JP5826632B2 - シアル酸を生成する細菌 - Google Patents
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Description
細菌株及びこれらの生成
Nestle Culture Collection(NCC)から細菌株を入手し、API培地(ペプトン1%、酵母抽出物0.5%、ポリソルベート80 0.1%、クエン酸アンモニウム0.2%、酢酸ナトリウム0.5%、硫酸マグネシウム0.01%、硫酸マンガン0.005%及びリン酸二カリウム0.2%、グルコース1%)上で成長させた。30℃で16時間成長させた後、細菌を回収し、フリーズドライした。
Jourdianら.(1971)J Biol Chem 246:430−435の方法を変更して使用して、SiAcを検出した。簡潔に述べると、0.04M過ヨウ素酸10μlを、試料50μl又はNeuAc標準物質50μl(0、20、40、60及び100μg/ml)と混合し、氷浴で35分間インキュベートした。28%のHCl6ml中のCuSO4 0.04mg+6%のレゾルシノール1ml+H2O 3mlからなる新鮮なミックス125μlを添加して、4℃で5分間インキュベートした。試料を15分間沸騰させ、冷却した。95%のtert−ブタノール125μlを添加し、37℃で3分間インキュベートして、色を安定化させた。試料の青色の強度と、異なる濃度の標準物質とを比較することによって、視覚的に採点を行った。
1,2−ジアミノ−4,5−メチレンジオキシベンゼンジヒドロクロリド(DMB)法:細菌試料を水に溶解し、約2μg/mLの予測された総シアル酸濃度を得た。この溶液の一定分量200μLを、ギ酸(1.0M)200μLを添加して、80℃で2時間加熱することによって加水分解し、すべての結合シアル酸を遊離させた。次いで、α−ケト酸に特異的な蛍光ラベルである1,2−ジアミノ−4,5−メチレンジオキシベンゼンジヒドロクロリド(DMB)でシアル酸を誘導体化した。誘導体化を、DMB(0.75M 2−メルカプトエタノール及び18mMハイドロサルファイトナトリウムを含有する1.4M酢酸中7.0mM)の溶液200μLを、加水分解した試料の一定分量200μLに添加することによって実行し、次いで、混合物を80℃で50分間加熱した。誘導体化した試料(5μL)を逆相HPLCカラム(Zorbax SB−Aq、3.5μm、4.6×50mm)に注入し、2.0mL/分で流れる水/メタノール/酢酸(75/25/0.05(v/v/v))の移動相を用いて溶出した。蛍光検出(λex=373nm、λem=448nm)を用いて、カラム溶離液をモニターした。既知の濃度のシアル酸から検量曲線を作成し、試料からのピーク領域を標準物質のピーク領域と比較することによって、定量を実施した。
メタノール(25滴)中の1M HClで、80℃で15時間処理し、続いて、メタノール(20滴)中のピリジン(5滴)及び無水酢酸(5滴)で、室温で1時間再N−アセチル化することによって、計量した量の試料からメチルグリコシドを調製した。次いで、80℃で(15分)Tri−Sil(10滴、Pierce)での処理によって、試料をペル−O−トリメチルシリル化した。これらの手順を、既に記載されている通りに実行した(Merkle,R.K.及びI.Poppe(1994)Methods Enzymol.230:1−15;York,W.A.at al(1986)Methods Enzymol 118:3−40)。TMSメチルグリコシドのGC/MS分析を、DB−1カラム(30m×0.25mm ID)を用いて、5970MSDに接続したHP5890GC上で実施した。
SiAcを生成する細菌の検出
周期法を用いて、Nestle Culture Collectionからの細菌を、SiAc生成のためにスクリーニングした。以下の株は、SiAc生成において特に有効であると同定され、ブダペスト条約の下で寄託された。
ラクトバチルス・サケイNCC2935 (寄託番号CNCM I−4064)
ラクトバチルス・サケイNCC2934 (寄託番号CNCM I−4025)
ラクトバチルス・サケイNCC166 (寄託番号CNCM I−4066)
ラクトバチルス・サケイNCC170 (寄託番号CNCM I−4067)
ラクトバチルス・サケイNCC1393 (寄託番号CNCM I−4022)
ラクトバチルス・サケイNCC1428 (寄託番号CNCM I−4023)
ラクトバチルス・サケイNCC1511 (寄託番号CNCM I−4024)
ラクトバチルス・サケイNCC2937 (寄託番号CNCM I−4065)
ラクトバチルス・プランタルムNCC2936 (寄託番号CNCM I−4026)
ラクトバチルス・プランタルムNCC252 (寄託番号CNCM I−4021)
材料及び方法において記載した通り、SiAcを生成する株の乾燥粉末を調製した。同様の粉末を、2つの異なる方法:DMB及びGC−MSを用いて分析した。
DMB法及び周期アッセイ法を用いて、細菌試料中のSiAcの定量化を行った。DMBは定量的方法であるが、試料の半定量的分析には、周期アッセイを使用した。背景色が強く、結果の分光学的な読取りを妨げるので、周期アッセイを用いる正確な定量化は不可能であった。細菌の同様のバッチ上で実施した定量化の結果を表2に示す。
Claims (16)
- シアル酸で食品を強化するための、天然のシアル酸を生成する食品用細菌の使用であって、
前記細菌が、CNCMに番号I−4064として寄託されたラクトバチルス・サケイ、CNCMに番号I−4025として寄託されたラクトバチルス・サケイ、CNCMに番号I−4065として寄託されたラクトバチルス・サケイ、CNCMに番号I−4026として寄託されたラクトバチルス・プランタルム及びこれらの混合物からなる群から選択される、使用。 - 前記天然のシアル酸を生成する食品用細菌が、食品の摂取後に体内でシアル酸を生成するように生存可能である、請求項1に記載の使用。
- 前記細菌が、0.05〜2乾燥重量%のシアル酸含有量の増加を食料品中で得るのに十分な量で使用される、請求項1又は2に記載の使用。
- 前記シアル酸がN−アセチルノイラミン酸である、請求項4に記載の使用。
- 前記食品が、乳汁ベースの食品、乳汁、乳清、ヨーグルト、チーズ、発酵製品;調製粉乳;固形離乳食;フォローオン調製乳;幼児用の飲物;果汁;粉末形態の少なくとも部分的に可溶性の飲料ミックス;チョコレート;シリアル製品;菓子;クッキー;ゼラチンからなる群から選ばれる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の使用。
- 前記粉末形態の少なくとも部分的に可溶性の飲料ミックスが、麦芽飲料、チョコレート飲料、カプチーノ及びコーヒー飲料からなる群から選ばれる、請求項6に記載の使用。
- 請求項1に記載の天然のシアル酸を生成する食品用細菌を含む、シアル酸強化食品。
- 対象に栄養を提供することに使用するための、請求項8に記載のシアル酸強化食品。
- 内在性のシアル酸の生成の不足を埋め合わせることに使用するための、請求項8に記載のシアル酸強化食品。
- 神経変性を治療又は予防することに使用するための、請求項8に記載のシアル酸強化食品。
- 成人において神経変性を治療又は予防することに使用するための、請求項8に記載のシアル酸強化食品。
- 免疫系を支援すること及び/又は腸機能を向上させることに使用するための、請求項8に記載のシアル酸強化食品。
- 免疫性を高めること、及び/又は腸機能を向上させることに使用するための、請求項8に記載のシアル酸強化食品。
- 認識能力を向上させること、及び/又は脳発達を支援することに使用するための、請求項8に記載のシアル酸強化食品。
- 子供における認識能力を向上させること、及び/又は脳発達を支援することに使用するための、請求項8に記載のシアル酸強化食品。
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