JP5823994B2 - 3’−t突出部を伴うアダプターの使用方法 - Google Patents
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Description
以下の説明及び実施例において、多くの用語が使用される。そのような用語に与えられる範囲を含む、明細書及び請求項についての明確で一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。特別に本明細書において定義されないならば、使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。全ての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献の開示は、参照によりそれら全体は本明細書において援用される。
a)対象となる第1の核酸サンプルを提供する工程と、
b)対象となる第1の核酸サンプルについて複雑度の減少を行ない、第1の核酸サンプルの第1のライブラリーを提供する、工程と、
c)対象となる第2の核酸サンプル又はさらなる核酸サンプルにより、連続的に又は同時に工程a)及び工程b)を行ない、対象となる第2の核酸サンプルの第2のライブラリー又はさらなる核酸サンプルのさらなるライブラリーを得る、工程と、
d)第1のライブラリー及び第2のライブラリー又はさらなるライブラリーの少なくとも一部をシークエンシングする工程と、
e)工程d)において得られた配列をアライメントさせる工程と、
f)工程e)のアライメントにおいて、第1の核酸サンプル及び第2の核酸サンプル又はさらなる核酸サンプルの間の1つ又は複数の多型性を決定する工程と、
g)工程f)において決定された1つ又は複数の多型性を用い、1つ又は複数の検出プローブを設計する、工程と、
h)対象となる検査サンプルの核酸を提供する工程と、
i)対象となる検査サンプルの核酸について工程b)の複雑度の減少を行ない、検査サンプルの核酸の検査ライブラリーを提供する、工程と、
j)検査ライブラリーをハイスループットスクリーニングして、工程g)において設計された1つ又は複数の検出プローブを用いて、工程f)において決定された多型性の存在、多型性の非存在、又は多型性の量を同定する、ハイスループットスクリーニングする工程と
を含む。
(a)核酸、特にDNA又はcDNAを1つ又は複数の特異的な制限エンドヌクレアーゼで消化して、対応する一連の制限断片へとDNAを断片化する工程と、
(b)このように得られた制限断片を、1つの末端が1つ又は両方の制限断片の末端と適合する二本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプターとライゲーションして、アダプターでライゲーションされた(好ましくは、タグ付けされた)開始DNAの制限断片を生成する工程と、
(c)アダプターでライゲーションされた(好ましくは、タグ付けされた)制限断片を、ハイブリダイズする条件下で、その3’−末端で少なくとも1つの選択的なヌクレオチドを含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程と、
(d)プライマーとハイブリダイズされたアダプターでライゲーションされた(好ましくは、タグ付けされた)制限断片を、プライマーがハイブリダイズする開始DNAの制限断片に沿ってハイブリダイズされたプライマーのさらなる伸長を引き起こすように、PCR又は同様の技術によって増幅する工程と、
(e)このように得られた増幅又は伸長したDNA断片を、検出、同定、又は回収する工程
を含む。
− 少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼにより核酸サンプルを消化して、制限断片へ断片化すること、
− 1つ又は両方の制限断片の末端と合うような1つの末端を有する、少なくとも1つの二本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプターで得られた制限断片をライゲーションして、アダプターにライゲーションされた制限断片を生成すること、
− ハイブリダイズする条件下で、アダプターにライゲーションされた上記制限断片を、1つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させること、及び
− 1つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長によって、アダプターにライゲーションされた上記制限断片を増幅することにより行なわれ、
ここで1つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも1つが、上記制限エンドヌクレアーゼのための標的配列の形成に関与するヌクレオチドを含み、アダプターの存在するヌクレオチドの少なくとも一部を含む、アダプターにライゲーションされた上記制限断片の末端で鎖の端末部分と同じヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含み、ここで任意で、当該プライマーの少なくとも1つは、その3’末端で、当該制限エンドヌクレアーゼのための標的配列の形成に関与するヌクレオチドにすぐに隣接して位置する少なくとも1つのヌクレオチドを含む選択された配列を含む。
− 各々のビーズがアダプターにライゲーションされた単一の断片とアニーリングされるビーズへ、アダプターにライゲーションされた断片をアニーリングする工程と、
− 各々の油中水滴型マイクロリアクターが単一のビーズを含む、油中水滴型マイクロリアクター中のビーズの乳化する工程と、
− 各々のウェルが単一のビーズを含む、ウェル中にビーズを充填する工程と、
− ピロリン酸シグナルを生成する工程と
を含む。
a)対象となる複数の核酸サンプルを提供する工程と、
b)各々のサンプル上で複雑度の減少を行ない、核酸サンプルの複数のライブラリーを提供する、工程であって、複雑度の減少が、
− 少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼにより各々の核酸サンプルを消化して、制限断片へ断片化すること、
− 1つ又は両方の制限断片の末端と合うような1つの末端を有する、少なくとも1つの二本鎖の合成オリゴヌクレオチドアダプターで得られた制限断片をライゲーションして、アダプターにライゲーションされた制限断片を生成すること、
− ハイブリダイズする条件下で、前記アダプターにライゲーションされた制限断片を、1つ又は複数のリン酸化されたオリゴヌクレオチドプライマーと接触させること、及び
− 1つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長によってアダプターにライゲーションされた上記制限断片を増幅することであって、ここで1つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも1つが、上記制限エンドヌクレアーゼのための標的配列の形成に関与するヌクレオチドを含み、アダプターの存在するヌクレオチドの少なくとも一部を含む、アダプターにライゲーションされた当該制限断片の末端で鎖の端末部分と同じヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含み、ここで任意で、当該プライマーの少なくとも1つが、その3’末端で、該制限エンドヌクレアーゼのための標的配列の形成に関与するヌクレオチドにすぐに隣接して位置する少なくとも1つのヌクレオチドを含む選択された配列を含み、ここでアダプター及び/又はプライマーがタグを含むこと
によって行なわれる工程と、
c)組合せライブラリーへ上記ライブラリーを組み合わせる工程と、
d)ビーズへアニーリングすることが可能なシークエンシングアダプターを、組合せライブラリー中の増幅されたアダプターでキャッピングされた断片へライゲーションし、3’−T突出部を伴うシークエンシングアダプターを用い、ビーズにアニーリングされた断片をエマルジョン重合する工程と、
e)組合せライブラリーの少なくとも一部をシークエンシングする工程と、
f)工程e)において得られた各々のサンプルからの配列をアライメントさせる工程と、
g)工程f)のアライメントにおいて複数の核酸サンプル間で1つ又は複数の多型性を決定する工程と、
h)工程g)において決定された1つ又は複数の多型性を用いて、検出プローブを設計する工程と、
i)対象となる検査サンプルの核酸を提供する工程と、
j)対象となる検査サンプルの核酸について工程b)の複雑度の減少を行ない、検査サンプルの核酸の検査ライブラリーを提供する、工程と、
k)検査ライブラリーでハイスループットスクリーニングを行ない、工程h)において設計された検出プローブを用いて、工程g)において決定された多型性の存在、多型性の非存在、又は多型性の量を同定する、工程と
を含む。
制限混合物(40ul/サンプル)
DNA 6μl(±300ng)
ECoRI(5U) 0.1μl
MseI(2U) 0.05μl
5×RL 8μl
MQ 25.85μl
合計 40μl
37℃における1時間のインキュベーション
10mM ATP 1μl
T4 DNA リガーゼ 1μl
ECoRIアダプター(5pmol/μl) 1μl
MseIアダプター(50pmol/μl) 1μl
5×RL 2μl
MQ 4μl
合計 10μl
の添加
37℃における3時間のインキュベーション
前増幅(A/C):
RL混合物(10×) 5μl
EcoRIプライマー E01L(50ng/ul) 0.6μl
MseIプライマー M02K(50ng/ul) 0.6μl
dNTPs(25mM) 0.16μl
Taqポリメラーゼ(5U) 0.08μl
10×PCR 2.0μl
MQ 11.56μl
1反応につき合計20μl
選択的な前増幅を50μlの反応容量中で行なった。PCRをPE GeneAmp PCRシステム9700で行ない、20サイクルのプロフィールは、94℃30秒間の変性工程でスタートし、その後、56℃60秒間のアニーリング工程、及び72℃60秒間の伸張工程を行なった。
PA+1/+1−混合物(20×) :5μl
EcoRIプライマー :1.5μl
MseIプライマー :1.5μl
dNTPs(25mM) :0.4μl
Taqポリメラーゼ(5U) :0.2μl
10×PCR :5μl
MQ :36.3μl
合計 :50μl
選択的な前増幅を20μlの反応容量中で行なった。PCRをPE GeneAmp PCRシステム9700で行なった。13サイクルのプロフィールは、94℃30秒間の変性工程でスタートし、その後、アニーリング温度が各々のサイクルにおいて0.7℃低下するタッチダウンフェーズを伴う、65℃30秒間のアニーリング工程、及び72℃60秒間の伸張工程を行なった。このプロフィールの後で、94℃30秒間の変性工程、56℃30秒間のアニーリング工程、及び72℃60秒間の伸張工程を伴う、23サイクルのプロフィールを行なった。
キアゲン精製は製造者の説明書に従って行なった:QIAquick(登録商標)スピンハンドブック(http://www1.qiagen.com/literature/handbooks/PDF/DNACleanupAndConcentration/QQSpin/1021422 HBQQSpin 072002ww.pdf)
コショウの系統PSP−11及びPI20234からのDNAを、AFLPの鍵遺伝子の認識部位に特異的なプライマーの使用により、AFLP産物を生成するために用いた。これらのAFLPプライマーは本質的に従来のAFLPプライマーと同じであり(例えば、欧州特許第0,534,858号に記述されている)、認識部位領域、定常領域、及び選択的領域において1つ又は複数の選択的なヌクレオチドを通常含むだろう。コショウの系統PSP−11又はPI20234からの150ngのDNAを、制限エンドヌクレアーゼのEcoRI(1反応につき5U)及びMseI(1反応につき2U)により、37℃で1時間消化させ、その後80℃で10分間不活性化を行なった。得られた制限断片を、1つの末端がEcoRI及び/又はMseI制限断片の1つ又は両方の末端と合う二本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプターとライゲーションした。+1/+1 AFLPプライマーによるAFLP前増幅反応(1反応につき20μl)を、10倍に希釈した制限ライゲーション混合物で行なった。PCRプロフィール:20*(94℃で30秒+56℃で60秒+72℃で120秒)。異なる+1 EcoRI及び+2 MseI AFLP鍵遺伝子の認識部位に特異的なプライマーによる追加のAFLP反応(1反応につき50μl)を(下記の表、タグは太字とし、選択的なヌクレオチドは下線が引かれている)、20倍に希釈した+1/+1 EcoRI/MseI AFLP前増幅産物で行なった。PCRプロフィール:30*(94℃で30秒+56℃で60秒+72℃で120秒)。AFLP産物を、QIAquick(登録商標)スピンハンドブック(07/2002)の18ページに従って、QIAquick PCR精製キット(QIAGEN)を用いることによって精製し、濃度はナノドロップ(NanoDrop)(登録商標)ND−1000分光測光器により測定した。5μgの+1/+2 PSP−11 AFLP産物及び5μgの+1/+2 PI20234 AFLP産物の合計を一緒にし、23.3μlのTE中で溶解した。最終的に、430ng/μlの濃度で+1/+2 AFLP産物の混合物が得られた。
トウモロコシの系統B73及びM017からのDNAを、AFLPの鍵遺伝子の認識部位に特異的なプライマーの使用により、AFLP産物を生成するために用いた。これらのAFLPプライマーは本質的に従来のAFLPプライマーと同じであり(例えば、欧州特許第0,534,858号に記述されている)、認識部位領域、定常領域、及び3’末端において1つ又は複数の選択的なヌクレオチドを通常含むだろう。
本明細書において以前に記述されたように調製されたコショウ及びトウモロコシのAFLP断片サンプルは、以下に記述されるような454 Life Sciencesにより加工された(Margulies et al., 2005「微細加工高密度ピコリッターリアクター中のゲノムシークエンシング(Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors)」Nature 437 (7057) :376-80. Epub July 31, 2005)。
加工パイプライン:
入力データ
未加工配列データが各々の実行に対して受け取られた:
−200,000〜400,000の読み取り
−ベースコール(塩基呼び出し)品質スコア
これらの配列データを、読み取りの始め及び末端で、鍵遺伝子認識部位(KRS)の存在について分析する。これらのKRS配列はAFLPアダプター及びサンプル標識配列の両方から成り、特定のサンプルの特定のAFLPプライマーの組合せに対して特異的である。KRS配列は、BLASTによって同定及びトリミングされ、制限部位が回復される。読み取りは、KRS起源の同定のためのタグでマークされる。トリミングされた配列は、その後の処理を行なうために、長さ(最低33ヌクレオチド)で選択される。
MegaBlast分析は、相同配列のクラスターを得るために全てのサイズ選択且つトリミングされた読み取りで行なわれる。引き続いて全てのクラスターは、アセンブリングされたコンティグをもたらすために、CAP3によりアセンブリングされる。両方の工程からの、他の読み取りと一致しないユニーク配列の読み取りが同定される。これらの読み取りはシングルトンとしてマークされる。本明細書において以前に記述された工程を行なう加工パイプラインを図4の(A)に示す。
アセンブリー解析からの最終的なコンティグは、多型性検出の根拠を成す。各々のクラスターのアライメントにおける各々の「ミスマッチ」は、可能性のある多型性である。選択基準を、品質スコアを得るために定義する:
− 1つのコンティグ当たりの読み取りの数
− 1つのサンプル当たりの「対立遺伝子」の頻度
− ホモポリマー配列の発生
− 近隣する多型性の発生
閾値を超えた品質スコアにより、SNP及びインデルは、推定上の多型性として同定される。SSR抽出については、MISA(MIcroSAtellite同定)ツール(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)を用いる。このツールはジヌクレオチド、トリヌクレオチド及びテトラヌクレオチド及び化合物SSRモチーフをあらかじめ定められた基準により同定し、これらのSSRの発生を要約する。
下記の表は、組み合わせたコショウのサンプルについて2回の454シークエンスの実行、及び組み合わせたトウモロコシサンプルについて2回の実行から得られた配列を組み合わせた分析の結果を要約する。
DNAの単離
ゲノムDNAは、コショウ組換え近交系(RIL)集団の親の2系統及び10のRILの子孫から単離された。親系統はPSP11及びPI201234である。ゲノムDNAを、Stuart及びViaによって記述された修飾CTAB手順を用いて、個々の苗木の葉材料から単離した(Stuart, C.N., Jr and Via,L.E. (1993)「RAPDフィンガープリンティング及び他のPCR用途のために有用な高速CTAB DNA分離方法(A rapid CTAB DNA isolation technique useful for RAPD fingeprinting and other PCR applications)」Biotechniques, 14, 748-750)。DNAサンプルを、TE(10mMトリスHCl pH 8.0、1mM EDTA)中で100ng/μlの濃度に希釈し、−20℃で保存した。
Zabeau及びVos(1993:「選択的制限断片増幅;DNAフィンガープリントのための一般法(Selective restriction fragment amplification; a general method for DNA fingerprinting)」欧州特許第0534858号(A1)及び(B1);米国特許第6045994号)、並びにVos他(Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van de Lee, T., Hornes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M. et al. (1995)「AFLP:DNAフィンガープリントのための新しい技術(AFLP: a new technique for DNA fingerprinting)」Nucl. Acids Res., 21, 4407-4414)によって記述されたように、制限エンドヌクレアーゼの組合せEcoRI/MseIを用いて、コショウの親系統のPSP11及びPI201234のAFLP鋳型を調製した。
DNA制限
DNA 100〜500ng
EcoRI 5単位
MseI 2単位
5×RL緩衝液 8μl
40μlまでのMilliQ水
インキュベーションは37℃で1時間行なった。酵素の制限後に、80℃で10分間インキュベーションによって、酵素を不活性化した。
10mM ATP 1μl
T4 DNAリガーゼ 1μl
EcoRIアダプター(5pmol/μl) 1μl
MseIアダプター(50pmol/μl) 1μl
5×RL緩衝液 2μl
40μlまでのMilliQ水
インキュベーションは37℃で3時間行なった。
制限−ライゲーションに続いて、制限/ライゲーション反応物をT10E0.1で10倍に希釈し、希釈混合物5μlを、選択的増幅工程において鋳型として用いた。+1/+2選択的増幅が意図されたので、最初に+1/+1選択的前増幅工程(標準AFLPプライマーで)が行なわれたことに留意されたい。+1/+1(+A/+C)増幅の反応条件は以下のとおりであった。
EcoRIプライマー+1(50ng/μl): 0.6μl
MseIプライマー+1(50ng/μl) 0.6μl
dNTPs(20mM) 0.2μl
Taqポリメラーゼ(5U/μl Amplitaq、PE) 0.08μl
10×PCR緩衝液 2.0μl
20μlまでのMilliQ水
プライマー配列は、
+1/+1選択的な増幅産物(20倍希釈) 5.0μl
KRS EcoRIプライマー+A(50ng/μl) 1.5μl
KRS MseIプライマー+CA(50ng/μl) 1.5μl
dNTPs(20mM) 0.5μl
Taqポリメラーゼ(5U/μl Amplitaq、Perkin Elmer) 0.2μl
10×PCR緩衝液 5.0μl
50μlまでのMQ
タグ付けされたAFLPプライマー配列は、
PSP11:
1つのコショウサンプル当たり、2つの50マイクロリットルの+1/+2選択的なAFLP反応をプールした後、最終的な12の100μl AFLP反応生成物を、QIAquick(登録商標)スピンハンドブック(18ページ)に従って、QIAquick PCR精製キット(QIAGEN)を用いて精製した。各々のカラムに最高100μlの産物を充填した。増幅された産物を、T10E0.1で溶出した。精製された産物の品質を1%アガロースゲルでチェックし、濃度をナノドロップで測定した(図2)。
両方のコショウ系統からの混合増幅産物を、Margulies他によって記述されるような、454ライフサイエンスシークエンシング技術を用いて、ハイスループットシークエンシングした(Margulies et al., Nature 437, pp. 376-380及びオンライン上の補足)。具体的には、Margulies及び共同研究者等によって記述されるように、エマルジョンPCR増幅及び続く断片シークエンシングを促進するために、AFLP PCR産物を最初に末端を平滑にし、続いてアダプターにライゲーションした。454のアダプター配列、エマルジョンPCRプライマー、配列プライマー及びシークエンスの実行条件は、全てMargulies及び共同研究者等によって記述されるものであった。図1Aに例示されるように、454シークエンシング過程におけるセファロースビーズ上で増幅されたエマルジョン−PCR断片中の機能要素の直線的な順序は、以下のとおりだった:
454 PCRアダプター − 454シークエンスアダプター − 4bp AFLPプライマータグ1 − 選択的なヌクレオチド(複数可)を含むAFLPプライマー配列1 − AFLP断片内部配列−選択的なヌクレオチド(複数可)を含むAFLPプライマー配列2、4bp AFLPプライマータグ2 − 454配列アダプター − 454PCRアダプター − セファロースビーズ
2回の454シークエンスの実行に由来する配列データを、バイオインフォマティクスパイプライン(Keygene N.V.)を用いて加工した。具体的には、未加工の454ベースコール済みシークエンス読み取りを、FASTAフォーマットで変換し、BLASTアルゴリズムを用いて、タグ付けしたAFLPアダプター配列の存在の有無を検査した。既知のタグを付けたAFLPプライマー配列への高い信頼性の一致に際して、配列をトリミングし、制限エンドヌクレアーゼ部位を回復し、適切なタグを割り当てた(それぞれ、サンプル1 EcoRI(ES1)、サンプル1 MseI(MS1)、サンプル2 EcoRI(ES2)、又はサンプル2 MseI(MS2))。次に、33塩基よりも長いトリミングされた配列の全てを、全体の配列相同性に基づくmegaBLAST手順を用いてクラスターに分けた。次に、クラスターを、CAP3の多重アライメントアルゴリズムを用いて、1つのクラスター当たり1つ又は複数のコンティグ及び/又はシングルトンへアセンブリングした。1つより多くの配列を含むコンティグは、推定上の多型性を表わす配列ミスマッチの有無を検査された、配列ミスマッチには、以下の基準に基づく品質スコアを割り当てた:
*コンティグ中の読み取りの数
*観察された対立遺伝子の分布
上の2つの基準は、各々の推定上のSNP/インデルに対応する、いわゆるQスコアのための根拠を成す。Qスコアは0〜1にわたる;両方の対立遺伝子が少なくとも2度観察された場合にのみ、Qスコア0.3が達成される。
*特定の長さのホモポリマー中の位置(調整可能;3塩基以上のホモポリマーに位置する多型性を回避するための初期設定)
*クラスター中のコンティグの数。
*最も近い隣接する配列ミスマッチへの距離(調整可能;フランキング配列を調べる特定の型の遺伝子型決定分析にとって重要)
*サンプル1又はサンプル2で観察された対立遺伝子の関連のレベル;
推定上の多型性並びにサンプル1及び2の対立遺伝子間で一貫して完全な関連が存在する場合には、多型性(SNP)が推定上の「エリート」多型性(SNP)として示される。エリート多型性は、2つのホモ接合体系統が発見過程で用いられた場合に、ユニークゲノム配列又は低コピーのゲノム配列に位置する確率が高いと考えられる。反対に、サンプル起源との多型性の弱い関連は、コンティグ中の非対立遺伝子配列のアライメントから生じる誤った多型性を発見してしまうリスクが高い。
いずれかの側にも12塩基以内の0.1よりも大きいQスコアを有する隣接する多型性はなく、3塩基以上のホモポリマー中に存在しない。抽出基準は、サンプル1及び2で一貫した関連を考慮しなかった、すなわち、SNP及びインデルは必ずしも推定上のエリートSNP/インデルではない。
実施例1において同定された推定上のA/G SNPを検証するために、このSNPのためのタグ付き配列部位(STS)分析を、隣接するPCRプライマーを用いて設計した。PCRプライマー配列は以下のとおりであった:
1つのPCR反応に対して、下記成分を混合した:
5μl 1/10に希釈したAFLP混合物(app.10ng/μl)
5μl 1pmol/μlプライマー 1.2f(500μMストックから直接希釈したもの)
5μl 1pmol/μlプライマー 1.2r(500μMストックから直接希釈したもの)
5μl PCR混合物 −2μl 10×PCR緩衝液
−1μl 5mM dNTPs
−1.5μl 25mM MgCl2
−0.5μl H2O
5μl 酵素混合物 −0.5μl 10×PCR緩衝液
(Applied Biosystems)
−0.1μl 5U/μl AmpliTaq
DNAポリメラーゼ(Applied Biosystems)
−4.4μl H2O
以下のPCRプロフィール:
サイクル1 2分間;94℃
サイクル2〜サイクル34 20秒間;94℃
30秒間;56℃
2分30秒間;72℃
サイクル35 7分間;72℃
∞;4℃
を使用した。
PSP11(配列1):(5’−3’)
実施例1において同定された推定上のA/G SNPを検証するために、コンセンサス配列を用いて、SNPWaveライゲーションプローブセットは、このSNPの両方の対立遺伝子について定義された。ライゲーションプローブの配列は以下のとおりであった:
SNPWaveプローブ配列(5’−3’)
この実施例は、実施例4に記述されていたようなエリート多型性の収率を増加させるために、ユニークゲノム配列の低コピーを標的とする、いくつかの濃縮法を記述する。この方法は4つのカテゴリーに分類することができる:
ここで、大量の葉緑体DNAの共単離を除外するために、実施例4に記述されているような全ゲノムDNAの代わりに、核DNAを調製することを提案する。この調製により、断片ライブラリー調製方法で用いられる制限エンドヌクレアーゼ及び選択的なAFLPプライマーに依存して、植物ゲノムDNA配列数の減少がもたらされ得る。高度に純粋なトマト核DNAの単離のプロトコルは、Peterson, DG., Boehm, K.S. & Stack S.M. (1997)「トマト(Lycopersicon esculentum)からのミリグラム量の核DNAの単離、高レベルのポリフェノール化合物を含む植物(Isolation of Milligram Quantities of Nuclear DNA From Tomato (Lycopersicon esculentum), A Plant Containing High Levels of Polyphenolic Compounds)」Plant Molecular Biology Reporter 15 (2), pages 148-153により記述されている。
ここで、AFLP鋳型調製方法において特定の制限エンドヌクレアーゼを用いることを提案する。この使用は、低コピーのゲノム配列又はユニークゲノム配列を標的とすると予想され、遺伝子型決定分析への転換能力の増加により、多型性について濃縮された断片ライブラリーをもたらす。植物ゲノムにおける低コピー配列を標的とする制限エンドヌクレアーゼの一例は、PstIである。他のメチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼも、低コピーのゲノム配列又はユニークゲノム配列を優先的に標的とし得る。
ここで、選択的増幅の前に、全ゲノムDNAサンプル又は(cDNA−)AFLP鋳型材料のいずれかから、高度に重複した(反復)配列を選択的に除去することを提案する。
最終的に、ここで、任意で、正規化のために上の3b中に記述した、二重鎖特異的なカニのヌクレアーゼの使用と組み合わせて、多型性の発見のための出発物質としてのゲノムDNAとは対照的なオリゴdTでプライミングしたcDNAを用いることが提案される。オリゴdTでプライミングしたcDNAの使用により、葉緑体配列も除外されることに留意されたい。或いは、オリゴdTでプライミングしたcDNAの代わりに、cDNA−AFLP鋳型を、AFLPと同様に、残存する低コピー配列の増幅を促進するために用いる(上の3bも参照)。
この実施例は、実施例4において記述されたSNP発見と同様に、単純反復配列の発見のために提案された戦略を記述する。
2)Kijas及び共同研究者等によって記述された解決法での、(AFLP)断片を取り込むためにビオチン化された捕獲オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを用いる濃縮(Kijas, J.M,. Fowler, J.C., Garbett C.A., and Thomas, M.R., (1994)「ストレプトアビジンがコートされた磁気微粒子に結合したビオチン化オリゴヌクレオチド配列を用いた、柑橘類のゲノムからのマイクロサテライトの濃縮(Enrichment of microsatellites from the citrus genome using biotinylated oligonucleotide sequences bound to streptavidin-coated magnetic particles)」Biotechniques, vol. 16, pp. 656-662)。
混合したタグは、1つのサンプル当たりに、タグ付けされたAFLPプライマーの期待される組合せに加えて、サンプル1のタグを1つの末端に及びサンプル2のタグを他方の末端に含む配列の画分が少量観察されるという観察を示す(実施例4中の表1も参照)。図式的に、混合したタグを含んでいる配列の配置は本明細書において以下で表現される。
実施例9において記述されるような混合したタグを含む低頻度のシークエンス読み取りについての観察の他に、コンカテマーになったAFLP断片から観察された低頻度のシークエンス読み取りが観察された。
Claims (15)
- 3’−T突出部を伴うアダプターを使用して、増幅されたDNAサンプルの混合タグを減少させる方法であって、
DNAサンプルを用意する工程と、
タグ付けされた増幅プライマーを用いて、前記DNAサンプルを増幅し、タグ付けされた増幅産物を生成する工程と、
3’−T突出部を伴うアダプターを前記タグ付けされた増幅産物にライゲーションする工程を含む、方法。 - 前記タグ付けされた増幅産物の末端に3’−A突出部を設けることを特徴とする請求項1に記載された方法。
- 前記DNAサンプルは、複雑度が減少したDNAサンプルであることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 3’−T突出部を伴うアダプターを使用して、DNAサンプルから得られたDNA断片のコンカテマー生成を減少させる方法であって、
DNAサンプルからDNA断片を準備する工程と、
前記DNA断片を研磨してブラントな末端を有するDNA断片を設ける工程と、
ブラントな末端を有するDNA断片の前記末端に、3’−A突出部を設ける工程と、
前記DNA断片にアダプターをライゲートする工程とを含み、
前記アダプターは、前記DNA断片にライゲートされた末端に3’−T突出部を有している方法。 - 前記DNAサンプルは、複雑度が減少したDNAサンプルであるか、及び/又は前記DNA断片は、複雑度が減少したDNA断片であることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 前記DNA断片は、(タグ付けされた)増幅プライマーで増幅され、増幅産物を生成することを特徴とする請求項4又は5に記載の方法。
- 前記アダプターをライゲーションされた前記DNA断片は、固体支持体上でシークエンシングされることを特徴とする請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 3’−T突出部を伴うアダプターを用いて、核酸サンプルにおける少なくとも1つの多型性を同定する方法であって、
a)対象となる複数の核酸サンプルを準備する工程と、
b)対象となる前記複数の核酸サンプルについて複雑度の減少を行ない、前記複数の核酸サンプルの複数のライブラリーを提供する工程と、
c)前記ライブラリー中における複雑度が減少した前記核酸サンプルに、3’−T突出部を伴うアダプターを用いてアダプターをライゲーションする工程と、
d)前記ライブラリーの少なくとも一部をシークエンシングする工程と、
e)工程d)において得られた配列をアライメントさせる工程と、
f)工程e)のアライメントにおいて、前記複数の核酸サンプルの間の1つ又は複数の多型性を決定する工程と、
g)検出プローブを用いて、対象となる検査核酸サンプルをスクリーニングして、工程f)において決定された1つ又は複数の多型性の有無又は量を同定する工程と、
を有する方法。 - 前記検査核酸サンプルが、工程b)に用いられる複雑度の減少を用いて得られた複雑度を減少した核酸サンプルであることを特徴とする請求項8に記載の方法。
- 前記工程b)が、タグを付けたライブラリーを得るための前記ライブラリーにタグを付ける工程をさらに含むことを特徴とする請求項8又は9に記載の方法。
- 前記タグは、前記アダプター又は前記プライマーに設けられていることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記タグが、識別子配列であることを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 前記シークエンシングが、固体支持体上で行なわれることを含むことを特徴とする請求項8に記載の方法。
- スクリーニングがアレイ上に請求項8に記載の工程g)で設計されたプローブの固定化によって行なわれ、その後ハイブリダイズする条件下で、プローブを含む前記アレイを検査ライブラリーと接触させることを特徴とする請求項8〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 濃縮されたマイクロサテライトライブラリーのスクリーニング、転写プロファイリングcDNA−AFLP(デジタルノーザン)の実行、複雑なゲノムのシークエンシング、発現配列タグライブラリーのシークエンシング(全体のcDNA又はcDNA−AFLPについて)、マイクロRNAの検出方法(小さなインサートライブラリーのシークエンシング)、バクテリア人工染色体(コンティグ)シークエンシング、AFLP/cDNA−AFLPと組み合わせたバルクセグレガント分析(Bulked Segregant analysis:バルク分離体分析)アプローチ方法、AFLP断片のルーチン検出方法(マーカー利用戻し交配)のために使用することを特徴とする請求項14に記載の方法。
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