JP5868176B2 - 抗癌活性を有する抗体 - Google Patents
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Description
(1) 配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるヒト由来のPODXL2蛋白質における400−428位のアミノ酸配列からなる領域に結合し、かつ、抗癌活性を有する抗体、
(2) 癌が胃癌である、(1)に記載の抗体、
(3) 配列番号:3から5に記載のアミノ酸配列をCDRとして含む軽鎖可変領域と、配列番号:6から8に記載のアミノ酸配列をCDRとして含む重鎖可変領域を保持する、(1)に記載の抗体、
(4) (3)に記載の抗体における配列番号:3から8に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、1のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されており、かつ、(3)に記載の抗体と比較して70%以上の抗癌活性を有する抗体、
(5) (3)に記載の抗体における配列番号:3から8に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、1のアミノ酸が保存的に置換されており、かつ、(3)に記載の抗体と比較して70%以上の抗癌活性を有する抗体、
(6) 配列番号:10に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する、(1)に記載の抗体、
(7) (6)に記載の抗体における配列番号:10および12に記載のアミノ酸配列少なくともいずれかにおいて、1若しくは10アミノ酸以内のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されており、かつ、(6)に記載の抗体と比較して70%以上の抗癌活性を有する抗体、
(8) (6)に記載の抗体における配列番号:10および12に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、1若しくは10アミノ酸以内のアミノ酸が保存的に置換されており、かつ、(6)に記載の抗体と比較して70%以上の抗癌活性を有する抗体、
(9) (6)に記載の抗体における配列番号:10および12に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいてシグナル配列が除去されており、かつ、(6)に記載の抗体と比較して70%以上の抗癌活性を有する抗体、
(10) 配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるヒト由来のPODXL2蛋白質における、(6)に記載の抗体のエピトープに結合し、かつ、抗癌活性を有する抗体、
(11) 配列番号:3から5に記載のアミノ酸配列をCDRとして含む、請求項1に記載の抗体の軽鎖またはその可変領域からなるペプチドと、配列番号:6から8に記載のアミノ酸配列をCDRとして含む、請求項1に記載の抗体の重鎖またはその可変領域からなるペプチドとの組み合わせ、
(12) 配列番号:10に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列を含むペプチドと、配列番号:12に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列を含むペプチドとの組み合わせ、
(13) (1)から(9)のいずれかに記載の抗体または(11)から(14)のいずれかに記載のペプチドをコードするDNA、
(14) (1)から(9)のいずれかに記載の抗体を産生する、または、(15)に記載のDNAを含む、ハイブリドーマ又は宿主細胞、
(15) (14)に記載のハイブリドーマ又は宿主細胞により産生された抗体、
(16) (1)から(9)のいずれかに記載の抗体を有効成分とする、抗癌剤、
(17) 癌が胃癌である、(16)に記載の抗癌剤。
「一本鎖Fv(sFv)」は、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在する。「sc(Fv)2」は、2つの重鎖可変領域および2つの軽鎖可変領域をリンカー等で結合して一本鎖にしたものである。「ダイアボディー」とは、二つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片であり、この断片は、同一ポリペプチド鎖の中に軽鎖可変領域に結合した重鎖可変領域を含み、各領域は別の鎖の相補的領域とペアを形成している。「多特異性抗体」は、少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。例えば、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の同時発現により調製することができる。
[実施例1] SST-REXの実施
スキルス胃癌株化細胞GCIY細胞細胞表面に発現している膜あるいは分泌遺伝子情報を網羅的に得るためにSST-REXを実施した。
(1)cDNAの作製
GCIY細胞2×107個をTrizol(invitrogen,#15596-026)1mlに懸濁して5分放置し、クロロフォルムを200μl添加して15秒間懸濁後、12,000×gで15分間遠心した。この遠心後の上清と500μlのイソプロパノールを混ぜ合わせた後、12,000×gで10分間遠心を行った。得られたペレットを80%エタノールで洗浄し、全RNA 200μg以上を得て、以後の実験に供した。
(2)pMX-SSTベクターへのcDNA配列の組み込み(キメラ化)
レトロウイルスベクターpMX-SSTに得られたcDNAを組み込むためにpMX-SSTベクター(Nature Biotechnology 17, p487-490, 1999)5μgを制限酵素BstXIを用いて、100μlの反応系で45度で4時間処理した。反応液すべてを1%アガロースゲルにて電気泳動したところ、約5000塩基の長さのDNA断片と約500塩基の長さのDNA断片が検出された。約5000塩基の長さのDNA断片を保有している部分のアガロースゲルを切り出した。さらにWizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System(promega,#A9282)を用いて、約5000塩基の長さのDNA断片を精製した。このようにして得られたDNA断片をpMX-SSTベクターをBstXIで制限酵素処理したものとし、これを1μl当たり50ng含む水溶液となるよう調製した。
(3)cDNAライブラリの増幅
pMX-SSTベクターを用いて構築したcDNAライブラリを大腸菌に導入して増幅を行った。cDNAライブラリに、5μgのtRNA、12.5μlの7.5M酢酸ナトリウム、および70μlのエタノールを加え、転倒混和した後、20,400×gで30分遠心し、上清を捨て沈殿を得た。得られた沈殿に500μlの70%エタノールを加え、20,400×gで5分遠心し、上清を捨て得られた沈殿を10μlの水に溶かした。cDNAを大腸菌内で増幅させるために、そのうちの2μlを、コンピテントセル(invitrogen,#18920−015)23μlと混ぜ、1.8kVの条件でエレクトロポレーションを行い、1mlのSOC培地(invitrogen,#15544-034)全量を懸濁した。この作業を2回行い、大腸菌を懸濁したSOC培地を37度で90分間、振とう培養した。その後、この培養溶液全量を、培地1ml当たりアンピシリン100μgを含むLB培地500mlに投入し、37度で16時間、振とう培養を行った。
(4)cDNAライブラリのパッケージングおよびSST-REX法の実施
cDNAライブラリ由来遺伝子が組み込まれたpMX-SSTレトロウイルスベクターRNAを含むレトロウイルスを産生させるため、ウイルスパッケイジング細胞Plat-E(Gene Ther. 2000Jun;7(12):1063-6.)2×106個を、4mlのDMEM培地(Wako,#044-29765)を含む6cmディッシュに懸濁し、37度で5%CO2の条件で24時間培養した。一方、100μlのopti-MEM(GIBCO,#31985070)と9μlのFugene(Roche,#1814443)を混ぜ、5分室温で放置後、3μgのcDNAライブラリを添加し、15分室温で放置した。cDNAライブラリを含む溶液を、培養後のPlat-E細胞に滴下し、24時間後に上清を入れ替えて同一条件で培養を続けた。さらに24時間後の上清を0.45μmのフィルターを通してろ過した。
(5)SST-REXで得られた遺伝子産物の解析
各ウェルから得られた細胞の半分量は拡大培養して、細胞ストックとした。さらに、細胞ストックからの細胞を培養して、組み込まれたcDNA由来のペプチド分子を細胞外に発現するトランスフェクタントBa/F3細胞を、抗体作製のための免疫源細胞として、また、スクリーニング対象の細胞として用いた。各ウェルから得られた細胞の残り半分からはゲノムを抽出してシークエンスを行い、導入されたcDNA由来の遺伝子を解析した。シークエンスにおいては、得られたゲノムに対して、LA taq DNA polymerase(Takara,#RR002)またはPrimeSTAR MAX DNA polymerase(TaKaRa,#R045A)を用いて、PCRを行った。PCRプライマーには、以下の配列を用いた。
SST3’−T7 5’-TAATACGACTCACTATAGGGCGCGCAGCTGTAAACGGTAG-3’(配列番号:13)
SST5’−T3 5’-ATTAACCCTCACTAAAGGGAGGGGGTGGACCATCCTCTA-3’(配列番号:14)
PCR産物をWizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System(promega,#A9282)などを用いて精製した。その後、精製したPCR産物について、BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing(ABI,#4337456)およびDNAシークエンサーABI3100XLを用いて、シークエンスを行った。シークエンスのプライマーには以下のものを用いた。
SST5’−T3 5’-ATTAACCCTCACTAAAGGGAGGGGGTGGACCATCCTCTA-3’(配列番号:15)
得られたシークエンスデータは、BLAST検索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)とSignalP 3.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)を利用して解析した。
[実施例2] PODXL2全長遺伝子のクローニングと、それを発現するBa/F3細胞株の樹立
さらに、実施例1で得られたcDNA由来遺伝子リスト中に含まれた、PODXL2遺伝子について、遺伝子全長を含むSSTクローン細胞を得るためにクローニングを行った。
フォワードプライマー:ccggaattcagaggcgacgacacgatgcg(配列番号:16)
リバースプライマー:ttttccttttgcggccgcgaggtgtgtgtcttcctcct(配列番号:17)
得られたPCR産物を1%アガロースゲルで電気泳動し、目的の長さのDNA断片をゲルから抽出した。抽出したDNA断片をEcoRI(TaKaRa,#1040A)とNotI(TaKaRa,#1166A)で制限酵素処理した。同時に、pMX-SSTベクターについても、EcoRIとNotIで制限酵素処理した。制限酵素処理したDNA断片100ngとpMX-SSTベクター40ngとをLigationHigh(TOYOBO,#LGK-201)を用いて、2時間かけて結合させた。
[実施例3] PODXL2モノクローナル抗体の作製
免疫動物はマウスBalb/cを使用し、まず、免疫賦活剤として、TiterMax Gold(Alexis Biochemicals,ALX-510-002-L010)を等量のPBSと混和して乳化したもの50μlを投与した。翌日、PODXL2遺伝子を有するSSTクローン細胞を免疫原細胞として5×106個投与し、さらに免疫原細胞を2日おきに4回注入した。最初の免疫から約2週間後、摘出した二次リンパ組織をすりつぶし、抗体産生細胞を含む細胞集団を得た。それらの細胞と融合パートナー細胞を混合し、ポリエチレングリコール(MERCK,1.09727.0100)を用いた細胞融合によりハイブリドーマを作製した。融合パートナー細胞としては、マウスミエローマ細胞P3U1(P3-X63-Ag8.U1)を用いた。
[実施例4] フローサイトメトリーを用いた抗体スクリーニング
ACT36-27_5D1抗体と、各種細胞(目的遺伝子を発現するBa/F3細胞、目的遺伝子を発現していないBa/F3細胞、各種癌細胞など)との反応性を、フローサイトメトリーを用いて解析した。
[実施例5] 癌細胞を用いたフローサイトメトリー
染色対象とする癌細胞が80%コンフルエントになった時点でCell Dissociation Buffer(GIBCO,13151-014)を用いて培養プレートから剥がして回収し、回収した細胞1×105個を0.5%BSA、2mM EDTA/PBS(実施例4に示す洗浄バッファー)に100μlずつ懸濁し、96ウェルプレート(BD Falcon,353911)に分注した。以降実施例4と同様の方法で、癌細胞と抗体との反応性をフローサイトメーターを用いて解析した(図2)。
[実施例6] 癌細胞の細胞染色
ACT36-27_5D1抗体と各種癌細胞との反応性を、細胞染色により解析した。黒色96ウェルプレート(BD Falcon,353219)に、染色の対象とした癌細胞1×104個を100μlの培地に懸濁して播種し、24時間培養した。癌各種癌細胞の培地には、非働化処理した10%FBS(Equitech)および1%ペニシリン/ストレプトイマイシン溶液(GIBCO Penicillin-streptomycin liquid、15140122、以降「P/S」と略す)を含むDMEM培地(SIGMA)を用いた。本実施例では、洗浄バッファーとして、25mM HEPES(pH7.4)、120mM NaCl、4.8mM KCl、1.2mM MgSO4、1.3mM CaCl2を含有するバッファーを用いた。
[実施例7] 抗ACT36-27_5D1モノクローナル抗体の癌細胞の増殖に対する効果(MTT)
ACT36-27_5D1抗体の癌細胞の増殖に与える影響について、MTTアッセイを用いて解析した。各種癌細胞の培地には、前立腺癌細胞株AsPC1については非働化処理した10%FBS(Equitech、以降同じ)と1%P/Sを含むRPMI1640培地(WAKO)を、それ以外の癌細胞については非働化処理した10%FBSおよび1%P/S溶液を含むDMEM培地(SIGMA)を用いた。対象抗体を産生するハイブリドーマ用培地には、必要量のHT(Sigma-Aldrich H0137、HT media supplement(50X) Hybri-Max)、15%FBS、1%P/S溶液を含むRPMI培地(Wako)を用いた。
[実施例8] マウス担癌モデルに対する尾静脈投与による抗体の効果
ACT36-27_5D1抗体のin vivoにおける効果についてマウス担癌モデルを用いて検討した。
腫瘍体積(mm3)=0.5×長径×短径×短径
腫瘍体積データを対照群と比較して、経時的な抗腫瘍効果を検討した。その結果を図6に示す。
[実施例9] 抗体可変領域決定方法
ACT36-27_5D1抗体の可変領域の遺伝子配列を明らかにするため、ACT36-27_5D1抗体産生細胞ハイブリドーマ細胞2×106個をTrizol(invitrogen,#15596-026)1mlに懸濁し5分放置し、クロロフォルムを200μl添加して、15秒間懸濁後、12,000×gで15分間遠心し、上清を得た。この上清と500μlのイソプロパノールを混合した後、12,000×gで10分間遠心した。得られたペレットを80%エタノールで洗浄し、全RNA 40μgを得た。その全量を20μlの水で溶かした。そのうち、全RNA 5μg分の溶液を使用して、SuperScriptTM Choice System(invitorgen,#18090-019)を用いて、全RNAから2本鎖cDNAを作製した。得られた2本鎖cDNAをエタノール沈殿後、LigationHigh(TOYOBO,#LGK-201)を用いて2本鎖cDNAの5’末端と3’末端を結合させ、そのうち1μlを鋳型としてPCRを行った。プライマーとしては、重鎖と軽鎖の定常領域に対して設計したものを使用した。プライマーの配列は、次の通りである。
重鎖5'gtccacgaggtgctgcacaat(配列番号:18)
重鎖3'gtcactggctcagggaaataacc(配列番号:19)
軽鎖5’aagatggatacagttggtgc(配列番号:20)
軽鎖3'tgtcaagagcttcaacagga(配列番号:21)
PCR産物を1.5%ゲルにて電気泳動を行った後、切り出して精製を行った。精製したDNAを用いてシークエンスを行った。軽鎖については、精製したDNAをクローニングした後、シークエンスを行った。決定された軽鎖の可変領域の塩基配列を配列番号:9に、アミノ酸配列を配列番号:10に、重鎖の可変領域の塩基配列を配列番号:11に、アミノ酸配列を配列番号:12に示す。
[実施例10] エピトープ解析のための目的因子領域発現細胞の作製とエピトープ解析
ACT36-27_5D1抗体のエピトープを特定するために、数種の鎖長のPODXL2ペプチドを発現するBa/F3細胞を作製し、抗体との反応性を評価した。
フォワードプライマー(14種類の遺伝子共通)は、以下の通りである。
ccggaattcagaggcgacgacacgatgcg(配列番号:22)
リバースプライマー(Rに付加した数値は、増幅産物がコードするペプチドの鎖長を意味する)は以下の通りである。
R300:ttttccttttgcggccgcgagaaggtgttttggggtatc(配列番号:23)
R310:ttttccttttgcggccgctgcccagttactctcatgag(配列番号:24)
R320:ttttccttttgcggccgcctgtgtctgtgtctcaacatc(配列番号:25)
R330:ttttccttttgcggccgctgtgaagttcaggacgagc(配列番号:26)
R340:ttttccttttgcggccgccgaagcgccccctgcacag(配列番号:27)
R350:ttttccttttgcggccgctcggcatatcagtgagatc(配列番号:28)
R360:ttttccttttgcggccgcttgggccgggttgaaggtgg(配列番号:29)
R370:ttttccttttgcggccgcaacagatgccagccgtatgc(配列番号:30)
R380:ttttccttttgcggccgcttctttgacgaccacggtc(配列番号:31)
R390:ttttccttttgcggccgccttggcagggagcttagtg(配列番号:32)
R400:ttttccttttgcggccgcccatttgtccttcagccgc(配列番号:33)
R410:ttttccttttgcggccgcgtcactgacccctgcctcc(配列番号:34)
R420:ttttccttttgcggccgcctccggtggcccctggtccc(配列番号:35)
R428:ttttccttttgcggccgcgatgaggggcatgctgaagc(配列番号:36)
得られた各PCR産物を1%アガロースゲルにて電気泳動を行った後、切り出し精製を行い、EcoRIとNotIで制限酵素処理を行った。pMX-SSTもEcoRIとNotIで制限酵素処理を行い切り出し精製した。さらにそれぞれをLigationHigh(TOYOBO#LGK-201)にて処理し、その後、実施例2(大腸菌にトランスホーメーション以降)と同様の処理を行い、50μgアンピシリン含有LBアガロースプレートに、トランスホーメーションした大腸菌をプレーティングした。37℃で1晩培養して得られたコロニーからインサート部分を含有するようにPCRを行い、希望する配列を含んだpMX-SSTベクターであるかにつき、シークエンスにて確認した。シークエンス用PCRプライマーとしては、次のオリゴヌクレオチドを用いた。
SST3’−T7 5’-TAATACGACTCACTATAGGGCGCGCAGCTGTAAACGGTAG-3’(配列番号:37)
SST5’−T3 5’-ATTAACCCTCACTAAAGGGAGGGGGTGGACCATCCTCTA-3’(配列番号:38)
その後、実施例1(4)(ウイルスパッケイジング以降)と同様の方法で、各種鎖長のPODXL2遺伝子配列を含むBa/F3細胞を作製した。さらに、実施例4と同様の手法で、各種鎖長のPODXL2分子を発現するBa/F3細胞とACT36-27_5D1抗体との反応性をフローサイトメーターにて解析した(図10)。その結果、ACT36-27_5D1抗体は、PODXL2分子の1-400位あるいはそれ以下まで発現させたクローンに対しては反応性を示さず、1-410位、1-420位、1-428位の間の領域を発現するクローンに対して反応性を示した。以上から、PODXL2分子の400-428位の間に抗体のエピトープが含まれることが明らかとなった。
[比較例1]
実施例3に記載の方法で、抗PODXL2抗体を産生する、ACT36-27_5D1以外の4つのクローン「ACT36-27_7G11K」、「ACT36-27_2C12E1B」、「ACT36-27_3D10B」、「ACT36-27_7E2B」を得た。産生抗体のアイソタイプは、「ACT36-27_7G11K」と「ACT36-27_2C12E1B」はIgG2a/κ、「ACT36-27_3D10B」と「ACT36-27_7E2B」はIgG1/κであった。これらクローンが産生するモノクローナル抗体について、実施例7に記載の方法によりMTTアッセイを行ったところ、いずれも癌細胞の増殖抑制効果が見られなかった。また、実施例10に記載の方法によりエピトープ解析を行ったところ、いずれも1-310位の間のアミノ酸配列にエピトープが含まれることが明らかとなった。
Claims (17)
- 配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるヒト由来のPODXL2蛋白質における400−428位のアミノ酸配列からなる領域に結合し、かつ、抗癌活性を有する抗体。
- 癌が胃癌である、請求項1に記載の抗体。
- 配列番号:3から5に記載のアミノ酸配列をCDRとして含む軽鎖可変領域と、配列番号:6から8に記載のアミノ酸配列をCDRとして含む重鎖可変領域を保持する、請求項1に記載の抗体。
- 請求項3に記載の抗体における配列番号:3から8に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、1のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されており、かつ、請求項3に記載の抗体と比較して70%以上の抗癌活性を有する抗体。
- 請求項3に記載の抗体における配列番号:3から8に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、1のアミノ酸が保存的に置換されており、かつ、請求項3に記載の抗体と比較して70%以上の抗癌活性を有する抗体。
- 配列番号:10に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号:12に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する、請求項1に記載の抗体。
- 請求項6に記載の抗体における配列番号:10および12に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、1若しくは10アミノ酸以内のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されており、かつ、請求項6に記載の抗体と比較して70%以上の抗癌活性を有する抗体。
- 請求項6に記載の抗体における配列番号:10および12に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、1若しくは10アミノ酸以内のアミノ酸が保存的に置換されており、かつ、請求項6に記載の抗体と比較して70%以上の抗癌活性を有する抗体。
- 請求項6に記載の抗体における配列番号:10および12に記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいてシグナル配列が除去されており、かつ、請求項6に記載の抗体と比較して70%以上の抗癌活性を有する抗体。
- 配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるヒト由来のPODXL2蛋白質における、請求項6に記載の抗体のエピトープに結合し、かつ、抗癌活性を有する抗体。
- 配列番号:3から5に記載のアミノ酸配列をCDRとして含む、請求項1に記載の抗体の軽鎖またはその可変領域からなるペプチドと、配列番号:6から8に記載のアミノ酸配列をCDRとして含む、請求項1に記載の抗体の重鎖またはその可変領域からなるペプチドとの組み合わせ。
- 配列番号:10に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列を含むペプチドと、配列番号:12に記載のアミノ酸配列または該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列を含むペプチドとの組み合わせ。
- 請求項1から9のいずれかに記載の抗体または請求項11又は12に記載のペプチドの組み合わせをコードするDNA。
- 請求項1から9のいずれかに記載の抗体を産生する、または、請求項13に記載のDNAを含む、ハイブリドーマ又は宿主細胞。
- 請求項14に記載のハイブリドーマ又は宿主細胞により産生された抗体。
- 請求項1から9のいずれかに記載の抗体を有効成分とする、抗癌剤。
- 癌が胃癌である、請求項16に記載の抗癌剤。
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