JP5861582B2 - Method for imparting water solubility or water dispersibility to hydrophobic cluster compounds - Google Patents

Method for imparting water solubility or water dispersibility to hydrophobic cluster compounds Download PDF

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本発明は、疎水性クラスター化合物を含む水溶性又は水分散性を有する複合体の製造方法、及び疎水性クラスター化合物への水溶性又は水分散性の付与方法に関する。   The present invention relates to a method for producing a water-soluble or water-dispersible complex containing a hydrophobic cluster compound, and a method for imparting water-solubility or water-dispersibility to a hydrophobic cluster compound.

近年、腫瘍治療などのために、疎水性クラスター化合物の中で、非金属クラスター化合物を生体に投与することが試みられている。
例えば、腫瘍細胞や腫瘍組織内の新生血管の内皮細胞内に取り込ませた光感受性物質にレーザー光を照射して活性酸素を発生させることにより、腫瘍細胞に傷害を与えて腫瘍を消失させる光線力学療法において、光感受性物質として炭素クラスター化合物であるフラーレンを用いることが試みられている。さらにフラーレンを美白素材とした化粧品原料として使用することも報告されている。 In recent years, attempts have been made to administer non-metallic cluster compounds to living bodies among hydrophobic cluster compounds for tumor treatment and the like.
For example, photodynamics that damages tumor cells and causes tumors to disappear by irradiating a photosensitizer incorporated into tumor cells or endothelial cells of new blood vessels in tumor tissue with laser light to generate active oxygen In therapy, it has been attempted to use fullerene which is a carbon cluster compound as a photosensitive substance. It has also been reported that fullerene is used as a cosmetic raw material with whitening.

金属クラスター化合物は、その導電性や半導体性を活かして微粒子化することにより、従来のめっき方法に代わる塗布方法を用いた手法で配線が可能となるため、電子機器や情報機器の回路形成やセンサーへの応用等、多方面で検討が進められており、プリンタブルエレクトロニクスとして一つの技術が形成されつつある。また、金属およびその金属酸化物は抗酸化剤やＵＶ吸収剤として化粧品の原料としても使用されている。
さらにカーボンナノチューブはその高い導電性や炭素化合物として環境保護性が高いことから、それらを用いた導電性担体やデバイスへの用途開発が期待されている。 Metal cluster compounds can be made into fine particles by taking advantage of their electrical conductivity and semiconducting properties to enable wiring by a technique that uses a coating method instead of the conventional plating method. Studies are being made in various fields such as application to the field, and one technology is being formed as printable electronics. Metals and their metal oxides are also used as cosmetic raw materials as antioxidants and UV absorbers.
Furthermore, since carbon nanotubes have high electrical conductivity and high environmental protection as a carbon compound, application development to conductive carriers and devices using them is expected.

疎水性クラスター化合物の中で、非金属クラスター化合物を生体に投与するには、それを水溶化することが必要である。例えば、特許文献１は、フラーレンをシゾフィランのようなβ-１,６-結合側鎖の分岐度が低いβ-１,３-１,６-グルカンとの複合体にすることにより、水溶性を付与することを開示している。また、特許文献２は、フラーレンをシクロデキストリン（α-グルカン）との複合体にすることにより、水溶性を付与することを開示している。また、特許文献３は、カルボランをシゾフィランとの複合体にすることにより、水溶性を付与することを開示している。特許文献４にはシゾフィランを用いた複合化により、カーボンナノチューブに水溶性を付与することが開示されている。   Among hydrophobic cluster compounds, in order to administer a non-metallic cluster compound to a living body, it is necessary to make it water-soluble. For example, Patent Document 1 discloses that water solubility is improved by making fullerene a complex with β-1,3-1,6-glucan having a low degree of branching of β-1,6-linked side chain such as Schizophyllan. It is disclosed to grant. Patent Document 2 discloses that water solubility is imparted by making fullerene a complex with cyclodextrin (α-glucan). Patent Document 3 discloses that water solubility is imparted by making carborane into a complex with schizophyllan. Patent Document 4 discloses that water solubility is imparted to carbon nanotubes by complexing with schizophyllan.

一方、β-グルカンは、β-１,３-グルカン、β-１,６グルカン、β-１,３-１,６グルカンなどが自然界に生息するキノコ（担子菌の子実体）に多く含まれる成分（数％から５０％程度）であり、それらの子実体だけでなく培養菌糸体にも含まれていることが知られている。また、それらのβ-グルカンには抗腫瘍活性があることが知られている（非特許文献１）。例えば、スエヒロタケ、カワラタケ、シイタケから抽出されたそれぞれのβ-グルカンは、既に抗がん剤などの医薬品として製造販売されている。一方、不完全菌であるオーレオバシジウム属（Aureobasidium）に属する微生物もβ-１,３-１,６グルカンを生産することが知られている。   On the other hand, β-glucan is abundant in mushrooms (bacterial bodies of basidiomycetes) inhabiting nature such as β-1,3-glucan, β-1,6-glucan, β-1,3-1,6-glucan, etc. It is a component (about several to 50%) and is known to be contained not only in the fruiting bodies but also in cultured mycelium. In addition, these β-glucans are known to have antitumor activity (Non-patent Document 1). For example, each β-glucan extracted from Suehirotake, Kawaratake and Shiitake is already manufactured and sold as a pharmaceutical such as an anticancer agent. On the other hand, microorganisms belonging to the incomplete bacterium Aureobasidium are also known to produce β-1,3-1,6 glucan.

また、β-１,３-１,６グルカンは、一本鎖構造のものが絡みあい３重螺旋構造を形成していることが知られており、ジメチルスルホキシドなどの極性溶媒で処理することにより、３重螺旋構造が解離し、一本鎖構造となることが知られている（非特許文献２）。   In addition, β-1,3-1,6 glucan is known to have a single-stranded structure intertwined to form a triple helical structure, and by treatment with a polar solvent such as dimethyl sulfoxide. It is known that the triple helix structure is dissociated into a single-stranded structure (Non-patent Document 2).

本願発明者らは、特許文献５において、有機溶媒を用いることによる疎水性クラスター化合物を含む複合体の溶液への分散性付与や疎水性クラスター化合物とβグルカンの粉体を振動混合することにより複合体を形成させ、得られた複合体を水へ分散させる方法を報告している。前記方法による有機溶剤を用いて作成した複合体は、食品・化粧品などの用途において使用可能な有機溶媒が限られる。また、粉体同士を振動混合する方法は、大量生産する場合において製造効率の点で問題があった。そこで、有機溶媒を使用しないか、若しくは粉体同士を振動混合する方法に代わる、簡便に疎水性クラスター化合物複合体を水溶液中に分散することのできる方法が求められている。   The inventors of the present application disclosed in Patent Document 5 that compounding is performed by imparting dispersibility to a solution containing a hydrophobic cluster compound by using an organic solvent or by vibrating and mixing the powder of the hydrophobic cluster compound and β-glucan. A method for forming a body and dispersing the resulting complex in water is reported. The composite prepared using the organic solvent by the above-mentioned method has limited organic solvents that can be used in applications such as food and cosmetics. In addition, the method of vibrating and mixing powders has a problem in terms of manufacturing efficiency in mass production. Therefore, there is a need for a method that can simply disperse the hydrophobic cluster compound complex in an aqueous solution, instead of using an organic solvent or replacing the powder by vibration.

特開２００７−２３８８４７号公報JP 2007-238847 A 特開２００６−６９８１２号公報JP 2006-69812 A 特開２００８−２２２５８５号公報JP 2008-222585 A 特開２００５−１０４７６２号公報JP 2005-104762 A WO２０１１／０６５４８１WO2011 / 065481

Immunity,19(3),311-315Immunity, 19 (3), 311-315 J.Med.Mycol.Vol.33,267-277,（1992）J.Med.Mycol.Vol.33,267-277, (1992)

本発明は、実用上十分な水溶性又は水分散性を有する疎水性クラスター化合物複合体の効率良い製造方法、及び実用上十分な水溶性又は水分散性を疎水性クラスター化合物に与えることができる方法を提供することを課題とする。   The present invention is a method for efficiently producing a hydrophobic cluster compound complex having practically sufficient water solubility or water dispersibility, and a method capable of imparting practically sufficient water solubility or water dispersibility to a hydrophobic cluster compound. It is an issue to provide.

本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ね、疎水性クラスター化合物とβ-１,３-１,６グルカンの中でも、特に主鎖のβ-１,３結合に対する側鎖のβ-１,６結合の比率(分岐度)が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６グルカンとをアルカリ性の溶液中で混合し、中和剤としてカルボキシル基を有する酸を用いて中和することによって、得られる疎水性クラスター化合物とβ-１,３-１,６グルカンの複合体が、水溶液中への分散性に著しく優れることを見出した。
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下の疎水性クラスター化合物複合体の製造方法、並びに疎水性クラスター化合物への水溶性又水分散性付与方法を提供する。 The inventors of the present invention have made extensive studies to solve the above-mentioned problems, and among the hydrophobic cluster compounds and β-1,3-1,6 glucans, the side chain β with respect to the β-1,3 bond of the main chain is particularly important. Β-1,3-1,6 glucan having a 1,6-bond ratio (branch degree) of 50 to 100% is mixed in an alkaline solution, and an acid having a carboxyl group is used as a neutralizing agent. It was found that by neutralizing, the resulting complex of a hydrophobic cluster compound and β-1,3-1,6 glucan is extremely excellent in dispersibility in an aqueous solution.
The present invention has been completed based on the above findings, and provides the following method for producing a hydrophobic cluster compound complex and a method for imparting water solubility or water dispersibility to the hydrophobic cluster compound.

項１. 疎水性クラスター化合物と、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６グルカンとをアルカリ性の溶液中で混合する工程と、混合した混合液にカルボキシル基を有する酸を添加して中和する工程とを含む、疎水性クラスター化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体の製造方法。
項２. カルボキシル基を有する酸が不飽和脂肪族カルボン酸、飽和脂肪族カルボン酸、芳香族カルボン酸、アルドン酸、及びウロン酸から成る群より選ばれる１種である項１に記載の方法。
項３. 疎水性クラスター化合物が、カルボラン、フラーレン、カーボンナノチューブ、又はカーボンナノコイルである項１又は２に記載の方法。
項４. 疎水性クラスター化合物が、鉛、ニッケル、鉄、マグネシウム、コバルト、ロジウム、ルテニウム、白金、金、銀、銅、チタン、亜鉛、パラジウム、インジウム、ガリウム、ゲルマニウム、タングステン、アルミニウム、ジルコニウム、及びこれらの金属の酸化物からなる群より選ばれる少なくとも１種である項１又は２に記載の方法。
項５. 疎水性クラスター化合物と、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６グルカンとをアルカリ性の溶液中で混合する工程と、混合した混合液にカルボキシル基を有する酸を添加して中和する工程とを含む、疎水性クラスター化合物への水溶性又は水分散性の付与方法。
項６. カルボキシル基を有する酸が不飽和脂肪族カルボン酸、飽和脂肪族カルボン酸、芳香族カルボン酸、アルドン酸、及びウロン酸から成る群より選ばれる１種であるである項５に記載の方法。
項７. 疎水性クラスター化合物が、カルボラン、フラーレン、カーボンナノチューブ、又はカーボンナノコイルである項５又は６に記載の方法。
項８. 疎水性クラスター化合物が、鉛、ニッケル、鉄、マグネシウム、コバルト、ロジウム、ルテニウム、白金、金、銀、銅、チタン、亜鉛、パラジウム、インジウム、ガリウム、ゲルマニウム、タングステン、アルミニウム、ジルコニウム、及びこれらの金属の酸化物からなる群より選ばれる少なくとも１種である項５又は６に記載の方法。 Item 1. Mixing a hydrophobic cluster compound and β-1,3-1,6 glucan having a degree of branching of β-1,6 bonds with respect to β-1,3 bonds of 50 to 100% in an alkaline solution And a method for producing a complex of a hydrophobic cluster compound and β-1,3-1,6 glucan, comprising a step of neutralizing the mixed liquid mixture by adding an acid having a carboxyl group.
Item 2. The method according to Item 1, wherein the acid having a carboxyl group is one selected from the group consisting of unsaturated aliphatic carboxylic acids, saturated aliphatic carboxylic acids, aromatic carboxylic acids, aldonic acids, and uronic acids.
Item 3. The method according to Item 1 or 2, wherein the hydrophobic cluster compound is carborane, fullerene, carbon nanotube, or carbon nanocoil.
Item 4. The hydrophobic cluster compound is lead, nickel, iron, magnesium, cobalt, rhodium, ruthenium, platinum, gold, silver, copper, titanium, zinc, palladium, indium, gallium, germanium, tungsten, aluminum, zirconium, and Item 3. The method according to Item 1 or 2, which is at least one selected from the group consisting of oxides of these metals.
Item 5. Mixing a hydrophobic cluster compound and β-1,3-1,6 glucan having a degree of branching of β-1,6 bonds with respect to β-1,3 bonds of 50 to 100% in an alkaline solution And a method for imparting water solubility or water dispersibility to the hydrophobic cluster compound, comprising a step of adding and neutralizing the mixed liquid mixture by adding an acid having a carboxyl group.
Item 6. The acid according to Item 5, wherein the acid having a carboxyl group is one selected from the group consisting of unsaturated aliphatic carboxylic acids, saturated aliphatic carboxylic acids, aromatic carboxylic acids, aldonic acids, and uronic acids. Method.
Item 7. The method according to Item 5 or 6, wherein the hydrophobic cluster compound is carborane, fullerene, a carbon nanotube, or a carbon nanocoil.
Item 8. The hydrophobic cluster compound is lead, nickel, iron, magnesium, cobalt, rhodium, ruthenium, platinum, gold, silver, copper, titanium, zinc, palladium, indium, gallium, germanium, tungsten, aluminum, zirconium, and Item 7. The method according to Item 5 or 6, which is at least one selected from the group consisting of oxides of these metals.

本発明によれば、疎水性クラスター化合物に水溶性を付与して、水溶液中に安定して分散させることができる。
本発明は、食品成分としても利用されるβ-１,３-１,６グルカンを用いて疎水性クラスター化合物を水溶液中に分散させているため、本発明の複合体は安全性が高く、医薬・化粧品として応用利用可能なものである。また、本発明の複合体は、触媒材料、磁気記録材料、導電膜形成材料、半導体膜形成材料、顔料などの各種用途に使用できる。
また、本発明の疎水性クラスター化合物への水溶性又は水分散性の付与方法を用いることで、効率よく安定性に優れた疎水性クラスター化合物の水分散液を製造することができる。 According to the present invention, it is possible to impart water solubility to a hydrophobic cluster compound and stably disperse it in an aqueous solution.
In the present invention, since the hydrophobic cluster compound is dispersed in an aqueous solution using β-1,3-1,6 glucan, which is also used as a food ingredient, the complex of the present invention is highly safe,・ Applicable for cosmetics. Further, the composite of the present invention can be used for various applications such as a catalyst material, a magnetic recording material, a conductive film forming material, a semiconductor film forming material, and a pigment.
Further, by using the method for imparting water solubility or water dispersibility to the hydrophobic cluster compound of the present invention, an aqueous dispersion of the hydrophobic cluster compound having excellent stability can be produced efficiently.

実験例で得たオーレオバシジウム・プルランス由来のグルカンの１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。It is a 1 H NMR spectrum of glucan derived from Aureobasidium pullulans obtained in an experimental example. 実験例で得たオーレオバシジウム・プルランス由来のグルカンの超音波照射したときの培養液の粒度分布を示す図である。It is a figure which shows the particle size distribution of a culture solution when ultrasonically irradiating the glucan derived from an aureobasidium pullulans obtained in the experiment example.

以下、本発明を詳細に説明する。   Hereinafter, the present invention will be described in detail.

（１）複合体
本発明の複合体は、疎水性クラスター化合物と、主鎖のβ-１,３結合に対する側鎖のβ-１,６結合の比率(分岐度)が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６グルカンとの複合体である。
（１−１）疎水性クラスター化合物
本発明において、クラスター化合物は、数個〜数百個の原子又は分子が凝集して形成された集団又は微粒子を指す。また、疎水性クラスターとは、水に対する２５℃における溶解度が、例えば１０ｍｇ／ｍｌ以下のクラスター化合物を意味し、好ましくは５ｍｇ／ｍｌ以下、より好ましくは３ｍｇ／ｍｌ以下、さらに好ましくは１ｍｇ／ｍｌ以下である。疎水性クラスター化合物としては、鉛(Ｐｂ)、ニッケル(Ｎｉ)、鉄(Ｆｅ)、マグネシウム（Ｍｇ）、コバルト(Ｃｏ)、ロジウム(Ｒｈ)、ルテニウム（Ｒｕ）、白金(Ｐｔ)、金(Ａｕ)、銀(Ａｇ)、銅(Ｃｕ)、チタン(Ｔｉ)、亜鉛(Ｚｎ)、パラジウム(Ｐｄ)、インジウム(Ｉｎ)、ガリウム(Ｇａ)、ゲルマニウム(Ｇｅ)、タングステン（Ｗ）、アルミニウム(Ａｌ)、ジルコニウム（Ｚｒ）などの金属原子、又はこれらの金属の酸化物や硫化物の１種又は２種以上を含む金属クラスター化合物；ホウ素(Ｂ)、炭素(Ｃ)、ケイ素(Ｓｉ)、硫黄(Ｓ)、リン(Ｐ)などの非金属原子の１種又は２種以上を含む非金属クラスター化合物などが挙げられる。また、金属原子と非金属原子とを含むクラスター化合物であってもよい。
また、例えば、非金属クラスター化合物内に金属原子が内包されている化合物；フタロシアニンと金属原子との錯体、ポルフィリンと金属原子との錯体のような有機金属錯体等、他原子を内包したクラスター化合物であってもよい。また、錯体としては、ルテニウム、コバルトの金属錯体も好ましいものとして例示できる。 (1) Complex In the complex of the present invention, the ratio (branch degree) of the hydrophobic cluster compound and the β-1,6 bond of the side chain to the β-1,3 bond of the main chain is 50 to 100%. It is a complex with β-1,3-1,6 glucan.
(1-1) Hydrophobic cluster compound In the present invention, the cluster compound refers to a group or fine particles formed by aggregation of several to several hundred atoms or molecules. The hydrophobic cluster means a cluster compound having a solubility in water at 25 ° C. of, for example, 10 mg / ml or less, preferably 5 mg / ml or less, more preferably 3 mg / ml or less, and even more preferably 1 mg / ml or less. It is. Hydrophobic cluster compounds include lead (Pb), nickel (Ni), iron (Fe), magnesium (Mg), cobalt (Co), rhodium (Rh), ruthenium (Ru), platinum (Pt), gold (Au ), Silver (Ag), copper (Cu), titanium (Ti), zinc (Zn), palladium (Pd), indium (In), gallium (Ga), germanium (Ge), tungsten (W), aluminum (Al ), Metal atoms such as zirconium (Zr), or metal cluster compounds containing one or more oxides or sulfides of these metals; boron (B), carbon (C), silicon (Si), sulfur (S), nonmetallic cluster compounds containing 1 type, or 2 or more types of nonmetallic atoms, such as phosphorus (P). Moreover, the cluster compound containing a metal atom and a nonmetallic atom may be sufficient.
In addition, for example, a compound in which a metal atom is encapsulated in a non-metallic cluster compound; a cluster compound in which other atoms are encapsulated, such as a complex of phthalocyanine and a metal atom, or an organometallic complex such as a complex of porphyrin and a metal atom. There may be. Moreover, as a complex, the metal complex of ruthenium and cobalt can be illustrated as a preferable thing.

水溶性又は水分散性を付与する上で、疎水性クラスター化合物の大きさは、その最大径が１０００ｎｍ以下、特に５００ｎｍ以下であることが好ましく、さらには２００ｎｍ以下であることがより好ましい。分岐度が５０〜１００％であるβ-１，３-１，６グルカンとの複合体にすることにより、最大径が５ｎｍ以上であるような大きな疎水性クラスター化合物に水溶性又は水分散性を付与することができる。
クラスター化合物は一次粒子が凝集している場合があるが、β-１,３-１,６グルカンとの複合化には一次粒子の大きさが影響を与えるので、ここでいう最大径は一次粒子の最大径である。また、クラスター化合物がカーボンナノチューブのように繊維状である場合は、周方向の長さがβ-１,３-１,６グルカンとの複合化に影響を与えるので、ここでいう最大径は周方向の最大径である。また、クラスター化合物がカーボンナノコイルのようにコイル状である場合は、コイルの周方向の長さがβ-１,３-１,６グルカンとの複合化に影響を与えるので、ここでいう最大径はコイルの周方向の最大径である。 From the viewpoint of imparting water solubility or water dispersibility, the size of the hydrophobic cluster compound is preferably 1000 nm or less, particularly preferably 500 nm or less, and more preferably 200 nm or less. By forming a complex with β-1,3-1,6 glucan having a branching degree of 50 to 100%, a large hydrophobic cluster compound having a maximum diameter of 5 nm or more has water solubility or water dispersibility. Can be granted.
The primary particle of the cluster compound may be agglomerated, but the size of the primary particle affects the complexation with β-1,3-1,6 glucan, so the maximum diameter here is the primary particle. Is the maximum diameter. In addition, when the cluster compound is in the form of a fiber such as a carbon nanotube, since the circumferential length affects the complexation with β-1,3-1,6 glucan, the maximum diameter here is the circumference. The maximum diameter in the direction. In addition, when the cluster compound is coiled like carbon nanocoils, the circumferential length of the coil affects the complexation with β-1,3-1,6 glucan. The diameter is the maximum diameter in the circumferential direction of the coil.

金属クラスター化合物の中では、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）、チタン（Ｔｉ）、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）、マグネシウム（Ｍｇ）、タングステン（Ｗ）、アルミニウム（Ａｌ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、及びそれらの酸化物が好ましく、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）、チタン（Ｔｉ）、亜鉛（Ｚｎ）、及びそれらの酸化物がより好ましい。中でも、白金、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化鉄、酸化アルミニウムが好ましく、白金、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化鉄がより好ましい。また、上記の金属を２種以上任意の割合で混合したものも含まれる。   Among the metal cluster compounds, platinum (Pt), gold (Au), silver (Ag), copper (Cu), titanium (Ti), zinc (Zn), iron (Fe), cobalt (Co), magnesium (Mg) ), Tungsten (W), aluminum (Al), zirconium (Zr), and oxides thereof, platinum (Pt), gold (Au), silver (Ag), copper (Cu), titanium (Ti), Zinc (Zn) and oxides thereof are more preferable. Among these, platinum, titanium oxide, zinc oxide, iron oxide, and aluminum oxide are preferable, and platinum, titanium oxide, zinc oxide, and iron oxide are more preferable. Moreover, what mixed 2 or more types of said metals in arbitrary ratios is also contained.

また、本発明に用いる金属クラスター化合物には、数平均粒子径の最大径５ｎｍ以上５００ｎｍ以下の金属ナノ粒子も含まれる。また、金属ナノ粒子の数平均粒子径の測定方法は、一般に、マイクロトラック法（レーザー解析・散乱法など）によって測定することができる。   The metal cluster compound used in the present invention also includes metal nanoparticles having a maximum number average particle diameter of 5 nm to 500 nm. Moreover, generally the measuring method of the number average particle diameter of a metal nanoparticle can be measured by the microtrack method (laser analysis, a scattering method etc.).

また、本発明に用いる金属ナノ粒子の形状は、特に限定されないが、例えば、球状、フレーク状、粒状、棒状、ワイヤー状などを例示することができる。中でも水溶液中での分散性の点で、粒状、棒状、ワイヤー状が好ましい。また、上記金属ナノ粒子の形状のものを２種以上混合して用いることもできる。   In addition, the shape of the metal nanoparticles used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a spherical shape, a flake shape, a granular shape, a rod shape, and a wire shape. Among these, granular, rod-like, and wire-like are preferable from the viewpoint of dispersibility in an aqueous solution. Also, two or more kinds of metal nanoparticles can be used as a mixture.

非金属クラスター化合物の中では、フラーレンやカーボンナノチューブ、カーボンナノコイルのような炭素クラスター化合物、カルボランのようなホウ素クラスター化合物がより好ましい。また、フラーレンやカルボランのように、正多面体構造を有する化合物が好ましい。
フラーレンとしては、炭素数６０,７０,７６,７８,８０,８２,８４,８６,８８,９０,９２,９４,９６など炭素数６０〜１２０程度のものが知られている。本発明において炭素数は特に限定されないが、入手が容易で、β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンと複合体を形成したときの安定性や水への溶解性に優れる点で、炭素数６０〜７０のものが好ましい。また、スカンジウム(Ｓｃ)、ランタン(Ｌａ)、セリウム(Ｃｅ)、チタン(Ｔｉ)、窒素(Ｎ)などの異種原子を内包したフラーレンも使用できる。
単層カーボンナノチューブは、直径約１ｎｍであるが、本発明では、溶解性の点で、１本から数本（例えば１０本）がバンドル化した状態のものが好ましい。直径では１ｎｍ〜２０ｎｍ程度が最適である。また、本発明によれば、単層カーボンナノチューブが複数個入れ子状に積層された多層カーボンナノチューブにも十分な水溶性又は水分散性を付与することができる。多層カーボンナノチューブの直径は、例えば、約１５０〜２００ｎｍであり、長さは、例えば、約１〜１０μｍである。
カルボランは、ボランの骨格構造のホウ素原子の一部を炭素原子で置換した化合物及びイオンの総称であり、多面体構造を有する。多面体頂点の数が６〜１２のものが知られているが、本発明では多面体頂点の数は特に限定されない。特に、β-１,３-１,６グルカンと複合体を形成したときの安定性に優れる点で、Ｂ１０Ｃ２Ｈ１２で表され正２０面体構造を有するｍ−カルボラン及びｏ−カルボランが好ましい。 Among non-metallic cluster compounds, carbon cluster compounds such as fullerenes, carbon nanotubes, and carbon nanocoils, and boron cluster compounds such as carborane are more preferable. Further, compounds having a regular polyhedral structure such as fullerene and carborane are preferable.
As fullerenes, those having about 60 to 120 carbon atoms such as 60,70,76,78,80,82,84,86,88,90,92,94,96 carbon atoms are known. In the present invention, the number of carbon atoms is not particularly limited, but it is easily available and is excellent in stability and solubility in water when a complex is formed with β-1,3-1,6-D-glucan. Those having 60 to 70 carbon atoms are preferred. In addition, fullerenes containing different atoms such as scandium (Sc), lanthanum (La), cerium (Ce), titanium (Ti), and nitrogen (N) can also be used.
The single-walled carbon nanotube has a diameter of about 1 nm. In the present invention, from the point of solubility, one to several (for example, 10) are preferably bundled. A diameter of about 1 nm to 20 nm is optimal. In addition, according to the present invention, sufficient water solubility or water dispersibility can also be imparted to multi-walled carbon nanotubes in which a plurality of single-walled carbon nanotubes are nested. The diameter of the multi-walled carbon nanotube is, for example, about 150 to 200 nm, and the length is, for example, about 1 to 10 μm.
Carborane is a general term for compounds and ions obtained by substituting some of the boron atoms in the skeleton structure of borane with carbon atoms, and has a polyhedral structure. Although those having 6 to 12 polyhedral vertices are known, the number of polyhedral vertices is not particularly limited in the present invention. In particular, m-carborane and o-carborane represented by B 10 C 2 H 12 and having a regular icosahedron structure are excellent in stability when a complex is formed with β-1,3-1,6 glucan. preferable.

（１−２）β-１,３-１,６グルカン
本発明に用いるβ-１,３-１,６グルカンにおいて、主鎖のβ-１,３結合数に対する側鎖のβ-１,６結合数の比率である分岐度は、通常約５０〜１００％、好ましくは約７５〜１００％、より好ましくは約８５〜１００％であればよい。
β-１,３-１,６グルカンが上記分岐度を有することは、β-１,３-１,６グルカンをエキソ型のβ-１,３-グルカナーゼ（キタラーゼ Ｍ、ケイアイ化成製）で加水分解処理した場合に分解生成物としてグルコースとゲンチオビオースが遊離すること、及びＮＭＲの積算比から確認できる（今中忠行 監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス（2002））。 (1-2) β-1,3-1,6 Glucan In the β-1,3-1,6 glucan used in the present invention, β-1,3 of the side chain with respect to the number of β-1,3 bonds in the main chain The degree of branching, which is the ratio of the number of bonds, is usually about 50 to 100%, preferably about 75 to 100%, more preferably about 85 to 100%.
β-1,3-1,6 glucan has the above-mentioned degree of branching because β-1,3-1,6 glucan is hydrolyzed with exo-type β-1,3-glucanase (Kitalase M, manufactured by KAI Kasei Co., Ltd.). Glucose and gentiobiose are liberated as degradation products when decomposed, and can be confirmed from the integration ratio of NMR (supervised by Tadayuki Imanaka, development of the use of microorganisms, 1012-1015, NTS (2002)) .

(a)オーレオバシジウム属微生物が生産するβ-１,３-１,６グルカン
上記の分岐度を有するβ-１,３-１,６グルカンは、オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物から得ることができる。
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物由来のβ-１,３-１,６グルカンは、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する。ＮＭＲの測定値は条件の微妙な変化によって変化し、また誤差を伴うことは周知のことであることから、「約４．７ｐｐｍ」「約４．５ｐｐｍ」は、通常予測される範囲の測定値の変動幅（例えば±０．２）を含む数値を意味する。
上記の分岐度を有するβ-１,３-１,６グルカンは、水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が、好ましくは２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、より好ましくは１００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、さらに好ましくは５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下のものである。上記粘度の下限値は通常１０ｃＰ（ｍＰａ・s）程度であり得る。
本発明において、粘度は、ＢＭ型回転粘度計を用いて測定した値である。
オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６グルカンは、菌体外に分泌されるため、キノコ類やパン酵母の細胞壁に含まれるβ-グルカンと比べて、回収が容易であり、また水溶性である点で好ましいものである。オーレオバシジウム属の微生物は、分子量が１００万以上の高分子量のグルカンから分子量が数万程度の低分子のグルカンまでを培養条件に応じて産生することができる。 (a) β-1,3-1,6 glucan produced by microorganisms belonging to the genus Aureobasidium β-1,3-1,6 glucan having the above branching degree belongs to the genus Aureobasidium sp. It can be obtained from microorganisms.
Β-1,3-1,6 glucan derived from a microorganism belonging to the genus Aureobasidium sp. Has a 1 H NMR spectrum of about 4.7 ppm and about 4 in a solution containing 1N sodium hydroxide heavy aqueous solution as a solvent. Has two signals of .5 ppm. Since it is well known that NMR measurement values change due to subtle changes in conditions and are accompanied by errors, “about 4.7 ppm” and “about 4.5 ppm” are measured values within the normally expected range. A numerical value including a fluctuation range (for example, ± 0.2).
The β-1,3-1,6 glucan having the above degree of branching preferably has a viscosity of an aqueous solution at 30 ° C., pH 5.0, concentration 0.5 (w / v%), preferably 200 cP (mPa · s) or less. More preferably, it is 100 cP (mPa · s) or less, more preferably 50 cP (mPa · s) or less. The lower limit of the viscosity is usually about 10 cP (mPa · s).
In the present invention, the viscosity is a value measured using a BM type rotational viscometer.
Since β-1,3-1,6 glucan produced by microorganisms belonging to the genus Aureobasidium is secreted outside the cell body, it is easier to recover than β-glucans contained in the cell walls of mushrooms and baker's yeast In addition, it is preferable in that it is water-soluble. Aureobasidium microorganisms can produce high-molecular-weight glucans having a molecular weight of 1 million or more to low-molecular-weight glucans having a molecular weight of about tens of thousands according to the culture conditions.

中でも、オーレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans)が生産するものが好ましく、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センターにそれぞれＦＥＲＭ
Ｐ-１９２８５及びＦＥＲＭ Ｐ-１９２８６として寄託済み）が産生するものが好ましい。ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株は、オーレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）Ｋ-１株の変異株である。オーレオバシジウム属Ｋ-１株は、分子量２００万以上と１００万程度の２種類のβ-１,３-１,６グルカンを産生することが知られている。
また、オーレオバシジウム属微生物が産生するβ-１,３-１,６グルカンは、通常、硫黄含有基を有するところ、Ｋ-１株の産生するβ−グルカンはスルホ酢酸基を有することが知られている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）,科学と工業,64,131-135（1990））。ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株、及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株が生産するβ-１,３-１,６グルカンもスルホ酢酸基を有すると考えられる。オーレオバシジウム属微生物の中には、リン酸基のようなリン含有基、リンゴ酸基などを含むβ-１,３-１,６グルカンを産生する菌種、菌株も存在する。
ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株は、後に実施例において示すようにメインピークが見かけ上５０〜２５０万の高分子量のβ-グルカン（微粒子グルカン）とメインピークが見かけ上２〜３０万の低分子量のβ-グルカンの両方を産生する菌株である。この微粒子状グルカンは、一次粒子径が０．０５〜２μｍ程度である。 Among them, those produced by Aureobasidium pullulans are preferable, and Aureobasidium pullulans GM-NH-1A1 strain or GM-NH-1A2 strain (incorporated administrative agency National Institute of Industrial Science and Technology patent biological deposit center) FERM respectively
P-19285 and FERM P-19286) have been produced. The GM-NH-1A1 and GM-NH-1A2 strains are mutants of the Aureobasidium sp. K-1 strain. The Aureobasidium genus K-1 strain is known to produce two types of β-1,3-1,6 glucans having a molecular weight of 2 million or more and about 1 million.
In addition, β-1,3-1,6 glucan produced by microorganisms belonging to the genus Aureobasidium usually has a sulfur-containing group, whereas β-glucan produced by K-1 strain has a sulfoacetic acid group. (Arg. Biol. Chem., 47, 1167-1172 (1983)), Science and Industry, 64, 131-135 (1990)). The β-1,3-1,6 glucan produced by the GM-NH-1A1 strain and the GM-NH-1A2 strain is also considered to have a sulfoacetic acid group. Among the microorganisms belonging to the genus Aureobasidium, there are also species and strains that produce β-1,3-1,6 glucan containing a phosphorus-containing group such as a phosphate group, a malate group, and the like.
The GM-NH-1A1 and GM-NH-1A2 strains have a high molecular weight β-glucan (particulate glucan) having an apparent main peak of 500 to 2.5 million and an apparent peak of 2 to 2 as shown in the Examples. It is a strain that produces both 300,000 low molecular weight β-glucan. The fine particle glucan has a primary particle diameter of about 0.05 to 2 μm.

β-１,３-１,６グルカンの溶解度は、ｐＨ及び温度に依存する。このβ-１,３-１,６グルカンは、ｐＨ３．５、温度２５℃の条件で２ｍｇ／ｍｌ水溶液を調製しようとすると、その５０重量％以上が一次粒子径０．０５〜２μｍの微粒子を形成し、残部は水に溶解する。本発明において粒子径は、レーザー回折散乱法により測定した値である。
β-１,３-１,６グルカンは、水溶液にしたときの粘度が、オーレオバシジウム属微生物が産生する天然型β-１,３-１,６グルカンより低いものが好ましい。この低粘度β-１,３-１,６グルカンは、水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が、通常２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、より好ましくは１００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、さらに好ましくは５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、よりさらに好ましくは１０ｃＰ以下である。 The solubility of β-1,3-1,6 glucan depends on pH and temperature. When β-2,3-1,6 glucan is prepared to prepare a 2 mg / ml aqueous solution under the conditions of pH 3.5 and temperature 25 ° C., 50% by weight or more of the particles have a primary particle size of 0.05 to 2 μm. Forms and the remainder dissolves in water. In the present invention, the particle diameter is a value measured by a laser diffraction scattering method.
β-1,3-1,6 glucan preferably has a viscosity lower than that of natural β-1,3-1,6 glucan produced by microorganisms belonging to the genus Aureobasidium, when made into an aqueous solution. This low-viscosity β-1,3-1,6 glucan has a viscosity of an aqueous solution at 30 ° C., pH 5.0 and a concentration of 0.5 (w / v%), usually 200 cP (mPa · s) or less. Preferably it is 100 cP (mPa * s) or less, More preferably, it is 50 cP (mPa * s) or less, More preferably, it is 10 cP or less.

この低粘度グルカンは、オーレオバシジウム属微生物が産生する天然型β-１,３-１,６グルカンと同様の一次構造を有し得る。具体的には、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである。ＮＭＲの測定値は条件の微妙な変化によって変化し、また誤差を伴うことは周知のことであることから、「約４．７ｐｐｍ」「約４．５ｐｐｍ」は、通常予測される範囲の測定値の変動幅（例えば±０．２）を含む数値を意味する。
β-１,３-１,６グルカンは、金属イオン濃度が、β-１,３-１,６グルカンの固形分１ｇ当たり０．４ｇ以下であることが好ましく、０．２ｇ以下であることがより好ましく、０．１ｇ以下であることがさらにより好ましい。原料β-１,３-１,６グルカンが水溶液状態のものである場合は、金属イオン濃度は、水溶液の１００ｍｌ当たり１２０ｍｇ以下であることが好ましく、５０ｍｇ以下であることがより好ましく、２０ｍｇ以下であることがさらにより好ましい。
ここでいう金属イオンには、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、第３〜第５族金属イオン、遷移金属イオンなどが含まれるが、混入する可能性のある金属イオンとしては、代表的には、低粘度β-１,３-１,６グルカンの製造において使用されるアルカリ由来のカリウムイオン、ナトリウムイオンなどが挙げられる。金属イオン濃度は、限外ろ過や透析により調整できる。
金属イオン濃度が上記範囲であれば、水溶液状態で保存する場合や、水溶液状態で加熱滅菌する際に、β-１,３-１,６グルカンのゲル化、凝集、沈殿が生じ難い。また、固形で使用する場合は、再溶解させる場合に凝集などが生じ難い。 This low-viscosity glucan may have the same primary structure as natural β-1,3-1,6 glucan produced by an aureobasidium microorganism. Specifically, the 1 HNMR spectrum of a solution using 1N sodium hydroxide heavy aqueous solution as a solvent has two signals of about 4.7 ppm and about 4.5 ppm. Since it is well known that NMR measurement values change due to subtle changes in conditions and are accompanied by errors, “about 4.7 ppm” and “about 4.5 ppm” are measured values within the normally expected range. A numerical value including a fluctuation range (for example, ± 0.2).
β-1,3-1,6 glucan preferably has a metal ion concentration of 0.4 g or less per gram of solid content of β-1,3-1,6 glucan, preferably 0.2 g or less. More preferably, it is still more preferably 0.1 g or less. When the raw material β-1,3-1,6 glucan is in an aqueous solution state, the metal ion concentration is preferably 120 mg or less per 100 ml of the aqueous solution, more preferably 50 mg or less, and 20 mg or less. Even more preferably.
The metal ions referred to here include alkali metal ions, alkaline earth metal ions, Group 3 to Group 5 metal ions, transition metal ions, and the like. Include alkali-derived potassium ions and sodium ions used in the production of low-viscosity β-1,3-1,6 glucan. The metal ion concentration can be adjusted by ultrafiltration or dialysis.
When the metal ion concentration is in the above range, β-1,3-1,6 glucan gelation, aggregation and precipitation are unlikely to occur when stored in an aqueous solution or when sterilized by heating in an aqueous solution. Further, when used in solid form, aggregation or the like hardly occurs when re-dissolving.

(b)オーレオバシジウム属微生物によるβ-１,３-１,６グルカンの生産方法
分岐度５０〜１００％のβ-１,３-１,６グルカンは、例えば、これを産生する微生物の培養上清に有機溶媒を添加することにより沈殿物として得ることができる。
また、オーレオバシジウム属の微生物を培養して、β-１,３-１,６グルカンを産生させる方法は種々報告されている。培養培地に使用できる炭素源としては、シュークロース、グルコース、フラクトースなどの炭水化物、ペプトンや酵母エキスなどの有機栄養源などを挙げることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウムや硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源などを挙げることができる。場合によってはβ-グルカンの産生量を上昇させるために適宜、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの無機塩、更には鉄、銅、マンガンなどの微量金属塩やビタミン類などを添加するのも有効な方法である。
オーレオバシジウム属微生物を、炭素源としてシュークロースを含むツアペック培地にアスコルビン酸を添加した培地で培養した場合、高濃度のβ-１,３-１,６グルカンを産生することが報告されている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）；科学と工業,64,131-135（1990）；特開平７−５１０８２号公報）。しかし、培地は、微生物が生育し、β-１,３-１,６グルカンを生産するものなら特に限定されない。必要に応じて酵母エキスやペプトンなどの有機栄養源を添加してもよい。 (b) Production method of β-1,3-1,6 glucan by microorganisms belonging to the genus Aureobasidium β-1,3-1,6 glucan having a branching degree of 50 to 100% is, for example, culturing of microorganisms that produce it It can be obtained as a precipitate by adding an organic solvent to the supernatant.
In addition, various methods for producing β-1,3-1,6 glucan by culturing microorganisms belonging to the genus Aureobasidium have been reported. Examples of the carbon source that can be used in the culture medium include carbohydrates such as sucrose, glucose and fructose, and organic nutrient sources such as peptone and yeast extract. Examples of the nitrogen source include inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate, sodium nitrate, and potassium nitrate. In some cases, inorganic salts such as sodium chloride, potassium chloride, phosphate, magnesium salt, calcium salt, trace metal salts such as iron, copper, manganese, and vitamins are used as appropriate to increase the production of β-glucan. It is also an effective method to add a kind or the like.
It has been reported that Aureobasidium microorganisms produce high concentrations of β-1,3-1,6 glucan when cultured in a medium in which ascorbic acid is added to a tourpec medium containing sucrose as a carbon source. (Arg. Biol. Chem., 47, 1167-1172 (1983)); Science and Industry, 64, 131-135 (1990); JP-A-7-51082). However, the medium is not particularly limited as long as microorganisms grow and produce β-1,3-1,6 glucan. If necessary, organic nutrient sources such as yeast extract and peptone may be added.

オーレオバシジウム属の微生物を上記培地で好気培養するための条件としては、１０〜４５℃程度、好ましくは２０〜３５℃程度の温度条件、３〜７程度、好ましくは３．５〜５程度のｐＨ条件などが挙げられる。
効果的に培養ｐＨを制御するためにアルカリ、あるいは酸で培養液のｐＨを制御することも可能である。更に培養液の消泡のために適宜、消泡剤を添加してもよい。培養時間は通常１〜１０日間程度、好ましくは１〜４日間程度であり、これによりβ−グルカンを産生することが可能である。なお、β-グルカンの産生量を測定しながら培養時間を決めてもよい。
上記条件下オーレオバシジウム属の微生物を４〜６日間程度通気攪拌培養すると、培養液にはβ-１,３-１,６グルカンを主成分とするβ-グルカン多糖が０．１％（ｗ/ｖ）〜数％（ｗ/ｖ）含有されており、その培養液の粘度はＢＭ型回転粘度計（東機産業社製）により３０℃では数百ｃＰ(ｍＰａ・s)から数千ｃＰ（ｍＰａ・s）という非常に高い粘度を有する。この培養を遠心分離して得られる上清に例えば有機溶媒を添加することにより、β-１,３-１,６グルカンを沈殿物として得ることができる。 Conditions for aerobic culture of microorganisms belonging to the genus Aureobasidium in the above medium are about 10 to 45 ° C, preferably about 20 to 35 ° C, about 3 to 7, preferably about 3.5 to 5. PH conditions and the like.
In order to effectively control the culture pH, it is also possible to control the pH of the culture solution with an alkali or an acid. Furthermore, you may add an antifoamer suitably for the defoaming of a culture solution. The culture time is usually about 1 to 10 days, preferably about 1 to 4 days, whereby β-glucan can be produced. The culture time may be determined while measuring the production amount of β-glucan.
When microorganisms belonging to the genus Aureobasidium are cultured under aeration and agitation for about 4 to 6 days under the above conditions, β-glucan polysaccharide containing β-1,3-1,6 glucan as a main component is 0.1% (w / v) to several percent (w / v), and the viscosity of the culture solution is from several hundred cP (mPa · s) to several thousand cP at 30 ° C. by a BM type rotational viscometer (manufactured by Toki Sangyo Co., Ltd.). It has a very high viscosity of (mPa · s). By adding an organic solvent, for example, to the supernatant obtained by centrifuging this culture, β-1,3-1,6 glucan can be obtained as a precipitate.

＜低粘度β-１,３-１,６グルカンの製造方法＞
上記の高粘度のβ-１,３-１,６グルカンを含む培養液を、常温で攪拌しながら、これにアルカリを添加すると、急激に粘度が低下する。
アルカリは、水溶性で、かつ医薬品や食品添加物として用いることができるものであればよく、特に限定されない。例えば、炭酸カルシウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸アンモニウム水溶液などの炭酸アルカリ水溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの水酸化アルカリ水溶液；あるいはアンモニア水溶液などを使用できる。アルカリは、培養液のｐＨが１２以上、好ましくは１３以上になるように添加してもよい。例えば水酸化ナトリウムを使用して培養液のｐＨを上げる場合は、水酸化ナトリウムの最終濃度が好ましくは０．５％(ｗ/ｖ)以上、より好ましくは１．２５％(ｗ/ｖ)以上になるように添加すればよい。培養液にアルカリを添加し、良く攪拌すると、瞬時に培養液の粘度が低下する。
次いで、アルカリ処理後の培養液から菌体などの不溶性物質を分離する。培養液の粘度が低いため、菌体を自然沈降させて上澄みを回収する方法（デカント法）、遠心分離、ろ紙あるいはろ布を利用した全量ろ過、フィルタープレス、更に膜ろ過（ＭＦ膜などの限外ろ過）などの方法で、容易に不溶性物質とグルカンとを分離できる。ろ紙あるいはろ布による全量ろ過の場合は、セライトなどろ過助剤を利用するのも一つの手段である。工業的にはフィルタープレスによる菌体除去が好ましい。また、不溶性物質除去前のβ-グルカン液は必要に応じて水で希釈しても良い。濃度が高すぎると不溶性物質除去が困難であり、低すぎても効率的でない。β-グルカン濃度は、０.１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ程度、好ましくは０.５ｍｇ/ｍｌ〜１０ｍｇ/ｍｌ程度、さらに好ましくは１ｍｇ/ｍｌ〜５ｍｇ/ｍｌ程度が良い。 <Production Method of Low Viscosity β-1,3-1,6 Glucan>
When an alkali is added to the above-mentioned culture solution containing β-1,3-1,6 glucan having high viscosity while stirring at room temperature, the viscosity is drastically decreased.
The alkali is not particularly limited as long as it is water-soluble and can be used as a pharmaceutical or food additive. For example, an alkali carbonate aqueous solution such as a calcium carbonate aqueous solution, a sodium carbonate aqueous solution, a potassium carbonate aqueous solution, or an ammonium carbonate aqueous solution; an alkali hydroxide aqueous solution such as a sodium hydroxide aqueous solution, a potassium hydroxide aqueous solution, or a calcium hydroxide aqueous solution; or an ammonia aqueous solution is used. it can. The alkali may be added so that the pH of the culture solution is 12 or more, preferably 13 or more. For example, when using sodium hydroxide to increase the pH of the culture solution, the final concentration of sodium hydroxide is preferably 0.5% (w / v) or higher, more preferably 1.25% (w / v) or higher. Add so that. When alkali is added to the culture solution and stirred well, the viscosity of the culture solution decreases instantaneously.
Next, insoluble substances such as bacterial cells are separated from the culture solution after the alkali treatment. Since the viscosity of the culture solution is low, a method of allowing the cells to settle naturally (decant method), centrifuging, filtering the whole volume using filter paper or filter cloth, filter press, and membrane filtration (limitation of MF membrane, etc.) Insoluble substances and glucan can be easily separated by a method such as external filtration. In the case of total filtration with filter paper or filter cloth, it is one means to use a filter aid such as celite. Industrially, removal of bacterial cells by a filter press is preferred. Further, the β-glucan solution before removal of insoluble substances may be diluted with water as necessary. If the concentration is too high, it is difficult to remove insoluble substances, and if it is too low, it is not efficient. The β-glucan concentration is about 0.1 mg / ml to 20 mg / ml, preferably about 0.5 mg / ml to 10 mg / ml, more preferably about 1 mg / ml to 5 mg / ml.

次いで、グルカンを含む溶液に酸を添加して中和する。中和は、不溶物の除去前に行ってもよい。酸は、医薬や食品添加物として使用できるものであればよく、特に限定されない。例えば、塩酸、燐酸、硫酸、クエン酸、リンゴ酸などを使用できる。酸の使用量は、溶液又は培養液の液性が中性（ｐＨ５〜８程度）になるような量とすればよい。即ち、中和はｐＨ７に合わせることを必ずしも要さない。
ｐＨ１２以上のアルカリ処理後、中和して得られるβ-１,３-１,６グルカンは、３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が通常２００ｃＰ以下、場合によっては、１００ｃＰ以下、５０ｃＰ以下、又は１０ｃＰ以下である。粘度は製造方法ないしは精製方法によって変動する。
アルカリ処理された低粘度のβ-１,３-１,６グルカンは、中和しても粘度が高くなることがない。さらに、常温（１５〜３５℃）では、液性をｐＨが４を下回るような酸性にしても、粘度が高くなることがない。
また、培養上清をアルカリ処理、及び中和した後に、菌体などを除去するのに代えて、培養上清から菌体などを除去した後に、アルカリ処理、及び中和を行うこともできる。 Next, the solution containing glucan is neutralized by adding an acid. Neutralization may be performed before removal of insoluble matter. The acid is not particularly limited as long as it can be used as a pharmaceutical or food additive. For example, hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, citric acid, malic acid and the like can be used. The amount of acid used may be such that the solution or culture solution becomes neutral (pH 5-8). That is, neutralization does not necessarily need to be adjusted to pH 7.
β-1,3-1,6 glucan obtained by neutralization after alkaline treatment at pH 12 or higher has a viscosity of usually 200 cP or less at 30 ° C., pH 5.0 and concentration 0.5 (w / v%). Depending on the case, it is 100 cP or less, 50 cP or less, or 10 cP or less. The viscosity varies depending on the production method or purification method.
The low-viscosity β-1,3-1,6 glucan treated with alkali does not increase in viscosity even when neutralized. Furthermore, at room temperature (15 to 35 ° C.), even if the liquid is acidified so that the pH is less than 4, the viscosity does not increase.
In addition, instead of removing the cells after neutralizing and neutralizing the culture supernatant, alkali treatment and neutralization can be performed after removing the cells from the culture supernatant.

得られるグルカン水溶液からグルカンより低分子量の可溶性夾雑物（例えば塩類など）を除去する場合は、例えば限外ろ過を行えばよい。
また、アルカリ処理、除菌した後、中和せずに、アルカリ性条件下で限外ろ過することもでき、これにより透明性、熱安定性、長期保存性に一層優れる精製β-１,３-１,６グルカンが得られる。アルカリ性条件は、ｐＨ１０以上、好ましくは１２以上であり、ｐＨの上限は通常１３．５程度である。
このようにして得られる水溶液に含まれるβ-１,３-１,６グルカンは、乾燥させて固形製剤にする場合も、また水溶液のまま製剤として使用する場合も、一旦、水溶液から析出させることができる。β-１,３-１,６グルカンの析出方法は、特に限定されないが、例えば、限外ろ過などにより濃縮してグルカン濃度を１ｗ／ｗ％以上にした水溶液に、エタノールのようなアルコールを、水溶液に対して容積比で等倍以上、好ましくは２倍以上添加することにより、β-１,３-１,６グルカンを析出させることができる。この場合にｐＨをクエン酸などの有機酸によりｐＨを酸性、好ましくはｐＨ４未満、さらに好ましくはｐＨ３−３．７に調整して、エタノールを添加すると高純度のβ-１,３-１,６グルカンの粉末を得ることができる。
β-１,３-１,６グルカンを低粘度化することにより、限外ろ過などによる濃縮を容易に行えることから、アルコール沈殿に使用するアルコール量を少なくすることができる。
固形物として得る場合は、低粘度β-１,３-１,６グルカン水溶液を直接乾燥させてもよく、析出させたβ-１,３-１,６グルカンを乾燥させてもよい。乾燥は、噴霧乾燥法、凍結乾燥法など公知の方法で行うことができる。 In order to remove soluble contaminants (for example, salts) having a lower molecular weight than glucan from the resulting aqueous solution of glucan, ultrafiltration may be performed, for example.
In addition, after the alkali treatment and sterilization, it is possible to perform ultrafiltration under alkaline conditions without neutralization. As a result, purified β-1,3- is further excellent in transparency, thermal stability and long-term storage. 1,6 glucan is obtained. The alkaline condition is pH 10 or more, preferably 12 or more, and the upper limit of pH is usually about 13.5.
The β-1,3-1,6 glucan contained in the aqueous solution thus obtained must once be precipitated from the aqueous solution, whether it is dried into a solid formulation or used as a formulation in the aqueous solution. Can do. The precipitation method of β-1,3-1,6 glucan is not particularly limited. For example, an alcohol such as ethanol is added to an aqueous solution that is concentrated by ultrafiltration or the like so that the glucan concentration is 1 w / w% or more. Β-1,3-1,6 glucan can be precipitated by adding the aqueous solution in an equal volume or more, preferably 2 times or more in volume ratio. In this case, the pH is adjusted to acidic with an organic acid such as citric acid, preferably less than pH 4, more preferably pH 3-3.7, and ethanol is added to obtain high purity β-1,3-1,6. A glucan powder can be obtained.
By reducing the viscosity of β-1,3-1,6 glucan, concentration by ultrafiltration and the like can be easily performed, so that the amount of alcohol used for alcohol precipitation can be reduced.
When obtained as a solid, the low viscosity β-1,3-1,6 glucan aqueous solution may be directly dried, or the precipitated β-1,3-1,6 glucan may be dried. Drying can be performed by a known method such as spray drying or freeze drying.

（２）複合体の製造方法
上記説明した本発明の複合体は、疎水性クラスター化合物と、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６グルカンとをアルカリ性（好ましくはｐＨ１１以上、さらに好ましくはｐＨ１３以上）の溶液中で混合する工程（混合工程）と、得られる混合液にカルボキシル基を有する酸を添加して中和する工程（中和工程）とを含む方法によって製造することができる。なお、中和後の溶液のｐＨとしては、ｐＨ４〜９の範囲であればよく、特に、医薬品・化粧品向けの用途に用いるものは、ｐＨ５〜７．５の範囲であることが好ましい。 (2) Production method of complex The complex of the present invention described above is composed of a hydrophobic cluster compound and β-1 having a degree of branching of β-1,6 bonds to β-1,3 bonds of 50 to 100%. , 3-1,6 glucan in an alkaline (preferably pH 11 or higher, more preferably pH 13 or higher) solution (mixing step) and adding an acid having a carboxyl group to the resulting mixture It can manufacture by the method of including the process (neutralization process) of summing. The pH of the solution after neutralization may be in the range of pH 4 to 9, and in particular, those used for applications for pharmaceuticals and cosmetics are preferably in the range of pH 5 to 7.5.

疎水性クラスター化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの比率（β-１,３-１,６グルカン：疎水性クラスター化合物）は、重量比で、１：０．００１〜１０００程度が好ましく、１：０．０１〜１０００程度がより好ましく、１：０．１〜４００程度がさらに好ましい。   The ratio of the hydrophobic cluster compound to β-1,3-1,6 glucan (β-1,3-1,6 glucan: hydrophobic cluster compound) is about 1: 0.001 to 1000 in weight ratio. Preferably, about 1: 0.01-1000 is more preferable, and about 1: 0.1-400 is further more preferable.

本発明に用いるβ-１,３-１,６グルカンは、複合体の作成に用いるにあたり、アルカリ条件下（好ましくはｐＨ１１以上、さらに好ましくはｐＨ１３以上）に付すことにより、３重螺旋構造を解離させて、一本鎖構造状態とすることが必要となる。そのため、複合体の製造はアルカリ条件下の水溶液中で行うことが好ましい。また、β-１,３-１,６グルカンはアルカリ条件下では、一本鎖構造状態のままであり、そのままの状態では疎水性クラスター化合物との複合体を形成しない。そのため、カルボキシル基を有する酸を用いて中和することにより、一本鎖構造状態のβ-１,３-１,６グルカンから３重螺旋構造への再生が起こる。その過程において、疎水性クラスター化合物が３重螺旋のβ-１,３-１,６グルカンで被覆され、疎水性クラスター化合物とβ-１,３-１,６グルカンの複合体が形成する。ここで「被覆」とは、β-１,３-１,６グルカンの３重螺旋構造中に疎水性クラスター化合物が取り込まれた状態や疎水性クラスター化合物の表面に３重螺旋構造のβ-１,３-１,６グルカンが覆い被さった状態のことを意味する。   The β-1,3-1,6 glucan used in the present invention dissociates the triple helical structure by subjecting it to an alkaline condition (preferably pH 11 or more, more preferably pH 13 or more). Thus, a single-stranded structure is required. Therefore, the production of the composite is preferably performed in an aqueous solution under alkaline conditions. In addition, β-1,3-1,6 glucan remains in a single-stranded structure under alkaline conditions, and does not form a complex with a hydrophobic cluster compound in that state. Therefore, neutralization with an acid having a carboxyl group causes regeneration of β-1,3-1,6 glucan in a single-stranded structure to a triple helical structure. In the process, the hydrophobic cluster compound is coated with a triple helix β-1,3-1,6 glucan, and a complex of the hydrophobic cluster compound and β-1,3-1,6 glucan is formed. Here, “coating” means a state in which a hydrophobic cluster compound is incorporated into a triple helical structure of β-1,3-1,6 glucan or a β-1 having a triple helical structure on the surface of the hydrophobic cluster compound. , 3-1,6 means that the glucan is covered.

（２−１）混合工程(2-1) Mixing process

本発明の混合工程では、疎水性クラスター化合物とβ-１,３-１,６グルカンの混合液を作成する。ここで、混合液のｐＨは、複合体を形成させるために３重螺旋構造のβ-１,３-１,６グルカンを一本鎖構造状態と解離するため、ｐＨ１１以上、好ましくはｐＨ１３以上であることが必要である。   In the mixing step of the present invention, a mixed solution of a hydrophobic cluster compound and β-1,3-1,6 glucan is prepared. Here, the pH of the mixed solution is pH 11 or more, preferably pH 13 or more, because the β-1,3-1,6 glucan having a triple helical structure is dissociated from the single-stranded structure state in order to form a complex. It is necessary to be.

本発明の複合体の製造方法における混合工程は、ｐＨを調整したアルカリ性（ｐＨ１１以上、好ましくはｐＨ１３以上）の溶液中に疎水性クラスター化合物とβ-１,３-１,６グルカンをそれぞれ添加した後、後述する攪拌方法によって攪拌混合させてもよく、或いはβ-１,３-１,６グルカンのアルカリ性の溶液を調製し、そのアルカリ溶液中に疎水性クラスター化合物を直接添加し、又は疎水性クラスター化合物を懸濁した懸濁液を添加して攪拌混合させてもよく、或いは疎水性クラスター化合物の懸濁液を調製し、β-１,３-１,６グルカンのアルカリ性の溶液を添加して攪拌混合させてもよい。ここでいう、疎水性クラスター化合物の「懸濁液」とは、疎水性クラスター化合物を溶液に添加し、攪拌することで一時的に溶液中に分散状態となっているものを意味し、一定時間が経過すると疎水性クラスター化合物が沈降し、分散状態を保持することができないものをいう。   In the mixing step in the method for producing a complex of the present invention, a hydrophobic cluster compound and β-1,3-1,6 glucan were added to an alkaline (pH 11 or higher, preferably pH 13 or higher) solution with adjusted pH. Thereafter, the mixture may be stirred and mixed by a stirring method described later, or an alkaline solution of β-1,3-1,6 glucan is prepared, and a hydrophobic cluster compound is directly added to the alkaline solution, or hydrophobic A suspension in which the cluster compound is suspended may be added and mixed with stirring, or a suspension of the hydrophobic cluster compound may be prepared and an alkaline solution of β-1,3-1,6 glucan added. May be mixed with stirring. The “suspension” of the hydrophobic cluster compound referred to here means that the hydrophobic cluster compound is temporarily dispersed in the solution by adding the hydrophobic cluster compound to the solution and stirring. When the time elapses, the hydrophobic cluster compound settles and cannot maintain a dispersed state.

また、混合工程においては、疎水性クラスター化合物の懸濁液とβ-１,３-１,６グルカンのアルカリ性の溶液を別々に調製した後、両者を混合させてもよい。この場合、個別に調製した各液を混合する際には、どちらか一方の液をディスパーなどの攪拌機を用いて攪拌しながら、もう一方の液を添加することにより混合してもよい。さらに、混合した後に、必要に応じて適宜、混合液のｐＨを調整してもよい。
中でも、作業効率・得られる複合体の水分散液の安定性の点で、疎水性クラスター化合物の懸濁液とβ-１,３-１,６グルカンの溶液を別々に調製した後、両者を混合させる態様が好ましい。 In the mixing step, a suspension of the hydrophobic cluster compound and an alkaline solution of β-1,3-1,6 glucan may be prepared separately, and then both may be mixed. In this case, when mixing each liquid prepared separately, you may mix by adding one liquid, stirring either liquid using stirring machines, such as a disper. Furthermore, after mixing, the pH of the mixed solution may be adjusted as necessary.
Above all, from the standpoint of working efficiency and stability of the resulting aqueous dispersion of the complex, a suspension of hydrophobic cluster compound and a solution of β-1,3-1,6 glucan were prepared separately, A mode of mixing is preferable.

本発明の混合工程における攪拌方法は、疎水性クラスター化合物とβ-１,３-１,６グルカンをアルカリ溶液中で均一に分散できる方法であれば、特に限定されない。具体的には、メカニカルスターラー、ディスパー、マグネティックスターラー、超音波分散機、遊星ミル、ボールミル、三本ロールなどを例示することができる。なかでも、分散性の点で、ディスパー、ボールミル、超音波分散機が好ましい。
混合工程における温度は１０〜４０℃であればよく、攪拌時間は０．１〜２時間であればよい。上記範囲であれば、アルカリ溶液中で均一に疎水性クラスター化合物とβ-１,３-１,６グルカンを混合することができる。 The stirring method in the mixing step of the present invention is not particularly limited as long as the method can uniformly disperse the hydrophobic cluster compound and β-1,3-1,6 glucan in the alkaline solution. Specific examples include a mechanical stirrer, a disper, a magnetic stirrer, an ultrasonic disperser, a planetary mill, a ball mill, and a three roll. Of these, dispersers, ball mills, and ultrasonic dispersers are preferred from the viewpoint of dispersibility.
The temperature in the mixing step may be 10 to 40 ° C., and the stirring time may be 0.1 to 2 hours. If it is the said range, a hydrophobic cluster compound and (beta) -1,3-1,6 glucan can be mixed uniformly in an alkaline solution.

ｐＨを調節する際に用いるアルカリとしては、水溶性であればよく、特に限定されない。例えば、炭酸カルシウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸アンモニウム水溶液などの炭酸アルカリ水溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの水酸化アルカリ水溶液；あるいはアンモニア水溶液などを例示することができる。   The alkali used for adjusting the pH is not particularly limited as long as it is water-soluble. Examples include aqueous alkali carbonates such as aqueous calcium carbonate, aqueous sodium carbonate, aqueous potassium carbonate, and aqueous ammonium carbonate; alkaline aqueous solutions such as aqueous sodium hydroxide, aqueous potassium hydroxide, and aqueous calcium hydroxide; or aqueous ammonia. can do.

（２−２）疎水性クラスター化合物の懸濁液の調製方法
本発明において、混合工程に用いる疎水性クラスター化合物の懸濁液は、混合する際の混合液のｐＨ調整のし易さの点で、懸濁液のｐＨがアルカリ性（ｐＨ１１以上、好ましくはｐＨ１３以上）であることが好ましい。なお、懸濁液のｐＨを調節する際に用いるアルカリとしては、水溶性であればよく、特に限定されない。例えば、炭酸カルシウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸アンモニウム水溶液などの炭酸アルカリ水溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの水酸化アルカリ水溶液；あるいはアンモニア水溶液などを例示することができる。 (2-2) Method for Preparing Suspension of Hydrophobic Cluster Compound In the present invention, the suspension of the hydrophobic cluster compound used in the mixing step is easy to adjust the pH of the mixed solution at the time of mixing. The pH of the suspension is preferably alkaline (pH 11 or higher, preferably pH 13 or higher). The alkali used for adjusting the pH of the suspension is not particularly limited as long as it is water-soluble. Examples include aqueous alkali carbonates such as aqueous calcium carbonate, aqueous sodium carbonate, aqueous potassium carbonate, and aqueous ammonium carbonate; alkaline aqueous solutions such as aqueous sodium hydroxide, aqueous potassium hydroxide, and aqueous calcium hydroxide; or aqueous ammonia. can do.

疎水性クラスター化合物の懸濁液の調製方法としては、水に疎水性クラスター化合物を添加し、上述した攪拌方法によって、調製することができる。中でも、高速攪拌機による攪拌方法が好ましい。攪拌条件（温度、時間など）は使用する疎水性クラスター化合物の種類や量に応じて適宜選択しておこなえばよい。上記方法により調製した疎水性クラスター化合物の懸濁液を混合工程に用いることができる。   As a method for preparing the suspension of the hydrophobic cluster compound, it can be prepared by adding the hydrophobic cluster compound to water and by the stirring method described above. Among these, a stirring method using a high-speed stirrer is preferable. The stirring conditions (temperature, time, etc.) may be appropriately selected according to the type and amount of the hydrophobic cluster compound used. A suspension of the hydrophobic cluster compound prepared by the above method can be used in the mixing step.

懸濁液に用いる疎水性クラスター化合物の添加量は、分散液中での最終濃度として１〜５０重量％の範囲であればよく、２０〜４０重量％の範囲が好ましい。上記範囲であれば、水に安定した分散性を有する複合体が得られる。   The addition amount of the hydrophobic cluster compound used in the suspension may be in the range of 1 to 50% by weight as the final concentration in the dispersion, and is preferably in the range of 20 to 40% by weight. If it is the said range, the composite_body | complex which has the dispersibility stabilized in water will be obtained.

（２−３）β-１,３-１,６グルカンの溶液の調製方法
本発明において、混合工程に用いるβ-１,３-１,６グルカンの溶液は、混合する際の混合液のｐＨ調整のし易さの点で、溶液のｐＨがアルカリ性（ｐＨ１１以上、好ましくはｐＨ１３以上）であることが好ましい。なお、溶液のｐＨを調節する際に用いるアルカリとしては、水溶性であればよく、特に限定されない。例えば、炭酸カルシウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸アンモニウム水溶液などの炭酸アルカリ水溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの水酸化アルカリ水溶液；あるいはアンモニア水溶液などを例示することができる。 (2-3) Preparation method of β-1,3-1,6 glucan solution In the present invention, the β-1,3-1,6 glucan solution used in the mixing step is the pH of the mixture at the time of mixing. In terms of ease of adjustment, the pH of the solution is preferably alkaline (pH 11 or more, preferably pH 13 or more). The alkali used for adjusting the pH of the solution is not particularly limited as long as it is water-soluble. Examples include aqueous alkali carbonates such as aqueous calcium carbonate, aqueous sodium carbonate, aqueous potassium carbonate, and aqueous ammonium carbonate; alkaline aqueous solutions such as aqueous sodium hydroxide, aqueous potassium hydroxide, and aqueous calcium hydroxide; or aqueous ammonia. can do.

β-１,３-１,６グルカンの溶液の調製方法としては、水に粉体又は水溶液のβ-１,３-１,６グルカンを添加し、上述した攪拌方法によって調製することができる。なお、溶液のｐＨ調整は、β-１,３-１,６グルカンを添加する前の水にアルカリを添加して調製してもよく、β-１,３-１,６グルカンを添加しながら、同時にアルカリを添加して調製してもよく、β-１,３-１,６グルカンを添加した後に、アルカリを添加して調製してもよい。   As a method for preparing a β-1,3-1,6 glucan solution, powder or an aqueous solution of β-1,3-1,6 glucan can be added to water and prepared by the stirring method described above. The pH of the solution may be adjusted by adding alkali to water before adding β-1,3-1,6 glucan, while adding β-1,3-1,6 glucan. At the same time, it may be prepared by adding an alkali, or after adding β-1,3-1,6 glucan, it may be prepared by adding an alkali.

溶液へのβ-１,３-１,６グルカンの添加量は、疎水性クラスター化合物の使用量にもよるが、分散液中での最終濃度として０．０１〜１０重量％の範囲であればよく、０．０５〜５重量％の範囲が好ましく、０．０５〜３重量％の範囲がより好ましい。上記範囲であれば、十分な水溶性又は水分散性が得られる。   The amount of β-1,3-1,6 glucan added to the solution depends on the amount of the hydrophobic cluster compound used, but is within the range of 0.01 to 10% by weight as the final concentration in the dispersion. The range of 0.05 to 5% by weight is preferable, and the range of 0.05 to 3% by weight is more preferable. If it is the said range, sufficient water solubility or water dispersibility will be acquired.

（２−４）中和工程
本発明における中和工程は、調製した疎水性クラスター化合物の懸濁液、及びβ-１,３-１,６グルカンの溶液を混合したアルカリ性の混合液にカルボキシル基を有する酸を添加して中和することによって、水溶性又は水分散性を有する複合体が得られる。なお、中和の際の攪拌は、上述した攪拌方法によって行うことができる。 (2-4) Neutralization Step The neutralization step in the present invention comprises a carboxyl group in an alkaline mixture obtained by mixing a suspension of the prepared hydrophobic cluster compound and a solution of β-1,3-1,6 glucan. A complex having water solubility or water dispersibility can be obtained by adding an acid having an acid to neutralize. In addition, the stirring in the case of neutralization can be performed with the stirring method mentioned above.

中和工程に用いるカルボキシル基を有する酸としては、一般に市販されているものを用いることができ、例えば、不飽和脂肪族カルボン酸、飽和脂肪族カルボン酸、芳香族カルボン酸、アルドン酸、ウロン酸などを例示することができる。   As the acid having a carboxyl group used in the neutralization step, a commercially available one can be used, for example, unsaturated aliphatic carboxylic acid, saturated aliphatic carboxylic acid, aromatic carboxylic acid, aldonic acid, uronic acid. Etc. can be illustrated.

飽和脂肪族カルボン酸としては、モノカルボン酸、ジカルボン酸、又はトリカルボン酸を例示することができる。   Examples of the saturated aliphatic carboxylic acid include monocarboxylic acid, dicarboxylic acid, and tricarboxylic acid.

モノカルボン酸としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ヘプラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、グリコール酸、乳酸、グリセリン酸、２−ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシ酪酸、γ-ヒドロキシ酪酸、ロイシン酸、メバロン酸、パントイン酸などを例示することができる。   Examples of monocarboxylic acids include formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid, caproic acid, enanthic acid, caprylic acid, heprargonic acid, capric acid, lauric acid, palmitic acid, margaric acid, stearic acid, glycolic acid, lactic acid, Examples thereof include glyceric acid, 2-hydroxybutyric acid, 3-hydroxybutyric acid, γ-hydroxybutyric acid, leucine acid, mevalonic acid, pantoic acid and the like.

ジカルボン酸としては、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、フマル酸、マレイン酸、タルトロン酸、リンゴ酸、酒石酸、シトラマル酸などを例示することができる。   Examples of the dicarboxylic acid include oxalic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, fumaric acid, maleic acid, tartronic acid, malic acid, tartaric acid, and citramalic acid.

トリカルボン酸としては、クエン酸、イソクエン酸などを例示することができる。   Examples of the tricarboxylic acid include citric acid and isocitric acid.

不飽和脂肪族カルボン酸としては、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸など例示することができる。   Examples of the unsaturated aliphatic carboxylic acid include oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, docosahexaenoic acid, and eicosapentaenoic acid.

芳香族カルボン酸としては、安息香酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、サリチル酸などを例示することができる。   Examples of the aromatic carboxylic acid include benzoic acid, phthalic acid, isophthalic acid, terephthalic acid, and salicylic acid.

アルドン酸としては、グルコン酸、マンノン酸、ガラクトン酸、リボン酸、キシロン酸、アラボン酸、セロビオン酸、マルトビオン酸、マルトトリオン酸、マルトテトラオン酸、マルトペンタオン酸、メリビオン酸、ラクトビオン酸などを例示することができる。   As aldonic acid, gluconic acid, mannonic acid, galactonic acid, ribbon acid, xylonic acid, arabonic acid, cellobionic acid, maltobionic acid, maltotriionic acid, maltotetraionic acid, maltopentanoic acid, melionic acid, lactobionic acid, etc. It can be illustrated.

ウロン酸としては、グルクチュロン酸、ガラクチュロン酸、マンヌロン酸などを例示することができる。   Examples of uronic acid include glucuronic acid, galacturonic acid, mannuronic acid and the like.

中和工程に用いるカルボキシル基を有する酸としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、イソクエン酸、乳酸が好ましく、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、乳酸がより好ましく、乳酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸がさらに好ましい。また、上述した酸を２種以上組合せて用いることもできる。   Examples of acids having a carboxyl group used in the neutralization process include formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, fumaric acid, maleic acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, and isocitric acid. Lactic acid is preferred, acetic acid, propionic acid, oxalic acid, succinic acid, fumaric acid, maleic acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, lactic acid are more preferred, and lactic acid, succinic acid, malic acid, tartaric acid, citric acid are more preferred. . Also, two or more of the above-mentioned acids can be used in combination.

中和に使用するカルボキシル基を有する酸の量は、目的とするｐＨに応じて適宜選択すればよい。また、中和の際に発熱するため、必要に応じて冷却しながら中和をおこなってもよい。また、中和に用いるカルボキシル基を有する酸の添加方法としては、必要量を一括で添加してもよく、少量ずつ分けて添加して行うことができる。   What is necessary is just to select suitably the quantity of the acid which has a carboxyl group used for neutralization according to the target pH. Moreover, since heat is generated during neutralization, neutralization may be performed while cooling as necessary. Moreover, as a method for adding an acid having a carboxyl group used for neutralization, a necessary amount may be added all at once, or it may be added in small portions.

以上の操作により、疎水性クラスター化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体が分散した溶液（水分散液）が得られる。本発明において、複合体が「分散した溶液（水分散液）」とは、一定時間が経過しても溶液中に疎水性クラスター化合物とβ-１，３-１，６グルカンの複合体が均一に分散した状態で保たれてものを意味する。   By the above operation, a solution (aqueous dispersion) in which a complex of the hydrophobic cluster compound and β-1,3-1,6 glucan is dispersed is obtained. In the present invention, the “dispersed solution (aqueous dispersion)” means that the complex of the hydrophobic cluster compound and β-1,3-1,6-glucan is homogeneous in the solution even after a certain period of time. It means something that is kept dispersed.

（３）その他
上記説明した本発明の複合体の製造方法は、疎水性クラスター化合物の水溶化又は水分散化方法、又は疎水性クラスター化合物への水溶性又は水分散性の付与方法と捉えることもできる。 (3) Others The production method of the complex of the present invention described above may be regarded as a water-solubilizing or water-dispersing method for a hydrophobic cluster compound, or a method for imparting water-solubility or water-dispersibility to a hydrophobic cluster compound. it can.

本発明の複合体は安全性が高く、医薬として応用可能なものである。
また、本発明の疎水性クラスター化合物の複合体は、触媒材料、磁気記録材料、導電膜形成材料、半導体膜形成材料、顔料等の各種用途に使用することができる。例えば、本発明の金属クラスター化合物やカーボンナノチューブとの複合体を基板に塗布した後、２０〜６００℃の温度で乾燥、焼成し被膜を形成することができる。この基板は、電極、配線、回路などを構成するのに一般に用いられている、乾燥・焼成によって焼失、劣化しない耐熱性のものであれば良い。具体的には、例えば、鉄、銅、アルミニウムなどの金属基板、ポリイミドフィルムなどの耐熱性樹脂基板、ガラス基板などを挙げることができる。塗布方法は公知の方法を採用できる。具体的には、例えば、スクリーン印刷法、ディップコーティング法、スプレー法、スピンコーティング法などが挙げられる。また、インクジェットヘッドを用いて複合体を基板上の必要な部分のみに塗布することもできる。塗布後に約２０〜６００℃、好ましくは約１００〜４５０℃、更に好ましくは約１００〜３５０℃で乾燥、焼成することができる。焼成時の雰囲気は、不活性雰囲気または還元性雰囲気であることが好ましい。焼成時間は約０．１〜３時間、好ましくは約０．２〜２時間である。得られた被膜は配線として用いることができる。
また、本発明の疎水性クラスター化合物の複合体は架橋剤を添加することにより成形体とすることもできる。用いられる架橋剤としては、カードランのような長鎖の多糖や酸無水物、イソシアネート化合物等を例示できる。
本発明の疎水性クラスター化合物の複合体を用いた成形体は、各種センサー、放熱体、磁性体、固体触媒、光学素子、導電体等、種々の用途に用いることができる。 The complex of the present invention has high safety and can be applied as a medicine.
Moreover, the composite of the hydrophobic cluster compound of the present invention can be used for various applications such as a catalyst material, a magnetic recording material, a conductive film forming material, a semiconductor film forming material, and a pigment. For example, the composite of the metal cluster compound or carbon nanotube of the present invention is applied to a substrate, and then dried and fired at a temperature of 20 to 600 ° C. to form a film. This substrate may be any heat-resistant substrate that is generally used for constituting electrodes, wirings, circuits, etc. and does not burn and deteriorate due to drying and baking. Specific examples include metal substrates such as iron, copper, and aluminum, heat resistant resin substrates such as polyimide films, and glass substrates. As a coating method, a known method can be adopted. Specific examples include a screen printing method, a dip coating method, a spray method, and a spin coating method. In addition, the composite can be applied only to a necessary portion on the substrate using an inkjet head. After coating, it can be dried and fired at about 20 to 600 ° C., preferably about 100 to 450 ° C., more preferably about 100 to 350 ° C. The firing atmosphere is preferably an inert atmosphere or a reducing atmosphere. The firing time is about 0.1 to 3 hours, preferably about 0.2 to 2 hours. The obtained coating can be used as wiring.
The composite of the hydrophobic cluster compound of the present invention can be formed into a molded body by adding a crosslinking agent. Examples of the crosslinking agent used include long-chain polysaccharides such as curdlan, acid anhydrides, and isocyanate compounds.
The molded body using the composite of the hydrophobic cluster compound of the present invention can be used for various applications such as various sensors, heat radiators, magnetic bodies, solid catalysts, optical elements, and conductors.

以下、本発明の実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実験例（精製β-１,３-１,６グルカンの製造）
（１）低粘度β-１,３-１,６グルカンの調製
（１-１）β−グルカンの培養産生
後掲の表１に示す組成を有する液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容量の肩付きフラスコに入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った後、オーレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）を同培地組成のスラントより無菌的に１白金耳植菌し、１３０ｒｐｍの速度で通気攪拌しつつ、３０℃で２４時間培養することにより種培養液を調製した。
次いで、同じ組成の培地２００Ｌを３００Ｌ容量の培養装置（丸菱バイオエンジ製）に入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌し、上記のようにして得られた種培養液２Ｌを無菌的に植菌し、２００ｒｐｍ、２７℃、４０L／ｍｉｎの通気攪拌培養を行った。なお、培地のｐＨは水酸化ナトリウム及び塩酸を用いてｐＨ４．２〜４．５の範囲内に制御した。９６時間後の菌体濁度はＯＤ６６０ｎｍで２３ＯＤで、多糖濃度は０．５％(ｗ/ｖ)で、硫黄含量から計算される置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。 EXAMPLES Hereinafter, although the Example of this invention is given and demonstrated in detail, this invention is not limited to these.
Experimental example (production of purified β-1,3-1,6 glucan)
(1) Preparation of low viscosity β-1,3-1,6 glucan
(1-1) beta-glucan a liquid medium 100ml having the composition shown in Table 1 supra after culture production placed on shouldered flask 500ml volume, at 121 ° C., 15 min, after pressurized steam sterilization, Aureobasidium pullulans GM-NH-1A1 strain (FERM P-19285) was aseptically inoculated from a slant of the same medium composition with 1 platinum ear inoculum and stirred at a rate of 130 rpm at 24 ° C. for 24 hours at 30 ° C. A seed culture solution was prepared by culturing for a period of time.
Next, 200 L of medium having the same composition is placed in a 300 L culture apparatus (manufactured by Maruhishi Bioengineer), autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes, and 2 L of the seed culture obtained as described above is aseptic. The cells were inoculated and aerated and stirred at 200 rpm, 27 ° C., 40 L / min. The pH of the medium was controlled within the range of pH 4.2 to 4.5 using sodium hydroxide and hydrochloric acid. The turbidity after 96 hours was 23 OD at OD 660 nm, the polysaccharide concentration was 0.5% (w / v), and the substituted sulfoacetic acid content calculated from the sulfur content was 0.09%.

＜多糖濃度測定＞
多糖濃度は、培養液を数ｍｌサンプリングし、菌体を遠心分離除去した後、その上清に最終濃度が６６％(v/v)となるようにエタノールを加えて多糖を沈殿させて回収した後、イオン交換水に溶解し、フェノール硫酸法で定量した。 <Measurement of polysaccharide concentration>
The polysaccharide concentration was collected by sampling several ml of the culture solution, centrifuging and removing the cells, and then adding ethanol to the supernatant so that the final concentration was 66% (v / v) to precipitate the polysaccharide. Then, it melt | dissolved in ion-exchange water and quantified with the phenol sulfuric acid method.

＜置換スルホ含量測定＞
同様にして菌体を除去した培養上清にエタノールを最終濃度が６６％となるように添加し、β−グルカンを沈殿回収した。その後、再度イオン交換水に溶解し、再度遠心分離後、その上清に最終濃度が０．９％になるように食塩を加えた後、再度６６％エタノールでβ−グルカンを回収した。このβ−グルカン回収精製操作を更に２回繰り返し、得られたβ−グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ−グルカン粉末を得た。
このβ−グルカン粉末を燃焼管式燃焼吸収後、イオンクロマト法で組成分析した結果、Ｓ含量は２３９ｍｇ／ｋｇであり、この値から計算される置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。 <Measurement of substituted sulfo content>
Similarly, ethanol was added to the culture supernatant from which the cells had been removed so that the final concentration was 66%, and β-glucan was collected by precipitation. Thereafter, the sample was dissolved again in ion-exchanged water, centrifuged again, sodium chloride was added to the supernatant so that the final concentration was 0.9%, and β-glucan was again collected with 66% ethanol. This β-glucan recovery and purification operation was further repeated twice, and the resulting β-glucan aqueous solution was dialyzed against ion-exchanged water and then freeze-dried to obtain a β-glucan powder.
This β-glucan powder was combusted and absorbed by the combustion tube and analyzed by ion chromatography. As a result, the S content was 239 mg / kg, and the substituted sulfoacetic acid content calculated from this value was 0.09%.

Figure 0005861582
Figure 0005861582

（１−２）アルカリ処理
上記のようにして得られた培養液の粘度をＢＭ型回転粘度計（東京計器製）を用いて、３０℃、１２ｒｐｍで測定したところ、１５００ｃＰ（ｍＰａ・ｓ）であった。測定に用いるロータは粘度にあわせて適当なものを選択した。
この培養液に水酸化ナトリウム最終濃度が２．４％(ｗ/ｖ)となるように２５％(ｗ/ｗ)水酸化ナトリウムを添加し攪拌したところ（ｐＨ１３．６）、瞬時に粘度が低下した。引き続いて５０％(ｗ/ｖ)クエン酸水溶液でｐＨ５．０となるように中和してから、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度を測定したところ、そのときの粘度（３０℃）は２０ｃＰ(ｍＰａ・s)であった。
次いで、この培養液にろ過助剤としてＫＣフロック（日本製紙社製）を１ｗｔ％添加し、薮田式ろ過圧搾機（薮田機械製）を用いて菌体を除去し、最終的に培養ろ液（約２３０Ｌ）を得た。その多糖濃度は０．５％(ｗ/ｖ)で、ほぼ１００％の回収率であった。 (1-2) Alkali treatment When the viscosity of the culture solution obtained as described above was measured at 30 ° C. and 12 rpm using a BM type rotational viscometer (manufactured by Tokyo Keiki Co., Ltd.), it was 1500 cP (mPa · s). there were. The rotor used for the measurement was selected appropriately according to the viscosity.
When 25% (w / w) sodium hydroxide was added to this culture solution so that the final concentration of sodium hydroxide was 2.4% (w / v) and stirred (pH 13.6), the viscosity decreased instantaneously. did. Subsequently, after neutralizing with a 50% (w / v) aqueous citric acid solution to pH 5.0, the viscosity at a concentration of 0.5 (w / v%) was measured. ) Was 20 cP (mPa · s).
Next, 1 wt% of KC Flock (manufactured by Nippon Paper Industries Co., Ltd.) was added to the culture broth as a filter aid, and the cells were removed using a Kamata filter press (manufactured by Kamata Kikai). About 230 L). The polysaccharide concentration was 0.5% (w / v), and the recovery rate was almost 100%.

（１−３）β−グルカン水溶液の脱塩
上記のβ−グルカン水溶液（培養ろ液）を０．３％に希釈後、限外ろ過（ＵＦ）膜（分子量カット５万、日東電工社製）を用いて脱塩を行い、最終的にナトリウムイオン濃度を２０ｍｇ／１００ｍｌに落とした後、５０％(ｗ/ｖ)クエン酸水溶液によりｐＨを３．５に調整した。
引き続いて、ホット充填用加熱ユニット（日阪製作所製）を用いて９５℃で、３分間保持することにより殺菌処理を行い、最終製品のβ−グルカン水溶液を得た。この時のβ−グルカンの濃度をフェノール硫酸法により測定したところ０．２２％(ｗ/ｖ)であった。また、培養液からのトータル収率は約７３％であった。 (1-3) Desalination of β-glucan aqueous solution After dilution of the above β-glucan aqueous solution (culture filtrate) to 0.3%, ultrafiltration (UF) membrane (molecular weight cut 50,000, manufactured by Nitto Denko Corporation) Was used, and finally the sodium ion concentration was lowered to 20 mg / 100 ml, and then the pH was adjusted to 3.5 with a 50% (w / v) aqueous citric acid solution.
Subsequently, sterilization was performed by holding at 95 ° C. for 3 minutes using a hot filling heating unit (manufactured by Nisaka Manufacturing Co., Ltd.) to obtain a final β-glucan aqueous solution. The concentration of β-glucan at this time was 0.22% (w / v) as measured by the phenol sulfuric acid method. The total yield from the culture was about 73%.

＜硫黄含有量の測定＞
また、得られたβ-グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ−グルカン粉末を得た。本β-グルカンの組成分析結果からＳ含量は３３０ｍｇ／ｋｇであり、これから計算される置換スルホ酢酸含量は０．１２％であった。 <Measurement of sulfur content>
Further, the obtained β-glucan aqueous solution was dialyzed with ion-exchanged water and then freeze-dried to obtain β-glucan powder. From the compositional analysis result of this β-glucan, the S content was 330 mg / kg, and the substituted sulfoacetic acid content calculated from this was 0.12%.

＜結合状態の確認＞
また、脱塩を行った上記培養ろ液について、コンゴーレッド法によって、４８０ｎｍから５２５ｎｍ付近への波長シフトを確認することができたのでβ−１，３結合を含むグルカンを含有していることが証明された（K. Ogawa, Carbohydrate Research, 67, 527-535 (1978)、今中忠行 監修, 微生物利用の大展開, 1012-1015, エヌ・ティー・エス（2002））。そのときの極大値へのシフト差分はΔ0.48/500μｇ多糖であった。
上記培養ろ液１５ｍｌを取り出し、３０ｍｌのエタノールを添加し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎで遠心して、沈殿する多糖を回収した。６６％エタノールで洗浄し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０分間遠心して、沈殿する多糖に２ｍｌのイオン交換水と、１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加撹拌後、６０℃、１時間保温して沈殿を溶解させた。次に-８０℃にて凍結後、一晩、真空凍結乾燥を行い、乾燥後の粉末を１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、２次元ＮＭＲに供した。
２次元ＮＭＲ（１３Ｃ−１Ｈ ＣＯＳＹ ＮＭＲ）１０６ｐｐｍと相関関係を有する１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図１に示す。このスペクトルにおいて４．７ｐｐｍと４．５ｐｐｍ付近との２つのシグナルが得られた。
この結果、本β−グルカンがβ-１,３-１,６グルカンであることが証明された（今中忠行 監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス（2002））。それぞれの１Ｈ ＮＭＲシグナルの積分比から、β-１,３結合／β-１,６結合の比は１．１５であることが判明した。従って、主鎖のβ-１,３結合に対する側鎖のβ-１,６結合の分岐度は、約８７％である。 <Confirmation of combined state>
Moreover, since the wavelength shift from 480 nm to about 525 nm could be confirmed by the Congo red method, the above-described culture filtrate that had been desalted contained glucan containing β-1,3 bonds. Proven (K. Ogawa, Carbohydrate Research, 67, 527-535 (1978), supervised by Tadayuki Imanaka, Development of the use of microorganisms, 1012-1015, NTS (2002)). The shift difference to the maximum value at that time was Δ0.48 / 500 μg polysaccharide.
15 ml of the culture filtrate was taken out, 30 ml of ethanol was added, and centrifuged at 4 ° C. and 1000 rpm for 10 minutes to collect the precipitated polysaccharide. Wash with 66% ethanol, centrifuge at 4 ° C, 1000 rpm for 10 minutes, add 2 ml of ion-exchanged water and 1 ml of 1N sodium hydroxide aqueous solution to the precipitated polysaccharide, stir, then heat at 60 ° C for 1 hour to precipitate. Dissolved. Next, after freezing at −80 ° C., vacuum lyophilization was performed overnight, and the dried powder was dissolved in 1 ml of 1N sodium hydroxide heavy aqueous solution and subjected to two-dimensional NMR.
FIG. 1 shows a 1 H NMR spectrum having a correlation with 106 ppm of two-dimensional NMR ( 13 C- 1 H COSY NMR). In this spectrum, two signals of 4.7 ppm and around 4.5 ppm were obtained.
As a result, it was proved that this β-glucan is β-1,3-1,6 glucan (supervised by Tadayuki Imanaka, large development of microbial use, 1012-1015, NTS (2002)) . From the integration ratio of each 1 H NMR signal, it was found that the ratio of β-1,3 bond / β-1,6 bond was 1.15. Therefore, the degree of branching of the β-1,6 bond in the side chain relative to the β-1,3 bond in the main chain is about 87%.

＜粒度測定＞
次に、レ−ザ回折/散乱式粒度分布測定装置(ＨＯＲＩＢＡ製ＬＡ−９２０)を用いて培養液の粒度を測定したところ、粒子としては０．３μｍと１００μｍ程度の大きさのところにピ−クが見られた。続いて、超音波を照射しながら、粒度測定を行うと、１００μｍのピ−クはみるみるうちに消失し、０．３μｍのピ−クが増え、最終的に０．３μｍのみとなった。超音波照射したときの培養液の粒度分布を図２に示す。
０．３μｍのピークはβ-１,３-１,６グルカンの一次粒子によるピークであり、１００〜２００μｍのピークはβ-１,３-１,６グルカンの一次粒子が凝集した二次粒子によるピークであると考えられる。
また、二次粒子はマグネチックスターラ−による攪拌、軽い振とうでも同じように消失し、容易に砕けて一次粒子になることが確認された。よって、二次粒子は非常に緩い凝集(緩凝集状態)と考えられる。 <Particle size measurement>
Next, when the particle size of the culture solution was measured using a laser diffraction / scattering type particle size distribution measuring apparatus (LA-920 manufactured by HORIBA), the particles were about 0.3 μm and 100 μm in size. I was seen. Subsequently, when particle size measurement was performed while irradiating with ultrasonic waves, the 100 μm peak disappeared as soon as it was seen, the 0.3 μm peak increased, and finally only 0.3 μm. The particle size distribution of the culture solution when irradiated with ultrasonic waves is shown in FIG.
The peak of 0.3 μm is a peak due to primary particles of β-1,3-1,6 glucan, and the peak of 100 to 200 μm is due to secondary particles in which primary particles of β-1,3-1,6 glucan are aggregated It is considered a peak.
Further, it was confirmed that the secondary particles disappeared in the same manner even when stirred with a magnetic stirrer and lightly shaken, and easily broken into primary particles. Therefore, the secondary particles are considered to be very loosely aggregated (slowly aggregated state).

＜分子量測定＞
また、東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））を用いて、０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、溶解β-１,３-１,６グルカンとβ-１,３-１,６グルカンの１次粒子とを含む溶液の分子量を測定したところ、溶解β-１,３-１,６グルカンに由来する２〜３０万のピークの低分子画分と、１次粒子に由来する見かけ上５０〜２５０万の高分子画分との二種類が検出された。分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
水溶性β-１,３-１,６グルカンと微粒子とを分離するため、上記の微粒子画分と可溶性画分とを含むβ-１,３-１,６グルカン溶液をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。このことから、高分子画分はβ-１,３-１,６グルカンの一次粒子や一次粒子が凝集した二次粒子に相当することが判明した。よって、水溶性β-１,３-１,６グルカンの分子量は２〜３０万と考えられる。 <Molecular weight measurement>
Further, using Toyopearl HW65 (column size 75 cm × φ1 cm, excluded molecular weight 2.5 million (dextran)) manufactured by Tosoh Corporation, gel filtration chromatography was performed using a 0.1 M sodium hydroxide aqueous solution as an eluent to dissolve β- When the molecular weight of a solution containing 1,3-1,6 glucan and β-1,3-1,6 glucan primary particles was measured, it was derived from dissolved β-1,3-1,6 glucan 2 Two types of low molecular fractions having a peak of 300,000 and apparently high molecular fractions of 500 to 2.5 million derived from primary particles were detected. Shodex pullulan was used as a molecular weight marker.
In order to separate the water-soluble β-1,3-1,6 glucan and the fine particles, the β-1,3-1,6 glucan solution containing the fine particle fraction and the soluble fraction was filtered with an Advantech filter ( When filtration was performed at 0.2 μm, a polymer fraction of 500 to 2.5 million disappeared. From this, it was found that the polymer fraction corresponds to primary particles of β-1,3-1,6 glucan and secondary particles in which primary particles are aggregated. Therefore, the molecular weight of water-soluble β-1,3-1,6 glucan is considered to be 2 to 300,000.

（２）粉末化β-グルカンの調製
（１−２）において、アルカリ処理および菌体除去処理により調製された微粒子β-１,３-１,６グルカンを含むβ-１,３-１,６グルカン水溶液に、最終濃度が６６％(v/v)となるようにエタノールを添加して、多糖グルカンを沈殿させ、遠心分離法により回収した。次いで凍結乾燥法によりエタノールと水分を除去し、乾燥β-１,３-１,６グルカンを得た。そのときの収率はエタノール沈殿前の全糖濃度と比較して９５％以上であった。
次いで、得られた乾燥β-１,３-１,６グルカンを最終濃度が０．３％（ｗ／ｖ）となるように水に溶解分散後、前述したと同様にして東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））により０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルクロマトグラフィーを行い、分子量を測定したところ、得られた多糖の分子量は２〜３０万のピークの低分子画分と見かけ上５０〜２５０万の高分子画分の二種類からなることが判明した。ここで、分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
一方、水溶性β-１,３-１,６グルカンと微粒子を分離するため、本法で調製したβ-１,３-１,６グルカン水溶液（微粒子と可溶化グルカンを含むもの）をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。よって、本法により得られたβ-１,３-１,６グルカンを乾燥させても、再溶解させれば乾燥前のβ-１,３-１,６グルカンと同様の物理的挙動を再現することが実証された。 (2) Preparation of powdered β-glucan In (1-2), β-1,3-1,6 containing fine particle β-1,3-1,6 glucan prepared by alkali treatment and bacterial cell removal treatment Ethanol was added to the aqueous glucan solution so that the final concentration was 66% (v / v) to precipitate the polysaccharide glucan and recovered by centrifugation. Subsequently, ethanol and water were removed by a freeze-drying method to obtain dry β-1,3-1,6 glucan. The yield at that time was 95% or more compared to the total sugar concentration before ethanol precipitation.
Next, the obtained dry β-1,3-1,6 glucan was dissolved and dispersed in water so that the final concentration was 0.3% (w / v), and then Toyo made by Tosoh Corporation was used in the same manner as described above. Gel chromatography was performed using Pearl HW65 (column size 75 cm × φ1 cm, exclusion molecular weight of 2.5 million (dextran)) with 0.1 M sodium hydroxide aqueous solution as an eluent, and the molecular weight was measured. The molecular weight of the obtained polysaccharide was 2 It was found to consist of two types, a low molecular fraction having a peak of ˜300,000 and a high molecular fraction having an apparent appearance of 500,000 to 2.5 million. Here, a pullulan manufactured by Shodex was used as a molecular weight marker.
On the other hand, in order to separate water-soluble β-1,3-1,6 glucan and fine particles, an aqueous solution of β-1,3-1,6 glucan (containing fine particles and solubilized glucan) prepared by this method is used by Advantech. When filtration was performed with a filter (0.2 μm), a polymer fraction of 500 to 2,500,000 disappeared. Therefore, even if the β-1,3-1,6 glucan obtained by this method is dried, if it is redissolved, the physical behavior similar to that of β-1,3-1,6 glucan before drying is reproduced. Proved to be.

（３）高純度β-１,３-１,６グルカン粉末の製造
（１）においてアルカリ処理を行い低粘度化した培養液（多糖濃度０．５％（５ｍｇ／ｍｌ））９０Ｌを５０％クエン酸水溶液９ｋｇで中和後、ろ過助剤（日本製紙ケミカル製粉末セルロ−スＫＣフロック）を１．８ｋｇプレコートした薮田式濾過圧搾機４０Ｄ-４を通して、菌体を取り除いた。ろ液を限外ろ過スパイラルエレメント（日東電工製ＮＴＵ３１５０−Ｓ４）で９Ｌまで濃縮した。本濃縮液を攪拌しながら、ｐＨを３．０-３．５にクエン酸により調整して、エタノール１８Ｌを加え、グルカン／エタノール／水スラリーを得た。スラリーの粘度はＢＭ型粘度計で２２ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。室温で３時間静置し、上澄み液（エタノール／水）約１７Ｌを取り除いた。残ったスラリーの粘度は４５ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。本濃縮スラリー１０Ｌを坂本技研型の噴霧乾燥装置Ｒ-３を用いて噴霧乾燥し、３６０ｇのβ-１,３-１,６グルカン粉末を得た（回収率８０％）。得られたβ-１,３-１,６グルカンの純度はＮＭＲスペクトルの解析の結果、９０％以上であった。
なお、得られたβ-１,３-１,６グルカン粉末を１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、ＮＭＲスペクトルを測定したところ、１Ｈ ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを得た。また、得られたβ-１,３-１,６グルカン粉末の濃度０．５（ｗ／ｖ％）の水溶液の粘度は２００ｃＰ以下であった（ｐＨ５．０、３０℃）。上記記載の方法によって得られた精製β-グルカンを下記の試験に供した。 (3) Production of high-purity β-1,3-1,6 glucan powder 90% of the culture solution (polysaccharide concentration 0.5% (5 mg / ml)) 90L obtained by alkali treatment in (1) was reduced to 50% After neutralization with 9 kg of the acid aqueous solution, the cells were removed through a Kamata type filter press 40D-4 pre-coated with 1.8 kg of filter aid (Nippon Paper Chemicals Powder Cellulose KC Flock). The filtrate was concentrated to 9 L with an ultrafiltration spiral element (NTU3150-S4 manufactured by Nitto Denko). While stirring the concentrate, the pH was adjusted to 3.0-3.5 with citric acid, and 18 L of ethanol was added to obtain a glucan / ethanol / water slurry. The viscosity of the slurry was 22 mPa · s (30 ° C.) with a BM viscometer. The mixture was allowed to stand at room temperature for 3 hours, and about 17 L of the supernatant (ethanol / water) was removed. The viscosity of the remaining slurry was 45 mPa · s (30 ° C.). 10 L of this concentrated slurry was spray-dried using a Sakamoto Giken type spray dryer R-3 to obtain 360 g of β-1,3-1,6 glucan powder (recovery rate 80%). As a result of analyzing the NMR spectrum, the purity of the obtained β-1,3-1,6 glucan was 90% or more.
The obtained β-1,3-1,6 glucan powder was dissolved in a 1N sodium hydroxide heavy aqueous solution, and the NMR spectrum was measured. As a result, the 1 H NMR spectrum was about 4.7 ppm and about 4.5 ppm. One signal was obtained. Further, the viscosity of the obtained β-1,3-1,6 glucan powder aqueous solution having a concentration of 0.5 (w / v%) was 200 cP or less (pH 5.0, 30 ° C.). The purified β-glucan obtained by the method described above was subjected to the following test.

（２）複合体の製造方法
以下に実施例および比較例に用いた疎水性クラスター化合物（金属クラスター化合物）を示す。
金属クラスター化合物；酸化チタン（粒状、数平均粒子径；３０〜５０ｎｍ；石原産業（株）製 ＴＴＯ−５５（Ａ）） (2) Manufacturing method of composite body The hydrophobic cluster compound (metal cluster compound) used in Examples and Comparative Examples is shown below.
Metal cluster compound; titanium oxide (granular, number average particle size; 30 to 50 nm; TTO-55 (A) manufactured by Ishihara Sangyo Co., Ltd.)

（実施例１）
（２−１）酸化チタンの懸濁液の調製方法
４８％水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ１２に調整した水６５０ｇに上述した酸化チタン３５０ｇを添加し、室温で、２０分間、高速攪拌機を用いて攪拌を行い、酸化チタンの懸濁液（チタン濃度；３５重量％）１０００ｇを調製した。 Example 1
(2-1) Preparation Method of Titanium Oxide Suspension 350 g of the above-mentioned titanium oxide was added to 650 g of water adjusted to pH 12 using a 48% aqueous sodium hydroxide solution, and at room temperature for 20 minutes using a high-speed stirrer. Stirring was performed to prepare 1000 g of a suspension of titanium oxide (titanium concentration: 35% by weight).

（２−２）β-１,３-１,６グルカン溶液の調製方法
４８％水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ１３に調整した水９７ｇに上述した方法によって得られたβ-１,３-１,６グルカン粉末３ｇを添加し、８０℃で加熱しながら、１５分間、高速攪拌機を用いて攪拌を行い、β-１,３-１,６グルカン溶液（β-１,３-１,６グルカン濃度３重量％）１００ｇを調製した。 (2-2) Preparation method of β-1,3-1,6 glucan solution To 97 g of water adjusted to pH 13 using 48% aqueous sodium hydroxide solution, β-1,3-1, Add 3 g of 6 glucan powder and stir for 15 minutes using a high-speed stirrer while heating at 80 ° C. to obtain a β-1,3-1,6 glucan solution (β-1,3-1,6 glucan concentration 3%) 100 g was prepared.

（２−３）金属クラスター化合物とβ-１,３-１,６グルカンの複合体の製造方法
上記（２−１）で調製した酸化チタンの懸濁液９５０ｇと上記（２−２）β-１,３-１,６グルカン溶液３３ｇを用いて、酸化チタンの懸濁液をディスパー１５００ｒｐｍで攪拌しながら、β-１,３-１,６グルカン溶液に添加した後、室温、３０分間攪拌して、混合液９８３ｇ（β-１,３-１,６グルカン；０．１重量％、酸化チタン；３３．４重量％）を調製した。さらに、混合液をディスパーで攪拌しながら、中和剤として５０％クエン酸を８５ｇ使用してｐＨ７．２まで中和を実施し、金属クラスター化合物とβ-１,３-１,６グルカンの複合体が分散した水分散液１０６８ｇを得た。得られた複合体の水分散液の分散性を測定した。結果を表２に示す。 (2-3) Method for producing complex of metal cluster compound and β-1,3-1,6 glucan 950 g of titanium oxide suspension prepared in (2-1) above and (2-2) β- Using 33 g of the 1,3-1,6 glucan solution, the titanium oxide suspension was added to the β-1,3-1,6 glucan solution while stirring at 1500 rpm, and then stirred at room temperature for 30 minutes. Thus, 983 g (β-1,3-1,6 glucan; 0.1 wt%, titanium oxide; 33.4 wt%) was prepared. Furthermore, while stirring the mixed solution with a disper, neutralization was performed to pH 7.2 using 85 g of 50% citric acid as a neutralizing agent, and a composite of a metal cluster compound and β-1,3-1,6 glucan 1068 g of an aqueous dispersion in which the body was dispersed was obtained. The dispersibility of the obtained composite aqueous dispersion was measured. The results are shown in Table 2.

（実施例２）
混合液中のβ-１,３-１,６グルカン濃度を０.４重量％（使用量１４６ｇ）とした以外は、実施例１に記載の方法により、複合体の水分散液１１８１ｇを作成した。得られた複合体の水分散液の分散性を測定した。結果を表２に示す。 (Example 2)
Except for changing the β-1,3-1,6 glucan concentration in the mixture to 0.4 wt% (amount used: 146 g), 1181 g of the aqueous dispersion of the composite was prepared by the method described in Example 1. . The dispersibility of the obtained composite aqueous dispersion was measured. The results are shown in Table 2.

（比較例１）
中和剤としてクエン酸に変えて１０％塩酸８０ｇを使用した以外は、実施例１に記載の方法により、複合体の水分散液を作成した。得られた複合体の水分散液の分散性を測定した。結果を表２に示す。 (Comparative Example 1)
An aqueous dispersion of the composite was prepared by the method described in Example 1 except that 80 g of 10% hydrochloric acid was used instead of citric acid as the neutralizing agent. The dispersibility of the obtained composite aqueous dispersion was measured. The results are shown in Table 2.

（比較例２）
中和剤としてクエン酸に変えて１０％塩酸１７２ｇを使用した以外は、実施例２に記載の方法により、複合体の水分散液を作成した。得られた複合体の水分散液の分散性を測定した。結果を表２に示す。 (Comparative Example 2)
An aqueous dispersion of the composite was prepared by the method described in Example 2, except that 172 g of 10% hydrochloric acid was used instead of citric acid as the neutralizing agent. The dispersibility of the obtained composite aqueous dispersion was measured. The results are shown in Table 2.

（比較例３）
混合液中にβ-１,３-１,６グルカンを添加しなかった以外は実施例１と同様の方法により、複合体の水分散液を作成した。得られた複合体の水分散液の分散性を測定した。結果を表２に示す。 (Comparative Example 3)
An aqueous dispersion of the complex was prepared in the same manner as in Example 1 except that β-1,3-1,6 glucan was not added to the mixture. The dispersibility of the obtained composite aqueous dispersion was measured. The results are shown in Table 2.

（比較例４）
混合液中にβ-１,３-１,６グルカンを添加しなかった以外は比較例２と同様の方法により、複合体の水分散液を作成した。得られた複合体の水分散液の分散性を測定した。結果を表２に示す。 (Comparative Example 4)
An aqueous dispersion of the composite was prepared in the same manner as in Comparative Example 2 except that β-1,3-1,6 glucan was not added to the mixture. The dispersibility of the obtained composite aqueous dispersion was measured. The results are shown in Table 2.

評価方法
（分散性の評価）
分散性は、得られた水分散液を１２時間（室温）静置し、粒子の沈降状態を観察し、以下のように評価した。
○・・・沈降なし。
△・・・沈降が確認されるが振とうにより分散状態が復元する。
×・・・沈降が確認され、底部に粘土質の沈殿が発生する。 Evaluation method ( evaluation of dispersibility)
Dispersibility was evaluated as follows by allowing the obtained aqueous dispersion to stand for 12 hours (room temperature), observing the sedimentation state of the particles.
○: No sedimentation.
Δ: Sedimentation is confirmed, but the dispersion state is restored by shaking.
X: Sedimentation is confirmed, and clayey precipitation occurs at the bottom.

各実施例、及び比較例の評価結果を表２に示す。   Table 2 shows the evaluation results of each example and comparative example.

Figure 0005861582
Figure 0005861582

表２に示すように、カルボキシル基を有する酸（クエン酸）を用いて、β-１,３-１,６グルカンと金属クラスター化合物の混合液を中和することで、β-１,３-１,６グルカンの３重螺旋構造を復元させるにより、金属クラスター化合物が３重螺旋のβ-１,３-１,６グルカンで被覆され、金属クラスター化合物とβ-１,３-１,６グルカンの複合体が形成され、水溶液中でも良好な分散性を保持する。
（３）中和剤の検討 As shown in Table 2, by using a carboxyl group-containing acid (citric acid) to neutralize the mixed solution of β-1,3-1,6 glucan and metal cluster compound, β-1,3- By restoring the triple helix structure of 1,6 glucan, the metal cluster compound is coated with triple helix β-1,3-1,6 glucan, and the metal cluster compound and β-1,3-1,6 glucan And a good dispersibility is maintained even in an aqueous solution.
(3) Examination of neutralizing agent

（実施例３）
中和剤としてクエン酸に変えて５０％乳酸１０８ｇを使用した以外は、実施例１に記載の方法により、複合体の水分散液を作成した。得られた複合体の水分散液の分散性を測定した。結果を表３に示す。 (Example 3)
An aqueous dispersion of the composite was prepared by the method described in Example 1, except that 108 g of 50% lactic acid was used instead of citric acid as a neutralizing agent. The dispersibility of the obtained composite aqueous dispersion was measured. The results are shown in Table 3.

（実施例４）
中和剤としてクエン酸に変えて５％コハク酸６１０ｇを使用した以外は、実施例１に記載の方法により、複合体の水分散液を作成した。得られた複合体の水分散液の分散性を測定した。結果を表３に示す。 Example 4
An aqueous dispersion of the composite was prepared by the method described in Example 1 except that 610 g of 5% succinic acid was used instead of citric acid as a neutralizing agent. The dispersibility of the obtained composite aqueous dispersion was measured. The results are shown in Table 3.

（実施例５）
中和剤としてクエン酸に変えて５０％リンゴ酸９０ｇを使用した以外は、実施例１に記載の方法により、複合体の水分散液を作成した。得られた複合体の水分散液の分散性を測定した。結果を表３に示す。 (Example 5)
An aqueous dispersion of the composite was prepared by the method described in Example 1 except that 90 g of 50% malic acid was used instead of citric acid as the neutralizing agent. The dispersibility of the obtained composite aqueous dispersion was measured. The results are shown in Table 3.

（実施例６）
中和剤としてクエン酸に変えて１０％酒石酸４０３ｇを使用した以外は、実施例１に記載の方法により、複合体の水分散液を作成した。得られた複合体の水分散液の分散性を測定した。結果を表３に示す。 (Example 6)
An aqueous dispersion of the composite was prepared by the method described in Example 1, except that 403 g of 10% tartaric acid was used instead of citric acid as the neutralizing agent. The dispersibility of the obtained composite aqueous dispersion was measured. The results are shown in Table 3.

Figure 0005861582
表３に示すように、クエン酸以外のカルボキシル基を有する酸を用いた場合にも、クエン酸を用いた場合と同等に良好な分散性を保持する分散液が得られる。これはβ-１,３-１,６グルカンと金属クラスター化合物の混合液をこれらのカルボキシル基を有する酸で中和することで、β-１,３-１,６グルカンの３重螺旋構造を復元させるにより、金属クラスター化合物が３重螺旋のβ-１,３-１,６グルカンで被覆され、金属クラスター化合物とβ-１,３-１,６グルカンの複合体が形成されることによって、水中でも良好な分散性を保持する。
Figure 0005861582
 As shown in Table 3, even when an acid having a carboxyl group other than citric acid is used, a dispersion having good dispersibility equivalent to that when citric acid is used can be obtained. This is because the mixed solution of β-1,3-1,6 glucan and metal cluster compound is neutralized with acid having these carboxyl groups, so that the triple helical structure of β-1,3-1,6 glucan is formed. By restoring, the metal cluster compound is coated with triple helical β-1,3-1,6 glucan, and a complex of the metal cluster compound and β-1,3-1,6 glucan is formed, Maintains good dispersibility even in water.

本発明の疎水性クラスター化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体の製造方法は、有機溶剤を用いていないため、医薬及び化粧品として実用可能なものである。
Since the method for producing a complex of the hydrophobic cluster compound and β-1,3-1,6 glucan of the present invention does not use an organic solvent, it can be practically used as a medicine and cosmetics.

Claims (8)

疎水性クラスター化合物と、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６グルカンとをアルカリ性の溶液中で混合する工程と、混合した混合液にカルボキシル基を有する酸を添加して中和する工程とを含む、疎水性クラスター化合物とβ-１,３-１,６グルカンとの複合体の製造方法。   Mixing a hydrophobic cluster compound with β-1,3-1,6 glucan having a degree of branching of β-1,6 bonds with respect to β-1,3 bonds of 50 to 100% in an alkaline solution; A method for producing a complex of a hydrophobic cluster compound and a β-1,3-1,6 glucan, which comprises a step of neutralizing a mixed liquid mixture by adding an acid having a carboxyl group. カルボキシル基を有する酸が不飽和脂肪族カルボン酸、飽和脂肪族カルボン酸、芳香族カルボン酸、アルドン酸、及びウロン酸から成る群より選ばれる１種である請求項１に記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the acid having a carboxyl group is one selected from the group consisting of unsaturated aliphatic carboxylic acids, saturated aliphatic carboxylic acids, aromatic carboxylic acids, aldonic acids, and uronic acids. 疎水性クラスター化合物が、カルボラン、フラーレン、カーボンナノチューブ、又はカーボンナノコイルである請求項１又は２に記載の方法。   The method according to claim 1 or 2, wherein the hydrophobic cluster compound is carborane, fullerene, carbon nanotube, or carbon nanocoil. 疎水性クラスター化合物が、鉛、ニッケル、鉄、マグネシウム、コバルト、ロジウム、ルテニウム、白金、金、銀、銅、チタン、亜鉛、パラジウム、インジウム、ガリウム、ゲルマニウム、タングステン、アルミニウム、ジルコニウム、及びこれらの金属の酸化物からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１又は２に記載の方法。   Hydrophobic cluster compounds are lead, nickel, iron, magnesium, cobalt, rhodium, ruthenium, platinum, gold, silver, copper, titanium, zinc, palladium, indium, gallium, germanium, tungsten, aluminum, zirconium, and these metals The method according to claim 1, wherein the method is at least one selected from the group consisting of oxides. 疎水性クラスター化合物と、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６グルカンとをアルカリ性の溶液中で混合する工程と、混合した混合液にカルボキシル基を有する酸を添加して中和する工程とを含む、疎水性クラスター化合物への水溶性又は水分散性の付与方法。     Mixing a hydrophobic cluster compound with β-1,3-1,6 glucan having a degree of branching of β-1,6 bonds with respect to β-1,3 bonds of 50 to 100% in an alkaline solution; A method for imparting water-solubility or water-dispersibility to a hydrophobic cluster compound, comprising a step of neutralizing a mixed liquid mixture by adding an acid having a carboxyl group. カルボキシル基を有する酸が不飽和脂肪族カルボン酸、飽和脂肪族カルボン酸、芳香族カルボン酸、アルドン酸、及びウロン酸から成る群より選ばれる１種であるである請求項５に記載の方法。   6. The method according to claim 5, wherein the acid having a carboxyl group is one selected from the group consisting of unsaturated aliphatic carboxylic acids, saturated aliphatic carboxylic acids, aromatic carboxylic acids, aldonic acids, and uronic acids. 疎水性クラスター化合物が、カルボラン、フラーレン、カーボンナノチューブ、又はカーボンナノコイルである請求項５又は６に記載の方法。   The method according to claim 5 or 6, wherein the hydrophobic cluster compound is carborane, fullerene, carbon nanotube, or carbon nanocoil. 疎水性クラスター化合物が、鉛、ニッケル、鉄、マグネシウム、コバルト、ロジウム、ルテニウム、白金、金、銀、銅、チタン、亜鉛、パラジウム、インジウム、ガリウム、ゲルマニウム、タングステン、アルミニウム、ジルコニウム、及びこれらの金属の酸化物からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項５又は６に記載の方法。   Hydrophobic cluster compounds are lead, nickel, iron, magnesium, cobalt, rhodium, ruthenium, platinum, gold, silver, copper, titanium, zinc, palladium, indium, gallium, germanium, tungsten, aluminum, zirconium, and these metals The method according to claim 5 or 6, which is at least one selected from the group consisting of oxides of:
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