間インキュベートし組織を破砕した。その後、８００ｒｐｍで５分間遠心してから上清を吸引し、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ溶液を加え、培養フラスコに播き培養した（３７℃、５％ ＣＯ２）。細胞がコンフルーエントになり次第、恒温振とう機を用い３７℃、２００ｒｐｍの条件で１時間振とうし、接着力が弱いミクログリアを除去した。
次いで、６０ｍｍ ｄｉｓｈに１×１０６個のアストロサイトを播き、それぞれ無血清培地で４８時間培養後、それぞれ上清を回収した。
次に、前記の手順で回収した上清を用いて、培養液中に分泌されたフロチリン（ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ）、ＡｐｏＥ、ＨＳＰ９０、α－チュブリンレベルをウエスタンブロット解析で検出した。
＜ＡｐｏＥノックアウトマウスから培養したアストロサイトの細胞内コレステロールレベルは高い＞
（１）細胞培養試験
生まれて１日目の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＡｐｏＥ欠損Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＡｐｏＥ３－ノックインマウス、およびＡｐｏＥ４－ノックインマウスから大脳皮質を採取したのち髄膜を除去し、メスを用い細切した。細切した脳組織をトリプシン（０．２５％）及びＤＮａｓｅ Ｉ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ培地にいれ、３７℃、１５分間インキュベートし組織を破砕した。その後、８００ｒｐｍで５分間遠心してから上清を吸引し、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ溶液を加え、培養フラスコに播き培養した（３７℃、５％ ＣＯ２）。細胞がコンフルーエントになり次第、恒温振とう機を用い３７℃、２００ｒｐｍの条件で１時間振とうし、接着力が弱いミクログリアを除去した。
次いで、６０ｍｍ ｄｉｓｈに１×１０６個のアストロサイトを播き、それぞれ無血清培地で４８時間培養後、それぞれ上清を回収した。
次に、前記の手順で回収した上清を用いて、培養液中に分泌されたフロチリン（ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ）、ＡｐｏＥ、ＨＳＰ９０、α－チュブリンレベルをウエスタンブロット解析で検出した。
（２）ウエスタンブロット解析
１０％ポリアクリルアミドゲルに各サンプルの上清液１０μＬに４×ＳＤＳサンプルバッファー２．５μＬを加えた溶液を入れて電気泳動を行いタンパク質を分離した。分離されたタンパク質は、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンにトランスファーした後、室温で１時間ブロッキング（５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ－Ｔ）を行った。その後、メンブレンを洗浄バッファー（ＴＢＳ－Ｔ）で１０分間、３回洗浄し、ウサギ抗フロチリン－１抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及びヤギ抗アポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製，Ｃａｔ Ｎｏ．ＡＢ９４７）およびマウス抗ＨＳＰ９０モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製），マウス抗α－チュブリンモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ ＡＬｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）をＴＢＳ－Ｔバッファーで１，０００倍希釈した抗体溶液をメンブレンに入れ、４℃で１６時間反応を行った。メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識ｇｏａｔ二次抗体（２．５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０で５，０００倍希釈）を入れて室温で１時間反応させた後、化学発光をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ－６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）装置で検出した。
（３）コレステロール定量
培養細胞のコレステロール定量では、細胞のコレステロールを乾燥させ、その後ヘキサン・イソプロパノール溶液（３：２）で３０分間インキュベーションさせたのち、ヘキサン・イソプロパノール溶液を乾燥させ、溶解したコレステロールをコレステロール定量キット（協和発酵、和光純薬）を用いて定量した。溶液除去後にプレートを乾燥させ、タンパクを定量し、単位タンパク質当たりのコレステロール量を定量した。
１０％ポリアクリルアミドゲルに各サンプルの上清液１０μＬに４×ＳＤＳサンプルバッファー２．５μＬを加えた溶液を入れて電気泳動を行いタンパク質を分離した。分離されたタンパク質は、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンにトランスファーした後、室温で１時間ブロッキング（５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ－Ｔ）を行った。その後、メンブレンを洗浄バッファー（ＴＢＳ－Ｔ）で１０分間、３回洗浄し、ウサギ抗フロチリン－１抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及びヤギ抗アポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製，Ｃａｔ Ｎｏ．ＡＢ９４７）およびマウス抗ＨＳＰ９０モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製），マウス抗α－チュブリンモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ ＡＬｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）をＴＢＳ－Ｔバッファーで１，０００倍希釈した抗体溶液をメンブレンに入れ、４℃で１６時間反応を行った。メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識ｇｏａｔ二次抗体（２．５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０で５，０００倍希釈）を入れて室温で１時間反応させた後、化学発光をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ－６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）装置で検出した。
（３）コレステロール定量
培養細胞のコレステロール定量では、細胞のコレステロールを乾燥させ、その後ヘキサン・イソプロパノール溶液（３：２）で３０分間インキュベーションさせたのち、ヘキサン・イソプロパノール溶液を乾燥させ、溶解したコレステロールをコレステロール定量キット（協和発酵、和光純薬）を用いて定量した。溶液除去後にプレートを乾燥させ、タンパクを定量し、単位タンパク質当たりのコレステロール量を定量した。
図４に示す結果が得られた。
馴化培養液中のフロチリン濃度、ＨＳＰ９０濃度、ＡｐｏＥ濃度は、ＡｐｏＥノックアウト細胞が最も低かった（図４Ａ）。
また、セル・ライセート中のフロチリン及びＨＳＰ９０の濃度は、ＡｐｏＥノックアウト細胞と他の細胞との間で有意な差が無かったが、ＡｐｏＥの濃度が、ＡｐｏＥノックアウト細胞が最も低かった（図４Ｂ）。
細胞内コレステロールレベルは、ＡｐｏＥノックアウト細胞が著しく高く、野生型細胞、ＡｐｏＥ３ノックイン細胞及びＡｐｏＥ４ノックイン細胞は、ほぼ同レベルであった。
馴化培養液中のフロチリン濃度、ＨＳＰ９０濃度、ＡｐｏＥ濃度は、ＡｐｏＥノックアウト細胞が最も低かった（図４Ａ）。
また、セル・ライセート中のフロチリン及びＨＳＰ９０の濃度は、ＡｐｏＥノックアウト細胞と他の細胞との間で有意な差が無かったが、ＡｐｏＥの濃度が、ＡｐｏＥノックアウト細胞が最も低かった（図４Ｂ）。
細胞内コレステロールレベルは、ＡｐｏＥノックアウト細胞が著しく高く、野生型細胞、ＡｐｏＥ３ノックイン細胞及びＡｐｏＥ４ノックイン細胞は、ほぼ同レベルであった。
［例５］
＜コレステロール添加により培養液中のフロチリン／ＨＳＰ９０濃度は低下する＞
（１）細胞培養試験
生まれて１日目の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＡｐｏＥ欠損Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＡｐｏＥ３－ノックインマウス、およびＡｐｏＥ４－ノックインマウスから大脳皮質を採取したのち髄膜を除去し、メスを用い細切した。細切した脳組織をトリプシン（０．２５％）及びＤＮａｓｅ Ｉ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ培地にいれ、３７℃、１５分間インキュベートし組織を破砕した。その後、８００ｒｐｍで５分間遠心してから上清を吸引し、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ溶液を加え、培養フラスコに播き培養した（３７℃、５％ ＣＯ２）。細胞がコンフルーエントになり次第、恒温振とう機を用い３７℃、２００ｒｐｍの条件で１時間振とうし、接着力が弱いミクログリアを除去した。
次いで、６０ｍｍ ｄｉｓｈに１×１０６個のアストロサイトを播き、それぞれに濃度の異なるコレステロール（エタノールに溶解）を添加した。添加内容は、エタノールのみ、０μＭ、５μＭ、１０μＭのコレステロールであった。これらの濃度で処理された培養細胞は無血清培地で４８時間培養後、それぞれ上清を回収した。
次に、前記の手順で回収した上清を用いて、培養液中に分泌されたフロチリン（ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ）、ＡｐｏＥ、ＨＳＰ９０レベルをウエスタンブロット解析で検出した。
＜コレステロール添加により培養液中のフロチリン／ＨＳＰ９０濃度は低下する＞
（１）細胞培養試験
生まれて１日目の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＡｐｏＥ欠損Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＡｐｏＥ３－ノックインマウス、およびＡｐｏＥ４－ノックインマウスから大脳皮質を採取したのち髄膜を除去し、メスを用い細切した。細切した脳組織をトリプシン（０．２５％）及びＤＮａｓｅ Ｉ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ培地にいれ、３７℃、１５分間インキュベートし組織を破砕した。その後、８００ｒｐｍで５分間遠心してから上清を吸引し、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ溶液を加え、培養フラスコに播き培養した（３７℃、５％ ＣＯ２）。細胞がコンフルーエントになり次第、恒温振とう機を用い３７℃、２００ｒｐｍの条件で１時間振とうし、接着力が弱いミクログリアを除去した。
次いで、６０ｍｍ ｄｉｓｈに１×１０６個のアストロサイトを播き、それぞれに濃度の異なるコレステロール（エタノールに溶解）を添加した。添加内容は、エタノールのみ、０μＭ、５μＭ、１０μＭのコレステロールであった。これらの濃度で処理された培養細胞は無血清培地で４８時間培養後、それぞれ上清を回収した。
次に、前記の手順で回収した上清を用いて、培養液中に分泌されたフロチリン（ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ）、ＡｐｏＥ、ＨＳＰ９０レベルをウエスタンブロット解析で検出した。
（２）ウエスタンブロット解析
１０％ポリアクリルアミドゲルに各サンプルの上清液１０μＬに４×ＳＤＳサンプルバッファー２．５μＬを加えた溶液を入れて電気泳動を行いタンパク質を分離した。分離されたタンパク質は、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンにトランスファーした後、室温で１時間ブロッキング（５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ－Ｔ）を行った。その後、メンブレンを洗浄バッファー（ＴＢＳ－Ｔ）で１０分間、３回洗浄し、ウサギ抗フロチリン－１抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及びヤギ抗アポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製，Ｃａｔ Ｎｏ．ＡＢ９４７）およびマウス抗ＨＳＰ９０モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）をＴＢＳ－Ｔバッファーで１，０００倍希釈した抗体溶液をメンブレンに入れ、４℃で１６時間反応を行った。メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識ｇｏａｔ二次抗体（２．５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０で５，０００倍希釈）を入れて室温で１時間反応させた後、化学発光をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ－６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）装置で検出した。
（３）コレステロール定量
培養細胞のコレステロール定量では、細胞のコレステロールを乾燥させ、その後ヘキサン・イソプロパノール溶液（３：２）で３０分間インキュベーションさせたのち、ヘキサン・イソプロパノール溶液を乾燥させ、溶解したコレステロールをコレステロール定量キット（協和発酵、和光純薬）を用いて定量した。溶液除去後にプレートを乾燥させ、タンパクを定量し、単位タンパク質当たりのコレステロール量を定量した。
１０％ポリアクリルアミドゲルに各サンプルの上清液１０μＬに４×ＳＤＳサンプルバッファー２．５μＬを加えた溶液を入れて電気泳動を行いタンパク質を分離した。分離されたタンパク質は、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンにトランスファーした後、室温で１時間ブロッキング（５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ－Ｔ）を行った。その後、メンブレンを洗浄バッファー（ＴＢＳ－Ｔ）で１０分間、３回洗浄し、ウサギ抗フロチリン－１抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及びヤギ抗アポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製，Ｃａｔ Ｎｏ．ＡＢ９４７）およびマウス抗ＨＳＰ９０モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）をＴＢＳ－Ｔバッファーで１，０００倍希釈した抗体溶液をメンブレンに入れ、４℃で１６時間反応を行った。メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識ｇｏａｔ二次抗体（２．５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０で５，０００倍希釈）を入れて室温で１時間反応させた後、化学発光をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ－６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）装置で検出した。
（３）コレステロール定量
培養細胞のコレステロール定量では、細胞のコレステロールを乾燥させ、その後ヘキサン・イソプロパノール溶液（３：２）で３０分間インキュベーションさせたのち、ヘキサン・イソプロパノール溶液を乾燥させ、溶解したコレステロールをコレステロール定量キット（協和発酵、和光純薬）を用いて定量した。溶液除去後にプレートを乾燥させ、タンパクを定量し、単位タンパク質当たりのコレステロール量を定量した。
図５に示す結果が得られた。
野生型細胞及びＡｐｏＥノックアウト細胞のいずれにおいても、コレステロール添加によって、馴化培養液中のフロチリン濃度及びＨＳＰ９０濃度が低下したが、ＡｐｏＥ濃度は変化がなかった（図５Ａ、Ｃ～Ｅ）。
野生型細胞及びＡｐｏＥノックアウト細胞のいずれにおいても、コレステロール添加によって、細胞内コレステロールレベルが上昇したが、ＡｐｏＥノックアウト細胞は野生型細胞よりも高レベルであった（図５Ｂ）。
野生型細胞及びＡｐｏＥノックアウト細胞のいずれにおいても、コレステロール添加によって、馴化培養液中のフロチリン濃度及びＨＳＰ９０濃度が低下したが、ＡｐｏＥ濃度は変化がなかった（図５Ａ、Ｃ～Ｅ）。
野生型細胞及びＡｐｏＥノックアウト細胞のいずれにおいても、コレステロール添加によって、細胞内コレステロールレベルが上昇したが、ＡｐｏＥノックアウト細胞は野生型細胞よりも高レベルであった（図５Ｂ）。
［例６］
＜β－シクロデキストリン処理でコレステロールを細胞から引き抜くとフロチリン／ＨＳＰ９０分泌が増加する＞
（１）細胞培養試験
生まれて１日目の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＡｐｏＥ欠損Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから大脳皮質を採取したのち髄膜を除去し、メスを用い細切した。細切した脳組織をトリプシン（０．２５％）及びＤＮａｓｅ Ｉ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ培地にいれ、３７℃、１５分間インキュベートし組織を破砕した。その後、８００ｒｐｍで５分間遠心してから上清を吸引し、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ溶液を加え、培養フラスコに播き培養した（３７℃、５％ ＣＯ２）。細胞がコンフルーエントになり次第、恒温振とう機を用い３７℃、２００ｒｐｍの条件で１時間振とうし、接着力が弱いミクログリアを除去した。
次いで、６０ｍｍ ｄｉｓｈに１×１０６個のアストロサイトを播き、それぞれに濃度の異なるβ－シクロデキストリン（エタノールに溶解）をエタノールのみ、０ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭの濃度で添加した。β－シクロデキストリンは細胞からコレステロールを抜き取る作用があり、細胞のコレステロールレベルを低下させる。これらの濃度で処理された培養細胞は無血清培地で４８時間培養後、それぞれ上清を回収した。
次に、前記の手順で回収した上清を用いて、培養液中に分泌されたフロチリン（ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ）、ＡｐｏＥ、ＨＳＰ９０レベルをウエスタンブロット解析で検出した。
＜β－シクロデキストリン処理でコレステロールを細胞から引き抜くとフロチリン／ＨＳＰ９０分泌が増加する＞
（１）細胞培養試験
生まれて１日目の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＡｐｏＥ欠損Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから大脳皮質を採取したのち髄膜を除去し、メスを用い細切した。細切した脳組織をトリプシン（０．２５％）及びＤＮａｓｅ Ｉ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ培地にいれ、３７℃、１５分間インキュベートし組織を破砕した。その後、８００ｒｐｍで５分間遠心してから上清を吸引し、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ溶液を加え、培養フラスコに播き培養した（３７℃、５％ ＣＯ２）。細胞がコンフルーエントになり次第、恒温振とう機を用い３７℃、２００ｒｐｍの条件で１時間振とうし、接着力が弱いミクログリアを除去した。
次いで、６０ｍｍ ｄｉｓｈに１×１０６個のアストロサイトを播き、それぞれに濃度の異なるβ－シクロデキストリン（エタノールに溶解）をエタノールのみ、０ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭの濃度で添加した。β－シクロデキストリンは細胞からコレステロールを抜き取る作用があり、細胞のコレステロールレベルを低下させる。これらの濃度で処理された培養細胞は無血清培地で４８時間培養後、それぞれ上清を回収した。
次に、前記の手順で回収した上清を用いて、培養液中に分泌されたフロチリン（ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ）、ＡｐｏＥ、ＨＳＰ９０レベルをウエスタンブロット解析で検出した。
（２）ウエスタンブロット解析
１０％ポリアクリルアミドゲルに各サンプルの上清液１０μＬに４×ＳＤＳサンプルバッファー２．５μＬを加えた溶液を入れて電気泳動を行いタンパク質を分離した。分離されたタンパク質は、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンにトランスファーした後、室温で１時間ブロッキング（５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ－Ｔ）を行った。その後、メンブレンを洗浄バッファー（ＴＢＳ－Ｔ）で１０分間、３回洗浄し、ウサギ抗フロチリン－１抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及びヤギ抗アポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製，Ｃａｔ Ｎｏ．ＡＢ９４７）およびマウス抗ＨＳＰ９０モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）をＴＢＳ－Ｔバッファーで１，０００倍希釈した抗体溶液をメンブレンに入れ、４℃で１６時間反応を行った。メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識ｇｏａｔ二次抗体（２．５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０で５，０００倍希釈）を入れて室温で１時間反応させた後、化学発光をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ－６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）装置で検出した。
（３）コレステロール定量
培養細胞のコレステロール定量では、細胞のコレステロールを乾燥させ、その後ヘキサン・イソプロパノール溶液（３：２）で３０分間インキュベーションさせたのち、ヘキサン・イソプロパノール溶液を乾燥させ、溶解したコレステロールをコレステロール定量キット（協和発酵、和光純薬）を用いて定量した。溶液除去後にプレートを乾燥させ、タンパクを定量し、単位タンパク質当たりのコレステロール量を定量した。
１０％ポリアクリルアミドゲルに各サンプルの上清液１０μＬに４×ＳＤＳサンプルバッファー２．５μＬを加えた溶液を入れて電気泳動を行いタンパク質を分離した。分離されたタンパク質は、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンにトランスファーした後、室温で１時間ブロッキング（５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ－Ｔ）を行った。その後、メンブレンを洗浄バッファー（ＴＢＳ－Ｔ）で１０分間、３回洗浄し、ウサギ抗フロチリン－１抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及びヤギ抗アポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製，Ｃａｔ Ｎｏ．ＡＢ９４７）およびマウス抗ＨＳＰ９０モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）をＴＢＳ－Ｔバッファーで１，０００倍希釈した抗体溶液をメンブレンに入れ、４℃で１６時間反応を行った。メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識ｇｏａｔ二次抗体（２．５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０で５，０００倍希釈）を入れて室温で１時間反応させた後、化学発光をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ－６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）装置で検出した。
（３）コレステロール定量
培養細胞のコレステロール定量では、細胞のコレステロールを乾燥させ、その後ヘキサン・イソプロパノール溶液（３：２）で３０分間インキュベーションさせたのち、ヘキサン・イソプロパノール溶液を乾燥させ、溶解したコレステロールをコレステロール定量キット（協和発酵、和光純薬）を用いて定量した。溶液除去後にプレートを乾燥させ、タンパクを定量し、単位タンパク質当たりのコレステロール量を定量した。
図６に示す結果が得られた。
培養液へのβ－シクロデキストリンの添加により、ＡｐｏＥノックアウト細胞の馴化培養液中のフロチリン濃度及びＨＳＰ９０濃度は野生型細胞と同程度にまで増加したが、ＡｐｏＥ濃度に変化はなかった（図６Ａ、Ｃ～Ｅ）。
野生型細胞及びＡｐｏＥノックアウト細胞のいずれにおいても、β－シクロデキストリンの添加によって、細胞内コレステロールレベルが低下したが、ＡｐｏＥノックアウト細胞では、２ｍＭの添加で野生型細胞と同等にまで低下した（図６Ｂ）。
培養液へのβ－シクロデキストリンの添加により、ＡｐｏＥノックアウト細胞の馴化培養液中のフロチリン濃度及びＨＳＰ９０濃度は野生型細胞と同程度にまで増加したが、ＡｐｏＥ濃度に変化はなかった（図６Ａ、Ｃ～Ｅ）。
野生型細胞及びＡｐｏＥノックアウト細胞のいずれにおいても、β－シクロデキストリンの添加によって、細胞内コレステロールレベルが低下したが、ＡｐｏＥノックアウト細胞では、２ｍＭの添加で野生型細胞と同等にまで低下した（図６Ｂ）。
［例７］
＜β－シクロデキストリン処理でコレステロールを細胞から引き抜くとリン酸化ＰＩ３キナーゼとリン酸化Ａｋｔは減少する＞
（１）細胞培養試験
生まれて１日目の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＡｐｏＥ欠損Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから大脳皮質を採取したのち髄膜を除去し、メスを用い細切した。細切した脳組織をトリプシン（０．２５％）及びＤＮａｓｅ Ｉ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ培地にいれ、３７℃、１５分間インキュベートし組織を破砕した。その後、８００ｒｐｍで５分間遠心してから上清を吸引し、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ溶液を加え、培養フラスコに播き培養した（３７℃、５％ ＣＯ２）。細胞がコンフルーエントになり次第、恒温振とう機を用い３７℃、２００ｒｐｍの条件で１時間振とうし、接着力が弱いミクログリアを除去した。
次いで、６０ｍｍ ｄｉｓｈに１×１０６個のアストロサイトを播き、それぞれに濃度の異なるβ－シクロデキストリン（エタノールに溶解）をエタノールのみ、０ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭの濃度で添加した。β－シクロデキストリンは細胞からコレステロールを抜き取る作用があり、細胞のコレステロールレベルを低下させる。これらの濃度で処理された培養細胞は無血清培地で４８時間培養後、それぞれ上清を回収した。
次に、前記の手順で回収した上清を用いて、培養液中に分泌されたフロチリン（ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ）、リン酸化ＰＩ３キナーゼ、ＰＩ３キナーゼ、リン酸化Ａｋｔ、Ａｋｔレベルをウエスタンブロット解析で検出した。
＜β－シクロデキストリン処理でコレステロールを細胞から引き抜くとリン酸化ＰＩ３キナーゼとリン酸化Ａｋｔは減少する＞
（１）細胞培養試験
生まれて１日目の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＡｐｏＥ欠損Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから大脳皮質を採取したのち髄膜を除去し、メスを用い細切した。細切した脳組織をトリプシン（０．２５％）及びＤＮａｓｅ Ｉ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ培地にいれ、３７℃、１５分間インキュベートし組織を破砕した。その後、８００ｒｐｍで５分間遠心してから上清を吸引し、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ溶液を加え、培養フラスコに播き培養した（３７℃、５％ ＣＯ２）。細胞がコンフルーエントになり次第、恒温振とう機を用い３７℃、２００ｒｐｍの条件で１時間振とうし、接着力が弱いミクログリアを除去した。
次いで、６０ｍｍ ｄｉｓｈに１×１０６個のアストロサイトを播き、それぞれに濃度の異なるβ－シクロデキストリン（エタノールに溶解）をエタノールのみ、０ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭの濃度で添加した。β－シクロデキストリンは細胞からコレステロールを抜き取る作用があり、細胞のコレステロールレベルを低下させる。これらの濃度で処理された培養細胞は無血清培地で４８時間培養後、それぞれ上清を回収した。
次に、前記の手順で回収した上清を用いて、培養液中に分泌されたフロチリン（ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ）、リン酸化ＰＩ３キナーゼ、ＰＩ３キナーゼ、リン酸化Ａｋｔ、Ａｋｔレベルをウエスタンブロット解析で検出した。
（２）ウエスタンブロット解析
１０％ポリアクリルアミドゲルに各サンプルの上清液１０μＬに４×ＳＤＳサンプルバッファー２．５μＬを加えた溶液を入れて電気泳動を行いタンパク質を分離した。分離されたタンパク質は、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンにトランスファーした後、室温で１時間ブロッキング（５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ－Ｔ）を行った。その後、メンブレンを洗浄バッファー（ＴＢＳ－Ｔ）で１０分間、３回洗浄し、ウサギ抗マウスリン酸化ＰＩ３キナーゼｐ８５／ｐ５５ポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ウサギ抗ヒトＰＩ３キナーゼｐ８５モノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ウサギ抗マウスリン酸化Ａｋｔポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ウサギ抗マウスＡｋｔポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）をＴＢＳ－Ｔバッファーで１，０００倍希釈した抗体溶液をメンブレンに入れ、４℃で１６時間反応を行った。メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識ｇｏａｔ二次抗体（２．５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０で５，０００倍希釈）を入れて室温で１時間反応させた後、化学発光をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ－６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）装置で検出した。
１０％ポリアクリルアミドゲルに各サンプルの上清液１０μＬに４×ＳＤＳサンプルバッファー２．５μＬを加えた溶液を入れて電気泳動を行いタンパク質を分離した。分離されたタンパク質は、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンにトランスファーした後、室温で１時間ブロッキング（５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ－Ｔ）を行った。その後、メンブレンを洗浄バッファー（ＴＢＳ－Ｔ）で１０分間、３回洗浄し、ウサギ抗マウスリン酸化ＰＩ３キナーゼｐ８５／ｐ５５ポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ウサギ抗ヒトＰＩ３キナーゼｐ８５モノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ウサギ抗マウスリン酸化Ａｋｔポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ウサギ抗マウスＡｋｔポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）をＴＢＳ－Ｔバッファーで１，０００倍希釈した抗体溶液をメンブレンに入れ、４℃で１６時間反応を行った。メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識ｇｏａｔ二次抗体（２．５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０で５，０００倍希釈）を入れて室温で１時間反応させた後、化学発光をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ－６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）装置で検出した。
図７に示す結果が得られた。
セル・ライセート中のＡｋｔ量はβ－シクロデキストリン処理により影響を受けなかったが、Ｐ－Ａｋｔ（リン酸化Ａｋｔ）量はβ－シクロデキストリン処理により低下した（図７Ａ～Ｃ）。
セル・ライセート中のＰＩ３Ｋ（ＰＩ３キナーゼ）量はβ－シクロデキストリン処理により影響を受けなかったが、ＡｐｏＥノックアウト細胞では、Ｐ－ＰＩ３Ｋ（リン酸化ＰＩ３キナーゼ）量はβ－シクロデキストリン処理により低下した（図７Ａ、Ｄ、Ｅ）。
セル・ライセート中のＡｋｔ量はβ－シクロデキストリン処理により影響を受けなかったが、Ｐ－Ａｋｔ（リン酸化Ａｋｔ）量はβ－シクロデキストリン処理により低下した（図７Ａ～Ｃ）。
セル・ライセート中のＰＩ３Ｋ（ＰＩ３キナーゼ）量はβ－シクロデキストリン処理により影響を受けなかったが、ＡｐｏＥノックアウト細胞では、Ｐ－ＰＩ３Ｋ（リン酸化ＰＩ３キナーゼ）量はβ－シクロデキストリン処理により低下した（図７Ａ、Ｄ、Ｅ）。
［例８］
＜ＰＩ３キナーゼ阻害剤（ＬＹ２９４００２）はＡｐｏＥノックアウトにフロチリン／ＨＳＰ９０の減少を改善させた＞
（１）細胞培養試験
生まれて１日目の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＡｐｏＥ欠損Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから大脳皮質を採取したのち髄膜を除去し、メスを用い細切した。細切した脳組織をトリプシン（０．２５％）及びＤＮａｓｅ Ｉ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ培地にいれ、３７℃、１５分間インキュベートし組織を破砕した。その後、８００ｒｐｍで５分間遠心してから上清を吸引し、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ溶液を加え、培養フラスコに播き培養した（３７℃、５％ ＣＯ２）。細胞がコンフルーエントになり次第、恒温振とう機を用い３７℃、２００ｒｐｍの条件で１時間振とうし、接着力が弱いミクログリアを除去した。
次いで、６０ｍｍ ｄｉｓｈに１×１０６個のアストロサイトを播き、それぞれに濃度の異なるＰＩ３キナーゼ阻害剤（ＬＹ２９４００２）（ＤＭＳＯに溶解）を、２、１０、２０μＭ、の濃度で添加した。これらの濃度で処理された培養細胞は無血清培地で４８時間培養後、それぞれ上清を回収した。
次に、前記の手順で回収した上清を用いて、培養液中に分泌されたフロチリン（ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ）、ＨＳＰ９０レベルをウエスタンブロット解析で検出した。
＜ＰＩ３キナーゼ阻害剤（ＬＹ２９４００２）はＡｐｏＥノックアウトにフロチリン／ＨＳＰ９０の減少を改善させた＞
（１）細胞培養試験
生まれて１日目の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＡｐｏＥ欠損Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから大脳皮質を採取したのち髄膜を除去し、メスを用い細切した。細切した脳組織をトリプシン（０．２５％）及びＤＮａｓｅ Ｉ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ培地にいれ、３７℃、１５分間インキュベートし組織を破砕した。その後、８００ｒｐｍで５分間遠心してから上清を吸引し、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ溶液を加え、培養フラスコに播き培養した（３７℃、５％ ＣＯ２）。細胞がコンフルーエントになり次第、恒温振とう機を用い３７℃、２００ｒｐｍの条件で１時間振とうし、接着力が弱いミクログリアを除去した。
次いで、６０ｍｍ ｄｉｓｈに１×１０６個のアストロサイトを播き、それぞれに濃度の異なるＰＩ３キナーゼ阻害剤（ＬＹ２９４００２）（ＤＭＳＯに溶解）を、２、１０、２０μＭ、の濃度で添加した。これらの濃度で処理された培養細胞は無血清培地で４８時間培養後、それぞれ上清を回収した。
次に、前記の手順で回収した上清を用いて、培養液中に分泌されたフロチリン（ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ）、ＨＳＰ９０レベルをウエスタンブロット解析で検出した。
（２）ウエスタンブロット解析
１０％ポリアクリルアミドゲルに各サンプルの上清液１０μＬに４×ＳＤＳサンプルバッファー２．５μＬを加えた溶液を入れて電気泳動を行いタンパク質を分離した。分離されたタンパク質は、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンにトランスファーした後、室温で１時間ブロッキング（５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ－Ｔ）を行った。その後、メンブレンを洗浄バッファー（ＴＢＳ－Ｔ）で１０分間、３回洗浄し、ウサギ抗フロチリン－１抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及びマウス抗ＨＳＰ９０モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）をＴＢＳ－Ｔバッファーで１，０００倍希釈した抗体溶液をメンブレンに入れ、４℃で１６時間反応を行った。メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識ｇｏａｔ二次抗体（２．５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０で５，０００倍希釈）を入れて室温で１時間反応させた後、化学発光をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ－６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）装置で検出した。
１０％ポリアクリルアミドゲルに各サンプルの上清液１０μＬに４×ＳＤＳサンプルバッファー２．５μＬを加えた溶液を入れて電気泳動を行いタンパク質を分離した。分離されたタンパク質は、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンにトランスファーした後、室温で１時間ブロッキング（５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ－Ｔ）を行った。その後、メンブレンを洗浄バッファー（ＴＢＳ－Ｔ）で１０分間、３回洗浄し、ウサギ抗フロチリン－１抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及びマウス抗ＨＳＰ９０モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）をＴＢＳ－Ｔバッファーで１，０００倍希釈した抗体溶液をメンブレンに入れ、４℃で１６時間反応を行った。メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識ｇｏａｔ二次抗体（２．５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０で５，０００倍希釈）を入れて室温で１時間反応させた後、化学発光をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ－６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）装置で検出した。
図８に示す結果が得られた。
ＰＩ３キナーゼ阻害剤（ＬＹ２９４００２）添加によって、ＡｐｏＥノックアウト細胞における培養液中のフロチリン濃度及びＨＳＰ９０濃度が野生型細胞と同等にまで上昇した（図８Ａ～Ｃ）。
ＰＩ３キナーゼ阻害剤（ＬＹ２９４００２）添加によって、ＡｐｏＥノックアウト細胞における培養液中のフロチリン濃度及びＨＳＰ９０濃度が野生型細胞と同等にまで上昇した（図８Ａ～Ｃ）。
［例９］
＜ヒト血清試料を用いたフロチリン濃度とＣＤ６３／９との相関（ＭＣＩ（＋），ＭＣＩ（－））＞
ヒトサンプルの収集では、ＭＣＩ（－）（軽度認知障害ない）群とＭＣＩ（＋）（軽度認知障害あり）群の患者血清を採取した。これらの患者は、認知機能検査、ＭＲＩ検査、アミロイドＰＥＴ検査等により診断されたものである。
それぞれの血清をＰＢＳで１００倍に希釈したものを使用し、含まれているフロチリンレベルをウエスタンブロット解析で定量した。まず、１０％ポリアクリルアミドゲルに各サンプルの上清液１０μＬに４×ＳＤＳサンプルバッファー２．５μＬを加えた溶液を入れて電気泳動を行いタンパク質を分離した。分離されたタンパク質は、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンにトランスファーした後、室温で１時間ブロッキング（５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ－Ｔ）を行った。その後、メンブレンを洗浄バッファー（ＴＢＳ－Ｔ）で１０分間、３回洗浄し、ウサギ抗フロチリン－１抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）をＴＢＳ－Ｔバッファーで１，０００倍希釈した抗体溶液をメンブレンに入れ、４℃で１６時間反応を行った。メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識ｇｏａｔ二次抗体（２．５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０で５，０００倍希釈）を入れて室温で１時間反応させた後、化学発光をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ－６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）装置で検出した。
また、血清エクソソームレベル定量では、血清を２０倍に希釈してＣＤ９／ＣＤ６３エクソソーム定量キット（コスモバイオ株式会社）を使用し、プロトコールに従って解析した。
＜ヒト血清試料を用いたフロチリン濃度とＣＤ６３／９との相関（ＭＣＩ（＋），ＭＣＩ（－））＞
ヒトサンプルの収集では、ＭＣＩ（－）（軽度認知障害ない）群とＭＣＩ（＋）（軽度認知障害あり）群の患者血清を採取した。これらの患者は、認知機能検査、ＭＲＩ検査、アミロイドＰＥＴ検査等により診断されたものである。
それぞれの血清をＰＢＳで１００倍に希釈したものを使用し、含まれているフロチリンレベルをウエスタンブロット解析で定量した。まず、１０％ポリアクリルアミドゲルに各サンプルの上清液１０μＬに４×ＳＤＳサンプルバッファー２．５μＬを加えた溶液を入れて電気泳動を行いタンパク質を分離した。分離されたタンパク質は、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンにトランスファーした後、室温で１時間ブロッキング（５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ－Ｔ）を行った。その後、メンブレンを洗浄バッファー（ＴＢＳ－Ｔ）で１０分間、３回洗浄し、ウサギ抗フロチリン－１抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）をＴＢＳ－Ｔバッファーで１，０００倍希釈した抗体溶液をメンブレンに入れ、４℃で１６時間反応を行った。メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識ｇｏａｔ二次抗体（２．５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０で５，０００倍希釈）を入れて室温で１時間反応させた後、化学発光をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ－６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）装置で検出した。
また、血清エクソソームレベル定量では、血清を２０倍に希釈してＣＤ９／ＣＤ６３エクソソーム定量キット（コスモバイオ株式会社）を使用し、プロトコールに従って解析した。
図９に示す結果が得られた。
ＭＣＩ（－）（軽度認知障害ない）群とＭＣＩ（＋）（軽度認知障害あり）群とでは、血清中のエクソソーム濃度に有意差が認められた（図９Ａ～Ｃ）。
ＭＣＩ（－）（軽度認知障害ない）群とＭＣＩ（＋）（軽度認知障害あり）群とでは、血清中のエクソソーム濃度に有意差が認められた（図９Ａ～Ｃ）。
［例１０］
（１）マウスを用いた高脂肪食（高コレステロール食）による影響の解析
３か月齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを２０匹準備し、普通食で飼育するマウスを１１匹、高脂肪食で飼育するマウスを９匹とした。これらの条件で４カ月間飼育し、脳脊髄液、血清ならびに脳サンプルを回収した。回収に際しては３種類の麻酔剤をメデトミジン（ドミトール（登録商標）、日本全薬工業社製）０．３ｍｇ／ｋｇ、ミダゾラム（ドルミカム（登録商標）、アステラス製薬社製）４．０ｍｇ／ｋｇ及びブトルファノール（ベトルファール（登録商標）、Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ社製）５．０ｍｇ／ｋｇの割合で投与できるように混合したものを準備し、純水に溶かしたものをマウスの体重に合わせて使用した。
投与方法は、マウスの腹腔に容量としてｇ体重あたり０．０１ｍＬを投与した。
麻酔下で、マウス後頭部を開き、髄液を採取し凍結保存（－８０℃）した。
心臓から４℃ＰＢＳを注入して全身（脳を含む）を還流した。
（１）マウスを用いた高脂肪食（高コレステロール食）による影響の解析
３か月齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを２０匹準備し、普通食で飼育するマウスを１１匹、高脂肪食で飼育するマウスを９匹とした。これらの条件で４カ月間飼育し、脳脊髄液、血清ならびに脳サンプルを回収した。回収に際しては３種類の麻酔剤をメデトミジン（ドミトール（登録商標）、日本全薬工業社製）０．３ｍｇ／ｋｇ、ミダゾラム（ドルミカム（登録商標）、アステラス製薬社製）４．０ｍｇ／ｋｇ及びブトルファノール（ベトルファール（登録商標）、Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ社製）５．０ｍｇ／ｋｇの割合で投与できるように混合したものを準備し、純水に溶かしたものをマウスの体重に合わせて使用した。
投与方法は、マウスの腹腔に容量としてｇ体重あたり０．０１ｍＬを投与した。
麻酔下で、マウス後頭部を開き、髄液を採取し凍結保存（－８０℃）した。
心臓から４℃ＰＢＳを注入して全身（脳を含む）を還流した。
（２）ウエスタンブロット解析
１０％ポリアクリルアミドゲルに各サンプルの上清液１０μＬに４×ＳＤＳサンプルバッファー２．５μＬを加えた溶液を入れて電気泳動を行い、タンパク質を分離した。分離されたタンパク質は、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンにトランスファーした後、室温で１時間ブロッキング（５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ－Ｔ）を行った。その後、メンブレンを洗浄バッファー（ＴＢＳ－Ｔ）で１０分間、３回洗浄し、ウサギ抗フロチリン－１抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及びマウス抗ＨＳＰ９０モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）をＴＢＳ－Ｔバッファーで１，０００倍希釈した抗体溶液をメンブレンに入れ、４℃で１６時間反応を行った。メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識ｇｏａｔ二次抗体（２．５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０で５，０００倍希釈）を入れて室温で１時間反応させた後、化学発光をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ－６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）装置で検出した。
１０％ポリアクリルアミドゲルに各サンプルの上清液１０μＬに４×ＳＤＳサンプルバッファー２．５μＬを加えた溶液を入れて電気泳動を行い、タンパク質を分離した。分離されたタンパク質は、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンにトランスファーした後、室温で１時間ブロッキング（５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ－Ｔ）を行った。その後、メンブレンを洗浄バッファー（ＴＢＳ－Ｔ）で１０分間、３回洗浄し、ウサギ抗フロチリン－１抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及びマウス抗ＨＳＰ９０モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）をＴＢＳ－Ｔバッファーで１，０００倍希釈した抗体溶液をメンブレンに入れ、４℃で１６時間反応を行った。メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識ｇｏａｔ二次抗体（２．５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０で５，０００倍希釈）を入れて室温で１時間反応させた後、化学発光をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ－６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）装置で検出した。
図１０に示すように、高脂肪食で飼育したマウスの脳脊髄液におけるフロチリンならびにＨＳＰ９０のレベルは、普通食で飼育したマウスのそれにくらべて、有意に低下した。
また、図１１に示すように、血清中のフロチリンならびにＨＳＰ９０のレベルも同様に、高脂肪食で飼育したマウス血清では、普通食で飼育したマウスのそれにくらべて有意に低下した。
また、図１１に示すように、血清中のフロチリンならびにＨＳＰ９０のレベルも同様に、高脂肪食で飼育したマウス血清では、普通食で飼育したマウスのそれにくらべて有意に低下した。
本発明の、診断用マーカー、診断を補助する方法、診断のためにデータを収集する方法、罹患可能性を評価する方法、及び診断用キットによれば、直接測定できない細胞内コレステロールレベルを推定でき、細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の診断のために有用である。
Claims (6)
- エクソソームマーカー（但し、フロチリンを除く。）からなる軽度認知障害の診断用マーカー。
- 前記エクソソームマーカーが、ＣＤ６３、ＣＤ９、及びＨＳＰ９０からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の診断用マーカー。
- 軽度認知障害の診断を補助する方法であって、
被験者から採取した血液検体中の、請求項１又は２に記載の診断用マーカーの濃度を測定し、
前記濃度を基準値と比較する、方法。 - 軽度認知障害の診断のためにデータを収集する方法であって、
被験者から採取した血液検体中の、請求項１又は２に記載の診断用マーカーの濃度を測定する、方法。 - 軽度認知障害の罹患可能性を評価するための方法であって、
被験者から採取した血液検体中の、請求項１又は２に記載の診断用マーカーの濃度を測定し、
前記濃度を基準濃度と比較し、
前記濃度が前記基準濃度と比較して低い場合には、前記被験者が軽度認知障害に罹患している可能性が高いことを示す、方法。 - 請求項１又は２に記載の診断用マーカーに特異的な抗体を含む、軽度認知障害の診断用キット。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2019184791A JP7280610B2 (ja) | 2019-10-07 | 2019-10-07 | 細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の、診断用マーカー、診断を補助する方法、診断のためにデータを収集する方法、罹患可能性を評価する方法、及び診断用キット |
Applications Claiming Priority (1)
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| JP2019184791A JP7280610B2 (ja) | 2019-10-07 | 2019-10-07 | 細胞内コレステロールレベルに関連する疾患の、診断用マーカー、診断を補助する方法、診断のためにデータを収集する方法、罹患可能性を評価する方法、及び診断用キット |
Publications (2)
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|---|---|
| JP2021060289A JP2021060289A (ja) | 2021-04-15 |
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| JP2018513986A (ja) | 2015-04-10 | 2018-05-31 | キョンブク ナショナル ユニバーシティ ホスピタル | コレステロールの蓄積による疾患診断用マーカー組成物及びその利用 |
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-
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