JP5826561B2 - 顕微鏡システム、標本画像生成方法及びプログラム - Google Patents
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Description
上記顕微鏡システムにおいて、前記細胞構成要素がヘマトキシリン染色されていることを特徴とする。
本発明に係る顕微鏡システムは、多重染色された病理組織標本又は細胞診標本の全体またはその一部を、顕微鏡を用いて広視野かつ高精細にディジタル画像として記録して表示するものである。より詳細には、本発明に係る顕微鏡システムは、形態観察染色と分子標的染色とが多重に染色された標本を観察及び診断に供するものである。
図1は、実施の形態1に係る顕微鏡システム全体の構成例を示す図である。
図1に示す顕微鏡システム1は、顕微鏡装置10と、該顕微鏡装置10とデータ送受可能に接続されたホストシステム20と、ホストシステム20の制御の下で顕微鏡装置10の各部を制御する顕微鏡コントローラ30と、ホストシステム20に接続されたテレビ(TV)カメラコントローラ40と、顕微鏡装置10に取り付けられ、TVカメラコントローラ40の制御の下で動作するテレビ(TV)カメラ50とを備える。
表示部22は、LCDやELディスプレイ等の表示装置によって実現される。
画像合成部276は、明視野VS画像と蛍光VS画像とを重ね合わせた合成画像を作成する。
続くステップS11において、顕微鏡装置10は、低倍(例えば4倍)の対物レンズ151を光路に挿入する。
図4は、標本Sが配置されたスライドガラス100全体を示す上面図である。以下の説明においては、標本Sの一例として、多重染色を施した乳癌組織標本を用いる。多重染色としては、形態観察用の染色として、細胞核に対してヘマトキシリン染色を施し、エストロゲン受容体(以下、単にERとも記す)を認識する抗ER抗体に対してAlexa555で蛍光標識を施し、HER2受容体(以下、単にHER2とも記す)を認識する抗HER2抗体に対してCy5で蛍光標識を施すものとする。実施の形態1においては、このような標本Sに対して明視野(細胞核)観察及び蛍光観察を行う。なお、ラベルLBには、標本Sに関する情報が記載されている。
ここで、全ての小区画Pについてフォーカス位置を実測で求めようとすると、非常に多くの時間がかかってしまう。そこで、本実施の形態1においては、全ての小区画Pの内からフォーカス位置をサンプリング(実測)する小区画を自動抽出し、それ以外の小区画については、サンプリングされた値に基づいて演算により求める。なお、フォーカス位置抽出ポイントの自動抽出方法は任意で良く、ランダムであっても良いし、規則的(例えば3区画おき)であっても良い。
まず、明視野画像用のフォーカスマップを作成する。即ち、ステップS101において、顕微鏡システム1は、ステップS14において抽出した各フォーカス位置抽出ポイントFPにおける合焦位置を実測する。より詳細には、顕微鏡装置10は、対物レンズ151の光軸にフォーカス位置抽出ポイントFPが合うように、電動ステージ11をXY平面内で移動させる。続いて、ホストシステム20は、電動ステージ11をZ方向に移動させながらTVカメラ50により撮像された画像の入力を受け付け、画像の明るさやコントラストを評価することにより、合焦位置を求める。このようにして実測された各フォーカス位置抽出ポイントFPの合焦位置座標は、フォーカスマップMに記録される。
以上の処理により、高解像度の明視野画像用のフォーカスマップMが完成する。このフォーカスマップMは、撮像座標記録部24に格納される。
このようにして取得された各ポイントAの合焦位置座標は、フォーカスマップMに記録される。
まず、ステップS121において、顕微鏡システム1は、各ポイントBの近傍(例えば5区画以内)に蛍光画像用の合焦位置を実測した小区画Pが存在するか否かを判定する。なお、近傍の範囲は注目領域R3、R4の面積に応じて可変としても良い。顕微鏡システム1は、近傍に合焦位置を実測した小区画Pが存在する場合(ステップS121:Yes)、近傍の小区画Pの合焦位置座標を当該ポイントBのZ座標に設定して、第1の蛍光画像を取得する(ステップS122)。
続くステップS125において、顕微鏡システム1は、第2の蛍光画像の合焦評価を行う。合焦評価の詳細については、ステップS123と同様である。
これらのステップS121〜S133が全てのポイントBに対してなされた後、処理はメインルーチンに戻る。
次に、本発明の実施の形態2について説明する。
実施の形態2に係る顕微鏡システム全体の構成及び動作は実施の形態1と同様であり、フォーカスマップの作成処理(図3のステップS15)が実施の形態1とは異なる。より詳細には、実施の形態1においては、まず明視野画像用のフォーカスマップを作成し、これを利用して蛍光画像用のフォーカスマップを作成した。これに対し、実施の形態2においては、ステップS14において抽出したフォーカス位置抽出ポイント毎に、明視野画像用及び蛍光画像用の合焦位置を取得する。それにより、電動ステージ11の移動及び光学キューブ161の切替回数を必要最小限に留め、フォーカスマップの作成時間を短縮することを特徴とする。
ステップS204において、顕微鏡システム1は、明視野画像の合焦位置を実測し、その合焦位置座標を明視野画像用のフォーカスマップMに記録する。
ステップS206において、顕微鏡システム1は、ER蛍光画像の合焦位置を実測し、その合焦位置座標をER蛍光画像用のフォーカスマップMに記録する。
次に、本発明の実施の形態3について説明する。
実施の形態3に係る顕微鏡システム全体の構成及び動作は実施の形態1と同様であり、フォーカスマップの作成処理(図3のステップS15)及びVS画像の表示処理(ステップS17)が実施の形態1とは異なる。より詳細には、実施の形態3においては、図12に示すように、1つの明視野VS画像GBFを作成すると共に、この明視野VS画像GBF上の合焦位置座標ZBFを基準として、標的分子毎(本実施の形態では、ER用及びHER2用)に合焦位置座標(ER用の合焦位置座標ZER、HER2用の合焦位置座標ZHER2)を求める。そして、各合焦位置座標ZER、ZHER2、及びそれらの周辺の座標ZER(k)、ZHER2(k)(k=1、2、…、及び1’、2’、…)において、各標的分子に対応する蛍光VS画像(ER用の蛍光VS画像GER、GER(k)、及び、HER2用の蛍光VS画像GHER2、GHER2(k))を作成する。さらに、これらの蛍光VS画像を標的分子毎に重ね合わせて合成することにより、3次元的な蛍光VS画像を標的分子毎に構成する。なお、図12においては、各VS画像GBF、GER、GER(k)、GHER2、及びGHER2(k)をZ座標軸と対応付けられたバーによって表している。また、図12においては、模式的に、各VS画像GBF、GER、GER(k)、GHER2、及びGHER2(k)内の合焦位置座標(Z座標)を全て等しいものとして示しているが、これらのZ座標は実測又は演算により個別に取得されるため、実際には全て等しくなるわけではなく、3次元的に構成されるものである。
高解像度の明視野画像用のフォーカスマップの作成処理及び明視野画像GBFの取得処理については、実施の形態1において説明したものと同様である(図3及び図9参照)。
まず、ステップS301において、ホストシステム20は、注目領域R3、R4内の各小区画Pにおける明視野画像用の合焦位置座標ZBFを取得する。
また、3次元の広視野且つ高精細な画像の取得方法の詳細については、特開2006−343573号公報も参照されたい。
10 顕微鏡装置
11 電動ステージ
12 顕微鏡本体
13 透過照明光学系
130 透過照明用光源
131 コレクタレンズ
132 透過用フィルタユニット
133 透過シャッタ
134 透過視野絞り
135 透過開口絞り
136 折曲げミラー
137 コンデンサ光学素子ユニット
138 トップレンズユニット
14 落射照明光学系
140 落射照明用光源
141 コレクタレンズ
142 落射用フィルタユニット
143 落射シャッタ
144 落射視野絞り
145 落射開口絞り
15 レボルバ
151、151a、151b 対物レンズ
16 光学キューブ切換部
161、161a、161b 光学キューブ
17 鏡筒
171 双眼部
172 ビームスプリッタ
20 ホストシステム
21 入力部
22 表示部
23 画像データ記録部
24 撮影座標記録部
25 プログラム記録部
26 ビデオボード
27 制御部
271 蛍光VS画像領域設定部
272 明視野VS撮像制御部
273 蛍光VS撮像制御部
274 フォーカス位置取得部
275 VS画像作成部
276 画像合成部
30 顕微鏡コントローラ
31 ステージX−Y駆動制御部
32、34 モータ
33 ステージZ駆動制御部
40 TVカメラコントローラ
50 TVカメラ
100 スライドガラス
Claims (10)
- 明視野観察及び蛍光観察が可能な顕微鏡の対物レンズ及び標本を、前記対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させて複数枚の顕微鏡画像群を取得し、該複数枚の顕微鏡画像群を相互に繋ぎ合わせたバーチャルスライド画像を生成する顕微鏡システムにおいて、
細胞を構成する1つ以上の細胞構成要素が非蛍光色素により染色され、且つ、検出目的とする標的分子が蛍光色素により標識された標本に対する明視野観察により、前記細胞構成要素が表示された明視野バーチャルスライド画像を取得する制御を行う明視野バーチャルスライド画像取得制御手段と、
前記標本に対する蛍光観察により、前記標的分子に対応する蛍光バーチャルスライド画像を取得する制御を行う蛍光バーチャルスライド画像取得制御手段と、
前記蛍光バーチャル画像の取得対象となる領域を格子状に分割した複数の小区画の中から、明視野画像を取得する際に用いられる明視野画像用の合焦位置を実測するための小区画を複数抽出し、抽出した小区画の中から、蛍光画像を取得する際に用いられる蛍光画像用の合焦位置を更に実測するための第1の小区画を複数抽出し、各第1の小区画における前記明視野画像用及び蛍光画像用の合焦位置を実測して両合焦位置間における差分を算出すると共に、全ての前記第1の小区画における前記差分の平均値及び標準偏差を算出し、前記標準偏差が所定値以下である場合に、前記明視野画像用の合焦位置を実測するための小区画のうち前記第1の小区画以外の第2の小区画における前記蛍光画像用の合焦位置を、当該第2の小区画に対して実測された前記明視野画像用の合焦位置と前記平均値とから算出するフォーカス位置取得手段と、
を備えることを特徴とする顕微鏡システム。 - 前記標本の観察法に応じて光路に選択的に挿入される光学キューブを切り換える光学キューブ切換部をさらに備え、
前記フォーカス位置取得手段は、前記明視野画像用の合焦位置を取得する場合に、前記蛍光画像観察用の光学キューブを前記光路に挿入したままの状態で前記明視野画像用の合焦位置を実測により取得することを特徴とする請求項1に記載の顕微鏡システム。 - 前記蛍光バーチャルスライド画像取得制御手段は、前記明視野画像用の合焦位置を基準として光軸方向に複数の座標値を設定し、該複数の座標値において複数の蛍光画像をそれぞれ取得する処理を、前記領域を格子状に分割した複数の小区画の各々について実行する制御を行い、前記複数の座標値の配列順毎に、互いに隣接する小区画同士に対応する蛍光画像同士を繋ぎ合わせることにより、複数の蛍光バーチャル画像を作成することを特徴とする請求項1に記載の顕微鏡システム。
- 前記明視野バーチャルスライド画像と前記蛍光バーチャルスライド画像とを重ね合わせた合成画像を作成する画像合成手段をさらに備えることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の顕微鏡システム。
- 前記標本は、2種類以上の標的分子にそれぞれ対応する2種類以上の蛍光色素により標識がなされており、
前記蛍光バーチャルスライド画像取得制御手段は、前記標的分子の種類ごとに前記蛍光バーチャルスライド画像を取得することを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の顕微鏡システム。 - 前記明視野バーチャルスライド画像を用いて、前記標本の内、前記蛍光バーチャルスライド画像の取得対象とする領域を設定する領域設定手段をさらに備えることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の顕微鏡システム。
- 前記細胞構成要素は細胞核であることを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項に記載の顕微鏡システム。
- 前記細胞構成要素がヘマトキシリン染色されていることを特徴とする請求項7に記載の顕微鏡システム。
- 明視野観察及び蛍光観察が可能な顕微鏡の対物レンズ及び標本を、前記対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させて複数枚の顕微鏡画像群を取得し、該複数枚の顕微鏡画像群を相互に繋ぎ合わせたバーチャルスライド画像を生成する標本画像生成方法において、
細胞を構成する1つ以上の細胞構成要素が非蛍光色素により染色され、且つ、検出目的とする標的分子が蛍光色素により標識された標本に対する明視野観察により、前記細胞構成要素が表示された明視野バーチャルスライド画像を取得する制御を行う明視野バーチャルスライド画像取得制御ステップと、
前記標本に対する蛍光観察により、前記標的分子に対応する蛍光バーチャルスライド画像を取得する制御を行う蛍光バーチャルスライド画像取得制御ステップと、
前記蛍光バーチャル画像の取得対象となる領域を格子状に分割した複数の小区画の中から、明視野画像を取得する際に用いられる明視野画像用の合焦位置を実測するための小区画を複数抽出し、抽出した小区画の中から、蛍光画像を取得する際に用いられる蛍光画像用の合焦位置を更に実測するための第1の小区画を複数抽出し、各第1の小区画における前記明視野画像用及び蛍光画像用の合焦位置を実測して両合焦位置間における差分を算出すると共に、全ての前記第1の小区画における前記差分の平均値及び標準偏差を算出し、前記標準偏差が所定値以下である場合に、前記明視野画像用の合焦位置を実測するための小区画のうち前記第1の小区画以外の第2の小区画における前記蛍光画像用の合焦位置を、当該第2の小区画に対して実測された前記明視野画像用の合焦位置と前記平均値とから算出するフォーカス位置取得ステップと、
を含むことを特徴とする標本画像生成方法。 - 明視野観察及び蛍光観察が可能な顕微鏡の対物レンズ及び標本を、前記対物レンズの光軸と直交する方向に相対的に移動させて複数枚の顕微鏡画像群を取得し、該複数枚の顕微鏡画像群を相互に繋ぎ合わせたバーチャルスライド画像を生成する処理をコンピュータに実行させる標本画像生成プログラムにおいて、
細胞を構成する1つ以上の細胞構成要素が非蛍光色素により染色され、且つ、検出目的とする標的分子が蛍光色素により標識された標本に対する明視野観察により、前記細胞構成要素が表示された明視野バーチャルスライド画像を取得する制御を行う明視野バーチャルスライド画像取得制御ステップと、
前記標本に対する蛍光観察により、前記標的分子に対応する蛍光バーチャルスライド画像を取得する制御を行う蛍光バーチャルスライド画像取得制御ステップと、
前記蛍光バーチャル画像の取得対象となる領域を格子状に分割した複数の小区画の中から、明視野画像を取得する際に用いられる明視野画像用の合焦位置を実測するための小区画を複数抽出し、抽出した小区画の中から、蛍光画像を取得する際に用いられる蛍光画像用の合焦位置を更に実測するための第1の小区画を複数抽出し、各第1の小区画における前記明視野画像用及び蛍光画像用の合焦位置を実測して両合焦位置間における差分を算出すると共に、全ての前記第1の小区画における前記差分の平均値及び標準偏差を算出し、前記標準偏差が所定値以下である場合に、前記明視野画像用の合焦位置を実測するための小区画のうち前記第1の小区画以外の第2の小区画における前記蛍光画像用の合焦位置を、当該第2の小区画に対して実測された前記明視野画像用の合焦位置と前記平均値とから算出するフォーカス位置取得ステップと、
を含むことを特徴とする標本画像生成プログラム。
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