JP5819861B2 - アポトーシス又はネクローシスの発生抑制方法 - Google Patents

Description

本発明は、生細胞において抗アポトーシス効果及び／又は抗ネクローシス効果を誘導するための方法に関する。

従来、１０Ｖ以上５ｋＶ以下の交流電圧を、１μＡ以上１０００ｍＡ以下の微弱電流が流れるよう被処理物に印可することで、コーヒーの酸化を抑制したり、野菜類の鮮度を保持したりする技術が知られている（特許文献１及び２を参照）。しかしながら、微弱電流により食品の酸化抑制及び鮮度保持が可能になる機序はまったく不明であった。

一方、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）とは、多細胞生物の体を構成する細胞の死に方の一種であり、個体をより良い状態に保つために積極的に引き起こされる細胞の自殺、すなわちプログラムされた細胞死として知られている。これに対し、血行不良、外傷などによる細胞内外の環境の悪化によって起こる細胞死は、ネクローシス（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）として知られている。これらアポトーシス及びネクローシスを抑制するために、生細胞に各種薬剤を投与し、抗アポトーシス効果又は抗ネクローシス効果を誘導することが知られているが、生細胞に物理学的刺激となる電流を流すことにより抗アポトーシス効果又は抗ネクローシス効果を誘導することは従来まったく知られていなかった。
特開２００４−３０５０４６号公報 国際公開第２００８／０９６６３１号

本発明は、上記現状に鑑み、薬剤を投与することなく、簡易にかつ制御よく、生細胞において抗アポトーシス効果及び／又は抗ネクローシス効果を誘導するための方法を提供することを目的とするものである。

出願人らが、今回、生細胞に対して微弱電流が及ぼす影響を検討したところ、予想外なことに、極めて低い特定の電流値範囲において、生細胞における抗アポトーシス効果及び／又は抗ネクローシス効果が誘導されることを見出し、本発明に至った。

すなわち本発明は、２５μＡ以上７５μＡ以下の電流が流れるように交流電圧を生細胞に印加することを特徴とする、生細胞における抗アポトーシス及び／又は抗ネクローシス誘導方法に関する。

本発明では、前記生細胞として培養細胞を用いることができる。また、前記交流電圧の電圧値は１０Ｖ以上５ｋＶ以下であることが好ましい。

具体的な態様としては、前記交流電圧を、前記生細胞を保持する収容器が載置された載置部材に印可することで本発明を実施することができる。

本発明によって、薬剤を投与することなく、簡易にかつ制御よく、生細胞において抗アポトーシス効果及び／又は抗ネクローシス効果を誘導することができる。

本発明の一実施形態で使用可能な交流電圧印加装置の構造を示す模式図

図１は、本発明の一実施形態で使用可能な交流電圧印加装置の構造を示す模式図である。この交流電圧印加装置１は、処理槽２を有している。この処理槽は、通常の細胞培養の際に使用される密閉可能な培養機器であってよい。当該培養機器は、内部での温度及び湿度を一定に保持することで細胞培養を可能とする。処理槽２は箱形状を有し、壁部が導電性材料で構成されている。処理槽２の壁部の一部には、生細胞を保持する収容器６を出し入れするための扉２ａが設けられている。

処理槽２の内部には、置き台５が配設されている。置き台５は、例えば、電気絶縁性材料で構成され処理槽２の底面に立設された支持部材４と、支持部材４の先端に配設され導電性材料で構成された板状の載置部材（テーブル）３とを有している。この載置部材３上に収容器６が載置される。収容器６は、通常、上面に窪みを有する器であり、その窪みに、生細胞が収容されて保持される。収容器６としては、一般に、生細胞を保持するためのガラス又は樹脂製のディシュが使用される。

交流電圧印加装置１は、変圧器７を有しており、変圧器７の一対の二次側出力線の一方の端子９は絶縁し、どこにも接続していない。このように、本実施の形態では、収容器６に電圧を印加する側とは反対側の出力端子が絶縁されているので、当該出力端子が開放されている場合に比べて、負荷インピーダンスが小さくなり、そのため、変圧器７の出力電圧を下げることができる。また、変圧器７の一対の二次側端子の他方は、配線１１により安全抵抗Ｒ０を介して処理槽２の置き台５の載置部材３に接続されている。配線１１は処理槽２の壁部とは適宜電気的に絶縁されている。そして、図示されない電圧操作部によって一次電圧Ｖ１を調整することができ、それにより、収容器６に印加される負荷電圧ＶＬを調整することができる。

次に、以上のように構成された交流電圧印加装置を用いて微弱電流を生細胞に流しつつ、生細胞を保持して抗アポトーシス効果及び／又はネクローシス効果を誘導する方法について説明する。

まず、処理槽２のドア２ａを開閉して、置き台５の載置部材３上に、生細胞を保持している収容器６を置く。

次いで、変圧器７の一対の一次側端子間に一次電圧Ｖ１を印加する。この一次電圧Ｖ１は、ここでは商用周波数の正弦波交流電圧である。すると、変圧器７の二次側端子間に二次電圧Ｖ２が誘起され、この二次電圧Ｖ２から安全抵抗Ｒ０による電圧降下を差し引いた負荷電圧ＶＬが収容器６に印加される。収容器６と絶縁された端子９との間は支持部材４と２次側端子間の空気とによって絶縁されているので、変圧器７の二次側回路、ひいては収容器６に、収容器６と２次側端子間の空気との間の負荷インピーダンス（漏れ抵抗や容量）に応じた負荷電流が流れる。この負荷電流は、ごく微弱なものである。収容器６と２次側端子間の空気との間の負荷インピーダンスが非常に大きいからである。そして、この微弱な負荷電流によって、収容器６内に保持された生細胞でアポトーシス及び／又はネクローシスの発生が抑制される。

本発明では、微弱電流を用いることに特徴がある。しかも、負荷電流の電流値が２５μＡ以上７５μＡ以下という極めて狭い範囲において、生細胞での抗アポトーシス効果及び／又は抗ネクローシス効果を誘導することができる。最も好ましくは５０μＡ付近（４０μＡ〜６０μＡ）である。

さらに、本発明は交流電圧を利用するものであり、直流電圧では抗アポトーシス効果及び／又は抗ネクローシス効果を誘導することはできない。

抗アポトーシス効果及び／又は抗ネクローシス効果を誘導するための通電時間は特に限定されない。短い時間であっても相応の効果は得られるが、好ましくは１２時間以上、より好ましくは２４時間以上である。通電時間が長くなると、逆にアポトーシス又はネクローシスを誘導する恐れがあるので、例えば４８時間以内とすることが好ましい。

本発明で使用できる生細胞としては特に限定されないが、ヒト、マウス、ラット等の哺乳類や鳥類等の多細胞生物から採取した生細胞を使用できる。また、生細胞は、通常の培養条件下で培養されている生細胞を使用することができる。

培養条件についても限定されない。生細胞の種類に応じて適切な温度、湿度、雰囲気、培養液、及び添加剤を選択すればよい。本発明では、上述のように、培養細胞を通常の条件下で培養しつつ、微弱電流を流すことで、好適に、抗アポトーシス効果及び／又は抗ネクローシス効果を誘導することができる。

以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
材料および方法
（１）細胞
以下の試験では、培養細胞として、マウス由来で市販の細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を用いた。凍結保存された当該細胞を解凍後、５世代まで継代培養を行い、細胞増殖を安定化した後、試験に供した。

（２）培養環境
６０ｍｍ細胞培養用ディシュ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に５世代ＮＩＨ３Ｔ３細胞（２ｘ１０^７ｃｅｌｌ／ｄｉｓｈ）を、１０％胎児ウシ血清、１％抗生剤及び抗真菌剤、並びに、細胞培養液と共に入れ、ディシュ内で細胞が最大限培養可能な増殖１０割に対し、８割程度まで培養した。

培養はＴｈｅｒｍｏ社製の組織・細胞培養器内で行なった。当該培養器内に、電気絶縁性の支持部材を配置し、さらにその上に、導電性の載置部材を配置した。この載置部材上に上述のディシュを静置し、前記載置部材に、上述した通電装置であるサンテツ技研社製ｄｅｐａｋを接続した。

培養条件は終始温度３７℃、二酸化炭素５％、湿度１００％に設定し、この環境下に於いて通電の有無にかかわらず細胞を培養した。また培養器内の通電装置の接続には細心の注意を払い、通電域に全く干渉が無い事を検出器ＶｏｌｔＡｌｅｒｔ（Ｆｌｕｋｅ，Ｊａｐａｎ，ｗｗｗ．ｆｌｕｋｅ．ｃｏｍ）を用いて頻繁に確認した。

次に、通電装置の設定電流を０μＡ（通電なし）、２５μＡ、５０μＡ、７５μＡの４群に設定し、電圧を１０Ｖ〜１００００Ｖの範囲に設定して正確に２４時間通電を行いつつ各被験細胞を培養した。通電後の培養細胞は、４℃の洗浄液で素早く３度洗浄後、セル・スクレーパー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を用いて物理的に培養ディシュから細胞を剥離し、マイクロ遠心チューブに回収した。４℃にて遠心後上澄液を除き、各グループの細胞よりｍＲＮＡを抽出し計量した。

（３）ｍＲＮＡの抽出及びＰＣＲアレイによる抗アポトーシス関連遺伝子の検査（抗アポトーシス効果の確認）
各群のｍＲＮＡはスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮＩｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いたスピンカラム法にて精製された。次にｍＲＮＡ１０ｎｇを用いてｃＤＮＡへ転写し、それを用いて８４種に及ぶアポトーシス関連遺伝子について、半定量性のあるＰＣＲアレイ（ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）で検索を行った。

遺伝子発現はコントロールの０μＡ（通電なし）の群に対し、他の群が何倍高い発現を示すかを数値化し、表１および２に示した。

各遺伝子の発現に関して、コントロールの群と比べ１．５倍以上の発現を示した遺伝子を増大、０．４０未満の発現を示した遺伝子を減弱として考えると、増大又は減弱の有った遺伝子は以下の通りである。
Ｂｃｌ１０ （増大すると抗アポトーシス効果を示す）
Ｂｃｌ２／１０（減少するとアポトーシス効果を示す）
Ｎａｉｐ１ （減少するとアポトーシス効果を示す）
Ｃａｓｐ１４ （増大するとアポトーシス効果を示す）
Ｈｅｌｌｓ （増大すると抗アポトーシス効果を示す）
ＩＬ１０ （増大すると抗アポトーシス効果を示す）
Ｌｘｈ４ （増大すると抗アポトーシス効果を示す）
Ｎｍｅ５ （増大すると抗アポトーシス効果を示す）
Ｔｒｐ６３ （増大するとアポトーシス効果を示す）
以上の結果より、２５〜７５μＡの微弱電流を通電した群では、抗アポトーシス効果を示す遺伝子（特にＢｃｌ１０、Ｈｅｌｌｓ、Ｌｘｈ４、Ｎｍｅ５）が増強していた。すなわち、通電により抗アポトーシス効果が誘導されることが示された。特に、５０μＡの微弱電流を通電した群での増強効果が著しく、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の２４時間通電時の至適な微弱電流値は５０μＡであることが分子生物学的な手法により判明した。

（４）組織染色法（チャンバー・アッセイ法）を用いた抗ネクローシス効果の確認
４−１）ＡｎｎｅｘｉｎＶ ｘ ＰＩ染色
上述した培養方法でＮＩＨ３Ｔ３細胞をチャンバーに生着させ、アポトーシス細胞膜を検出するＡｎｎｅｘｉｎＶ（緑）と、ネクローシス細胞を検出するＰｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｏ（ＰＩ）（赤）で共染色を行なった。通電装置の設定電流は、０μＡ（通電なし）、２５μＡ、５０μＡ、７５μＡの４群に設定した。

結果、コントロールの０μＡ（通電なし）の群に対し、２５μＡ、５０μＡ、及び７５μＡの群で、通電後ＰＩ陽性細胞の割合が減少した。すなわち、通電により抗ネクローシス効果が誘導されたことが示された。

４−２）ＬＣ３ｘＤＡＰＩ 染色
上述した培養方法でＮＩＨ３Ｔ３細胞をチャンバーに生着させ、ネクローシス蛋白の誘導時に出現するＬＣ３蛋白（赤）と、細胞核を検出するＤＡＰＩ（青）で共染色をおこった。

結果、コントロールの０μＡ（通電なし）の群に対し、２５μＡ、５０μＡ、及び７５μＡの群で、通電後ＬＣ３陽性細胞の割合が減少した。特にコントロールではＬＣ３陽性細胞の割合が５０％であったのに対し、２５μＡの群では２８％、５０μＡの群では１６％と著しく低下することが観察された。この系でも、通電により抗ネクローシス効果が誘導されたことが示された。

（５）フローサイトメトリー法を用いた抗アポトーシス効果及び抗ネクローシス効果の確認
この実験では、フローサイトメトリー法を用いて抗アポトーシス効果及び抗ネクローシス効果を確認した。

上述した培養方法でＮＩＨ３Ｔ３細胞をチャンバーに生着させ、アポトーシス細胞膜を検出するＡｎｎｅｘｉｎＶ（緑）と、ネクローシス細胞を検出するＰｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｏ（ＰＩ）（赤）で共染色を行なった。通電装置の設定電流は、０μＡ（通電なし）、２５μＡ、５０μＡ、７５μＡの４群に設定した。

結果、表３に示すとおり、コントロールの０μＡ（通電なし）の群に対し、２５μＡ、５０μＡ、及び７５μＡの群で、ネクローシス細胞の割合、早期アポトーシス細胞の割合、及び晩期アポトーシス細胞の割合が減少した。従って、フローサイトメトリー法により、通電により抗アポトーシス効果及び抗ネクローシス効果が誘導されたことが示された。

さらに比較実験として、通電装置の設定電流を、１５μＡ又は１００μＡに設定して同様の手法でフローサイトメトリー法を用いて抗アポトーシス効果及び抗ネクローシス効果を確認した。その結果、１５μＡ又は１００μＡの群では、コントロールの０μＡの群と比較してネクローシス細胞の割合が同程度であった。アポトーシス細胞の割合についてはわずかに減少が認められたが、２５μＡ〜７５μＡの群で比較するとその減少の程度はわずかであった。すなわち、１５μＡ又は１００μＡの群では、抗アポトーシス効果及び抗ネクローシス効果の顕著な誘導は確認されなかった。

以上の実験は複数回実施して同傾向の結果が得られており、再現性が確認されている。

本発明によれば、生細胞におけるアポトーシス又はネクローシスの発生を抑制しつつ、生細胞を保持することが可能となる。特に、培養細胞におけるアポトーシス又はネクローシスの発生を抑制することが可能となる。

１ 交流電圧印加装置
２ 処理槽（培養機器）
３ 載置部材
４ 支持部材
５ 置き台
６ 生細胞を保持する収容器
７ 変圧器
９ 端子
１０，１１ 配線

Claims (5)

1. ２５μＡ以上７５μＡ以下の電流が流れるように交流電圧を生細胞に印加することを特徴とする、生細胞におけるアポトーシス及び／又はネクローシスの発生抑制方法。
2. 生細胞が培養細胞である、請求項１記載の方法。
3. 前記交流電圧の電圧値は１０Ｖ以上５ｋＶ以下である、請求項１記載の方法。
4. 前記交流電圧の電圧値は１０Ｖ以上５ｋＶ以下である、請求項２記載の方法。
5. 前記交流電圧を、前記生細胞を保持する収容器が載置された載置部材に印可する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。

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