JP5080029B2 - β-glucan producing microorganism, culture method, product and food - Google Patents
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Description
本発明は、β−グルカンの産生に好適な微生物及びその産生に使用する培養ろ液の生成方法、β−グルカン含有水溶液精製方法、β−グルカン粉末製造方法及びβ−グルカン粉末・食品に関し、特に、オウレオバシジウム属（Aureobasidium）に属する微生物が産生する水溶性β−グルカン培養液から、食品用添加物や健康食品素材などとして有用な水溶性低粘度β−１，３−グルカン等を製造する製造方法に関する。 The present invention relates to a microorganism suitable for β-glucan production, a method for producing a culture filtrate used for the production, a β-glucan-containing aqueous solution purification method, a β-glucan powder production method, and a β-glucan powder / food. Manufactures water-soluble low-viscosity β-1,3-glucan, etc. useful as food additives and health food materials from water-soluble β-glucan culture solution produced by microorganisms belonging to the genus Aureobasidium It relates to a manufacturing method.
近年、キノコ由来のβ−１，３−グルカンがその抗腫瘍活性、免疫増強活性などにより注目を集めている。例えば、スエヒロタケの菌子体から得られるシゾフィラン、シイタケから抽出されるレンチナン、カワラタケから抽出される多糖などが知られており、医薬品として利用されている。また、ハナビラタケのβ−１，３−グルカンも免疫増強活性を有する健康食品として市販されている。一方、不完全菌であるオウレオバシジウム属に属する微生物も培養液中にβ−１，３−グルカンを産生する。 In recent years, mushroom-derived β-1,3-glucan has attracted attention due to its antitumor activity, immune enhancement activity, and the like. For example, Schizophyllan obtained from the mycelium of Suehirotake, lentinan extracted from Shiitake, polysaccharide extracted from Kawaratake, etc. are known and used as pharmaceuticals. Hanabiratake β-1,3-glucan is also commercially available as a health food having immunopotentiating activity. On the other hand, microorganisms belonging to the genus Aureobasidium, which is an incomplete bacterium, also produce β-1,3-glucan in the culture solution.
オウレオバシジウム属の微生物は蔗糖を炭素源として培養するとプルランを産生することで有名であるが、大阪市立工業研究所保存のAureobasidium sp. K−１は蔗糖で培養しても、プルランを生産せずに、主としてβ−１，３−グルカンを産生することが知られている（非特許文献１，２参照）。また、その生産性はアスコルビン酸の添加によって促進されることが明らかにされている（非特許文献７参照）。本菌は表ｌのような特性を持っておりオウレオバシジウム属プルランス（Aureobasidium pullulans）菌と同定された。 Microorganisms of the genus Aureobasidium are famous for producing pullulan when cultured with sucrose as a carbon source, but Aureobasidium sp. K-1, preserved by Osaka City Industrial Research Institute, produces pullulan even when cultured with sucrose. It is known that mainly β-1,3-glucan is produced (see Non-Patent Documents 1 and 2). Moreover, it has been clarified that the productivity is accelerated by the addition of ascorbic acid (see Non-Patent Document 7). This bacterium has characteristics as shown in Table 1 and was identified as an Aureobasidium pullulans bacterium.
通常、β−１，３−グルカンは水溶液中で３重ラセン構造をとっていると言われている(非特許文献３参照)。その３重ラセン構造体が水素結合により会合し、濃度が高くなると、その会合が安定になり、水に不溶性のゲルを形成する。同様に、Aureobasidium pullulans K−１菌のβ―グルカン含有培養液も、粘度が高いために、その培養液から菌体を分離し、グルカンを精製することが非常に困難であった。 Usually, β-1,3-glucan is said to have a triple helix structure in an aqueous solution (see Non-Patent Document 3). When the triple helix structure associates by hydrogen bonding and the concentration increases, the association becomes stable and forms a water-insoluble gel. Similarly, the β-glucan-containing culture solution of Aureobasidium pullulans K-1 bacteria has a high viscosity, so it was very difficult to separate the cells from the culture solution and purify the glucan.
Aureobasidium pullulans K−１菌の産生するβ―グルカン（分子量約２００万）より低分子のβ―グルカンを産生することができる菌を得るために、本願の発明者は、このK−１菌を変異させて、その低分子化の目的に合致した変異菌株として、ＧＭ−ＮＨ−１Ａ１菌、ＧＭ−ＮＨ−１Ａ２菌を生成することを試みた結果、それらを得ることに成功している。これらの変異菌株を培養することにより、低分子のβ―グルカンが得られるが、これらの変異菌でも、会合を起こして、溶解性が悪くなるなどの問題があり、その培養ろ液からβ―グルカンを精製するには、なおも困難を伴っていた。 In order to obtain a bacterium capable of producing β-glucan having a lower molecular weight than β-glucan (molecular weight of about 2 million) produced by Aureobasidium pullulans K-1, the inventor of the present application mutated this K-1 bacterium. As a result of trying to produce GM-NH-1A1 and GM-NH-1A2 as mutant strains that meet the purpose of reducing the molecular weight, the inventors succeeded in obtaining them. By culturing these mutant strains, low-molecular β-glucan can be obtained. However, these mutant bacteria also have problems such as association and poor solubility. Purifying glucan was still difficult.
β―グルカン含有培養液の低粘度化については、例えば特許文献１に開示されているように、その培養液にアルカリ溶液を加えて０．５Ｎにすることにより、会合しているβ―グルカンを解離させて低粘度化するβ―グルカンの精製・調製方法がある。しかし、この方法では、中和、脱塩の工程を必要とし、回収率が７０％と悪く、長期保存によって沈殿を生ずるという欠点がある。 For reducing the viscosity of a culture solution containing β-glucan, for example, as disclosed in Patent Document 1, an alkaline solution is added to the culture solution to make 0.5 N, so that the associated β-glucan is reduced. There is a method for purifying and preparing β-glucan which is dissociated to lower the viscosity. However, this method requires the steps of neutralization and desalting, the recovery rate is as low as 70%, and there is a disadvantage that precipitation is caused by long-term storage.
特許文献２及び非特許文献４に開示されているように、β−１，３−グルカン（シゾフィラン）を超音波処理することによって、β−１，３−結合が切断されて分子量が低下し、低粘度化することが知られている。なお、Aureobasidium pullulans菌の産生するβ―グルカンについては、０．１ＮのＮａＯＨ溶液中での超音波処理によって低分子化したという報告があるが、水溶液中では、その効果は認められていない（非特許文献５参照）。 As disclosed in Patent Document 2 and Non-Patent Document 4, by sonicating β-1,3-glucan (schizophyllan), β-1,3-bond is cleaved and the molecular weight is reduced. It is known to reduce viscosity. Although β-glucan produced by Aureobasidium pullulans has been reported to have a low molecular weight by sonication in 0.1N NaOH solution, its effect has not been observed in aqueous solution (non- (See Patent Document 5).
本発明の目的のひとつは、低粘度化した水溶性β―グルカンを産生する好適な、オウレオバシジウム属の微生物の提供であり、また本発明の別の目的は、微生物が産生する水溶性β―グルカンを含む培養液の低粘度化及び低粘度化した水溶性β―グルカンを高効率に、且つ簡便に調製可能な培養ろ液生成方法の提供である。更に、本発明の別の目的は、培養ろ液生成方法による培養ろ液から低粘度のβ−グルカン含有水溶液を精製する精製方法及びβ−グルカン粉末の製造方法の提供である。更に加えて、本発明の目的は、β−グルカン粉末の製造方法により製造されるβ−グルカン及びその粉末及び／又は含有食品の提供である。 One of the objects of the present invention is to provide a suitable microorganism of the genus Aureobasidium that produces a low-viscosity water-soluble β-glucan, and another object of the present invention is to provide a water-soluble substance produced by the microorganism. A low-viscosity culture medium containing β-glucan and a low-viscosity water-soluble β-glucan can be provided with high efficiency and a simple method for producing a culture filtrate. Furthermore, another object of the present invention is to provide a purification method for purifying a low-viscosity β-glucan-containing aqueous solution from the culture filtrate by the culture filtrate production method and a method for producing β-glucan powder. In addition, an object of the present invention is to provide β-glucan produced by a method for producing β-glucan powder and a powder and / or food containing the same.
本発明者は、上記課題に鑑み、Aureobasidium pullulans K−１菌を変異させ、低分子で会合度の低いβ―グルカンを産生する変異菌を取得することに成功した。また、その培養ろ液に含まれるβ―グルカンを超音波あるいはユニジェットスプレーで処理することにより、水溶性でかつ、さらに低粘度のβ―グルカン含有培養ろ液が得られることの知見を得るに至り、本発明を完成した。即ち、本発明の第１の形態は、オウレオバシジウム属プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）Ｋ−１株の変異菌株（独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２０８６９）からなる微生物である。 In view of the above problems, the present inventor succeeded in obtaining a mutant bacterium that produces a β-glucan having a low molecular weight and a low degree of association by mutating Aureobasidium pullulans K-1. In addition, to obtain knowledge that β-glucan contained in the culture filtrate can be treated with ultrasonic waves or unijet spray to obtain a water-soluble and low-viscosity β-glucan-containing culture filtrate. The present invention has been completed. That is, the first embodiment of the present invention is derived from a mutant strain of Aureobasidium pullulans K-1 strain (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, Deposit No .: FERM P-20869). It is a microorganism.
本発明の第２の形態は、オウレオバシジウム属プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）Ｋ−１株を原菌株としてＮＴＧ（Ｎ―methyl−Ｎ’―nitro−Ｎ―nitrosoguanidine）処理した変異菌株からなる微生物である。 A second aspect of the present invention is a microorganism comprising a mutant strain treated with NTG (N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine) using an Aureobasidium pullulans K-1 strain as an original strain. is there.
本発明の第３の形態は、前記第１又は第２の形態において、前記変異菌株はβ−グルカンを産生する微生物である。 According to a third aspect of the present invention, in the first or second aspect, the mutant strain is a microorganism that produces β-glucan.
本発明の第４の形態は、前記第１、第２又は第３の形態において産生されるグルカンにβ−１、３−グルカンを含む微生物である。 The fourth form of the present invention is a microorganism comprising β-1,3-glucan in the glucan produced in the first, second or third form.
本発明の第５の形態は、前記第１、第２又は第３の形態において産生されるグルカンにβ−１、３−１，６−グルカンを含む微生物である。 The fifth aspect of the present invention is a microorganism comprising β-1,3-1,6-glucan in the glucan produced in the first, second or third form.
本発明の第６の形態は、前記第１〜第５の形態に係る微生物を所定の培養条件下で好気培養してβ−グルカン含有培養ろ液を生成するβ−グルカン含有培養ろ液生成方法である。 According to a sixth aspect of the present invention, a β-glucan-containing culture filtrate is produced by aerobically culturing the microorganisms according to the first to fifth embodiments under predetermined culture conditions to produce a β-glucan-containing culture filtrate. Is the method.
本発明の第７の形態は、前記第６の形態に係る前記好気培養の培地に、アスコルビン酸及び／又はグルコン酸を添加してβ−グルカン含有培養ろ液を生成するβ−グルカン含有培養ろ液生成方法である。 The seventh aspect of the present invention is a β-glucan-containing culture in which ascorbic acid and / or gluconic acid is added to the aerobic culture medium according to the sixth aspect to produce a β-glucan-containing culture filtrate. It is a filtrate production | generation method.
本発明の第８の形態は、前記第７の形態において、アスコルビン酸を培地重量比０〜０．６％添加するβ−グルカン含有培養ろ液生成方法である。 An eighth aspect of the present invention is the β-glucan-containing culture filtrate production method of the seventh aspect, wherein ascorbic acid is added in a medium weight ratio of 0 to 0.6%.
本発明の第９の形態は、前記第７の形態において、グルコン酸を培地重量比０．０１〜０．３％添加するβ−グルカン含有培養ろ液生成方法である。 The ninth aspect of the present invention is the β-glucan-containing culture filtrate producing method according to the seventh aspect, wherein gluconic acid is added in a medium weight ratio of 0.01 to 0.3%.
本発明の第１０の形態は、前記第６〜第９のいずれかの形態において、前記培養条件が、１０〜４０℃の培養温度と、４〜７のｐＨと、１〜１０日の培養時間であるβ−グルカン含有培養ろ液生成方法である。 According to a tenth aspect of the present invention, in any of the sixth to ninth aspects, the culture conditions include a culture temperature of 10 to 40 ° C., a pH of 4 to 7 and a culture time of 1 to 10 days. This is a method for producing a β-glucan-containing culture filtrate.
本発明の第１１の形態は、前記第６〜第１０のいずれかの形態に係る生成方法により得られる前記β−グルカン含有培養ろ液から会合状態のβ−グルカンを解離させて水溶性低粘度のβ−グルカンを含有した培養ろ液を生成する水溶性低粘度β−グルカン含有培養ろ液生成方法である。 The eleventh aspect of the present invention is a water-soluble low viscosity by dissociating associated β-glucan from the β-glucan-containing culture filtrate obtained by the production method according to any of the sixth to tenth aspects. It is a water-soluble low-viscosity β-glucan-containing culture filtrate production method for producing a culture filtrate containing β-glucan.
本発明の第１２の形態は、前記第１１の形態において、前記β−グルカン含有培養ろ液を超音波処理により低粘度化する水溶性低粘度β−グルカン含有培養ろ液生成方法である。 A twelfth aspect of the present invention is the water-soluble low-viscosity β-glucan-containing culture filtrate production method according to the eleventh aspect, wherein the β-glucan-containing culture filtrate is reduced in viscosity by sonication.
本発明の第１３の形態は、前記第１２の形態において、前記超音波処理を、４０〜１２０Ｗの超音波により行う水溶性低粘度β−グルカン含有培養ろ液生成方法である。 A thirteenth aspect of the present invention is the water-soluble low-viscosity β-glucan-containing culture filtrate producing method according to the twelfth aspect, wherein the ultrasonic treatment is performed by ultrasonic waves of 40 to 120 W.
本発明の第１４の形態は、前記第１１の形態において、前記β−グルカン含有培養ろ液をジェットスプレー処理により低粘度化する水溶性低粘度β−グルカン含有培養ろ液生成方法である。 A fourteenth aspect of the present invention is the water-soluble low-viscosity β-glucan-containing culture filtrate production method according to the eleventh aspect, wherein the β-glucan-containing culture filtrate is reduced in viscosity by jet spray treatment.
本発明の第１５の形態は、前記第１４の形態において、前記ジェットスプレー処理を、流圧が０．１〜１ＭＰａ（メガパスカル）、噴出流量が５０〜２００ｍｌ／分の噴出条件で行う水溶性低粘度β−グルカン含有培養ろ液生成方法である。 The fifteenth aspect of the present invention is the water-soluble composition according to the fourteenth aspect, wherein the jet spray treatment is carried out under jetting conditions where the flow pressure is 0.1 to 1 MPa (megapascal) and the jet flow rate is 50 to 200 ml / min. This is a method for producing a low-viscosity β-glucan-containing culture filtrate.
本発明の第１６の形態は、前記第１１〜第１５のいずれかの形態に係る生成方法により得られる水溶性低粘度β−グルカン含有培養ろ液にアルコール類を添加してβ−グルカンを沈殿させて、その沈殿物を水に溶解させて低粘度β−グルカン含有水溶液を精製する低粘度β−グルカン含有水溶液精製方法である。 According to a sixteenth aspect of the present invention, an alcohol is added to a water-soluble low-viscosity β-glucan-containing culture filtrate obtained by the production method according to any one of the first to fifteenth aspects to precipitate β-glucan. Then, the precipitate is dissolved in water to purify the low viscosity β-glucan-containing aqueous solution.
本発明の第１７の形態は、前記第１６の形態において、前記低粘度β−グルカン含有水溶液に、酸性又はアルカリ性の溶媒を添加してｐＨ値が調整された低粘度β−グルカン含有水溶液を精製する低粘度β−グルカン含有水溶液精製方法である。 According to a seventeenth aspect of the present invention, in the sixteenth aspect, a low-viscosity β-glucan-containing aqueous solution whose pH value is adjusted by adding an acidic or alkaline solvent to the low-viscosity β-glucan-containing aqueous solution is purified. This is a method for purifying an aqueous solution containing low viscosity β-glucan.
本発明の第１８の形態は、前記第１６又は第１７の形態に係る精製方法により得られる前記低粘度β−グルカン含有水溶液を乾燥処理して水溶性低粘度β−グルカン粉末を製造する水溶性低粘度β−グルカン粉末製造方法である。 According to an eighteenth aspect of the present invention, a water-soluble low-viscosity β-glucan powder is produced by drying the low-viscosity β-glucan-containing aqueous solution obtained by the purification method according to the sixteenth or seventeenth aspect. This is a method for producing a low viscosity β-glucan powder.
本発明の第１９の形態は、前記第１１〜第１５のいずれかの形態に係る生成方法により得られる前記水溶性低粘度β−グルカン含有培養ろ液にアルコール類を添加してβ−グルカンを沈殿させて、その沈殿物を乾燥処理して水溶性低粘度β−グルカン粉末を製造する水溶性低粘度β−グルカン粉末製造方法である。 According to a nineteenth aspect of the present invention, an alcohol is added to the water-soluble low-viscosity β-glucan-containing culture filtrate obtained by the production method according to any one of the eleventh to fifteenth aspects, thereby adding β-glucan. It is a water-soluble low-viscosity β-glucan powder production method in which precipitation is performed and the precipitate is dried to produce a water-soluble low-viscosity β-glucan powder.
本発明の第２０の形態は、前記第１〜第５のいずれかの形態に係る微生物の変異菌株から産生されたβ−グルカンである。 A twentieth aspect of the present invention is β-glucan produced from a mutant strain of a microorganism according to any one of the first to fifth aspects.
本発明の第２１の形態は、前記第１８又は第１９の形態に係る製造方法により２次加工された水溶性低粘度β−グルカン粉末である。 A twenty-first aspect of the present invention is a water-soluble low-viscosity β-glucan powder that has been secondarily processed by the production method according to the eighteenth or nineteenth aspect.
本発明の第２２の形態は、前記第２０の形態に係る前記水溶性低粘度β−グルカン粉末を含む低粘度β−グルカン含有食品である。 A twenty-second form of the present invention is a low-viscosity β-glucan-containing food containing the water-soluble low-viscosity β-glucan powder according to the twentieth aspect.
本発明の第２３の形態は、前記第１６又は第１７の形態に係る精製方法により得られる前記低粘度β−グルカン含有水溶液を含む低粘度β−グルカン含有食品である。 A twenty-third aspect of the present invention is a low-viscosity β-glucan-containing food containing the low-viscosity β-glucan-containing aqueous solution obtained by the purification method according to the sixteenth or seventeenth aspect.
本発明の第１の形態によれば、オウレオバシジウム属プルランスＫ−１株の変異菌株を培養することにより、低粘度性を備え、微粒加工や粉体加工等の二次加工を簡便に行うことのできる水溶性β―グルカンを産生することができる。 According to the first embodiment of the present invention, by culturing a mutant strain of the genus Aureobasidium pullulans K-1 strain, it has low viscosity and can easily perform secondary processing such as fine particle processing and powder processing. Water-soluble β-glucan that can be produced can be produced.
本発明の第２の形態によれば、オウレオバシジウム属プルランスＫ−１株を原菌株としてＮＴＧ処理した変異菌株を用いて、低粘度性を備え、微粒加工等の二次加工を簡便に行うことのできる水溶性β―グルカンを産生することができる。 According to the second aspect of the present invention, using a mutant strain that has been treated with NTG as the original strain of the genus Pleurans K-1 strain of the genus Aureobasidium, it has low viscosity and can easily perform secondary processing such as fine grain processing. Water-soluble β-glucan that can be produced can be produced.
本発明の第３の形態によれば、前記変異菌株を培養することにより、低粘度性を備え、微粒加工や粉体加工等の二次加工を簡便に行うことのできる水溶性β−グルカンを産生することができる。 According to the third aspect of the present invention, water-soluble β-glucan having low viscosity and capable of easily performing secondary processing such as fine particle processing and powder processing is obtained by culturing the mutant strain. Can be produced.
本発明の第４又は第５の形態によれば、乾燥粉末化加工が容易食品や飲食物の添加剤に利用可能なβ−１、３−グルカン、β−１，３−１，６−グルカンを得ることができる。 According to the fourth or fifth aspect of the present invention, β-1,3-glucan, β-1,3-1,6-glucan that can be easily used as an additive for foods and foods and beverages can be easily processed into dry powder. Can be obtained.
本発明の第６の形態によれば、前記培養条件下での前記好気培養により水溶性低粘度β―グルカン含有培養ろ液を調製することができる。 According to the sixth aspect of the present invention, a water-soluble low-viscosity β-glucan-containing culture filtrate can be prepared by the aerobic culture under the culture conditions.
本発明の第７の形態によれば、前記好気培養の培地に、アスコルビン酸及び／又はグルコン酸を添加することにより、低粘度の水溶性β−１、３−グルカンを生産することのできるβ−グルカン含有培養ろ液を生成することができる。 According to the seventh aspect of the present invention, low-viscosity water-soluble β-1,3-glucan can be produced by adding ascorbic acid and / or gluconic acid to the aerobic culture medium. A β-glucan-containing culture filtrate can be produced.
本発明の第８の形態によれば、前記培地にアスコルビン酸を培地重量比０〜０．６％添加することにより、低粘度の水溶性β−１、３−グルカンを産生することのできるβ−グルカン含有培養ろ液の生成が可能となる。アスコルビン酸の添加は、好ましくは０．０５％から０．１５％である。 According to the eighth aspect of the present invention, β that can produce low-viscosity water-soluble β-1,3-glucan by adding ascorbic acid to the medium at a medium weight ratio of 0 to 0.6%. -Generation of a glucan-containing culture filtrate is possible. The addition of ascorbic acid is preferably 0.05% to 0.15%.
本発明の第９の形態によれば、前記培地にグルコン酸を培地重量比０．０１〜０．３％添加することにより、低粘度の水溶性β−１、３−グルカンを産生することのできるβ−グルカン含有培養ろ液の生成が可能となる。グルコン酸の添加は、好ましくは０．０３％から０．１％である。 According to the ninth aspect of the present invention, low-viscosity water-soluble β-1,3-glucan can be produced by adding gluconic acid to the medium at a medium weight ratio of 0.01 to 0.3%. A β-glucan-containing culture filtrate can be produced. The addition of gluconic acid is preferably 0.03% to 0.1%.
本発明の第１０の形態によれば、１０〜４０℃の培養温度、４〜７のｐＨ、及び１〜１０日の培養時間からなる培養条件により、低粘度の水溶性β−１、３−グルカンを生産することのできるβ−グルカン含有培養ろ液の生成が可能となる。オウレオバシジウム属の微生物を好気的に培養するための条件として、温度は好ましくは２０〜３０℃であり、ｐＨは好ましくは４．５〜５．５である。培養時間は、２〜７日間が好ましく、3〜４日間培養すれば水溶性β―グルカンを生産することができる。 According to the tenth aspect of the present invention, the low viscosity water-soluble β-1, 3- It is possible to produce a β-glucan-containing culture filtrate that can produce glucan. As conditions for aerobic cultivation of microorganisms belonging to the genus Aureobasidium, the temperature is preferably 20 to 30 ° C., and the pH is preferably 4.5 to 5.5. The culture time is preferably 2 to 7 days, and if it is cultured for 3 to 4 days, water-soluble β-glucan can be produced.
本発明の第１１の形態によれば、前記生成方法により得られる前記β−グルカン含有培養ろ液から会合状態のβ−グルカンを解離させて水溶性低粘度のβ−グルカンを含有した培養ろ液を生成するので、その水溶性低粘度β−グルカン含有培養ろ液を用いて高効率にβ−グルカンを生成することができる。 According to an eleventh aspect of the present invention, a culture filtrate containing β-glucan having a water-soluble low viscosity by dissociating associated β-glucan from the β-glucan-containing culture filtrate obtained by the production method. Therefore, β-glucan can be generated with high efficiency using the water-soluble low-viscosity β-glucan-containing culture filtrate.
本発明の第１２の形態によれば、前記β−グルカン含有培養ろ液を超音波処理により低粘度化するので、精製工程において菌体等の固形物の除去が容易になって、培養ろ液からβ―グルカンを簡便に精製できる。従って、培養ろ液からβ―グルカンを乾燥して高純度の粉末処理加工がし易く、健康食品素材や健康食品飲料素材等に好適なβ―グルカンを得ることが可能となる。 According to the twelfth aspect of the present invention, since the β-glucan-containing culture filtrate is reduced in viscosity by sonication, it is easy to remove solids such as cells in the purification step, and the culture filtrate Β-glucan can be easily purified from Therefore, β-glucan is easily dried from the culture filtrate and subjected to high-purity powder processing, and β-glucan suitable for health food materials, health food beverage materials, and the like can be obtained.
本発明の第１３の形態によれば、前記超音波処理を、４０〜１２０Ｗの超音波により行うので、水溶性低粘度β−グルカン含有培養ろ液を確実に生成することができる。前記超音波処理には、好ましくは、６０〜８０Ｗの超音波を使用する。 According to the thirteenth aspect of the present invention, since the ultrasonic treatment is performed with ultrasonic waves of 40 to 120 W, a water-soluble low-viscosity β-glucan-containing culture filtrate can be reliably generated. Preferably, 60 to 80 W ultrasonic waves are used for the ultrasonic treatment.
本発明の第１４の形態によれば、前記β−グルカン含有培養ろ液をジェットスプレー処理により低粘度化するので、培養ろ液からβ―グルカンを簡便に精製でき、且つそれを乾燥して粉末処理加工し易く、健康食品素材や健康食品飲料素材等に好適なβ―グルカンを得ることが可能となる。 According to the fourteenth aspect of the present invention, since the β-glucan-containing culture filtrate is reduced in viscosity by jet spray treatment, β-glucan can be easily purified from the culture filtrate and dried to obtain a powder. It is easy to process and it is possible to obtain β-glucan suitable for health food materials and health food beverage materials.
本発明の第１５の形態によれば、前記ジェットスプレー処理を、流圧が０．１〜１ＭＰａ（メガパスカル）、噴出流量が５０〜２００ｍｌ／分の噴出条件で行うので、水溶性低粘度β−グルカン含有培養ろ液を確実に生成することができる。 According to the fifteenth aspect of the present invention, the jet spray treatment is carried out under jetting conditions where the flow pressure is 0.1 to 1 MPa (megapascal) and the jet flow rate is 50 to 200 ml / min. -A glucan-containing culture filtrate can be reliably produced.
本発明の第１６の形態によれば、前記生成方法により得られる水溶性低粘度β−グルカン含有培養ろ液にエタノール等のアルコール類を添加してβ−グルカンを沈殿させて、その沈殿物を水に溶解させて低粘度β−グルカン含有水溶液を精製するので、その沈殿物を乾燥させ破砕して微粒加工等の容易化に寄与する低粘度β−グルカン含有水溶液を得ることができる。 According to the sixteenth aspect of the present invention, alcohol such as ethanol is added to the culture filtrate containing water-soluble low-viscosity β-glucan obtained by the production method to precipitate β-glucan. Since the low-viscosity β-glucan-containing aqueous solution is purified by dissolving in water, the precipitate can be dried and crushed to obtain a low-viscosity β-glucan-containing aqueous solution that contributes to facilitation of fine particle processing and the like.
本発明の第１７の形態によれば、前記低粘度β−グルカン含有水溶液に、酸性又はアルカリ性の溶媒を添加してｐＨ値が調整された低粘度β−グルカン含有水溶液を精製するので、効果的な培養ｐＨに調整して、低粘度β−グルカン含有水溶液を調製することができる。 According to the seventeenth aspect of the present invention, the low-viscosity β-glucan-containing aqueous solution whose pH value is adjusted by adding an acidic or alkaline solvent to the low-viscosity β-glucan-containing aqueous solution is effective. It is possible to prepare a low viscosity β-glucan-containing aqueous solution by adjusting to a suitable culture pH.
本発明の第１８の形態によれば、前記低粘度β−グルカン含有水溶液を乾燥処理して水溶性低粘度β−グルカン粉末を製造するので、微粒加工や粉砕加工されたβ−グルカン粉末を簡易に製造することができる。 According to the eighteenth aspect of the present invention, the low-viscosity β-glucan-containing aqueous solution is dried to produce a water-soluble low-viscosity β-glucan powder. Can be manufactured.
本発明の第１９の形態によれば、前記水溶性低粘度β−グルカン含有培養ろ液にアルコール類を添加してβ−グルカンを沈殿させて、その沈殿物を乾燥処理して水溶性低粘度β−グルカン粉末を製造するので、微粒加工や粉砕加工されたβ−グルカン粉末を簡易に製造することができる。 According to the nineteenth aspect of the present invention, alcohol is added to the water-soluble low-viscosity β-glucan-containing culture filtrate to precipitate β-glucan, and the precipitate is dried to obtain a water-soluble low viscosity. Since β-glucan powder is produced, it is possible to easily produce β-glucan powder that has been finely processed or pulverized.
本発明の第２０の形態によれば、前記第１〜第５のいずれかの形態に係る微生物の変異菌株から産生されたβ−グルカンにより、低粘度性を備え、微粒加工や粉体加工等の二次加工を簡便に行うことのできる水溶性β―グルカンを得ることができる。 According to the twentieth aspect of the present invention, β-glucan produced from the mutant strain of the microorganism according to any one of the first to fifth aspects has low viscosity, and is used for fine particle processing, powder processing, etc. Thus, a water-soluble β-glucan that can be easily subjected to the secondary processing can be obtained.
本発明の第２１の形態によれば、前記製造方法により２次加工された水溶性低粘度β−グルカン粉末であるので、簡易に微粒加工や粉砕加工して、β−グルカン粉末の低コスト化に寄与する。 According to the twenty-first aspect of the present invention, since it is a water-soluble low-viscosity β-glucan powder that has been subjected to secondary processing by the production method, it is possible to easily reduce the cost of β-glucan powder by subjecting it to fine particle processing or grinding. Contribute to.
本発明の第２２の形態によれば、前記水溶性低粘度β−グルカン粉末を含むため、簡易に微粒加工や粉砕加工したβ−グルカン粉末を含有させて、β−グルカン含有食品の低コスト化を実現することができる。 According to the twenty-second aspect of the present invention, since the water-soluble low-viscosity β-glucan powder is contained, the β-glucan powder that has been easily processed into fine particles or pulverized can be contained to reduce the cost of the β-glucan-containing food. Can be realized.
本発明の第２３の形態によれば、簡易に精製した前記低粘度β−グルカン含有水溶液を含むため、β−グルカン水溶液含有食品の低コスト化を実現することができる。 According to the twenty-third aspect of the present invention, since the low-viscosity β-glucan-containing aqueous solution that has been easily purified is included, the cost reduction of the β-glucan aqueous solution-containing food can be realized.
本発明の微生物は、オウレオバシジウム属プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）Ｋ−１株の変異菌株（寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２０８６９）からなる。特には、オウレオバシジウム プルランスＫ−１株を原菌株としてＮＴＧ処理することによって得られた変異菌株２５−１ｂ菌を使用することができる。このＮＴＧ処理はＮＴＧ（５０μｇ/ｍｌ）で２７℃、３０分処理することにより行った。この変異菌株は会合の少ない、低分子量のβ−グルカンを生産し、低粘度の培養ろ液を得るためには、特に好ましい菌である。なお、原菌株であるオウレオバシジウム プルランスＫ−１株は高分子量のβ−グルカン（分子量約２００万）を産生する。そのβ−グルカンの構造はβ−１，３−結合したグルコース４個あたり、３個のグルコースが１，６−結合したグルコースの側鎖を有し、その側鎖のグルコースにスルホ酢酸基を０．１−０．５％結合している（非特許文献１参照）。そのβ―グルカンを含む培養ろ液は非常に粘度が高い性質を有する。なお、変異菌株の作製にはＮＴＧ以外の変異原物質を用いてもよく、また放射線照射を行ってもよい。 The microorganism of the present invention comprises a mutant strain of Aureobasidium pullulans K-1 strain (deposit number FERM P-20869). In particular, the mutant strain 25-1b obtained by NTG treatment using the Aureobasidium pullulans K-1 strain as the original strain can be used. This NTG treatment was performed by treating with NTG (50 μg / ml) at 27 ° C. for 30 minutes. This mutant strain is a particularly preferred bacterium for producing a low molecular weight β-glucan with little association and obtaining a low viscosity culture filtrate. The original strain Aureobasidium pullulans K-1 strain produces high molecular weight β-glucan (molecular weight of about 2 million). The structure of the β-glucan has a glucose side chain in which 3 glucoses are 1,6-linked per 4 β-1,3-linked glucoses, and a sulfoacetic acid group is 0 in the glucose of the side chain. .1-0.5% bonding (see Non-Patent Document 1). The culture filtrate containing β-glucan has very high viscosity. It should be noted that a mutagen other than NTG may be used for the production of a mutant strain, or irradiation may be performed.
まず、本変異菌株２５−１ｂ菌の粘度性質を明らかにするために、前述のＧＭ−ＮＨ−１Ａ１菌との特性比較を行った。
本変異菌株２５−１ｂ菌による基本培地の組成を下記の表２に示す。
First, in order to clarify the viscosity property of this mutant strain 25-1b, a characteristic comparison with the aforementioned GM-NH-1A1 was performed.
The composition of the basic medium by the mutant strain 25-1b is shown in Table 2 below.
β−グルカンの産生は、下記の表３に示すように、アスコルビン酸ＡＳＡを加えると促進され、そこへグルコン酸ＧＡを添加すると、さらに促進される。ＧＭ−ＮＨ−１Ａ１菌によるβ―グルカンの産生も同様培地により促進されることが分かっている。また。アスコルビン酸は原株、オウレオバシジウム プルランス Ｋ１菌によるβ―グルカンの生産を促進することは、Ｎ．Ｈａｍａｄａ，Ｋ．Ｄｅｇｕｃｈｉ ｅｔ．ａｌ．,Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.６４（９），１８０１−１８０６（２０００）又はＮ．Ｈａｍａｄａ，Ｙ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.５７，１３４８−１３４９（１９９３）の文献に既に報告されている。 As shown in Table 3 below, the production of β-glucan is promoted by adding ascorbic acid ASA, and is further promoted by adding gluconic acid GA thereto. It has been found that the production of β-glucan by GM-NH-1A1 bacteria is also promoted by the medium. Also. Ascorbic acid promotes the production of β-glucan by the original strain, Aureobasidium pullulans K1. Hamada, K .; Deguchi et. al. Biotechnol. Biochem. 64 (9), 1801-1806 (2000) or N., Biotechnol. Hamada, Y .; It has already been reported in the literature of Watanabe, Biotechnol. Biochem. 57 , 1348-1349 (1993).
基本培地（表２参照）にアスコルビン酸（０．１％）とグルコン酸（０．０３％）を添加した液体培地の組成を表４に示す。 Table 4 shows the composition of the liquid medium in which ascorbic acid (0.1%) and gluconic acid (0.03%) were added to the basic medium (see Table 2).
この液体培地７５ｍｌを坂口フラスコに入れ、１２１℃、１５分間加熱殺菌した後、変異菌株２５−１ｂ菌とＧＭ−ＮＨ−１Ａ１菌をそれぞれ植菌し、２７℃で、９６時間振とう培養して、これらから得られるβ―グルカンの生産性と性状を比較した。 75 ml of this liquid medium was placed in a Sakaguchi flask and sterilized by heating at 121 ° C. for 15 minutes, and then the mutant strains 25-1b and GM-NH-1A1 were inoculated, and cultured with shaking at 27 ° C. for 96 hours. The productivity and properties of β-glucan obtained from these were compared.
表３に示すように、変異菌株２５−１ｂ菌とＧＭ−ＮＨ−１Ａ１菌によるグルカンの生産性は近似しているが、β―グルカンを含んだ培養ろ液の粘度は変異菌株２５−１ｂ菌の方がＧＭ−ＮＨ−１Ａ１菌よりも低い。０．１％ＡＳＡ添加の場合、変異菌株２５−１ｂ菌とＧＭ−ＮＨ−１Ａ１菌の相対粘度がそれぞれ、１．２、１．８である。更に、０．０３％ＧＡを添加すると、変異菌株２５−１ｂ菌とＧＭ−ＮＨ−１Ａ１菌の相対粘度がそれぞれ、１．９、３．４であり、ＡＳＡ添加のみの場合より、粘度の差異は一層大きくなる。ＧＭ−ＮＨ−１Ａ１菌の産生するグルカンの分子量は約８０万であるのに対して、変異菌株２５−１ｂ菌の産生するグルカンの分子量は約６０万である。この分子量の差が、変異菌株２５−１ｂ菌の培養ろ液の粘度がＧＭ−ＮＨ−１Ａ１菌より低い要因の一つである。 As shown in Table 3, the productivity of glucan by the mutant strains 25-1b and GM-NH-1A1 is similar, but the viscosity of the culture filtrate containing β-glucan is the mutant strain 25-1b. Is lower than GM-NH-1A1. When 0.1% ASA is added, the relative viscosities of the mutant strains 25-1b and GM-NH-1A1 are 1.2 and 1.8, respectively. Furthermore, when 0.03% GA is added, the relative viscosities of the mutant strains 25-1b and GM-NH-1A1 are 1.9 and 3.4, respectively. Will be even bigger. The molecular weight of glucan produced by GM-NH-1A1 is about 800,000, whereas the molecular weight of glucan produced by mutant strain 25-1b is about 600,000. This difference in molecular weight is one of the factors that cause the viscosity of the culture filtrate of mutant strain 25-1b to be lower than that of GM-NH-1A1.
次に、変異菌株２５−１ｂ菌とＧＭ−ＮＨ−１Ａ１菌のβ―グルカンをトヨパールＨＷ６５(東ソー株式会社製ゲルクロマトグラフィー用充填剤)によりゲル濾過を行い、それぞれの会合度合いを比較した。図１は、ゲル濾過における各フラクションの糖含量をフェノール硫酸法で測定した時の吸光度を示す。図１に示すように、ＧＭ−ＮＨ−１Ａ１菌のβ−グルカンはピークからブロードに溶出される。一方、変異菌株２５−１ｂ菌によって産生されたβ−グルカンの溶出も、ピークからブロードになるが、その溶出はＧＭ−ＮＨ−１Ａ１菌の場合に比べて早く終わることが分かる。これらブロードの部分はグルカンの分子が会合を起こし、溶解度が低いために流出が悪くなり、生じたと考えられる。変異菌株２５−１ｂ菌におけるゲル濾過パターンのブロード部分はＧＭ−ＮＨ−１Ａ１菌におけるブロード部分よりも少ない。これは変異菌株２５−１ｂ菌によって産生されたβ―グルカンの会合が少ないためと考えられる。 Next, β-glucan of mutant strains 25-1b and GM-NH-1A1 were subjected to gel filtration with Toyopearl HW65 (a filler for gel chromatography manufactured by Tosoh Corporation), and the degree of association was compared. FIG. 1 shows the absorbance when the sugar content of each fraction in gel filtration is measured by the phenol-sulfuric acid method. As shown in FIG. 1, GM-NH-1A1 β-glucan is eluted broadly from the peak. On the other hand, the elution of β-glucan produced by mutant strain 25-1b also broadens from the peak, but it can be seen that the elution ends earlier than in the case of GM-NH-1A1. These broad portions are thought to have occurred because the glucan molecules were associated with each other and the solubility was low, resulting in poor outflow. The broad part of the gel filtration pattern in mutant strain 25-1b is less than the broad part in GM-NH-1A1. This is thought to be because there is little association of β-glucan produced by the mutant strain 25-1b.
オウレオバシジウム属に属する微生物の変異菌株２５−１ｂ菌株を培養して、低粘度の水溶性β−１，３−グルカンを生産する方法を以下に述べる。
表４に示した培地はβ―グルカンの生産性がよく、水溶性β―１，３−グルカンの生産用培地に好適である。なお、この培地組成の濃度は表４に示されるものに限定されるものではなく、殊に、アスコルビン酸は０〜０．６％、好ましくは０．０５％〜０．１５％である。グルコン酸は０．０１〜０．３％、好ましくは０．０３〜０．１％である。また、この培地に酵母エキス等の有機栄養源、銅、コバルト等の微量金属やビタミン類を添加するのも有効である。
A method for producing a low-viscosity, water-soluble β-1,3-glucan by culturing a mutant strain 25-1b of a microorganism belonging to the genus Aureobasidium will be described below.
The medium shown in Table 4 has good β-glucan productivity and is suitable as a medium for producing water-soluble β-1,3-glucan. In addition, the density | concentration of this culture medium composition is not limited to what is shown in Table 4, and especially ascorbic acid is 0 to 0.6%, Preferably it is 0.05% to 0.15%. Gluconic acid is 0.01 to 0.3%, preferably 0.03 to 0.1%. It is also effective to add organic nutrient sources such as yeast extract, trace metals such as copper and cobalt, and vitamins to this medium.
オウレオバシジウム属の微生物を好気的に培養するための好気培養条件は、温度は１０〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃であり、ｐＨは４〜７、好ましくは4.5〜5.5である。効果的な培養ｐＨにするためにはアルカリ又は酸の溶媒を添加して培養液のｐＨを制御することが有効である。培養液の消泡のために、消泡剤を添加してもよい。培養時間は通常2〜７日間が好ましく、3〜４日間培養すれば水溶性β−グルカンを生産することができる。 The aerobic culture conditions for aerobically culturing microorganisms of the genus Aureobasidium are a temperature of 10 to 40 ° C., preferably 20 to 30 ° C., and a pH of 4 to 7, preferably 4.5 to 5.5. is there. In order to achieve an effective culture pH, it is effective to control the pH of the culture solution by adding an alkali or acid solvent. An antifoaming agent may be added for defoaming the culture solution. The culture time is usually preferably 2 to 7 days, and water-soluble β-glucan can be produced by culturing for 3 to 4 days.
上記培養条件によりオウレオバシジウム属の微生物を４〜６日間、通気攪拌培養（１．５Ｌ／ｍｉｎ、３００ｒｐｍ）を行うと、培養液にβ−グルカンが０．１〜１．５％生産（ｗ／ｖ）される。その培養液の粘度は、食品物性レオメータ（ユービーエム社製：Ｒｈｅｏｓｏｌ−Ｇ５０００ＮＴＷＤ）の測定により、２５℃で５０ｃｐ〜１０００ｃｐである。これは、オウレオバシジウム属の微生物を培養して得られる従来のβ―グルカンを含む培養ろ液の粘度よりも低い粘度である。従って、その培養液から遠心分離機等を用いて、菌体を簡便に除去でき、菌体を除いたβ−グルカンを含む培養ろ液を得ることができる。 When a microorganism belonging to the genus Aureobasidium is subjected to aeration and agitation culture (1.5 L / min, 300 rpm) for 4 to 6 days under the above culture conditions, 0.1-1.5% of β-glucan is produced in the culture solution ( w / v). The culture fluid has a viscosity of 50 cp to 1000 cp at 25 ° C. as measured by a food physical property rheometer (UBM: Rheosol-G5000NTWD). This is a viscosity lower than the viscosity of a conventional culture filtrate containing β-glucan obtained by culturing microorganisms of the genus Aureobasidium. Therefore, the cells can be easily removed from the culture solution using a centrifuge, and a culture filtrate containing β-glucan excluding the cells can be obtained.
上記のようにして得られる培養ろ液を超音波処理（培養ろ液５０ｍｌをビーカーに入れて、８０Ｗで１分間超音波処理する。）あるいはユニジェットスプレー処理（培養ろ液を加圧タンクに５００ｍｌ入れて、コンプレッサーで０．５Ｐａの圧力を掛けてノズルから噴き出させる。ノズルの流量は１分間に水８０ｍｌ噴き出させる。）することによって、その粘度を低下させることができる。 The culture filtrate obtained as described above is sonicated (50 ml of culture filtrate is placed in a beaker and sonicated at 80 W for 1 minute) or unijet spray treatment (500 ml of culture filtrate in a pressurized tank). The viscosity of the nozzle can be lowered by applying a pressure of 0.5 Pa with a compressor and ejecting from the nozzle by spraying 80 ml of water per minute.
本実施形態においては、オウレオバシジウム属プルランスＫ−１株の変異菌株（寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２０８６９）からなる微生物を培養することにより、β―グルカンを含む低粘度培養ろ液を簡便に得ることができる。従って、アルカリ処理で粘度低下させる時に必要な中和処理、脱塩のような後処理を必要とせず、ロスが少ない低粘度化処理を簡便に行える利点がある。上記の超音波処理やユニジェットスプレー処理により低粘度化させた培養ろ液は加熱滅菌処理してβ−グルカン溶液のまま、あるいは６６％のエタノールで培養ろ液からβ−グルカンを沈殿させて効率的に精製できる。その沈殿物を乾燥して粉末にしたものは、水に容易に溶ける水溶性を備え、その水溶液は無色透明である。更に、β−グルカン粉末は健康食品素材、特に健康食品飲料素材として利用することができる。 In this embodiment, a low-viscosity culture filtrate containing β-glucan is easily obtained by culturing a microorganism consisting of a mutant strain of the genus Aureobasidium pullulans K-1 (deposit number FERM P-20869). be able to. Therefore, there is an advantage that a neutralization treatment and a post-treatment such as desalting required when the viscosity is reduced by an alkali treatment are not required, and a viscosity reduction treatment with little loss can be easily performed. The culture filtrate whose viscosity has been reduced by the above ultrasonic treatment or unijet spray treatment is heat-sterilized and remains in a β-glucan solution, or β-glucan is precipitated from the culture filtrate with 66% ethanol for efficiency. Can be purified automatically. A powder obtained by drying the precipitate has water solubility that is easily dissolved in water, and the aqueous solution is colorless and transparent. Furthermore, β-glucan powder can be used as a health food material, particularly as a health food beverage material.
次に、本発明に係るβ−グルカン培養ろ液を用いて行った粘度低下実験の実施例を説明する。 Next, examples of viscosity reduction experiments performed using the β-glucan culture filtrate according to the present invention will be described.
＜実施例１＞
実施例１におけるβ−グルカンの生産は次のように行った。前掲の表２に示す組成からなる液体培地７５ｍｌを坂口フラスコに入れ、１２１℃、 １５分間、加圧蒸気滅菌を行った後、２５-1b菌をスラントより無菌的に１白菌耳植菌し、２７Ｃ、１２０rpm, ７２時間振とう培養を行い種菌を調製した。
次いで、前掲の表４の培地３Ｌを５Ｌ用ジャーファメンター（ミツワ理化社製）に入れ、１２１C、１５分間、加圧蒸気滅菌を行い、そこへ先に得られた種菌（坂口フラスコ１本分）を無菌的に植菌し、２９ ℃、１．５L／ｍｉｎ、３００ｒｐｍの通気攪拌培養を行った。ｐＨは１NのＮａＯＨ、１ＮのＨＣｌを用いて、４．８〜４．９に制御した。表５は、超音波処理を行う前と、超音波処理を行った場合の培養液の特性データを示す。
<Example 1>
Production of β-glucan in Example 1 was performed as follows. 75 ml of a liquid medium having the composition shown in Table 2 above was placed in a Sakaguchi flask and autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes. , 27C, 120 rpm, 72 hours of shaking culture to prepare an inoculum.
Next, 3 L of the medium shown in Table 4 above was placed in a 5 L jar fermenter (manufactured by Mitsuwa Rika Co., Ltd.), autoclaved for 121 C for 15 minutes, and the inoculum obtained previously (for one Sakaguchi flask). ) Was aseptically inoculated and aerated and stirred at 29 ° C., 1.5 L / min, 300 rpm. The pH was controlled between 4.8 and 4.9 using 1N NaOH, 1N HCl. Table 5 shows the characteristic data of the culture solution before sonication and when sonication is performed.
培養約９６時間後の菌体濁度はＯＤ（６６０）２４、グルカン濃度は０．４２％（ｗ／ｖ）、粘度は９７ｃｐであった（表５参照）。この粘度は従来のβ−グルカン（例えば、GM−NH−１A１菌の産生するグルカン）の粘度と比べると半分以下であった。グルカン濃度は、培養液から菌体を遠心分離で除去した後、６６％（ｖ／ｖ）になるようにエタノールを加えて、グルカンを沈殿させ、更に６６％エタノールで洗浄後、その沈殿をイオン交換水に溶解して、フェノール硫酸法で定量した。 The cell turbidity after about 96 hours of culture was OD (660) 24, the glucan concentration was 0.42% (w / v), and the viscosity was 97 cp (see Table 5). This viscosity was less than half that of a conventional β-glucan (for example, glucan produced by GM-NH-1A1). The concentration of glucan is determined by removing the cells from the culture solution by centrifugation, adding ethanol to 66% (v / v) to precipitate glucan, and washing with 66% ethanol. It melt | dissolved in exchange water and quantified by the phenol sulfuric acid method.
β−１，３−グルカンのラセン構造体にコンゴーレッドが吸着すると、コンゴーレッドの吸収スペクトルが長波長側に１０〜２５nmシフトすることが知られている（例えば、Ｋ.Ｏｇａｗａ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ６７．５２７−５３５（１９７８））。このシフト現象を利用して定性的にβ−１，３−グルカンであるかどうかを判定することができる。本実施例に係るグルカンはコンゴーレッドの波長をシフトさせることを確認することにより、本グルカンにはβ−グルカンを含有することが証明された。そのときの５１０ｎｍにおける極大値の増大は０．４３／５００μｇ多糖であった（表５参照）。 It is known that when Congo red is adsorbed to a β-1,3-glucan helical structure, the absorption spectrum of Congo red shifts to 10 to 25 nm on the long wavelength side (for example, K. Ogawa, Carbohydrate Research, 67 527-535 (1978)). Using this shift phenomenon, it is possible to determine qualitatively whether it is β-1,3-glucan. It was proved that the glucan according to this example contained β-glucan by confirming that the wavelength of Congo red was shifted. The increase in the maximum value at 510 nm at that time was 0.43 / 500 μg polysaccharide (see Table 5).
本実施例のグルカンに対する２次元NMR（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル分析によれば、β−１，３−結合に由来する４．７ｐｐｍとβ−１，６−結合に由来する４．４ｐｐｍ付近に２個のシグナルを得た。この結果から、本β−グルカンがβ−１，３−グルカンであることが証明された。それぞれのシグナルの積分比から、β−１，３−結合／β−１，６−結合の比は１．１９であることが判明した。このことは本β−１，３−グルカンが８４％分岐していることを示している。 According to the two-dimensional NMR ( 1 H-NMR) spectrum analysis for the glucan of this example, 4.7 ppm derived from β-1,3-bond and around 4.4 ppm derived from β-1,6-bond. Two signals were obtained. From this result, it was proved that the present β-glucan was β-1,3-glucan. From the integral ratio of each signal, it was found that the ratio of β-1,3-bond / β-1,6-bond was 1.19. This indicates that the β-1,3-glucan is branched by 84%.
次に、上記培養ろ液から得られるβ―グルカンを粉体化して、β−グルカン粉末の分析を行った。培養ろ液にエタノールを６６％になるように加えて、β−グルカンを沈殿させその沈殿を遠心分離で集めた。その沈殿をイオン交換水に溶かして、再度、６６％エタノールでβ−グルカンを沈殿させて回収した。このβ−グルカンの水溶液をイオン交換水に対して透析し、その透析内液にエタノールを６６％になるように加えて、β−グルカンを沈殿させ、乾燥させた。その乾燥物を乳鉢で破砕してβ−グルカンの粉末を得た。そのβ−グルカン粉末を組成分析したところ、そのＳ含量は３４０ｍｇ／ｋｇであった。これから計算されるβ−グルカンに含まれるスルホ酢酸含量は０．１５％であった。これは非特許文献１に記載された方法で測定したスルホ酢酸含量からも確認できた。そのβ−１，３−グルカンの粉末は水に容易に溶解し、無色透明で、その純度はほぼ１００％であった。 Next, β-glucan obtained from the culture filtrate was pulverized, and β-glucan powder was analyzed. Ethanol was added to the culture filtrate at 66% to precipitate β-glucan, and the precipitate was collected by centrifugation. The precipitate was dissolved in ion-exchanged water, and β-glucan was precipitated again with 66% ethanol and collected. This aqueous solution of β-glucan was dialyzed against ion-exchanged water, ethanol was added to the dialyzed internal solution so that the concentration was 66%, and β-glucan was precipitated and dried. The dried product was crushed with a mortar to obtain β-glucan powder. The composition of the β-glucan powder was analyzed, and its S content was 340 mg / kg. The sulfoacetic acid content contained in β-glucan calculated from this was 0.15%. This could also be confirmed from the sulfoacetic acid content measured by the method described in Non-Patent Document 1. The β-1,3-glucan powder easily dissolved in water, was colorless and transparent, and its purity was almost 100%.
上記の生成処理工程により、培養ろ液からエタノール沈殿を繰り返すだけで、水に容易に溶けて、無色透明になる、真っ白なβ−グルカンの粉末が効率的かつ簡便に得られるが、超音波処理及び／又はユニジェットスプレー処理を行うことにより、更に粘度の低いβ―グルカン溶液を精製することができる。 By the above-described production treatment step, simply repeating ethanol precipitation from the culture filtrate, a pure white β-glucan powder that dissolves easily in water and becomes colorless and transparent can be obtained efficiently and simply. Further, a β-glucan solution having a lower viscosity can be purified by performing a unijet spray treatment.
上記生成工程により得られた培養ろ液の粘度を食品物性レオメーターで測定したところ、９７ｃｐであった。この培養ろ液５０mlを５０ml用ビーカーに入れて、超音波装置（Branson Sonifier Model ２５０，２０ＫＨｚ）を用いて、８０Wで超音波処理したところ、その粘度は１分間で２５．８ｃｐ、２分間で１０．４ｃｐ、 ３分間で８ｃｐまで低下した（表５参照）。この条件下において、３分間超音波処理を行うと水と同程度の粘度になった。 It was 97 cp when the viscosity of the culture filtrate obtained by the said production | generation process was measured with the food physical property rheometer. When 50 ml of this culture filtrate was placed in a 50 ml beaker and sonicated at 80 W using an ultrasonic device (Branson Sonifier Model 250, 20 KHz), the viscosity was 25.8 cp in 1 minute and 10 in 2 minutes. 4 cp, decreased to 8 cp in 3 minutes (see Table 5). Under this condition, when the ultrasonic treatment was carried out for 3 minutes, the viscosity became comparable to that of water.
無処理、超音波処理の培養ろ液中のβ−グルカンを６６％エタノールで沈殿させ、その沈殿を６６％エタノールで洗浄して得られるβ−グルカンについて、トヨパールＨＷ６５でゲル濾過を行い、分子量測定を実施した。
図２は、実施例１のゲル濾過における、各フラクションの糖含量をフェノール硫酸法で測定した時の吸光度を示す。図２に示すように、分子量６０万のピークは無処理が最も小さく、超音波処理１分、２分、３分の順に大きくなった。これらの溶出パターンはブロードの部分（分子量６０万より後ろに溶出されてくる部分）が無処理培養ろ液に最も多く、超音波処理１分、２分、３分の順に少なくなった。このことは分子量６０万のβ−グルカンが会合をおこし、溶出が遅れて、ブロードになっており、超音波処理することによって、会合しているβ−グルカンが分子量６０万のβ−グルカンに解離することを示している。
Β-glucan in an untreated, sonicated culture filtrate is precipitated with 66% ethanol, and the resulting β-glucan is washed with 66% ethanol, subjected to gel filtration with Toyopearl HW65, and measured for molecular weight. Carried out.
FIG. 2 shows the absorbance when the sugar content of each fraction in the gel filtration of Example 1 was measured by the phenol-sulfuric acid method. As shown in FIG. 2, the peak with a molecular weight of 600,000 was the smallest when no treatment was performed, and became larger in the order of 1 minute, 2 minutes, and 3 minutes of ultrasonic treatment. In these elution patterns, the broad portion (the portion eluted after the molecular weight of 600,000) was the most in the untreated culture filtrate, and decreased in the order of sonication for 1 minute, 2 minutes and 3 minutes. This is because β-glucan having a molecular weight of 600,000 causes association, elution is delayed, and broadens, and the associated β-glucan is dissociated into β-glucan having a molecular weight of 600,000 by sonication. It shows that
また、この培養ろ液５００ｍｌを加圧タンクに入れて、ユニジェットスプレー（スプレーイング システムス ジャパン株式会社製）を用いて、コンプレッサーで０．５ＭＰａ.(約５Ｋｇ／ｃｍ)の圧力を加えて、培養ろ液を極小の穴（ノズル）から押し出して、ユニジェットスプレー処理を行うと、その粘度は９７ｃｐから６１ｃｐまで低下した。ノズルはこの条件下で水が１分間に８０ｍｌ押し出されるものを使用した。同じノズルを使って、圧力を０．５ＭＰａ以上にすると１分間の流量が８０ｍｌ以上になり、その噴出条件でユニジェットスプレー処理を行うと、粘度は更に低下する。 In addition, 500 ml of this culture filtrate was put in a pressurized tank, and a pressure of 0.5 MPa. (About 5 kg / cm) was applied with a compressor using Unijet spray (manufactured by Spraying Systems Japan Co., Ltd.) When the culture filtrate was extruded from a very small hole (nozzle) and subjected to unijet spraying, the viscosity decreased from 97 cp to 61 cp. The nozzle used was one in which 80 ml of water was extruded per minute under these conditions. If the pressure is increased to 0.5 MPa or more using the same nozzle, the flow rate for 1 minute becomes 80 ml or more, and if the unijet spray treatment is performed under the ejection conditions, the viscosity further decreases.
＜実施例２＞
実施例２におけるβ―グルカンの培養生産は実施例１と異なる培養条件で行った。
培養約９１時間後の菌体濁度はＯＤ（６６０）２１、グルカン濃度は０．５９％（ｗ／ｖ）で、粘度は２１１ｃｐであった。グルカン濃度の定量は実施例１と同じ方法によった。実施例２におけるグルカンに実施例１と同様にコンゴーレッドを反応させると５１０ｎｍの吸収が０．４５／５００μｇであった。このことから、本グルカンはβ−１，３−グルカンを含むことを示している。本グルカンを実施例１と同じ方法で乾燥して、粉末化した。その粉末を組成分析したところ、そのＳ含量は４７０ｍｇ／ｋｇであった。これから計算される本グルカンに含まれるスルホ酢酸含量は０．２１％であった。これは非特許文献1に記載されている方法で測定したスルホ酢酸含量からも確認できた。また、本グルカンの２次元ＮＭＲスペクトル分析で、β−１，３−結合に由来する４．７ｐｐｍとβ−１，６−結合に由来する４．４ｐｐｍ付近に２本のシグナルを得た。この結果から、本グルカンはβ−１，３−１，６−グルカンであることが証明された。それぞれのシグナルの積分比から、β−１，３−結合／β−１，６−結合の比は１．１７であることが判った。このことは、本β―グルカンが８５％の分岐を有することを示している。本β−１，３−グルカンの乾燥標品は実施例１と同様に調製され、水に容易に溶け、無色透明の溶液が得られた。その純度は９９％以上であった。
<Example 2>
The culture production of β-glucan in Example 2 was performed under culture conditions different from those in Example 1.
After about 91 hours of culture, the turbidity of the cells was OD (660) 21, the glucan concentration was 0.59% (w / v), and the viscosity was 211 cp. The glucan concentration was determined by the same method as in Example 1. When Congo red was reacted with the glucan in Example 2 in the same manner as in Example 1, the absorption at 510 nm was 0.45 / 500 μg. This shows that this glucan contains β-1,3-glucan. This glucan was dried and powdered by the same method as in Example 1. Composition analysis of the powder revealed that its S content was 470 mg / kg. The sulfoacetic acid content contained in this glucan calculated from this was 0.21%. This could also be confirmed from the sulfoacetic acid content measured by the method described in Non-Patent Document 1. In addition, in the two-dimensional NMR spectrum analysis of this glucan, two signals were obtained in the vicinity of 4.7 ppm derived from β-1,3-bond and 4.4 ppm derived from β-1,6-bond. From this result, it was proved that this glucan was β-1,3-1,6-glucan. From the integration ratio of each signal, it was found that the ratio of β-1,3-bond / β-1,6-bond was 1.17. This indicates that the present β-glucan has 85% branching. The dry preparation of the present β-1,3-glucan was prepared in the same manner as in Example 1, and was easily dissolved in water to obtain a colorless and transparent solution. Its purity was 99% or more.
実施例２における培養ろ液（グルカン濃度０．５９％）を実施例１と同様に、超音波処理したところ、８０Ｗ、２分間超音波処理により、粘度は２１１ｃｐから５７ｃｐに低下した。また、実施例１と同様に、ユニジェットスプレー処理を実施すると、１３５ｃｐに低下した。これから、実施例２によるβ―グルカンに対しても、超音波処理、ユニジェットスプレー処理が低粘度化に有効であることがわかる。 When the culture filtrate (glucan concentration of 0.59%) in Example 2 was sonicated in the same manner as in Example 1, the viscosity decreased from 211 cp to 57 cp by sonication at 80 W for 2 minutes. Moreover, when the unijet spray process was implemented similarly to Example 1, it fell to 135 cp. From this, it can be seen that ultrasonic treatment and unijet spray treatment are also effective for reducing the viscosity of β-glucan obtained in Example 2.
なお、本発明は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲における種々変形例、設計変更などをその技術的範囲内に包含するものであることは云うまでもない。 It should be noted that the present invention is not limited to the above-described embodiment, but includes various modifications, design changes, and the like within the technical scope without departing from the technical idea of the present invention. Not too long.
本発明によれば、低粘度化した水溶性β―グルカンを産生する好適な、オウレオバシジウム属の微生物を提供でき、また、その微生物が産生する水溶性β―グルカンを含む培養液の低粘度化及び低粘度化した水溶性β―グルカンを高効率に、且つ簡便に調製可能な培養ろ液を生成して、低粘度培養ろ液からβ−グルカン粉末を効率的に製造できる。この製造β−グルカン粉末を含有させることにより、医薬、健康食品等、また水溶性により溶液状に含有させることにより、清涼飲料、ゼリー飲料、各種ジュースの飲料等を提供することができる。 According to the present invention, a suitable microorganism of the genus Aureobasidium that produces water-soluble β-glucan having a reduced viscosity can be provided, and the culture solution containing the water-soluble β-glucan produced by the microorganism can be reduced. A culture filtrate capable of easily and easily preparing a water-soluble β-glucan having a viscosity and a reduced viscosity can be produced, and β-glucan powder can be efficiently produced from the low-viscosity culture filtrate. By containing this manufactured β-glucan powder, soft drinks, jelly drinks, various juice drinks, and the like can be provided by including pharmaceuticals, health foods, and the like in a solution form due to water solubility.
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