JP5862211B2 - 細胞培養支持体の洗浄条件を決定する方法 - Google Patents
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Description
まず、本発明における細胞培養支持体について説明する。本発明において、細胞培養支持体は、基材面上に、ポリマー形成材料の重合反応により形成された温度応答性ポリマーが共有結合により固定化されている。すなわち、本発明における細胞培養支持体では、基材の表面上に温度応答性ポリマー層が形成されている。
基材は、一方の表面に後述する温度応答性ポリマー層を形成することが可能であり、細胞培養の際に耐え得る耐水性を有していれば、材料の種類は特に限定されない。典型的には、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリスチレン(PS)、ポリカーボネート(PC)、TAC(トリアセチルセルロース)、ポリイミド(PI)、ナイロン(Ny)、低密度ポリエチレン(LDPE)、中密度ポリエチレン(MDPE)、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、アクリル等が挙げられる。
温度応答性ポリマーは、所定の温度によって細胞接着性から細胞非接着性へと変化することが可能な表面を有し、所定の温度によって表面の細胞の接着度合いが変化するポリマーである。温度応答性ポリマーとしては、細胞を培養する温度では細胞接着性を示し、作製した細胞シートを剥離する時の温度では細胞非接着性を示すものを用いるとよい。例えば、温度応答性ポリマーは、臨界溶解温度未満の温度では周囲の水に対する親和性が向上し、ポリマーが水を取り込んで膨潤して表面に細胞を接着し難くする性質(細胞非接着性)を示し、同温度以上の温度ではポリマーから水が脱離することでポリマーが収縮して表面に細胞を接着しやすくする性質(細胞接着性)を示すものがよい。このような臨界溶解温度は、下限臨界溶解温度と呼ばれる。下限臨界溶解温度Tが0℃〜80℃、さらに好ましくは0℃〜50℃である温度応答性ポリマーを用いることが好ましい。Tが0℃〜80℃であると、細胞を安定に培養できるからである。
本発明の方法は、上記細胞培養支持体の洗浄条件を決定する方法である。上記のようにして作製された細胞培養支持体は、その品質を保証する観点から洗浄工程を経る。グラフト重合後の温度応答性ポリマー層の表面上には、共有結合により固定化されたポリマーだけでなく、固定化されていない遊離のポリマーや、未反応のモノマー、オリゴマー、プレポリマーなどが存在していると考えられる。これら遊離のポリマーや未反応物など(以下、非固定化物質という。)は、細胞の生育に何らかの影響を与えるおそれがあり、除去することが好ましい。例えば、温度応答性ポリマーを形成し得るモノマーとして一般的に選択されるN−イソプロピルアクリルアミドには、毒性があることが知られており、その残留はできるだけ避けたい。そこで、洗浄によって非固定化物質を除去している。本発明の方法によれば、細胞培養支持体の適切な洗浄条件を簡便に決定することができる。
洗浄工程は、細胞培養支持体を洗浄する工程である。この洗浄工程では、候補となり得る洗浄条件を1つ以上選択し、細胞培養支持体を洗浄する。この洗浄工程における洗浄方法は、特に限定されず、例えば、細胞培養支持体の洗浄工程において、通常行なわれる方法を選択するとよい。例えば、浸漬洗浄、揺動洗浄、シャワー洗浄、スプレー洗浄、超音波洗浄などが挙げられる。また、洗浄液としては、典型的には、各種水系、アルコール系、炭化水素系、塩素系、酸・アルカリ洗浄液が使用される。洗浄方法と洗浄液との組み合わせは、特に限定されず、細胞培養支持体に応じて、適宜、選択するとよい。一例としては、基材上に被覆されたポリマーを膨潤させるために十分な温度の脱イオン水を使用し、超音波洗浄する方法が挙げられる。
浸漬工程は、上記洗浄工程にて洗浄後の細胞培養支持体を、基材面上に固定化されていない非固定化物質を抽出し得る条件にて、液体に浸漬させる工程である。この浸漬工程では、上記洗浄工程で選択した洗浄条件で除去できなかった、細胞培養支持体に残留する非固定化物質を抽出する。浸漬させる液体としては、例えば、水、メタノール、テトラヒドロフラン、トルエン、ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリドンなどが挙げられ、これらの中から適宜、選択すればよい。液温は、特に限定されないが、好ましくは固定化された温度応答性ポリマーの転移温度以下である。転移温度以下では温度応答性ポリマーが親水性となるため、固定化されていない温度応答性ポリマーが溶媒中に溶出しやすいと考えられるからである。浸漬時間も特に限定されないが、水に浸漬させる場合には、4時間以上であることが好ましい。水への浸漬時間が4時間に満たないと、非固定化物質の抽出が不十分となる場合がある。
吸光度測定工程は、上記浸漬工程後の液体の吸光度を測定する工程である。この吸光度測定工程では、上記浸漬工程にて細胞培養支持体を浸漬させた後の液体の吸光度を測定する。測定には、紫外・可視分光分析法を用いる。測定装置は、典型的には、紫外・可視分光光度計を用いる。紫外・可視分光分析法は、原子核、あるいは分子を周回している電子が、エネルギーの低い起動からよりエネルギーの高い軌道へ遷移する際の光の吸収を測定する方法である。紫外・可視分光分析法は、公知の手法であるので、本明細書では簡単にその説明を行う。可視光〜紫外光の領域の波長を有する光源を配置し、光源から出射された光を分光器による波長分解し、ビームスプリットなどで光量の変動をモニターする光と、試料の光吸収量をサンプリングすると、に分割する。光吸収量をサンプリングする光は、分析試料が入ったガラス、石英などの透明なセルを透過する。最終的に光は受光素子により光量計測される。波長ごとの光の吸収量を計測して吸収スペクトルを得る。吸光度の測定波長は、温度応答性ポリマーの種類に応じて、すなわち、残留し得る非固定化物質の種類に応じて、適宜、選択するとよい。好ましくは、残留し得る非固定化物質の極大吸収波長付近を選択するとよい。比較工程における比較がしやすいからである。
比較工程は、上記吸光度測定工程にて得られた吸光度の測定値から非固定化物質の量を算出し、当該算出した非固定化物質の量と、予め設定した非固定化物質の量の閾値と、を比較する工程である。非固定化物質の濃度と、吸光度との間には相関性がある。したがって、本発明の方法では、例えば、まず想定される非固定化物質を所定の濃度で含有するサンプルにつき、吸光度を測定して1以上の吸光スペクトルを得る。次に、上記吸光度測定工程にて得られた吸光スペクトルに、上記1以上の吸光スペクトルをフィッティングさせるように、上記1以上の吸光スペクトルのフィッティング係数を設定する。該フィッティング係数と、上記所定の濃度の値から、上記吸光度測定工程に供した液体に含まれる非固定化物質の量を算出する。次に、細胞毒性などの実験結果に基づき、上記非固定化物質の許容限度濃度を調べる。そして、その許容限度濃度に基づき、上記非固定化物質の閾値を決定し、該閾値と、上記吸光度測定工程に供した液体に含まれる非固定化物質の量とを比較することで、洗浄工程における洗浄条件の良否の判断が可能となる。
本発明の細胞培養支持体の製造方法は、基材面上に温度応答性ポリマーを固定化させる固定化工程と、該温度応答性ポリマーが固定化された基材面を洗浄する洗浄工程とを含み、該洗浄工程では、上記方法により決定した条件にて細胞培養支持体を洗浄することを特徴とする。固定化工程において基材面上に温度応答性ポリマーを固定化させる方法については、上記にて既に説明しているので省略する。本発明の細胞培養支持体の製造方法では、上記本発明の方法(細胞培養支持体の洗浄条件を決定する方法)において適切であると判断し、洗浄工程の洗浄条件として決定した条件にて、作製した細胞支持体を洗浄する。
(細胞培養支持体の製造)
N−イソプロピルアクリルアミドを、最終濃度40重量%になるようにイソプロピルアルコール(IPA)に溶解させてN−イソプロピルアクリルアミド溶液を調製した。基材として、ポリスチレンフィルムシート(OPSシート,SUNDIC社製)を準備した。このポリスチレンフィルムシートに、上記N−イソプロピルアクリルアミド溶液を展開し、ミヤバーNO.4でコーティングした。電子線照射装置(岩崎電気社製)を用いて電子線照射を行い、ポリスチレンフィルムシート表面にポリ−N−イソプロピルアクリルアミドをグラフト重合により形成した。このときの電子線照射線量は300kGyであった。そして、ポリ−N−イソプロピルアクリルアミドが結合されたポリスチレンフィルムシートを円形に切り出し、試験用の細胞培養支持体とした。
製造例1にて得た細胞培養支持体(表面積:84.6cm2)をディッシュ(組織培養用ディッシュ、直径:15cm、IWAKI社製)の底面に貼付し、純水を添加し、3日間浸漬した。浸漬は、37℃のインキュベーター内で行なった。そして、経時的に浸漬中の液を採取し、その吸光度を紫外・可視分光光度計(UV−3100PC、測定波長:190〜220nm、島津製作所社製)により測定した。その結果を図1に示す。
N−イソプロピルアクリルアミド(モノマー)を純水に溶解させ、種々の濃度(1ppm、10ppm、100ppm、0.1質量%、1質量%、5質量%)の液を調製した。これらの溶液の吸光度を紫外・可視分光光度計(UV−3100PC、測定波長:190〜220nm、島津製作所社製)により測定した。その結果を図3(A)に示す。また、ポリ−N−イソプロピルアクリルアミド(ポリマー)を純水に溶解させ、種々の濃度(100ppm、0.1質量%、1質量%、5質量%)の液を調製した。これらの溶液についても同様に吸光度を測定した。その結果を図3(B)に示す。
製造例1にて得た細胞培養支持体(表面積:150cm2)をディッシュ(組織培養用ディッシュ、直径:15cm、IWAKI社製)の底面に貼付し、純水を添加し、24時間浸漬した。浸漬は、37℃のインキュベーター内で行なった。そして、浸漬後の液を採取し、その吸光度を紫外・可視分光光度計(UV−3100PC、測定波長:190〜220nm、島津製作所社製)により測定した。この浸漬後の液が示す吸光度は、非固定化物質によるものであり、反応系から推測される非固定化物質は、N−イソプロピルアクリルアミド(モノマー)及びポリ−N−イソプロピルアクリルアミド(ポリマー)である。一方、ランベルト・ベールの法則によれば、吸光度は、溶液中の溶質濃度に比例し、上記試験2においてもこの法則に従った結果が得られた。そこで、試験2の結果に基づき、上記モノマー及びポリマーの種々の濃度における吸光スペクトルを算出し、上記浸漬後の液の吸光スペクトルと一致する濃度を調べた。フィッティング結果を図4に示す。
N−イソプロピルアクリルアミドをシグマ社製ダルベッコ改変イーグル培地に溶解させ、種々の濃度(10−6、10−5、10−4、10−3、10−2、10−1、1、10mg/ml)の液を調製した。得られた液を用いて、BD falcon社製の35mmディッシュにてウシ血管内皮細胞をコンフルエントまで培養し、観察した。
製造例1にて得た細胞培養支持体を、20℃の水道水にて流水洗浄した。洗浄は、10秒間、30秒間、2分間の3条件にて行なった。洗浄後の各細胞培養支持体を乾燥させた後、ディッシュ(組織培養用ディッシュ、直径:15cm、IWAKI社製)の底面に貼付し、純水20mlを添加し、3日間浸漬した。浸漬は、37℃のインキュベーター内で行なった。浸漬後の液を採取し、その吸光度を紫外・可視分光光度計(UV−3100PC、測定波長:190〜220nm、島津製作所社製)により測定した。また、製造例1にて得た細胞培養支持体を、洗浄せずに、ディッシュ(組織培養用ディッシュ、直径:15cm、IWAKI社製)の底面に貼付し、純水20mlを添加し、3日間浸漬したものについても、同様の方法にて吸光度を測定した。その結果を図5に示す。
Claims (3)
- 基材面上に、ポリマー形成材料の重合反応により形成された温度応答性ポリマーが共有結合により固定化されている細胞培養支持体の洗浄条件を決定する方法であって、
前記細胞培養支持体を洗浄する洗浄工程と、
洗浄後の細胞培養支持体を、前記基材面上に固定化されていない非固定化物質を抽出し得る条件にて、液体に浸漬させる浸漬工程と、
前記浸漬工程後の液体の吸光度を測定して吸光スペクトルを得る吸光度測定工程と、
前記吸光度測定工程にて得られた吸光スペクトルに、想定される2以上の非固定化物質のそれぞれについての、所定の濃度で含有するサンプルの吸光スペクトルをフィッティングさせて、前記2以上の非固定化物質の吸光スペクトルのそれぞれについてフィッティング係数を求め、各フィッティング係数と前記所定の濃度の値とから、前記2以上の非固定化物質の量をそれぞれ算出し、当該算出した非固定化物質の量と、予め設定した非固定化物質の量の閾値と、を比較する比較工程と、を含み、
前記比較工程での比較結果に基づいて、細胞培養支持体の適切な洗浄条件を選定することを特徴とする、前記方法。 - 前記ポリマー形成材料は、少なくともN−イソプロピルアクリルアミドモノマーを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記2以上の非固定化物質が、前記ポリマー形成材料と、前記温度応答性ポリマーとを含む、請求項1又は2に記載の方法。
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