KR101549573B1 - 아폽토시스 또는 네크로시스 저해 방법 - Google Patents

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Abstract

약제를 투여하지 않고 간단하고 잘 제어되는, 생세포에 있어서 항 아폽토시스 효과 및 / 또는 항 네크로시스 효과를 유도하기 위한 방법을 제공한다. 25μA 이상 75μA 이하의 전류가 흐르도록 교류전압을 생세포에 인가함으로써, 생세포에 있어서 항 아폽토시스 효과 및 / 또는 항 네크로시스 효과를 유도한다. 상기 생세포로 배양세포를 이용할 수 있다. 상기 교류전압은 상기 생세포를 유지하는 수용기가 재치된 재치부재에 인가하여도 좋다.

Description

아폽토시스 또는 네크로시스 저해 방법{Apoptosis or necrosis inhibiting method}
본 발명은, 생세포에 있어서 아폽토시스 및 / 또는 네크로시스를 저해하기 위한 방법에 관한 것이다.
종래 10V 이상 5kV 이하의 교류전압을 1μA 이상 1000mA 이하의 미약한 전류가 흐르도록 피처리물에 인가함으로써, 커피 산화를 억제하거나 야채류의 선도를 유지하는 기술이 알려져 있다(특허문헌1 및 2 참조). 그러나 미약한 전류에 의해 식품 산화억제 및 선도 유지가 가능하게 되는 구조는 매우 불분명하다.
한편, 아폽토시스(apoptosis)란, 다세포생물의 몸을 구성하는 세포가 죽는 방법의 한 종류이며, 개체를 보다 좋은 상태로 유지하기 위해 적극적으로 일으키는 세포자살 즉, 프로그램된 세포사로 알려져 있다. 이에 반해, 혈행불량, 외상 등에 의한 세포내외의 환경악화에 따라 일어나는 세포사는 네크로시스(necrosis)로 알려져 있다. 이들 아폽토시스 및 네크로시스를 억제하기 위해 생세포에 각종 약제를 투여하고, 항 아폽토시스 효과 또는 항 네크로시스 효과를 유도하는 것이 알려져 있지만, 생세포에 물리학적 자극이 되는 전류를 흘리는 것에 의해 항 아포시스 효과 또는 항 네크로시스 효과를 유도하는 것은 종래에 전혀 알려지지 않았다.
특허문헌1: 특개 2004-305046호 공보 특허문헌1: 국제공개 제 2008/096631호
본 발명은 상기 현상을 감안하여, 약제를 투여하지 않고 간단하고 잘 제어되는, 생세포에 있어서의 항 아폽토시스 효과 및 / 또는 항 네크로시스 효과를 유도하기 위한 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
출원인들이 생세포에 대해 미약한 전류가 끼치는 영향을 검토한 결과, 예상외로 매우 낮은 특정 전류값 범위에 있어서 생세포에서의 항 아폽토시스 및 / 또는 항 네크로시스 효과가 유도되는 것을 발견하고 본 발명에 이르게 되었다.
즉, 본 발명은 25μA 이상 75μA 이하의 전류가 흐르도록 교류전압을 생세포에 인가하는 것을 특징으로 하는, 생세포에서의 항 아폽토시스 및 / 또는 항 네크로시스 유도방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 상기 생세포로 배양세포를 사용할 수 있다. 또한 상기 교류전압의 전압값은 10V 이상 5kV 이하인 것이 바람직하다.
구체적인 양태로는 상기 교류전압을 상기 생세포를 유지하는 수용기가 재치(載置)된 재치(載置)부재에 인가함으로써, 본 발명을 실시할 수 있다.
본 발명에 따라 약제를 투여하지 않고 간단하고 잘 제어되는 생세포에 있어서의 항 아폽토시스 효과 및 / 또는 항 네크로시스 효과를 유도할 수 있다.
도 1은, 본 발명의 1 실시태양에서 사용 가능한 교류전압 인가장치의 구조를 도시한 모식도이다.
도 1은, 본 발명의 1 실시태양에서 사용 가능한 교류전압 인가장치의 구조를 도시한 모식도이다. 이 교류전압 인가장치(1)는 처리조(2)를 가지고 있다. 이 처리조는 통상 세포배양 시 사용되는 밀폐가능한 배양기기여도 좋다. 그 배양기기는 내부에서의 온도 및 습도를 일정하게 유지함으로써, 세포배양을 가능하게 한다. 처리조(2)는 상자형상을 가지며, 벽 부위가 전도성 재료로 구성되어 있다. 처리조(2) 벽 부위의 일부에는 생세포를 유지하는 수용기(6)를 넣고 빼기 위한 문(2a)이 설치되어 있다.
처리조(2) 내부에는 받침대(5)가 배설되어 있다. 받침대(5)는 예를 들면, 전기 절연성 재료로 구성되며 처리조(2) 저면에 입설된 지지부재(4)와, 지지부재(4) 선단에 배설되며 전도성 재료로 구성된 판형의 재치부재(테이블)(3)를 가지고 있다. 이 재치부재(3) 위에 수용기(6)가 재치된다. 수용기(6)는 통상 상면에 패임부를 가지는 기기이며, 그 패임부에 생세포가 수용되어 유지된다. 수용기(6)로는 일반적으로 생세포를 유지하기 위한 유리 또는 수지로 만들어진 디쉬가 사용된다.
교류전압 인가장치(1)는 변압기(7)를 가지며, 변압기(7) 한 대의 2차측 출력선의 한쪽 단자(9)는 절연하고, 어디에도 연결하지 않는다. 이와 같이 본 실시태양에서는 수용기(6)에 전압을 인가하는 측과는 반대측의 출력단자가 절연되어 있기 때문에, 그 출력단자가 개방되어 있는 경우에 비해 부하 인피던스가 작아지게 되어서 변압기(7)의 출력전압을 내릴 수 있다. 또한 변압기(7) 한 대의 2차측 단자의 다른 한쪽은 배선(11)에 의해 안전저항(RO)을 통해 처리조(2) 받침대(5)의 재치부재(3)에 연결되어 있다. 배선(11)은 처리조(2) 벽 부위와는 적절히 전기적으로 절연되어 있다. 그리고 도시되지 않은 전압 조작부에 의해 1차 전압 V1을 조정할 수 있고, 그로 인해 수용기(6)에 인가되는 부하전압(VL)을 조정할 수 있다.
다음으로, 이상과 같이 구성된 교류전압 인가장치를 사용하여 미약한 전류를 생세포에 흘리면서 생세포를 유지하여 항 아폽토시스 효과 및 / 또는 네크로시스 효과를 유도하는 방법에 대하여 설명한다.
먼저, 처리조(2) 도어(2a)를 개폐하여 받침대(5)의 재치부재(3) 위에 생세포를 유지하고 있는 수용기(6)를 놓는다.
다음으로, 변압기(7) 한 대의 1차측 단자 사이에 1차 전압(V1)을 인가한다. 그 1차 전압(V1)은 여기에서는 상용주파수의 정현파 교류전압이다. 그러면 변압기(7)의 2차측 단자 사이에 2차 전압(V2)이 유도되고, 이 2차 전압(V2)으로부터 안전 저항(RO)에 따른 전압하강을 뺀 부하전압(VL)이 수용기(6)에 인가된다. 수용기(6)와 절연된 단자(9)와의 사이는 지지부재(4)와 2차측 단자 사이의 공기에 의해 절연되어 있으므로, 변압기(7)의 2차측 회로, 나아가서는 수용기(6)에 수용기(6)와 2차측 단자 사이의 공기와의 사이의 부하 임피던스(누설저항이나 용량)에 따른 부하전류가 흐른다. 이 부하전류는 매우 미약한 것이다. 수용기(6)와 2차측 단자 사이의 공기와의 사이의 부하 임피던스가 매우 크기 때문이다. 그리고 이 미약한 부하전류에 의해 수용기(6) 내에 유지된 생세포에서 항 아폽토시스 및 / 또는 항 네크로시스 발생이 억제된다.
본 발명에는 미약한 전류를 사용하는 것에 특징이 있다. 그리고 부하전류의 전류값이 25μA 이상 75μA 이하라는 매우 좁은 범위에 있어서, 생세포에서의 항 아폽토시스 효과 및 / 또는 항 네크로시스 효과를 유도할 수 있다. 가장 적합하게는 50μA 부근(40μA~60μA)이다.
더욱이 본 발명은 교류전압을 이용하는 것이며, 직류전압에서는 항 아폽토시스 효과 및 / 또는 항 네크로시스 효과를 유도할 수 없다.
항 아폽토시스 효과 및 / 또는 항 네크로시스 효과를 유도하기 위한 통전시간은 특별히 한정되지 않다. 짧은 시간이라도 상응하는 효과는 얻을 수 있지만, 바람직하게는 12시간 이상, 보다 바람직하게는 24시간 이상이다. 통전시간이 길어지게 되면 오히려 아폽토시스 또는 네크로시스를 유도할 우려가 있으므로, 예를 들면 48시간 이내로 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용할 수 있는 생세포로는 특별히 한정되지 않지만, 사람, 마우스, 래트 등의 포유류나 조류 등의 다세포 생물로부터 채취한 생세포를 사용할 수 있다. 또한 생세포는 통상의 배양조건하에서 배양되고 있는 생세포를 사용할 수 있다.
배양조건에 대해서도 한정되지 않는다. 생세포 종류에 따라 적절한 온도, 습도, 분위기, 배양액 및 첨가제를 선택하면 된다. 본 발명에서는 상술한 바와 같이, 배양세포를 통상의 조건하에서 배양하면서 미약한 전류를 흘림으로써, 적절히 항 아폽토시스 효과 및 / 또는 항 네크로시스 효과를 유도할 수 있다.
하기에 실시예를 들어 본 발명을 더 상세하게 설명하겠지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
(1)세포
하기 시험에서는 배양세포로서 마우스 유래의 시판 세포 NIH3T3(ATCC, Manassas, VA)를 사용한다. 동결보존된 그 세포를 해동한 후, 5세대까지 계대배양을 실행하고 세포증식을 안정화한 후, 시험에 제공하였다.
(2)배양환경
60mm 세포배양용 디쉬(BD Bioscience, Bedford, MA)에 5세대 NIH3T3 세포(2×107 cell/dish)를, 10% 태아소혈청, 1% 항생제 및 항진균제 및 세포배양액과 함께 넣고, 디쉬 내에서 세포가 최대한 배양 가능한 증식 10할에 대해 8할 정도까지 배양하였다.
배양은 Thermo사 제품의 조직·세포 배양기 내에서 실행하였다. 그 배양기 내에 전기 절연성 지지부재를 배치하고, 더욱이 그 위에 전도성 재치부재를 배치하였다. 그 재치부재 위에 상술한 디쉬를 정치하고, 상기 재치부재에 상술한 바와 같이, 통전장치인 산테츠 연구사 제품 depak를 연결하였다.
배양조건은 배양 내내 유지되는 온도를 37℃로, 이산화탄소 5%로, 습도 100%로 설정하고, 이 환경 하에 있어서 통전의 유무에 관계없이 세포를 배양하였다. 또한 배양기 내의 통전장치 연결에는 세심한 주의를 기울이고, 통전범위에 전혀 간섭하지 않는 것을 검출기 VoltAlert(Fluke, Japan, )를 사용하여 빈번하게 확인하였다.
다음으로, 통전장치 설정 전류를 0μA(통전없음), 25μA, 50μA, 75μA의 4군으로 설정하고, 전압을 10V~10000V 범위로 설정하여 정확하게 24시간 통전을 실행하면서 각 피험세포를 배양하였다. 통전 후 배양세포는 4℃의 세정액으로 재빠르게 3번 세정한 후, 셀 스크레퍼(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)를 이용하여 물리적으로 배양 디쉬로부터 세포를 박리하고, 마이크로 원심 튜브에 회수하였다. 4℃에서 원심 분리 후 상징액을 제외하고, 각 그룹 세포에서 mRNA를 추출하여 계량하였다.
(3)mRNA 추출 및 PCR 어레이에 따른 항 아폽토시스 관련 유전자 검사(항 아폽토시스 효과 확인)
각 군의 mRNA는 스핀컬럼(QIAGENInc., Valencia, CA)을 이용한 스핀컬럼법으로 정제되었다. 다음으로, mRNA 10ng를 이용하여 cDNA로 전사하고, 그것을 이용하여 84종에 이르는 아폽토시스 관련 유전자에 대해 반정량성 있는 PCR 어레이(SuperArray Bioscience, Frederick, MD)로 검색을 실행하였다.
유전자 발견은 컨트롤 0μA(통전없음) 군에 비해, 다른 군이 몇배 높이 발현을 나타내는지 수치화하고 표 1 및 2에 도시하였다.
Figure 112013029925072-pct00001
Figure 112013029925072-pct00002
각 유전자 발현에 관하여 컨트롤군과 비교하여 1.5배 이상 발현을 나타낸 유전자를 증대, 0.40 미만 발현을 나타낸 유전자를 감약(감쇠)으로 생각하면, 증대 또는 감약이 있는 유전자는 하기와 같다.
Bcl10(증대하면 항 아폽토시스 효과를 나타낸다)
Bcl2/10(감소하면 아폽토시스 효과를 나타낸다)
Naip1(감소하면 아폽토시스 효과를 나타낸다)
Caspl4(증대하면 아폽토시스 효과를 나타낸다)
Hells(증대하면 항 아폽토시스 효과를 나타낸다)
IL10(증대하면 항 아폽토시스 효과를 나타낸다)
Lxh4(증대하면 항 아폽토시스 효과를 나타낸다)
Nme5(증대하면 항 아폽토시스 효과를 나타낸다)
Trp63(증대하면 아폽토시스 효과를 나타낸다)
상기의 결과에서, 25~75μA의 미약한 전류를 통전한 군에서는 항 아폽토시스 효과를 나타내는 유전자(특히, Bcl10, Hells, Lxh4, Nme5)가 증강하고 있다. 즉, 통전에 의해 항 아폽토시스 효과가 유도되는 것이 나타나 있다. 특히, 50μA의 미약한 전류를 통전한 군에서의 증강효과가 현저하여 NIH3T3 세포의 24시간 통전시 최적인 미약한 전류값은 50μA 임이 분자생물학적인 수법에 의해 판명되었다.
(4)조직염색법(chamber assay 법)을 이용한 항 네크로시스 효과 확인
4-1) AnnexinV × PI 염색
상술한 배양 방법에서 NIH3T3 세포를 chamber에 생착시켜, 아폽토시스 세포막을 검출하는 AnnexinV(녹색)과 네크로시스 세포를 검출하는 Propidium Iodido(PI)(적색)에서 공염색을 실시했다. 통전장치의 설정전류는 0μA(통전없음), 25μA, 50μA, 75μA의 4군으로 설정하였다.
그 결과, 컨트롤 0μA(통전없음)군에 비해, 25μA, 50μA 및 75μA군에서 통전 후 PI 양성세포 비율이 감소하였다. 즉, 통전에 의해 항 네크로시스 효과가 유도된 것이 나타났다.
4-2) LC3× DAPI 염색
상술한 배양방법에서 NIH3T3 세포를 chamber에 생착시켜, 네크로시스 단백 유도시에 출현하는 LC3 단백(적색)과 세포핵을 검출하는 DAPI(청색)에서 공염색을 일으켰다.
결과, 컨트롤 0μA(통전없음)군에 비해, 25μA, 50μA 및 75μA의 군에서 통전 후 LC3 양성세포 비율이 감소하였다. 특히, 컨트롤에서는 LC3 양성세포 비율이 50% 인데 비해, 25μA 군에서는 28%, 50μA군에서는 16%로 현저하게 저하하는 것이 관찰되었다. 이 계에서도 통전에 의해 항 네크로시스 효과가 유도된 것이 나타났다.
(5)유동세포분석(flow cytometry)법을 이용한 항 아폽토시스 효과 및 항 네크로시스 효과 확인
이 실험에서는 유동세포분석법을 이용하여 항 아폽토시스 효과 및 항 네크로시스 효과를 확인하였다.
상술한 배양방법에서 NIH3T3 세포를 chamber에 생착시켜, 아폽토시스 세포막을 검출하는 AnnexinV(녹색)과 네크로시스 세포를 검출하는 Propidium Iodido(PI)(적색)으로 공염색을 실시했다. 통전장치의 설정전류는 0μA(통전없음), 25μA, 50μA, 75μA의 4군으로 설정하였다.
비율(%)
네크로시스 세포 초기 아폽토시스 세포 말기 아폽토시스 세포 기타 세포
0μA(컨트롤) 10.74 4.37 32.54 52.36
25μA 1.37 1.74 12.18 84.71
50μA 1.73 0.95 6.92 90.39
75μA 2.42 0.94 4.81 91.83
그 결과, 표 3에 도시한 바와 같이, 컨트롤 0μA(통전없음) 군에 비해, 25μA, 50μA 및 75μA 군에서 네크로시스 세포의 비율, 초기 아폽토시스 세포의 비율 및 말기 아폽토시스 세포의 비율이 감소하였다. 따라서, 유동세포분석법에 따라 통전에 의해 항 아폽토시스 효과 및 항 네크로시스 효과가 유도된 것이 나타났다.
더욱이 비교실험으로 통전장치 설정전류를 15μA 또는 100μA로 설정하여 동일한 수법에서 유동세포분석법을 이용하여 항 아폽토시스 효과 및 항 네크로시스 효과를 확인하였다. 그 결과, 15μA 또는 100μA 군에서는 컨트롤 0μA 군과 비교하여 네크로시스 세포 비율이 같은 정도이었다. 아폽토시스 세포 비율에 대해서는 약간 감소가 인정되었지만, 25μA~75μA 군에서 비교하면 그 감소 정도는 매우 적었다. 즉, 15μA 또는 100μA 군에서는 항 아폽토시스 효과 및 항 네크로시스 효과의 현저한 유도는 확인되지 않았다.
상기의 실험은 여러 차례 실시하여 같은 경향의 결과를 얻었으며, 재현성이 확인되었다.
본 발명에 따르면, 생세포에서의 아폽토시스 또는 네크로시스 발생을 억제하면서 생세포를 유지하는 것이 가능하게 된다. 특히, 배양세포에서의 아폽토시스 또는 네크로시스 발생을 억제하는 것이 가능하게 된다.
1: 교류전압 인가장치
2: 처리조(배양기구)
3: 재치부재
4: 지지부재
5: 받침대
6: 생세포를 유지하는 수용기
7: 변압기
9: 단자
10, 11: 배선

Claims (5)

  1. 25μA 이상 75μA 이하의 전류가 흐르도록 교류전압을 포유류 유래의 배양세포인 생세포에 인가하는 것을 특징으로 하는 생세포에서의 아폽토시스 및 네크로시스 중 하나 이상의 저해방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 교류전압의 전압값은 10V 이상 5kV 이하인 방법
  4. 삭제
  5. 제1항 또는 제3항에 있어서,
    상기 교류전압을 상기 생세포를 유지하는 수용기가 재치(載置)된 재치부재에 인가하는 방법.
KR1020137008840A 2011-01-19 2012-01-18 아폽토시스 또는 네크로시스 저해 방법 KR101549573B1 (ko)

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