JP5811912B2 - 質量分析装置 - Google Patents

Description

本発明は、液体クロマトグラフ等により成分分離されサンプルプレートなどの上にスポッティングされることで調製されたサンプルを質量分析する質量分析装置に関し、さらに詳しくは、試料成分に由来する特定の質量電荷比を有するイオンに対するＭＳⁿ分析（ｎは２以上の整数）を行うことが可能なＭＳⁿ型質量分析装置に関する。

タンパク質の網羅的解析などのプロテオミクスの分野では、液体クロマトグラフ（ＬＣ）とマトリクス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ＝Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization）質量分析装置とをオフラインで接続するＬＣ／ＭＡＬＤＩ-ＭＳの構成がよく用いられる。オフラインＬＣ／ＭＡＬＤＩ-ＭＳでは、液体クロマトグラフのカラムで成分分離された試料溶液をその溶出の時間順序に従って分画し、スポッティング装置によりＭＡＬＤＩ用マトリクスと混合させた上でサンプルプレート上の異なるウェルにスポットする（非特許文献１参照）。そうして多数のサンプルが調製されたサンプルプレートをＭＡＬＤＩ質量分析装置にセットし、各サンプルに対する質量分析を順次行うことでマススペクトル（以下ＭＳスペクトルと称す）又はＭＳⁿスペクトルをそれぞれ求め、そのＭＳスペクトル又はＭＳⁿスペクトルをデータベース検索などの手法で処理することにより目的成分を同定する。

含有成分の網羅的解析を行う際には、カラム出口からの溶出液中に混じっている各種成分を漏れなく分取してサンプルを調製する必要がある。そこで、スポッティング装置では、一定量（又はその量に見合った一定時間）毎に溶出液を異なるウェルに分注する分画が実施される。こうした分画では、カラムにおける試料保持の時間幅がスポッティングの時間間隔を上回ると、図３に示すように、クロマトグラム上で１つのピークに相当する成分（１つの成分又は複数の混合成分）が複数のウェルに分散された状態でスポッティングされることになる。図３の例では、（ｉ）、（ii）、（iii）なる３個のウェル中に形成されたサンプルに、１つのピークに相当する成分が含まれる。

一般的に、ＬＣ／ＭＡＬＤＩ-ＭＳにおいて自動的にＭＳ²分析を実行する際には、スループット向上と検出感度向上のために、衝突誘起解離（ＣＩＤ）等のイオンに対する解離操作を伴わない通常の質量分析により得られたＭＳスペクトルを参照して、同一成分が分散している連続した複数のウェルの中からイオン量が最も多い（イオン強度が最大である）ウェルを選択し、該ウェルのみを用いてＭＳ²分析を行う。

例えばカラムでの成分分離が適切に行われ、１つのピークが１つの成分のみに対応したものである場合には、ＭＳスペクトルには該成分由来の１本の明瞭なピークが現れる。そこで、そのピークの質量電荷比における信号強度が最大であるウェルを選択し、該ウェルに対し上記ピークをプリカーサイオンとするＭＳ²分析を行う。

一方、保持時間がほぼ同一である複数の成分が試料に含まれている場合には、これら複数の成分はカラムで分離されずに混合した状態で溶出する。そのため、クロマトグラム上でこれら複数の成分は１つのピークとして観測され、各成分の量比がほぼ維持された状態で連続する複数のウェルにスポッティングされることになる。このようにして調製されたサンプルに対し質量分析を行うと、ＭＳスペクトル上には成分毎に異なる質量電荷比においてピークが現れる。図３の例では、３つの成分が混在しており、ＭＳスペクトルには各成分に対応した３本の明瞭なピークａ、ｂ、ｃが現れる。ＭＳ²分析を行う際には、分散してスポッティングされた複数のウェルの中から、各成分毎にイオン量が最も多い（信号強度が最大である）ウェルを選択し、そのウェルに対し各成分由来のピークをプリカーサイオンとするＭＳ²分析を行う。

上述したように、試料溶液に含まれる成分のうち、複数成分の保持時間がほぼ同一である場合、複数のウェルにおける各成分の量比はほぼ維持される。そのため、図３に示したように、ＭＳスペクトル上で３つの成分に対応するピークａ、ｂ、ｃの信号強度が最大になるのは同一のウェルである。したがって、３つの成分についてはいずれもウェル（ii）を用いたＭＳ²分析が実行されることになる。また、ＭＡＬＤＩイオン源では１回のレーザ照射で以て必ずしも十分な量のイオンが発生しないことも多いため、或る１つの成分に対する質量分析結果を得るために複数回レーザ照射を行ってそれにより得られたイオン強度を積算するのが一般的である。同一のウェルに対し複数の成分のＭＳ²分析をそれぞれ複数回実行しようとすると、サンプルの消費量が多くなり、前半のＭＳ²分析時にサンプルが枯渇してしまい、後半のＭＳ²分析時に有意なデータが得られなくなる場合もある。

上記のように分析しようとするサンプルが枯渇すると、一部又は全ての成分について良好な、つまり高Ｓ／Ｎ、高感度のＭＳ²スペクトルが得られなくなり、例えばこのＭＳ²スペクトルを用いて成分同定を行う場合には同定精度が低下することになる。なお、上述したようにサンプルの枯渇のおそれがある場合でも、従来の質量分析装置では、選択されなかったウェルはＭＳ²分析の対象とはされずに廃棄されることになり、該ウェルに含まれる試料成分は全く無駄になる。

岩田、ほか６名、「ハイスループットスポッティング装置による多次元LC/MALDI-TOF MSを使ったプロテオミクスオフライン解析法」、島津評論、島津評論編集部、２００４年１０月３０日、第６１巻、第１・２号、ｐ．４９−６１

本発明は上記課題に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、複数のウェルに分散した複数の成分についてのＭＳⁿ分析を実行する際に、試料を有効に利用して、各成分に対し高いＳ／Ｎ、高い感度でＭＳⁿ分析を実行することができる質量分析装置を提供することである。

上記課題を解決するために成された本発明は、クロマトグラフィにより成分分離された試料をその溶出の時間順序に従って分画することで調製された複数のサンプルに対しＭＳⁿ分析（ｎは２以上の整数）を実施する質量分析装置であって、クロマトグラフィにより成分分離されなかった複数の成分が溶出の時間順序で連続するＭ個（Ｍは２以上の整数）のサンプルに含まれる状態である該サンプルに対してＭＳⁿ分析を行う質量分析装置において、
a)前記Ｍ個のサンプルのうちの少なくとも１個のサンプルに対し、解離操作を伴わない質量分析を実施してＭＳスペクトルを取得するＭＳスペクトル取得手段と、
b)前記ＭＳスペクトル取得手段により得られた少なくとも１つのＭＳスペクトルに基づいて、前記Ｍ個のサンプルに含まれる複数の成分由来のピークをそれぞれ抽出するピーク抽出手段と、
c)前記ピーク抽出手段により抽出された複数のピークの中で強度が最小であるピークに対し前記Ｍ個のサンプルの中で総イオン量が最大であるサンプルを割り当て、前記抽出された複数のピークの中で強度が最大であるピークに対しては前記Ｍ個のサンプルの中で総イオン量が最大でないいずれかのサンプルを割り当て、且つ、前記抽出された複数のピークの中で強度が最小及び最大であるピーク以外のピークについて、強度が大きくなる順に、前記Ｍ個のサンプルの中で総イオン量が同一である又は減少するサンプルを割り当てるように、各ピークの強度と各サンプルの総イオン量とに基づいて、各ピークをプリカーサイオンとするＭＳⁿ分析を実行する対象のサンプルを決定するサンプル割当て処理手段と、
d)前記サンプル割当て処理手段により決定された割当てに従って、前記複数の成分毎に、前記Ｍ個のサンプルのうちのいずれかに対し前記複数のピークのいずれかをプリカーサイオンに設定したＭＳⁿ分析を実行してＭＳⁿスペクトルを取得するＭＳⁿスペクトル取得手段と、
を備えることを特徴としている。

本発明に係る質量分析装置において、「クロマトグラフィ」は典型的には液体クロマトグラフィ又はキャピラリ電気泳動である。また、当該質量分析装置がＭＡＬＤＩイオン源やＬＤＩ（＝Laser Desorption/Ionization）イオン源などによるイオン源を搭載したものである場合には、「サンプル」とはサンプルプレート上の各ウェルに形成されたサンプルである。

本発明に係る質量分析装置では、異なる成分由来のピークをプリカーサイオンとしたＭＳⁿ分析をそれぞれ実施するサンプルを決める際に、複数の成分に対する各ピークの強度の大小関係をサンプルの選択に利用する。クロマトグラフィにより成分分離されない複数の成分が含まれる連続したＭ個のサンプルでは、含有量の絶対値はサンプル毎に異なるものの、複数の成分の量比はほぼ一定であると想定される。したがって、Ｍ個のサンプルの中の或るサンプル（通常はクロマトグラム上のピークトップの位置に対応したサンプル）において含有量が相対的に多い成分、つまりはＭＳスペクトル上で高い強度を示すピークに対応した成分は、そのＭ個のサンプル中の他のサンプルにおいても含有量が他の成分に比べて相対的に多い筈である。逆に、Ｍ個のサンプルの中の或るサンプルにおいて含有量が相対的に少ない成分、つまりはＭＳスペクトル上で低い強度を示すピークに対応した成分は、そのＭ個のサンプル中の他のサンプルにおいても含有量が他の成分に比べて相対的に低い筈である。こうしたことから、混在している複数の成分の中で含有量が相対的に多い成分については、必ずしも含有量が最大であるサンプルに対してＭＳⁿ分析を実行しなくても或る程度良好なＭＳⁿスペクトルが得られる。一方、混在している複数の成分の中で含有量が相対的に少ない成分については、含有量が最大であるサンプルであってもその含有量の絶対値は相対的に少ない筈であるから、良好なＭＳⁿスペクトルを得るためには、含有量ができるだけ多いサンプルを優先的に割り当てる必要がある。

そこで、含有量が少ない成分に対して含有量が多いサンプルを優先的に割り当てるために、サンプル割当て処理手段は、抽出された複数のピークの中で強度が最小であるピークに対しＭ個のサンプルの中で総イオン量が最大であるサンプルを割り当て、抽出された複数のピークの中で強度が最大であるピークに対してはＭ個のサンプルの中で総イオン量が最大でないいずれかのサンプルを割り当て、且つ、抽出された複数のピークの中で強度が最小及び最大であるピーク以外のピークについて、強度が大きくなる順に、Ｍ個のサンプルの中で総イオン量が同一である又は減少するサンプルを割り当てる。

ここで、「Ｍ個のサンプルの中で総イオン量が同一である」サンプルとは、Ｍ個のサンプルの中で総イオン量が同一である別々のサンプルであってもよいが、Ｍ個のサンプルの中で同一のサンプルであってもよい。即ち、同じサンプルに対して複数のピークが対応付けられる、つまりは、同じサンプルについて異なるプリカーサイオンを設定した複数のＭＳⁿ分析が実行されるようにしてもよい。ただし、本発明に係る質量分析装置では、従来のように、混在している複数の成分の全てについて同じサンプルに対するＭＳⁿ分析が実行されることはあり得ず、最低でも２個のサンプルに対してＭＳⁿ分析が実行されることになる。換言すれば、ＭＳⁿ分析が実施される対象のサンプルは１つに片寄ることはなく、少なくとも２以上のサンプルに分散したＭＳⁿ分析が実施される。

また、本発明に係る質量分析装置において、好ましくは、前記ピーク抽出手段で抽出されたピークの数ＮがＭ以下である場合、前記サンプル割当て処理手段は、Ｍ個のサンプルから総イオン量が多い順にＮ個のサンプルを選択し、Ｎ本のピークのうち強度が最小であるピークから強度が大きくなる順に、Ｎ個のサンプルの中で総イオン量が大きいサンプルを一対一で割り当てる構成とするとよい。

この構成によれば、混在している成分の数がサンプルの数Ｍ以下である場合には、１つのサンプルに対し１つの成分についてのＭＳⁿ分析しか実行されず、サンプルの枯渇の問題は殆ど生じない。

また本発明に係る質量分析装置では、前記ピーク抽出手段で抽出されたピークの数ＮがＭの倍数である場合、前記サンプル割当て処理手段は、Ｎ本のピークのうち強度が最小であるピークから、強度が大きくなる順にＮ／Ｍ本ずつ組にして、Ｍ個のサンプルの中で総イオン量が大きいサンプルを一対一で割り当てる構成とするとよい。

この構成によれば、混在している成分の数がサンプルの数Ｍの２倍数である場合に、ＭＳⁿ分析が実行されるサンプルが片寄らずバランス良く割り振られ、サンプルの枯渇の問題は殆ど生じない。

本発明に係る質量分析装置によれば、複数の成分が混在して複数のサンプルに分散している場合に、含有量が最大である特定の１つのサンプルのみ集中的に各成分についてのＭＳⁿ分析が実行されることがなく、ＭＳⁿ分析結果、つまりはＭＳⁿスペクトルのＳ／Ｎや感度が十分に確保できるような状態でＭＳⁿ分析実行対象のサンプルが分散される。それにより、データ積算などを目的とした繰り返し分析に際してもサンプルの枯渇を防止することができ、サンプルの枯渇による分析結果の不具合を回避することができる。また、従来は利用されていなかったサンプルを有効に利用することで、分析感度の向上にも繋がる。

本発明の一実施例によるＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＩＴ−ＴＯＦＭＳの概略構成図。 本実施例のＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＩＴ−ＴＯＦＭＳにおけるＭＳ²分析の処理手順を示すフローチャート。 従来のＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＩＴ−ＴＯＦＭＳにおけるＭＳ²分析の問題点を示す説明図。

以下、本発明に係る質量分析装置の一実施例であるＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＩＴ−ＴＯＦＭＳ（液体クロマトグラフ／マトリクス支援レーザ脱離イオン化イオントラップ飛行時間型質量分析装置）について、添付図面を参照して説明する。図１は本実施例のＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＩＴ−ＴＯＦＭＳの概略構成図である。

本実施例のＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＩＴ−ＴＯＦＭＳは、液体試料中の各種成分を保持時間に応じて分離するＬＣ部１と、ＬＣ部１で分離された成分を含む試料を分取・分画してサンプルプレート上のそれぞれ異なるウェルに分注することで分画試料（サンプル）を調製するスポッティング装置２と、分析対象のサンプルプレートが複数である場合にはその中の１つを選択した上で、１枚のサンプルプレートを後述のＭＳ部４のステージ上に搬送する試料搬送部３と、サンプルに対する質量分析（ＭＳ分析、及びｎが２以上であるＭＳⁿ分析）を実行するＭＳ部４と、ＭＳ部４により得られたデータを処理するデータ処理部５と、ＬＣ部１やスポッティング装置２等の各部の動作を制御する分析制御部６と、を備える。

ＬＣ部１は、移動相が貯留された移動相容器１１、移動相を吸引して一定流量で送る送液ポンプ１２、移動相中に試料を注入するインジェクタ１３と、移動相に乗って導入される試料中の各種成分を時間方向に分離するカラム１４と、カラム１４からの溶出液中に含まれる成分を順次検出する吸光検出器などの検出器１５と、を含む。検出器１５は溶出液の流れを乱さず、ＬＣ部１から出てくる溶出液中に含まれる各種成分は時間経過に伴って変化する。

スポッティング装置２は、上記溶出液を所定の時間間隔で分画し、分取した溶出液に所定量のＭＡＬＤＩ用マトリクスを混合させた上でサンプルプレート２１上に形成された異なるウェル２２に順次滴下し、各ウェル２２にサンプルを調製する。即ち、各ウェル２２に形成されたサンプルは、順次異なる保持時間、より厳密に言えば、カラム１４での保持時間が或る保持時間の範囲に入る１乃至複数の成分を含む。もちろん、上述したように溶出液中で或る１つの成分が溶出してくる時間には幅があり、分画時間間隔がこの幅よりも狭い場合には、１つの成分（又は保持時間がほぼ同じである複数成分の混合物）は時間的に連続する複数のウェル２２中のサンプルに含まれる。

ＭＳ部４は、ステージ４１上のサンプルプレートにレーザ光を照射するレーザ光源部４２を含むＭＡＬＤＩイオン源、イオンを内部に保持するとともに質量電荷比m/zに応じてイオンを分離する機能や衝突誘起解離（ＣＩＤ）によりイオンを解離させる機能を有するイオントラップ４３、イオントラップ４３から放出された各種イオンを質量電荷比に応じて分離する飛行時間型質量分析器４４、分離されたイオンを順次検出する検出器４５などを含むＭＡＬＤＩ-ＩＴ-ＴＯＦＭＳであり、ＭＳ分析だけでなく、イオン選択とイオン解離とを１乃至複数回繰り返すＭＳⁿ分析が可能である。

データ処理部５は、ＬＣ部１の検出器１５で得られたクロマトグラムデータをサンプルプレートの番号やサンプルプレート上での各サンプルの位置情報などと関連付けて記憶するクロマトグラムデータ収集部５１と、ＭＳ部４の検出器４５で得られるＭＳスペクトルデータ、ＭＳ²スペクトルデータをそれぞれ記憶するＭＳスペクトルデータ収集部５２、ＭＳ²スペクトルデータ収集部５３と、ＭＳスペクトルに基づいてＭＳ²分析のプリカーサイオンを抽出するプリカーサイオン抽出部５４と、後述するような特徴的な処理を実行してＭＳ²分析の実行対象であるウェルを決定するウェル／プリカーサイオン割当て処理部５５と、を機能ブロックとして含む。

データ処理部５や分析制御部６は、例えばパーソナルコンピュータをハードウエア資源とし、該パーソナルコンピュータにインストールされた専用の制御・処理ソフトウエアを実行することにより、上記のような各機能ブロックが具現化される構成とすることができる。

上記構成のＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＩＴ−ＴＯＦＭＳでは、上述したようにスポッティング装置２において多数のサンプルが搭載されたサンプルプレートは試料搬送部３によりＭＳ部４のステージ４１上にセットされる。元の試料中に含まれる各種成分を網羅的に同定するために、ＭＳ部４ではサンプルプレート上のウェルに形成されたサンプルに対するＭＳ分析やＭＳⁿ分析が行われるが、その際の処理及び制御動作は以下のように実行される。
図２はこの網羅的な同定処理及び制御の動作手順を示すフローチャートである。

データ処理部５においてクロマトグラムデータ収集部５１には、試料に対するクロマトグラムとそのクロマトグラム上の時間とサンプルプレート上のウェルの位置情報（つまりはサンプルの位置情報）とが対応付けて記憶されている。そのため、クロマトグラム上で１つのピークの期間（ピーク開始点からピーク終了点までの期間）に対応するサンプルの位置は既知である。そこで、データ処理部５は、クロマトグラムデータ収集部５１に格納されている情報に基づいて、クロマトグラム上の或る１つのピークに対応する１乃至複数の成分が含まれるウェルを特定し、そのウェルの数Ｍを求める（ステップＳ１）。なお、クロマトグラム上において処理対象のピークは自動的に順次指定されるようにしてもよいし、或いは、図示しない入力部からユーザが手動で指定するようにしてもよい。

１つのピークに対応する１乃至複数の成分が含まれるウェルを特定されると、そのＭ個のウェルの位置情報（サンプルプレート自体の入れ替えが必要である場合にはサンプルプレートを特定する情報も）が分析制御部６に送られる。分析制御部６の制御の下で、ＭＳ部４は指定されたＭ個のウェルに対するＭＳ分析をそれぞれ実行し、ＭＳスペクトルデータ収集部５２はＭＳスペクトルデータを取得する（ステップＳ２）。その結果、例えば図３に示したようなＭＳスペクトルが得られる。上述したように図３は、３つの成分がほぼ同じ保持時間を有し、成分分離されずに１つのピークとして観測される例である。このような場合、時間的に連続する３つのウェルに対する各ＭＳスペクトルに上記３つの成分にそれぞれ対応する３本のピークａ、ｂ、ｃが現れ、それらピークの強度比はほぼ等しくなる。

次に、プリカーサイオン抽出部５４は例えば総イオン量が最大であるウェルに対するＭＳスペクトル又は全てのウェルに対して得られたＭＳスペクトルを積算することで作成した積算ＭＳスペクトル上でピークピッキングを行い、各成分に対応したピークをそれぞれ抽出する（ステップＳ３）。いま、ここでは混在している成分の数がＮであり、Ｎ本のピークが抽出されたものとする。もちろん、ピークピッキングを実施する前に適宜のノイズ除去、バックグラウンド除去などのデータ処理を行うことにより、試料に含まれる分析対象成分とは無関係のノイズを除去することができる。したがって、ＭＳスペクトルからＮ本のピークが抽出された場合には、混在している成分の数はＮであると高い確度で推定することができる。

次に、ウェル／プリカーサイオン割当て処理部５５において、ウェル数Ｍがピーク数Ｎ以上であるか否かが判定される（ステップＳ４）。ここでＹｅｓと判定された場合には、ステップＳ５へと進み、Ｍ個のウェルの中で質量電荷比に依らない総イオン量が多い順にＮ個のウェルを選択する。つまり、ピーク数Ｎと同数のウェルを選択する。もちろん、Ｎ＝Ｍである場合には選択の余地はなく、Ｍ個全てのウェルを指定することになる。そして、Ｎ本のピークの中でイオン強度の低いピークから順に、総イオン量の多いウェルに一対一で割り当てを行う（ステップＳ６）。

一例として、ピーク数Ｎ＝４、ウェル数Ｍ＝６である場合を考える。４本のピークａ、ｂ、ｃ、ｄのピーク強度がｄ＞ｃ＞ｂ＞ａであり、６個のウェルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆの総イオン量がＡ＞Ｂ＞Ｃ＞Ｄ＞Ｅ＞Ｆであるものとする。この場合、ステップＳ４でＹｅｓと判定され、ステップＳ５において、６個のウェルの中から総イオン量が多い４個のウェル、即ち、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄが選択される。そして、ステップＳ６の処理により、各ウェルに割り当てられるピークは、ピークａ→ウェルＡ、ピークｂ→ウェルＢ、ピークｃ→ウェルＣ、ピークｄ→ウェルＤ、となる。

上記のようにしてピーク、つまりプリカーサイオンとウェルとの割当てが決まったならば、この結果が分析制御部６に与えられ、分析制御部６の制御の下、ＭＳ部４はＮ個のウェルに対してそれぞれ１つずつ割り当てられたピークをプリカーサイオンとするＭＳ²分析を実行する（ステップＳ７）。なお、ＭＳ²分析に際しては、例えば同一ウェルへのレーザ照射を複数回繰り返して得られたイオンをイオントラップ４３に一旦捕捉した後に、該イオンをＣＩＤにより開裂させ、開裂により生じた多量のプロダクトイオンを飛行時間型質量分析器４４に導入して質量分析するとよい。こうしたＭＳ²分析により得られたＭＳ²スペクトルデータはＭＳ²スペクトルデータ収集部５３に格納され、図示しない同定処理部はＭＳ²スペクトルを用いたデータベース検索又はデノボシーケンスサーチなどを行うことにより、ペプチドなどの目的成分を同定する（ステップＳ８）。

一方、ステップＳ４でＮｏと判定された場合にはステップＳ１１へと進み、ウェル／プリカーサイオン割当て処理部５５はまず、Ｎ／Ｍを計算する。そして、この計算値の小数点以下を繰り上げた整数値αと、αから１を減じた整数値β（＝α−１）とを算出する。

次に、α本のピークについてＭＳ²分析を実行するウェルの数をｘ、β本のピークについてＭＳ²分析を実行するウェルの数をｙと置き、次の連立方程式(1)を解く（ステップＳ１２）。
ｘ＋ ｙ＝Ｍ
αｘ＋βｙ＝Ｎ …(1)

Ｎ、Ｍ、α、βの値に基づいてｘ、ｙが求まったならば、その後に、Ｎ本のピークの中でイオン強度が低いピークからβ本ずつ、総イオン量が多いウェルから順番にｙ個のウェルに割当てを行う。これにより、Ｎ本のピークの中でβｙ本のピークの割当てが決まる。そのあと、残りのピーク（Ｎ−βｙ本）については、イオン強度が低いピークから順にα本ずつ、残りの総イオン量が多いウェルから順番にｘ個のウェルに割当てを行う。これにより、Ｎ本の全てのピークについて、ＭＳ²分析を実行する対象のウェルの割当てが決まる（ステップＳ１３）。

上述したステップＳ１１〜Ｓ１３による割当て処理は、ピーク数Ｎがウェル数Ｍの２倍数である場合を除き、ピーク強度が低いピークのＭＳ²分析を優先するために、１個のウェルから選択するプリカーサイオン候補の数を、強度が低いピーク数のほうがピーク強度が高いピーク数に比べて常に１つだけ少なくするという意味をもつ。

ここで、プリカーサイオンのピーク本数Ｎ及びウェル数Ｍが具体的に与えられる場合のいくつかの具体例を挙げる。
［例１］ピーク数Ｎ＝４、ウェル数Ｍ＝３である場合
４本のピークａ、ｂ、ｃ、ｄのピーク強度がｄ＞ｃ＞ｂ＞ａであり、３個のウェルＡ、Ｂ、Ｃのイオン総量がＡ＞Ｂ＞Ｃであるものとする。この場合、ステップＳ４でＮｏと判定され、ステップＳ１１において、Ｎ／Ｍ＝４／３＝１．３３、であることから、α＝２、β＝１、と計算される。Ｎ＝４、Ｍ＝３、α＝２、β＝１から(1)式の連立方程式を解くと、ｘ＝１、ｙ＝２、と求まる。ステップＳ１３の処理により、各ウェルに割り当てられるピークは、ピークａ→ウェルＡ、ピークｂ→ウェルＢ、ピークｃ、ｄ→ウェルＣ、となる。

［例２］ピーク数Ｎ＝５、ウェル数Ｍ＝３である場合
５本のピークａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅのピーク強度がｅ＞ｄ＞ｃ＞ｂ＞ａであり、３個のウェルＡ、Ｂ、Ｃのイオン総量がＡ＞Ｂ＞Ｃであるものとする。この場合、ステップＳ４でＮｏと判定され、ステップＳ１１において、Ｎ／Ｍ＝５／３＝１．６７、であることから、α＝２、β＝１、と計算される。Ｎ＝５、Ｍ＝３、α＝２、β＝１から(1)式の連立方程式を解くと、ｘ＝２、ｙ＝１、と求まる。ステップＳ１３の処理により、各ウェルに割り当てられるピークは、ピークａ→ウェルＡ、ピークｂ、ｃ→ウェルＢ、ピークｄ、ｅ→ウェルＣ、となる。

［例３］ピーク数Ｎ＝６、ウェル数Ｍ＝３である場合
６本のピークａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆのピーク強度がｆ＞ｅ＞ｄ＞ｃ＞ｂ＞ａであり、３個のウェルＡ、Ｂ、Ｃのイオン総量がＡ＞Ｂ＞Ｃであるものとする。この場合、ステップＳ４でＮｏと判定され、ステップＳ１１において、Ｎ／Ｍ＝６／３＝２、であることから、α＝２、β＝１、と計算される。Ｎ＝６、Ｍ＝３、α＝２、β＝１から(1)式の連立方程式を解くと、ｘ＝２、ｙ＝０、と求まる。ステップＳ１３の処理により、各ウェルに割り当てられるピークは、ピークａ、ｂ→ウェルＡ、ピークｃ、ｄ→ウェルＢ、ピークｅ、ｆ→ウェルＣ、となる。

このようにピーク数Ｎがウェル数Ｍの倍数である場合には、各ウェルに対し等しい本数ずつピークを割り当てることになる。例えば、ピーク数Ｎ＝９、ウェル数Ｍ＝３の場合には、イオン強度が低いピークから順に、９／３＝３本ずつ、イオン総量の多いウェルに割り当てる。また、ピーク数Ｎ＝８、ウェル数Ｍ＝４の場合には、イオン強度が低いピークから順に、８／４＝２本ずつ、イオン総量の多いウェルに割り当てる。

ただし、この場合、ピーク強度が低いピークのＭＳ²分析を優先するために、次のように割当てを変更してもよい。即ち、ピーク数Ｎ＝６、ウェル数Ｍ＝３である場合には、ピークａ→ウェルＡ、ピークｂ、ｃ→ウェルＢ、ピークｄ、ｅ、ｆ→ウェルＣ、とすることができる。ピーク数Ｎ＝９、ウェル数Ｍ＝３である場合には、ピークａ、ｂ→ウェルＡ、ピークｃ、ｄ、ｅ→ウェルＢ、ピークｆ、ｇ、ｈ、ｉ→ウェルＣ、とすることができる。さらに、ピーク数Ｎ＝８、ウェル数Ｍ＝４である場合には、ピークａ→ウェルＡ、ピークｂ、ｃ→ウェルＢ、ピークｄ、ｅ→ウェルＣ、ピークｆ、ｇ、ｈ→ウェルＤ、とすることができる。

［例４］ピーク数Ｎ＝８、ウェル数Ｍ＝３である場合
８本のピークａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈのピーク強度がｈ＞ｇ＞ｆ＞ｅ＞ｄ＞ｃ＞ｂ＞ａであり、３個のウェルＡ、Ｂ、Ｃのイオン総量がＡ＞Ｂ＞Ｃであるものとする。この場合、ステップＳ４でＮｏと判定され、ステップＳ１１において、Ｎ／Ｍ＝８／３＝２．６７、であることから、α＝３、β＝２、と計算される。Ｎ＝８、Ｍ＝３、α＝３、β＝２から(1)式の連立方程式を解くと、ｘ＝２、ｙ＝１、と求まる。ステップＳ１３の処理により、各ウェルに割り当てられるピークは、ピークａ、ｂ→ウェルＡ、ピークｃ、ｄ、ｅ→ウェルＢ、ピークｆ、ｇ、ｈ→ウェルＣ、となる。

［例５］ピーク数Ｎ＝９、ウェル数Ｍ＝４である場合
９本のピークａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉのピーク強度がｉ＞ｈ＞ｇ＞ｆ＞ｅ＞ｄ＞ｃ＞ｂ＞ａであり、４個のウェルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄのイオン総量がＡ＞Ｂ＞Ｃ＞Ｄであるものとする。この場合、ステップＳ４でＮｏと判定され、ステップＳ１１において、Ｎ／Ｍ＝９／４＝２．２５、であることから、α＝３、β＝２、と計算される。Ｎ＝９、Ｍ＝４、α＝３、β＝２から(1)式の連立方程式を解くと、ｘ＝１、ｙ＝３、と求まる。ステップＳ１３の処理により、各ウェルに割り当てられるピークは、ピークａ、ｂ→ウェルＡ、ピークｃ、ｄ→ウェルＢ、ピークｅ、ｆ→ウェルＣ、ピークｇ、ｈ、ｉ→ウェルＤ、となる。

なお、現実的には、ウェル数Ｍは３〜４個、ピーク数Ｎは１〜９本程度の範囲であることから、上記例のみを挙げたが、理論的には任意のＭ、Ｎに対して適切に割当てを決めることができることは容易に理解できる。

上記のようにしてピーク、つまりプリカーサイオンとウェルとの割当てが決まったならば、この結果が分析制御部６に与えられ、分析制御部６の制御の下、ＭＳ部４はＭ個のウェルのうちの２個以上のウェルに対してそれぞれ１乃至複数割り当てられたピークをプリカーサイオンとするＭＳ²分析を実行する（ステップＳ１４）。その後、上述したステップＳ８へ進み、このＭＳ²分析により得られたＭＳ²スペクトルデータはＭＳ²スペクトルデータ収集部５３に格納され、図示しない同定処理部はＭＳ²スペクトルを用いたデータベース検索又はデノボシーケンスサーチなどにより、ペプチドなどの目的成分を同定する。

以上のようにして本実施例のＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＩＴ−ＴＯＦＭＳによれば、クロマトグラム上の１つのピークに対応したＭ個のウェルの中で、特定の１個のウェルに対して集中的に各成分についてのＭＳ²分析を実行することなく、総イオン量が最大ではない別のウェルも利用して適宜分散したＭＳ²分析が実行される。それにより、特定のウェルだけが集中的にＭＳ²分析されることによるサンプルの枯渇を防止でき、それ故に、高感度、高Ｓ／ＮのＭＳ²スペクトルを得ることができる。

なお、上記実施例ではＭＳ²分析を行う場合について説明したが、ｎが３以上のＭＳⁿ分析を実行する場合のプリカーサイオンとサンプルの割当てを決める場合にも上記手法を適用できることは当然である。

また、上記実施例は本発明の一例にすぎないから、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。

１…ＬＣ部
１１…移動相容器
１２…送液ポンプ
１３…インジェクタ
１４…カラム
１５…検出器
２…スポッティング装置
２１…サンプルプレート
２２…ウェル
３…試料搬送部
４…ＭＳ部
４１…ステージ
４２…レーザ光源部
４３…イオントラップ
４４…飛行時間型質量分析器
４５…検出器
５…データ処理部
５１…クロマトグラムデータ収集部
５２…ＭＳスペクトルデータ収集部
５３…ＭＳ²スペクトルデータ収集部
５４…プリカーサイオン抽出部
５５…ウェル／プリカーサイオン割当て処理部
６…分析制御部

Claims (4)

1. クロマトグラフィにより成分分離された試料をその溶出の時間順序に従って分画することで調製された複数のサンプルに対しＭＳⁿ分析（ｎは２以上の整数）を実施する質量分析装置であって、クロマトグラフィにより成分分離されなかった複数の成分が溶出の時間順序で連続するＭ個（Ｍは２以上の整数）のサンプルに含まれる状態である該サンプルに対してＭＳⁿ分析を行う質量分析装置において、
   a)前記Ｍ個のサンプルのうちの少なくとも１個のサンプルに対し、解離操作を伴わない質量分析を実施してＭＳスペクトルを取得するＭＳスペクトル取得手段と、
   b)前記ＭＳスペクトル取得手段により得られた少なくとも１つのＭＳスペクトルに基づいて、前記Ｍ個のサンプルに含まれる複数の成分由来のピークをそれぞれ抽出するピーク抽出手段と、
   c)前記ピーク抽出手段により抽出された複数のピークの中で強度が最小であるピークに対し前記Ｍ個のサンプルの中で総イオン量が最大であるサンプルを割り当て、前記抽出された複数のピークの中で強度が最大であるピークに対しては前記Ｍ個のサンプルの中で総イオン量が最大でないいずれかのサンプルを割り当て、且つ、前記抽出された複数のピークの中で強度が最小及び最大であるピーク以外のピークについて、強度が大きくなる順に、前記Ｍ個のサンプルの中で総イオン量が同一である又は減少するサンプルを割り当てるように、各ピークの強度と各サンプルの総イオン量とに基づいて、各ピークをプリカーサイオンとするＭＳⁿ分析を実行する対象のサンプルを決定するサンプル割当て処理手段と、
   d)前記サンプル割当て処理手段により決定された割当てに従って、前記複数の成分毎に、前記Ｍ個のサンプルのうちのいずれかに対し前記複数のピークのいずれかをプリカーサイオンに設定したＭＳⁿ分析を実行してＭＳⁿスペクトルを取得するＭＳⁿスペクトル取得手段と、
   を備えることを特徴とする質量分析装置。
2. 請求項１に記載の質量分析装置において、
   前記ピーク抽出手段で抽出されたピークの数ＮがＭ以下である場合、前記サンプル割当て処理手段は、Ｍ個のサンプルから総イオン量が多い順にＮ個のサンプルを選択し、Ｎ本のピークのうち強度が最小であるピークから強度が大きくなる順に、Ｎ個のサンプルの中で総イオン量が大きいサンプルを一対一で割り当てることを特徴とする質量分析装置。
3. 請求項１に記載の質量分析装置において、
   前記ピーク抽出手段で抽出されたピークの数ＮがＭの倍数である場合、前記サンプル割当て処理手段は、Ｎ本のピークのうち強度が最小であるピークから、強度が大きくなる順にＮ／Ｍ本ずつ組にして、Ｍ個のサンプルの中で総イオン量が大きいサンプルを一対一で割り当てることを特徴とする質量分析装置。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の質量分析装置であって、
   マトリクス支援レーザ脱離イオン化法によるイオン源を用いたことを特徴とする質量分析装置。

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