JP5804148B2 - 管内で対象成分を操作するための操作管 - Google Patents
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Description
(3)前記磁場印加手段が、前記操作管の外部において、前記操作管の長手方向に前記磁性体粒子を移動させることができるものである、(1)又は(2)に記載のデバイス。
(5)前記保持手段が、前記操作管の閉口端部を保持することができる保持穴が複数形成された保持基板である、(4)に記載のデバイス。上記(5)の保持基板である保持手段の例は、図5及び図7の51として示されている。
(6)前記保持手段が温度制御機能を有する、(4)又は(5)に記載のデバイス。
(7)前記保持手段が前記磁場印加手段の前記操作管の長手方向への移動を許す凹所を有するものである、(4)〜(6)のいずれかに記載のデバイス。上記(7)の凹所を有する保持手段の一例は、図7の51として示されている。
(8)前記保持手段が光学的検出口を有するものである、(4)〜(7)のいずれかに記載のデバイス。
(10)前記磁場印加手段が温度制御機能を有する、(1)〜(9)のいずれかに記載のデバイス。
(11)前記磁場印加手段が、前記操作管の長手方向に移動することができる可動基板と、前記可動基板中に保持された複数の磁力源とを含む、(5)〜(10)のいずれかに記載のデバイス。上記(11)の磁場印加手段の一例は、図5の可動磁石板53として示されている。
(12)前記操作管の長手方向への磁場の移動と磁場の強度との制御を行う機構が、前記可動基板中において前記複数の磁力源を同時に移動させるものである、(11)に記載のデバイス。上記(12)の機構を有する可動基板の一例は、図6に示されている。
(14)前記操作用媒体が、核酸増幅反応液からなる水系液体層、又は、逆転写反応液からなる水系液体層及び核酸増幅反応液からなる水系液体層をさらに含む、(13)のいずれかに記載のデバイス。
(16)前記操作管が、操作部A及び回収部Bを有し、前記操作管を構成する前記管が、前記操作部A及び前記回収部Bにそれぞれ対応する操作用管部a及び回収用管部bを有し、前記操作部Aが、前記管部aと、前記管部a内に収容された前記操作媒体とを含み、前記回収部Bが、前記管部bと、前記管部b内に収容され且つ水系液体層及びゲル層のいずれか一方を少なくとも含む回収用媒体とを含む、(1)〜(15)のいずれかに記載のデバイス。上記(16)の操作管の一例は、図1(3)に示されている。
(17)前記操作用管部aと前記回収用管部bとが分離可能である、(16)に記載のデバイス。
(18)前記管の材質が、ポリエチレン、ポリプロピレン、フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリカーボネート、アクリロニトリルブタジエンスチレンコポリマー(ABS樹脂)、アクリロニトリルスチレンコポリマー(AS樹脂)、アクリル樹脂、ポリ酢酸ビニル、ポリエチレンテレフタレート、環状ポリオレフィン及びガラスからなる群から選ばれる、(1)〜(17)のいずれかに記載のデバイス。
(24)前記工程(vii)において、前記最下層が核酸増幅反応液からなり、前記核酸増幅反液中で精製核酸中の標的核酸の増幅が行われる、(23)に記載の方法。上記(24)において、前記核酸がRNAである場合、核酸増幅反応液からなる最下層の直上の層は、逆転写反応液からなる。
(25)前記核酸増幅反応による生成物をリアルタイムで光学的に検出する、(24)に記載の方法。
[1−1.対象成分]
本発明において操作される対象成分は、通常水系液体中、エマルジョン中、或いはヒドロゲル中で操作されうる成分であれば特に限定されず、生体内成分及び非生体内成分を問わない。生体内成分には、核酸(DNA及びRNAを含む)、タンパク質、脂質、糖などの生体分子が含まれる。非生体内成分には、前記の生体分子の人為的(化学的及び生化学的を問わない)修飾体、ラベル化体、変異体などの非生体分子、天然物由来の非生体分子、その他水系液体中で操作されうるいかなる成分も含まれる。
[1−2−1.操作の態様]
本発明においては、上記対象成分を含む試料は図1中の1として例示される操作管の中に供給され、操作管の中で対象成分が操作される。本発明における対象成分の操作は、上記の対象成分を種々の処理に供すること、及び、種々の処理行う複数の環境の間で上記対象成分を運搬することを含む。後に詳述するが、操作管にはゲル層と水系液体層とを収容している。例えば、図1に例示する態様においては、2g及び3gで示される層がゲルからなるもの(ゲルプラグ)であり、3lで示される層が水系液体からなるものである。4で示される層は、水系液体からなってもよいし、水系液体がゲル状態を維持できればヒドロゲルからなってもよい。水系液体やヒドロゲルは、対象成分の処理を行う環境を構築するものである。従ってより具体的には、本発明における対象成分の操作は、対象成分を水系液体やヒドロゲル内で処理に供すること、及び、ゲルプラグを介して、処理を行う複数の環境の間で対象成分を運搬することを含む。
対象成分が供される処理には、対象成分の物質変化を伴うもの、及び物理変化を伴うものが含まれる。
対象成分の運搬は、磁性体粒子及び磁場印加手段によって行われる。磁性体粒子は、操作の際には操作管の中に存在するものであり、対象成分をその表面に結合又は吸着させることによって捕捉した状態で操作管内を移動することにより、対象成分を運搬することができるものである。磁性体粒子は、操作管内の水系液体層中において分散することができ、通常操作管外部から磁場印加手段で磁場を生じさせることによって水系液体層中で凝集する。凝集した磁性体粒子は、操作管外部から磁場印加手段によって生じさせられた磁場の変動に伴って移動することができる。凝集した磁性体粒子は、ゲル層中に移動することができる。3−2−3で後述するゲルのチキソトロピックな性質(揺変性)を利用することにより、凝集した磁性体粒子はゲル層を破壊することなく通過することができる。ゲル中において、凝集した磁性体粒子は対象成分を結合又は吸着により伴っている。凝集した磁性体粒子群は、厳密には極僅かな水系液体にコートされている。すなわち、対象成分以外の成分を伴いうる。しかしコートされている水系液体の量が極僅かであるため、水系液体はほとんど引き連れないといえる。このため、対象成分の運搬を非常に効率よく行うことができる。
[2−1.操作管の構造]
本発明のデバイスは、操作管を有する。図1を参照して操作管の構造を説明する(以下の説明において、上下は、図1を基準としていうものとする)。操作管を構成する管は、上端が試料投入のため開口しており、コンタミネーションの観点から、開口端は閉鎖可能であることが好ましい。下端は閉鎖されている。通常、操作管を構成する管は横断面略円形であるが、その他の形の横断面を有する管を除外するものではない。管内には、水系液体層l及びゲル層gが管の長手方向に交互に重層した操作媒体が収容されている。なお、図1においては、操作管の上部及び下部の態様が異なる(1)〜(3)の3つの態様を例示している。しかしながら、上部と下部とは任意に組み合わせられるものであって、これら(1)〜(3)で示す組み合わせに限られるものではない。
操作管を構成する管の略内径は、例えば0.1mm〜5mm、好ましくは1〜2mmである。この程度の範囲であれば、操作管が良好な操作性を有することができる。上記範囲を下回ると、強度維持のため、管壁を厚くせざるを得ず、磁性粒子と磁石との距離が広がり、磁性体粒子への磁力が届きにくくなることで、操作上問題を生じる可能性はある。一方、管の内径が上記範囲を上回ると、操作用媒体を構成するゲル層と水系液体層との複層が外部からの衝撃や重力の影響等で乱れやすくなる傾向にある。なお、本発明においては、キャピラリー材質が高精度加工に耐えうるならば、内径0.1mm以下の管であることを除外するものではない。操作管の長手方向の長さは、例えば1〜30cm、好ましくは5〜15cmである。
操作管を構成する管の材質としては特に限定されない。例えば、ゲル層内において対象成分と微量の液体が磁性体粒子とともに移動する際の移動抵抗を下げるために、搬送面である内壁が滑らかでかつ撥水性であるものが挙げられる。そのような性質を与える材質として、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、フッ素樹脂(テフロン(登録商標))、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリカーボネート、アクリロニトリルブタジエンスチレンコポリマー(ABS樹脂)、アクリロニトリルスチレンコポリマー(AS樹脂)、アクリル樹脂、ポリ酢酸ビニル、ポリエチレンテレフタレート、環状ポリオレフィンなどの樹脂素材が挙げられる。樹脂素材であることは、操作管を落としたり曲げたりしても操作管内の層が乱れにくく堅牢性が高い点で好ましい。また、管の材質は、透明度、耐熱性及び/又は加工性の上で必要であればガラスであってもよい。また、試薬供給部5、操作用管部a、及び回収用管部bの材質は、同じであってもよいし、異なっていてもよい。
管の材質は、操作時における視認性の観点や、管外部から吸光度、蛍光、化学発光、生物発光、屈折率の変化等の測定を行う場合に、光学的な検出を行う観点などから、光透過性を有するものであることが好ましい。
[3−1.操作用媒体]
操作管内には、少なくとも、水系液体の層とゲルの層とが交互に重層した複層が操作用媒体として収容される。最上層は、ゲル層であってもよい(図1(1))し、水系液体層であってもよい(図1(2)及び(3))。また、最上の層が水系液体層である場合、その層中に磁性体粒子6が含まれていてもよいし(図1(3))、含まれていなくてもよい(図1(1)及び(2))。最下層は、水系液体層であってもよい(図1(1)〜(3))し、ゲル層であってもよい。
ゲル層は、管内で水系液体とともに重層された場合に、水系液体層を構成する液体に不溶性又は難溶性である化学的に不活性な物質からなる。液体に不溶性又は難溶性であるとは、25℃における液体に対する溶解度が概ね100ppm以下であることを意味する。化学的に不活性な物質とは、対象成分の操作(すなわち、水系液体中又はヒドロゲル中における対象成分の処理、及び、ゲルプラグを介した対象成分の運搬)において、対象成分及び水系液体又はヒドロゲルに化学的な影響を及ぼさない物質を指す。本発明におけるゲルには、オルガノゲルとヒドロゲルとの両方が含まれる。
オルガノゲルは、通常、非水溶性又は水難溶性である液体物質にゲル化剤を添加してゲル化され得るものである。
[3−2−1−1.非水溶性又は水難溶性である液体物質]
非水溶性又は水難溶性である液体物質としては、25℃における水に対する溶解度が概ね100ppm以下であり、常温(20℃±15℃)において液体状であるオイルが用いられうる。例えば、液体油脂、エステル油、炭化水素油、及びシリコーン油からなる群から1種又は2種以上が組み合わされて用いられうる。
ゲル化剤としては、ヒドロキシ脂肪酸、デキストリン脂肪酸エステル、及びグリセリン脂肪酸エステルからなる群から選ばれる油ゲル化剤が1種又は2種以上組み合わされて用いられうる。
ヒドロゲルとしては、例えば、ゼラチン、コラーゲン、デンプン、ペクチン、ヒアルロン酸、キチン、キトサンまたはアルギン酸及びこれらの誘導体をヒドロゲル材料として、ヒドロゲル材料を水又は水系液体に平衡膨潤させることによって調製されたものが用いられうる。上述のヒドロゲルの中でも、ゼラチンから調製されるヒドロゲルを用いることが好ましい。また、ヒドロゲルは、上記のヒドロゲル材料を化学架橋し、又は、ゲル化剤(例えばリチウム、カリウム、マグネシウムなどのアルカリ金属・アルカリ土類金属の塩、或いはチタン、金、銀、白金等の遷移金属の塩、さらには、シリカ、カーボン、アルミナ化合物等)で処理して得てもよい。これら化学架橋やゲル化剤は、当業者であれば容易に選択することができる。
管に収容したゲルは、ある温度を境にゾル−ゲル転移を起こす特性を有する。ゾル−ゲル転移点は、25〜70℃の範囲でありうる。ゾル−ゲル転移点がこの範囲であることは、回収等でゾル化による流動性を必要とする反応システムにおいて望ましい。ゾル−ゲル転移点は、オルガノゲル材料(オイル)やヒドロゲル材料の種類、ゲル化剤の種類、及びゲル化剤の添加量などの条件によって変動しうる。従って、当該各条件は、所望のゾル−ゲル転移点を有するよう、当業者によって適宜選択される。
本発明における水系液体は、ゲルに不溶性又は難溶性である水系液体であれば良く、水、水溶液又はエマルジョンと呼ばれる乳濁液、若しくは、微粒子が分散した懸濁液の態様で提供されうる。水系液体の構成成分としては、本発明における対象成分が供される反応や処理の環境を提供するいかなるものも含まれる。
細胞溶解液としては、カオトロピック物質を含有する緩衝液が挙げられる。この緩衝液は、EDTAその他の任意のキレート剤やTritonX−100その他の任意の界面活性剤をさらに含むことができる。緩衝液は、例えばトリス塩酸、その他の任意の緩衝剤に基づく。カオトロピック物質としては、グアニジン塩酸塩、グアニジンイソチアン酸塩、ヨウ化カリウム、尿素などが挙げられる。
洗浄液としては、核酸が磁性体粒子表面に吸着したまま、核酸含有試料に含まれる核酸以外の成分(例えば蛋白質、糖質など)や、核酸抽出など予め行われた他の処理に用いられた試薬その他の成分を溶解できる溶液であることが好ましい。具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム等の高塩濃度水溶液、エタノール、イソプロパノール等のアルコール水溶液などが挙げられる。核酸の洗浄は、すなわち、核酸が吸着した磁性体粒子の洗浄である。この洗浄の具体的プロトコールも、当業者が適宜決定することができる。また、核酸が吸着した磁性体粒子の洗浄の回数は、核酸増幅反応の際に不所望の阻害が生じない程度に当業者が適宜選択することができる。また、同様の観点で阻害成分の影響が無視できる場合、洗浄工程を省略することも可能である。洗浄液からなる水系液体層は、少なくとも洗浄する回数と同じ数だけ調製される。
核酸溶出液としては、水又は塩などを含む緩衝液を用いることができる。具体的には、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、蒸留水などを用いることができる。核酸が吸着した磁性体粒子から核酸を分離し溶出液中へ溶出させる具体的方法も、当業者が適宜決定することができる。
本発明における核酸増幅反応液には、通常核酸増幅反応に用いられる種々の要素に、少なくとも増幅すべき塩基配列を含む核酸及びそれを表面に吸着した磁性体粒子が含まれる。
上記以外のいかなる反応及び処理についても、それぞれの水系液体の組成は、当業者が容易に決定することができる。また、対象成分が上記の核酸以外の場合であっても、それぞれの水系液体の組成は当業者が容易に決定する
事ができる。
操作管の作製方法としては、操作用媒体である複層が収容されるべき管が用意される態様によって、以下の2つの方法が挙げられる。
この作成方法を行う場合としては、管が一体形成された状態で用意される場合や、管が操作用管部aと回収用管部bとから構成される場合であって、管部aと管部bとが連結された状態で用意される場合が当てはまる。一本の管内において、下部閉口端から必要な順番で、必要な水系液体及びゲルを交互に重層させるように充填することによって操作用媒体を形成し、操作管を作製することができる。管が操作用管部aと回収用管部bとから構成される場合は、まず、回収部Bを構成するために必要な回収用媒体の収容、すなわち、水系液体の収容、ゲルの収容、又は水系液体層とゲル層との複層形成が完了した時点で、回収部Bが完成する。さらに、操作部Aを構成するために必要な操作用媒体の収容、すなわち水系液体層及びゲル層の複層を形成することによって、操作部Aが完成する。水系液体及びゲルを交互に重層させて複層を形成するより具体的な方法は、後述4−2の場合における重層方法に準じて、当業者が適宜行うことができる。なお、必要な水系液体及び/又はゲルを収容した後は、上部開口端である試料供給部が適宜閉鎖されてよい。
この作成方法を行う場合としては、管が操作用管部aと回収用管部bとから構成される場合であって、管部aと管部bとが独立し状態で用意される場合が当てはまる。この場合、管部a内及び管部b内のそれぞれにおいて必要な水系液体及び/又はゲルを収容することによって操作部A及び回収部Bを別々に作製し、作製された操作部Aと回収部Bとを互いに連結することによって、操作管を作製することができる。
磁性体粒子は、操作管外からの磁場の変動によって、操作管内における対象成分を、付随する少量の液体塊と共に引き連れることにより移動させるために使用される。そのような移動によって特定成分の分離、回収、精製を可能にする目的とした磁性体粒子は、通常その表面に化学官能基を有する。磁性体粒子は予め操作管内に収容されていなくともよい(図1(1)及び図1(2))し、収容されていてもよい(図1(3)、図3及び図4)。予め操作管内に収容されている場合は、最上層を構成する水系液体の中に含ませることができる。磁性体粒子が予め操作管内に収容されていない場合は、対象成分を有する試料を操作管内に供給する際に、磁性体粒子も操作管内に供給される。
操作管内での対象成分の操作を、図3(0)〜(14)及び図4(0)〜(7)に示されている。以下、図3及び図4に基づいて説明する。
操作管の使用の際には、試薬供給口5から対象成分を含む試料32を供給する(図3(1)及び図4(1))。通常、試料は液状の態様で供給される。試料供給は、注射器などによって手動で行ってもよいし、ピペッターなどを用いる分注機で自動制御して行ってもよい。試料供給は、操作管を適当な保持手段(図示せず;なお操作管を保持するための保持手段については後述の項目7に詳述する)によって立てた状態で行われうる。
試料を供給し、最上層で試料と磁性粒子とを含む水系液体混合物が調製された操作管は、保持手段に立てた状態でそのまま、又はデバイス内専用の保持手段に移しかえる要領で、デバイスにセットすることができる。デバイス内においては、外部から磁場印加手段(例えば直径1mm〜5mm、長さ5mm〜30mmの円筒形ネオジム磁石)31を操作管1に近づけることによって磁場を生じさせ、水系液体混合物層3l1に分散していた磁性体粒子6を対象成分と共に凝集させる(図3(2)及び図4(2))。このとき、水系液体混合物層3l1に含まれていた不要成分も共に凝集しうる。磁場印加手段31を下へ毎秒0.5mm〜10mmの速度で移動させることによって、対象成分を引き連れる磁性体粒子を、水系液体混合物層3l1からそれに接する直下のゲル層3g1を介し(図3(3)及び図4(3))、ゲル層3g1に接する直下の水系液体層3l2へ運搬する(図3(4)及び図4(4))。なお、ゲル層3g1を通過している磁性体粒子は、通過前に供された水系液体混合物層3l1の水系液体混合物に薄くコートされているため、対象成分の他にも、濃度は低くなったものの夾雑成分を伴っている。そのような磁性体粒子がさらに水系液体層3l2へ運搬される。磁石の大きさ及び移動速度は、磁性粒子の量、操作管の内径・外径、ゲルプラグの状態等に応じて、当業者によって適宜決定される。
すように同様に直下のゲル層3g2へ運搬される。図3(6)におけるゲル層3g2内の磁性体粒子及び対象成分においては、図3(4)における洗浄により、図3(3)におけるゲル層3g1内の磁性体粒子及び対象成分におけるよりも、付随成分の一部又は大部分が取り除かれている。
例えば磁性粒子表面がシリカ被膜されている場合、図3に示すように、生体試料は、界面活性剤とグアニジンチオシアネート等のカオトロピック塩とを含む細胞溶解液3l1に供されることによって、核酸を細胞から遊離させる(図3(1))。遊離した核酸は粒子のシリカ表面に特異的に吸着させることができる。吸着した核酸はそのままでは反応阻害成分を伴っているため遺伝子増幅反応の鋳型として利用できない。このため、表面に核酸を吸着させたまま磁性粒子を洗浄液3l2で洗浄する。この際に反応阻害成分を洗浄液中に大量に持ち込まないようにするため、磁性体粒子6を磁石31によって集めて(図3(2))、細胞溶解液3l1と洗浄液3l2とを隔てるゲルプラグ3g1の中を通過させる(図3(3))。磁性体粒子がゲルプラグ3g1内を通過する際、液画分をほとんど引き連れずに洗浄液3l2に到達することができる(図3(4))。このため、高効率で磁性粒子の洗浄を実施することができる。磁性体粒子のさらなるゲルプラグ(3g2、3g3)内の通過及び洗浄液(3l3、3l4)への運搬を繰り返す(図3(5)〜(10))ことによって、核酸の精製度を上げることができる。磁性体粒子表面に吸着した状態で精製された核酸は磁石によって再び集められ(図2(11))ゲルプラグ2g内を通過させ(図3(12))、溶出液4中へ運搬される(図3)(13)。溶出液4中では磁性体粒子から核酸が分離し溶出液中に溶出する。磁性体粒子の混入を望まない場合、核酸を溶出させた磁性体粒子は再びゲルプラグ2gにとどめおかれ、回収部Bには溶出された精製核酸が残る(図3(14))。このようにして得られた核酸は、核酸増幅反応による分析が可能な鋳型核酸として有用である。得られた核酸は、操作管の回収部Bを操作部Aから取り外すことによって、次の操作(核酸増幅反応による分析を行う工程)に供することができる。
また、図4に示すように、操作管の操作部Aの管部a及び回収部Bの管部bが一体成形され、図3におけるものと同様の操作部Aと、ゲルプラグ4gで仕切られたRT反応液4l1及びPCR反応液4l2が収容された回収部Bとを有する操作管を使用する場合は、図3(1)〜(12)と同じ操作(図4(1)〜(5))を行った後、磁性体粒子6は精製された核酸(RNA)を吸着したままRT反応液4l1に運ばれ、RT反応が行われる(図4(7))。RT反応終了後、磁性体粒子は、RT反応によって得られたDNA(PCR反応の鋳型となる)も吸着してゲルプラグ4g中を通過してPCR反応液4l2に運ばれ、PCR反応が行われる(図4(7))。PCR生成物は、蛍光色素によるリアルタイム検出法又はエンドポイント検出法による蛍光検出法によって分析することができる。なお、図4において、42及び43は温度制御機能を模式的に示したものである。42の温度制御機能のより具体的な例は、後述の項目8−2−6で述べ、43の温度制御機能のより具体的な例は、後述の項目7−3で述べる。
[6−5−1.ヒドロゲル(P−ゲル)を用いたタンパク質合成]
ポリジメチルシロキサンを基剤とした無細胞タンパク合成システムが、前述の参考文献(Nature materials 8,432−437,2009)に発表さている。この無細胞タンパク質合成システムは、汎用の試料チューブで行われるものであるが、本発明の操作管内においても、そのような無細胞タンパク質合成システムを構築することができる。
タンパク質とそれを標的として製造された抗体(これもタンパク質である)による抗原抗体反応を利用した、タンパク質の分離、回収手段が市販精製キットですでに存在している。それらは汎用のチューブと遠心機とを用いたプロトコールで実施されている。上述の無細胞タンパク質システムにおいても、合成されたタンパクの分離には、試料チューブとは別にスピンカラムが使用される。本発明においては、表面に目的タンパク質の抗体を固定した磁性体粒子を採用することにより、目的タンパク質を異なるデバイス間で移動させることなく、1つの操作管内で目的タンパク質の分離及び取得を行うことができる。
表面に酸化チタンをコーティングした磁性体粒子に、別途調製された質量分析すべきタンパク質を吸着させ、そのままマトリックスと混合させて質量分析機で解析する手法が、参考文献(Analytical Chemistry,77,5912−5919,2005)等に記載されている。本発明においては、質量分析すべきタンパク質の調製及び磁性体粒子への吸着を、1つの操作管内で行うことができる。
操作管は、通常、使用の際には開口部である試料供給部が上となるように略垂直状に(すなわち立てた状態で)設置される。設置には、適当な保持手段を用いることができる。また保持手段は、試料供給時と対象成分操作時において同じものが用いられてもよいし、異なるものが用いられてもよい。試料供給時と対象成分操作時において異なる保持手段が用いられる場合は、保持手段間の操作管の移し変えは、手動でもよいし、自動化されていてもよい。
保持手段としては、一般的に操作管の開口部である試料供給部が上となるように略垂直状に(すなわち立てた状態で)保持することができるものであれば特に限定されない。例えば、操作管の閉口端部を突き刺すことによって保持することができる保持穴が形成された保持部材を1又は2以上組み合わせたり、線状部材を、保持穴としての格子穴を形成するように格子状に組んだりすることによって構成されるラックなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。上記の前者のケースにおいては、保持部材に形成される保持穴は、貫通していてもよいし、貫通していなくてもよい。保持穴の内径は、保持する操作管の外径に基づいて決定される。保持部材のうち、操作管の閉口端部を保持するものは、保持基板と記載する。保持基板においては、保持穴は、保持部Bの閉口端が保持基板を突き抜けないように(すなわち保持穴自体が保持基板を貫通しないように)形成されることができる。保持穴の深さは、操作管における保持したい範囲に基づいて適宜決定される。
本発明の操作管は細長く、立てた場合の一本当たりの設置面積が極めて小さいため、小さな設置面積であっても、複数の操作管を密集状態で立てて設置することができる。このことにより、複数の操作管を同時に操作することが可能になる。すなわち、操作のマルチチャンネル化を図ることができる。
また、保持手段は、温度制御機能を有してよい。より具体的には、保持手段は、回収部Bの少なくとも一部を保持する部位において、温度制御機能を有してよい。例えば図4において、温度制御機能を43として模式的に示している。より具体的には、保持基板が、保持穴において、回収部Bの閉口端部を保持するものである場合、その保持する部位において、温度制御機能を有することができる。例えば図5に示す保持基板51は、保持穴52において、回収部Bの閉口端部を保持するものであるが、保持基板51自体が温調ブロックから形成されていてもよい。温度制御機能により、回収部Bの少なくとも下端に収容された水系液体内で、温度制御を必要とする処理又は反応を行うことが可能となる。本発明では、例えば回収部Bで核酸増幅反応が行われる場合にこの態様が好ましく用いられる。
さらに、保持基板は光学検出口を有してよい。光学検出口は、回収部B内へ励起光を照射することができ、回収部Bにおける処理又は反応において発せられる、対象成分又はそれに関連する成分に由来するシグナルを検出するために設けられる。光学検出口は、例えば図7に示されるように、保持穴52の下端から保持基板を貫通するように、且つ保持穴52が保持する管部bの外径より小さい口径を有するように、光学検出口71が形成されうる。光学検出口71には、光学的検出用手段(図7においては蛍光検出用レンズ44及び光ファイバーケーブル45を含んで構成される)が設けられうる。光学検出口の位置は図7に限定されず、例えば回収部側面からの測光を考慮してもよい。
操作管内の磁性体粒子を対象成分と共に移動させるための磁場の変動をもたらす、磁場印加手段及びそれが有する磁場移動機構については特に限定されない。磁場印加手段としては、永久磁石(例えばフェライト磁石やネオジム磁石)や電磁石などの磁力源を用いることができる。磁場印加手段は、操作管の外側において、操作管内の水系液体層中に分散している磁性体粒子を管の搬送面側に凝集させることができ、且つ操作管内のゲル層中において凝集している磁性体粒子を運搬することができる程度に操作管に近接させて配置することができる。これによって、磁場印加手段が管の搬送面を介して磁性体粒子に対して効果的に磁場を生じさせ、磁性体粒子塊とともに対象成分を捕捉及び運搬することができる。
磁場印加手段の形状は特に限定されない。例えば、操作管の一点又は一部に磁場を生じさせることができる塊状のもの(例えば図3や図4の磁石31として例示)であってよい。より具体的には、円筒形(例えば直径1mm〜5mm、厚さ5mm〜30mm)でありうる。このような形状の場合、磁場印加手段は操作管の外周の一点又は一部に添えられることによって操作管内部に磁場を生じさせることができる。一方、磁場印加手段は、横断面略円形である操作管の周囲に磁場を生じさせることができる中心略円形穴を有するリング状の磁石であってもよい。このような形状の場合、磁場印加手段はそのリングの中心略円形穴に操作管を通すことによって、操作管内部に磁場を生じさせることができる。この場合、リング状の形状を有する磁場印加手段は操作管を取り囲むため、磁性体粒子が凝集すると、磁性体粒子も磁場印加手段の形状に従ってリング状となる。一方、磁場印加手段の形状が塊状であれば磁性体粒子の凝集形状も塊状となる。つまり、リング状の形状を有する磁場印加手段を用いた場合は、磁性体粒子と水系液体との接触面積がより大きいため、磁性体粒子に吸着した対象成分などを、水系液体層を構成する液体中により効率よく晒すことができるという点において好ましい。
[8−2−1.操作管の長手方向への移動]
磁場印加手段が有する磁場移動機構としては、例えば、磁性体粒子の凝集形態を保つことができる状態で、磁場を操作管の長手方向(軸方向、少なくとも下方向)に移動させることができるものでありうる。以下において磁場移動機構と記載する場合、その機構は、停止位置の決定及び移動速度の制御を行うことができるものであり、その制御は、手動によってなされるものであってもよいし、コンピュータなどによって自動的になされるものであってもよい。移動速度は、例えば毎秒0.5mm〜10mmであってよい。磁場移動機構は、磁場印加手段自体を物理的に操作管の長手方向に移動させることができるものであることが好ましい。磁場移動機構は、図3や図4に示すような磁場印加手段(図3及び図4中においては永久磁石31)自体を上下方向に移動させることができる。また、図5に示すような複数の操作管を密集させることができるデバイスにおいても、磁場印加手段(図5中においては可動磁石板53)を上下方向に移動させることができる(いずれも、磁場移動機構自体は図示せず)。
磁場印加手段が有する磁場移動機構は、磁性体粒子へ印加する磁場の強度を可変制御することができるものであってよい。具体的には、磁場が遮断又は減弱されうる。磁場の遮断又は減弱の程度は、凝集していた磁性体粒子群が液滴中で分散する(前述項目6−2)ことができる程度であることが好ましい。例えば、電磁石の場合であれば通電制御手段を用いて磁場を遮断することができる。また例えば、永久磁石の場合であれば、操作管外側に配置した磁石を、操作管から遠ざけることができる機構を用いることができる。この機構は、手動で制御されてもよいし、自動制御されてもよい。磁性体粒子への磁場が減弱されること、好ましくは磁性体粒子が磁場から開放されることによって、水系液体層中において磁性体粒子群を自然分散させることができる。これによって、磁性体粒子に吸着した対象成分や付随成分を、水系液体層を構成する液体中に十分に晒すことが可能になる。
図5に例示するように操作管1を複数本密集させたデバイスにおいては、複数の操作管に対応する複数の磁力源が、操作管の長手方向に移動可能な一の部材にユニット化されることにより保持されることができる。このようなユニット化された部材は、図5に例示するように、操作管1の長手方向に移動可能な磁場印加手段である可動磁石板53として体現されうる。図5の可動磁石板53は、図6に例示すように、操作管の長手方向に移動することができる可動基板と、その可動基板中に保持された磁力源(磁石31)とを含んで構成されるものであり、操作管のそれぞれに対応する複数の磁石31が配置された状態で保持されうる。また、前記部材は、前述の保持手段のような操作管を保持する機能を有していてもよいし、有していなくてもよい。図5に例示する場合においては、可動磁石板53に、操作管1に対応する保持穴54が形成されることによって、保持機能も持たせることができる。なお、図6の例示においては、磁場印加手段が塊状のものとして示されているが、磁場印加手段は、保持穴54に応じた中空を有するリング状のものであってもよい。
保持手段は、磁場印加手段が管部bの長手方向へ移動することができる凹所を有することができる。より具体的には、保持手段は、回収部Bを保持する部位において、磁場印加手段が管部bの長手方向へ移動することができる凹所を有することができる。この凹所の中を移動する磁場印加手段は、操作部Aにおける操作に貢献した磁場印加手段と同じであってもよいし、異なるものであってもよい。例えば、図7(1)に示すように、保持穴52を設けた保持基板51(図7において、保持基板51は温調ブロックから構成されている)において凹所72が形成されており、この凹所には予め磁石31’が収容されている。磁石31を配置した可動磁石板53が下りていき、図7(2)に示すように、可動磁石板53が保持基板51と接してそれ以上下に移動することができない状態になる。すなわち、磁石31によってはこれ以上磁性体粒子6を下へ運搬することができない様態となる。このとき、可動磁石板53における磁石31が及ぼす磁場によって、保持基板51の凹所72に収容されていた磁石31’が磁石31に引き寄せられる。そして、操作管1内の磁性体粒子6は、磁石31と磁石31’との両方にひきつけられる。次に、図7(3)に示すように、可動磁石板53における磁石31を操作管1から遠ざけると、磁石31’は磁石31による磁場から開放されるため、重力によって凹所72内を落ちる。この際、操作管1内の磁性体粒子は磁石31’の磁場の影響を受けることにより、共に回収部B内の水系液体4l2中へ運搬され、回収部B内の底近くまで降下することができる。このように、磁石31及び磁石31’によって、磁性体粒子の受け渡しを行い、対象成分を伴った磁性体粒子を操作管内の最下層内に十分に晒すことができる。
磁場移動機構は、磁場の振幅移動、回転等の揺動運動を可能にする機構を備えてよい。例えば磁力源を操作管の長手方向に振幅運動(上下運動)させることができる機能を備えることによって、スターラーの代用とすることができる。これによって、水系液体中における混合や撹拌が容易になる。例えば磁場の遮断又は減弱の機能を有さない場合であっても、磁場印加手段を操作管に近接させたまま(磁性体粒子を凝集させたまま)水系液体層の厚みの幅内で数回、上下方向に往復運動させることによって、水系液体中で磁性体粒子に吸着した対象成分などを、水系液体層を構成する液体中に十分に晒すことができる。
磁場印加手段は、温度制御機能をさらに有するものであってもよい。例えば図4において、42として温度制御機能が模式的に示されている。或いは、磁場印加手段にヒーターを内蔵させることもできる。後者の温度制御機能により、磁性体粒子が存在する位置における水系液体層中の試薬温度などを任意に調節することができる。例えば、図4に示す操作管が、図7に示すような保持手段(保持基板)であって上述の7−3に記載のような温度制御機能を有するものによって保持される場合を挙げて説明する。図4に示す操作管においては、回収部Bがゲル層4gを介したRT反応液層4l1及びPCR反応液層4l2を含む複層を回収用媒体として収容する。図4の操作管が図7に示すような保持基板51によって保持されると、保持基板51の保持穴52に直接保持される部分が、おおよそ、操作管の再下層(PCR反応液層4l2)に相当する部分のみとなる場合がある。この場合、逆転写反応が行われるRT反応液層4l1が収容された部分は、保持基板51に直接保持されているPCR反応液層4l2と離れているため、保持基板51による温度制御を及ぼすことが困難である。
光学的検出手段は特に限定されるものではなく、当業者であれば、対象成分が供された分析方法に応じて容易に選択可能である。例えば、光発生部、検出用手段、光送信手段及びパーソナルコンピュータなどを適宜含んで構成された手段を用いることができる。一例を挙げると、図4(7)に示す蛍光検出手段41の場合、図7により具体的に示すように、光発生部(図示せず)から、検出用手段(検出用レンズ44に取り付けた光送信手段(光ファイバーケーブル45)への入射を行い、検出用レンズ44を通して操作管1内の反応液4への光照射を行うことができる。検出用レンズ44によって検出された光学的シグナルを光ファイバーケーブル45によって受光素子に送られ、電気的シグナルに変換後、パーソナルコンピュータ(図示せず)にリアルタイムで送信し、反応液4の蛍光強度の変化をモニターすることができる。これは、本発明がリアルタイム核酸増幅反応などの変化しうる蛍光強度の検出が行われる反応又は処理が行われる場合に好適である。
実施例
[実施例1:血液からの核酸抽出・精製]
シリコンオイル(信越シリコーンKF-56)にゲル化剤(太陽化学株式会社;TAISET 26)を1.2%(重量比)となるように添加し70℃に加熱して完全にシリコンオイルと混和させた。混和してゾル状態となったオイルと、必要な試薬との所要量を気泡が入らないように交互に、図3(0)に示す操作管(キャピラリー(操作部A)とサンプルチューブ(回収部B)とからなる)内に注射針の先から注入し、重層した。内径1.5mmのキャピラリーを用いた場合、ゲルプラグの形成に各10μL、洗浄液(200mM KCl)は各15μL、溶出液(10mM Tris HCl, 1 mM EDTA pH8.0)20μLを図3(0)に示す通りに装填した。充填済みキャピラリーを室温で30分放置し、ゲルプラグを完全にゲル化させた。キャピラリー上端はフィルム材で封印したロート状の試料供給口を形成しており、セプタムで密封した。
図4(0)に示す操作管(キャピラリーデバイス)への試薬およびゲルの装填は、逆転写用反応液(RT反応液)及びPCR反応液がさらに用いられたことを除いて実施例1と同様に行った。本実施例におけるキャピラリ−デバイスは、実施例1のようにキャピラリー下端に回収用サンプルチューブが取り付けられたものではなく、キャピラリ−下端が盲管状となった、キャピラリーデバイス全体が一体成形されているものが用いられた。このキャピラリ−デバイスの試料供給口をセプタムで塞ぐと、核酸抽出機能付き完全密封型のPCRデバイスとなる。検出はSYBR Green I等の蛍光色素によるリアルタイム検出法又はエンドポイント検出法による蛍光検出法によって行った。
2g:ゲル層(ゲルプラグ)
3:操作用媒体(複層)
3l:水系液体層
3g:ゲル層(ゲルプラグ)
4:回収用媒体(例えば溶出液、反応液)
4l:水系液体層
4g:ゲル層(ゲルプラグ)
5:試料供給部(開口端)
6:磁性体粒子
31:磁場印加手段(磁石)
32:試料
33:水系液体混合物
41:光学的検出手段
42、43:温度制御機能(ヒーター)
51:保持手段(温調ブロック)
52:保持穴
53:磁場印加手段(可動磁石板)
54:保持穴
61:磁石保持部
64:温度制御機能(ヒーター)
71:光学検出口
72:凹所
Claims (18)
- 対象成分を操作するための操作管であって、
一方に対象成分を含む試料を供給するための閉鎖可能であってよい開口端及び他方に閉口端を有する管と、
前記管内に収容され且つゲル層及び水系液体層が前記管の長手方向に交互に重層されている操作媒体と、
対象成分を捕捉し運搬する磁性体粒子とを備え、
磁場が印加されることによって、前記磁性体粒子が、前記操作管の長手方向に、ゲル状態である前記ゲル層を通過して移動するよう構成された、操作管。 - 前記管の内径が0.1mm〜5mmである、請求項1に記載の操作管。
- 前記磁性体粒子が、対象成分としての核酸への結合力又は吸着力を有するものであり、
前記操作媒体が核酸を遊離させ、前記磁性体粒子へ結合又は吸着させる液体からなる水系液体層及び/又は前記磁性体粒子の洗浄液からなる水系液体層を含む、請求項1または2に記載の操作管。 - 前記操作媒体が、核酸増幅反応液からなる水系液体層、又は、逆転写反応液からなる水系液体層及び核酸増幅反応液からなる水系液体層をさらに含む、請求項3に記載の操作管。
- 前記操作管が、操作部A及び回収部Bを有し、
前記操作管を構成する前記管が、前記操作部A及び前記回収部Bにそれぞれ対応する操作用管部a及び回収用管部bを有し、
前記操作部Aが、前記管部aと、前記管部a内に収容された前記操作媒体とを含み、
前記回収部Bが、前記管部bと、前記管部b内に収容され且つ水系液体層及びゲル層のいずれか一方を少なくとも含む回収用媒体とを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の操作管。 - 前記操作用管部aと前記回収用管部bとが分離可能である、請求項5に記載の操作管。
- 前記管の材質が、ポリエチレン、ポリプロピレン、フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリカーボネート、アクリロニトリルブタジエンスチレンコポリマー、アクリロニトリルスチレンコポリマー、アクリル樹脂、ポリ酢酸ビニル、ポリエチレンテレフタレート、環状ポリオレフィン及びガラスからなる群から選ばれる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の操作管。
- 前記開口端の内径が、前記操作媒体であるゲル層及び水系液体層が収容されている前記管の内径よりも広い、請求項1〜7のいずれか1項に記載の操作管。
- 前記管が光透過性を有する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の操作管。
- 前記管の内壁の表面粗さが0.1μm以下である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の操作管。
- 前記ゲル層の長手方向の厚さが1〜20mmである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の操作管。
- 前記水系液体層の長手方向の厚さが0.5〜30mmである、請求項1〜11のいずれか1項に記載の操作管。
- 前記回収部Bが、対象成分に特異的に結合し、光照射により蛍光を生じることで対象成分を検出するための蛍光色素を含む水系液体層をさらに含む、請求項5または6に記載の操作管。
- 前記回収部Bが、逆転写反応液からなる水系液体層及び核酸増幅反応液からなる水系液体層をさらに含む、請求項5、6および13のいずれか1項に記載の操作管。
- 請求項13に記載の操作管と、
前記操作管に磁場を印加することによって前記磁性体粒子を前記操作管の長手方向に移動させることができる磁場印加手段と、
前記回収部Bに光を照射し、前記対象成分に特異的に結合された蛍光色素から生じた蛍光を検出する光学的検出手段とを備える、デバイス。 - 請求項1〜14のいずれか1項に記載の操作管を複数備え、
複数の前記操作管に磁場を同時に印加することによって、複数の前記操作管について、前記磁性体粒子を前記操作管の長手方向に同時に移動させることができる磁場印加手段をさらに備えるデバイス。 - 前記磁場印加手段が、
前記操作管の長手方向に移動することができる可動基板と、
前記操作管の長手方向への前記可動基板の移動の制御を行う磁場移動機構と、
前記可動基板中に保持された、複数の操作管に対応する複数の磁力源とを含む、請求項16に記載のデバイス。 - 請求項1〜14のいずれか1項に記載の操作管と、
前記操作管に磁場を印加することによって前記磁性体粒子を前記操作管の長手方向に移動させることができる磁場印加手段とを備え、
前記磁場印加手段が、前記操作管の長手方向に磁場を振幅移動させる、又は、磁場を回転運動させる、デバイス。
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JP2014136442A JP5804148B2 (ja) | 2010-12-21 | 2014-07-02 | 管内で対象成分を操作するための操作管 |
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