CN105723203B - 磁性分离 - Google Patents

Abstract

披露了用于对顺磁性珠粒进行磁性分离而用于生物分子的分离和处理的装置、***和方法。

Description

磁性分离

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年11月25日提交的美国临时申请序列号61/908,473的权益，该申请通过引用以其全部内容结合在此。

背景

生物分子的分离是任何样品加工***的关键部分。对于所有生物化学过程来说，靶样品的分离和纯化是其成功的关键。生物化学分析过程中的限制-焦磷酸测序、核酸连接、聚合酶链式反应、数字PCR、qPCR、核酸测序、蛋白检测/蛋白强化、遗传珠涂覆、稀少细胞检测以及细胞富集-并且不限于这些，归因于靶标的起始浓度以及分析中使用的反应样品内存在的生物化学抑制剂的水平。

对于大多数生物化学分析，要对样品进行一系列预分析步骤以从最初样品中分离靶标并且去除生物化学抑制剂。典型地，这些步骤是费时和费力的并且最终降低靶标的起始浓度。

一种样品纯化方法利用旋转离心柱。然而，旋转离心柱需要多个离心步骤，并且因此不可与自动化DNA文库制备平台整合。类似地，用于从琼脂糖凝胶中纯化核酸片段的纯化技术也需要多个离心步骤以实现核酸分离。

用于样品纯化的一项技术是基于顺磁性珠粒的纯化。该方法提供了一种可提供改进的DNA恢复率和可调缓冲条件的途径，这些条件可以用于选择性地结合特定的DNA片段大小。

该基于顺磁性珠粒的纯化是一种静态孔分批法。当前的方法涉及将珠粒混合物-顺磁性珠粒和一种缓冲液-连同最初样品移液至微量滴定板的孔中。将该溶液移液、混合、并在室温下孵育以使DNA结合至这些珠粒。然后将该微量滴定板置于磁性板上。具有该结合的DNA的这些珠粒移动到该板的边缘并且被磁体保持。接下来，使用移液管将上清液(包含废物)去除并且丢弃。然后进行多个洗涤步骤以去除存在于珠状小球上/处的残余废物。将乙醇移液至含有该珠状小球的板，孵育并且然后使用移液管去除。重复该洗涤步骤两次。然后添加洗脱缓冲液。将该板从该磁性板中移除，并且通过移液管混合将该洗脱缓冲液混合。将该微量滴定板放回到该磁性板上。然后，使用移液管将含有经纯化的DNA的洗脱液取出。

该基于顺磁性珠粒的方案是一项劳动密集型过程，并且其自动化是复杂的。移液步骤数量多还导致最初和最终样品体积大，从而导致每数据点的高试剂成本。

一种应用并且不限于该应用是为了用于下一代测序平台的改进的样品纯化。很多下一代测序平台需要多个由特定范围内的碱基对长度的DNA片段组成的DNA文库。此外，这些DNA片段需要用特定核苷酸序列(接头)进行标记以使得使用PCR对这些序列进行扩增并且使得这些文库片段退火至测序仪流动池。当在单一流动池内复用样品时，还可以向这些DNA片段中添加序列特异性指标以识别单独样品。DNA的标记片段化(tagmentation)(DNA被片断化并用接头进行标记)以及常用接头和指标的添加在两个单独的生物反应中实现。在这些反应后，清洁该DNA文库以移除过量的核苷酸、酶、引物、盐及其他污染物。因此，标记片段化DNA、纯化经标记片段化的DNA、添加常用接头和指标以及纯化最终文库产物所需要的工作流程是复杂且劳动密集型的。

本文概述的***和方法可有助于实现样品处理，该样品处理可减少(在某些实施例中可去除)污染并且可实现低体积、高通量、低成本和/或高样品浓度。

概述

复合液体池处理***用于进行样品处理，并且因此通常包括从周围样品中磁力分离目标分子的能力。高效磁性分离在样品和试剂体积较小、单个细胞中的靶分子数目也相应较小的复合液体池中特别重要。虽然针对复合液体池处理的应用而对在此处描述的某些具体实施例进行了优化，所述的装置和方法也广泛适用于具有和不具有复合液体池的***。

披露了用于对顺磁性珠粒进行磁性分离而用于生物分子的分离和处理的装置、***和方法。

附图简述

图1是一种液体处理***的示意图。

图2A-C展示了图1的液体处理***的歧管层。

图3A-E展示了图1的液体处理***的磁层。

图4展示了图1的液体处理***的管导层。

详细描述

如在先前的申请(如美国专利公开号US 20120045765、美国专利公开号US20130280726、PCT公开号WO 2012011091、PCT公开号WO 2013111016和PCT公开号WO2014083435，所有这些专利特此通过引用以其全文结合在此)中所解释的，可使用流体处理***生成复合液体池。这种流体处理***可具有用于吸取和分配液体的液体导管。这些液体导管可以移动并对准用于从现有的复合液体池中或从其他位置或结构中吸取和分配流体的特定位置。

在一些实施例中，有利的是具有共同作用的多个液体导管。这些液体导管可以布置成任何形式，例如布置成一条线、矩形或笛卡尔网格或六边结构。每个液体导管通常具有工作端，可从该工作端分配液体，并且可将液体吸入工作端。这些液体导管可以是毛细管，即具有亲水性的内表面以及必要的几何形状而通过毛细作用吸入水溶液或纯水。可替代地，在工作端的对侧，这些液体导管可以附接到能够产生足以吸入液体或空气的负压的泵上。这种泵还可以被构造成产生正压以将液体从所述导管的工作端分配出去。不管液体导管是否能够产生毛细作用，都可以包括泵。

在许多生化实验方案中，从较大的生物样品中分离目标生物分子(例如DNA)是有用的或必需的。用于这种分离的一种方便的方法是通过使目标分子与磁性珠粒在溶液中结合，施加磁场而使珠粒与其结合的目标分子固定，并且使洗涤溶液流经固定化的珠粒以除去除了固定结合的目标分子以外的其他原始样品材料。一旦目标分子已被如此分离，可以去除磁场，并且释放目标分子用于进一步的处理。

这种磁性分离可在如上所述的流体处理***中来完成。一个或多个磁体可与各液体导管相关联。磁体可以连接到致动器或能够在至少两个位置之间移动各磁体的致动器，在第一个位置处，磁体与液体导管间隔开，在第二位置处，磁体与液体导管并置。在一些实施例中，两个磁体可与各液体导管相关联。磁体可以沿着导管的流动轴线的方向而间隔开。将磁体沿着导管的流动轴线的方向而间隔开可以提高分离效率。流过第一个磁体时未被固定的任何珠粒随后会流过第二个磁体。鉴于给定的珠粒在经过单个磁体时无法被固定的可能性较小，珠粒在经过两个磁体时无法被固定的可能性会更小，是较小可能性的平方。这种效率的提高在处理复合液体池时是有利的，因为所涉及的体积如此之小。当用较大量液体进行处理时，不能使一小部分磁性珠粒固定化不用太多关注。自然地，如果需要更高效的固化，可以使用串联的三个、四个或更多的磁体。

在图1中展示了这种流体处理***的一个实施例。***1具有三层：歧管层2、磁层3和管导层4。为了清楚起见，示出了没有液体导管的***。

图2A单独地展示了歧管层2。歧管层2包括四个通常是线性的模块201、202、203、204，各模块具有六个输入口205。图2B示出了单独的一个单线性模块204，可从模块204的顶部看到其输入口205。图2C示出了同一个线性模块204，其近壁面被去除以展现模块的内部。各输入口205连接到将流体路径分成四个输出口的支管206。输出口位于歧管层2面向磁层3的一侧。因此，歧管层2将总共二十四条输入管线分成九十六条输出管线。而在一些实施例中，歧管可构成所展示的单独的线性模块，在另一些实施例中，歧管可以是一个单一元件，在某些情况下是整体件或整合件。在一些实施例中，歧管可由如图2A-C所示可以是线性的或可以不是线性的较小的模块的组合组成。在任何给定的实施例中，歧管中的端口数目不必是如图所示的96个，可以为特定的应用而进行调整，如可以是输入和/或输出口的几何布局。

图3A单独地展示了磁层3。磁层3包括四个二十四线磁体模块301、302、303、304。图3B单独地展示了单磁体模块304。磁体模块包括插口305、以及可在插口305内可滑动地移位的磁体螺栓306。图3C示出了同一个磁体模块304，将其插口305的一侧移除以便看到磁体螺栓306的整个长度。槽缝307会保持磁体，为了清楚起见将其省略。图3D以横截面示出了磁层3。该横截面穿过液体导管308，并且示出了与液体导管308对齐的磁体槽缝307。图3E以水平截面示出了磁层3，以便可以看到所有的九十六个磁体槽缝307。

磁体螺栓306可被致动器击发到插口305中的完全***的位置。如图3A-E所示，在这个完全***的位置，两个磁体与各液体导管是并置的。可替代地，致动器可将螺栓306移动到撤回位置，未示出。磁体螺栓306位于两行(各十二个液体导管)之间。在所示的实施例中，磁体螺栓306可包含四十八个磁体，每个液体导管308有两个，在每个槽缝307中有两个分立的磁体。可替代地，每个螺栓可只包括十二个磁体槽缝，每个槽缝中有两个单独的磁体，这些磁体水平穿过螺栓，以便每个磁体可在螺栓306的对侧与两个液体导管并置。磁体螺栓306可包含二十四个磁体，设置这些磁体按大小并安排在螺栓中，以便当螺栓被击发时，每个磁体与两个液体导管并置，螺栓的每侧各有一个。在其他实施例中，可能有磁体的不同安排。

图4展示了管导层4。管导层的功能是保持液体导管笔直。尽管为了清楚起见已经省略了，管导层4通常会通过穿过螺栓孔401、402、403、404的四个螺栓连接到磁层3，并且固定附接到管导层4。螺栓还可滑动地连接到磁层3。管导层4的存在使液体导管的尖头正确对准多孔板。在某些情况下，对每个液体导管头的深度的精确控制可以是很重要的。为了帮助这种精确控制，允许管导层4和磁层3相对于彼此进行滑动，以便管导层4可以下降而与多孔板的顶面直接接触。另外，每个螺栓可被将管导层朝向磁层3向上偏斜的弹簧所包围。以此方式，当***完成了与多孔板的相互反应时，管导层4会朝向磁层3缩回。

如图1-4所示的***可以如下使用。从标准生物分子筛选协会(SBS)板上将磁性珠粒溶液抽吸进入液体导管，然后从液体导管中进行分配，以便形成若干复合液体池(CLC)。CLC通常固位在如热芯片等平台上，在这里可以根据预定方案对其进行孵育。在孵育之后，将包括磁性珠粒溶液的每个CLC抽吸进入这些液体导管之一中，随后加入洗涤缓冲液、空气、包封油、洗脱缓冲液和更多的包封油。根据所讨论的特定方案，通常抽吸1-50μl容量的各缓冲液。然后接合这个或这些磁体。样品流经磁体安排，然后捕获珠粒。这些流体继续流动，以便将固定的珠粒暴露在洗涤缓冲液、空气、包封油和洗脱缓冲液中。一旦洗脱缓冲液经过固定的珠粒，液流反转。然后液流再次反转，第二次将固定的珠粒暴露在洗脱缓冲液中，之后从每个液体导管中分配洗脱缓冲液。这些磁体然后脱离接合，将磁性珠粒释放进入洗涤缓冲液。然后将洗涤缓冲液分配进入废弃物位置。

更一般地说，***可包括多个液体导管，每个液体导管限定了流动轴线。每个液体导管可具有近端和远端，这些端部沿着流动轴线而间隔开。对于每个液体导管，一个、两个或更多个磁体可与液体导管相关联，两个或更多个磁体在与由相关联的液体导管限定的流动轴线平行的方向上彼此间隔开。两个或更多个磁体可以例如是两个、三个、四个、五个或更多个磁体。至少一个致动器可与这些磁体相关联，该至少一个致动器能够使每个磁体采取第一位置或第二位置，在第一位置中，在与由相关联的液体导管限定的流动轴线垂直的方向上，磁体与相关联的液体导管分隔开；在第二位置中，磁体与相关联的液体导管并置。多个液体导管的流动轴线都是彼此平行的。在与多个液体导管的平行流动轴线垂直的平面上，例如在该平面中以二维模式(如矩形或边方结构)，液体导管可以彼此间隔开。液体导管可以在一条或多条线上间隔开。液体导管可以是或不是毛细管。

该***还可包括可操作地连接至多个液体导管的至少一个泵，以便该至少一个泵的启动可在该多个液体导管中的至少一个液体导管内产生负压或正压。该***可包括多个泵，每个液体导管都可操作地连接至该多个泵中的唯一一个泵上。其中每个泵可操作地连接至该多个液体导管中的四个液体导管上。可替代地，该***可只包括可操作地连接至所有液体导管的单个泵。

该***可包括可操作地连接至这个或这些泵以及这个或这些致动器的控制器，其中，该控制器被编程以(1)启动一个或多个泵，以便在该多个液体导管中的一个液体导管内产生负压，由此将含有磁性珠粒的液体抽吸进入液体导管，(2)启动一个或多个致动器，由此导致与该多个液体导管中的一个或多个液体导管相关联的两个磁体从第一位置行进到第二位置，以及(3)启动该泵，以便产生使水性液体移动通过这两个磁体的压力。

该***可包括一个或多个致动器。每个磁体有唯一的一个致动器，或单个致动器与多个液体导管相关联，并且每个液体导管都只与一个致动器相关联。每个磁体可与一个液体导管、两个液体导管或更多个液体导管相关联。

在一些实施例中，该***可包括与每个液体导管的近端处于流体连通的歧管，以便每个液体导管通过该歧管与至少一个其他液体导管处于流体连通。例如，每个液体导管可与一个、两个、三个或更多个其他液体导管处于流体连通。

在一些实施例中，该***可包括可操作地附接至每个流体导管的远端的管导，该管导适于将每个流体导管的每个远端引导到一个预定位置。在一些实施例中，这类***可包括可操作地附接至该管导的管导控制器，该管导控制器被编程以对该管导进行定位，以便该管将每个流体导管的每个远端引导至一个预定位置。在某些这类***中，各流体导管的各远端的预定位置被安排成以便各流体的远端对齐具有适于固定复合液体池的稳固特征的基质或一些其他有利基质(例如多孔板)上的预定部位。

在某些实施例中，该***可用于纯化。在某些实施例中，当对样品(如血液、唾液或尿液)分析病毒病原体时，可在定量PCR的上游进行纯化。为了实现针对病毒感染(如HIV、肝炎等)准确筛查患者样品所需的敏感性，有必要对样品的病毒RNA或DNA进行纯化。仍有很大的难度来将大的输入样品浓缩到用于PCR检测的小样品。这种利用磁性分离的***可以在各种各样的生化过程中使用，例如焦磷酸测序、核酸连接、PCR、数字PCR、qPCR、核酸测序、蛋白质检测/富集、遗传珠涂覆、稀少细胞检测和细胞富集等。

在一些实施例中，该***可从最初的样品容器中抽取样品液体(如血液、唾液或尿液)。

Claims (23)

1.一种***，该***包括：

多个液体导管，每个液体导管限定流动轴线；

针对每个液体导管，与该液体导管相关联的至少两个磁体，该至少两个磁体在与由该相关联的液体导管限定的流动轴线平行的方向上彼此间隔开；以及

与这些磁体相关联的至少一个致动器，该至少一个致动器能够使每个磁体采取第一位置或第二位置，其中，在该第一位置中，在与由该相关联的液体导管限定的流动轴线垂直的单一方向上，每个磁体与该相关联的液体导管分隔开；在该第二位置中，每个磁体与该相关联的液体导管并置。

2.如权利要求1所述的***，其中，该多个液体导管的流动轴线是彼此平行的。

3.如权利要求2所述的***，其中，该多个液体导管在与该多个液体导管的平行流动轴线垂直的平面上彼此间隔开。

4.如权利要求3所述的***，其中，该多个液体导管在与该多个液体导管的平行流动轴线垂直的平面上以二维模式彼此间隔开。

5.如权利要求3所述的***，其中，该多个液体导管在与该多个液体导管的平行流动轴线垂直的平面上以直线彼此间隔开。

6.如权利要求1-5中任一项所述的***，其中，这些液体导管是能够通过毛细作用吸入水性溶液的毛细管。

7.如权利要求1所述的***，该***进一步包括可操作地连接至该多个液体导管的至少一个泵，以便该至少一个泵的启动可在该多个液体导管中的至少一个液体导管内产生负压或正压。

8.如权利要求7所述的***，其中，该至少一个泵是多个泵，并且每个液体导管可操作地只连接至该多个泵中的一个泵上。

9.如权利要求8所述的***，其中，该多个泵中的每个泵可操作地连接至该多个液体导管中的四个液体导管上。

10.如权利要求7所述的***，该***进一步包括可操作地连接至该至少一个泵和该至少一个致动器两者上的控制器，该控制器被编程以：

启动该至少一个泵中的一个泵，以便在该多个液体导管中的一个液体导管内产生负压，由此将含有磁性珠粒的液体抽吸进入该液体导管；

启动该至少一个致动器，由此导致与该多个液体导管中的一个液体导管相关联的两个磁体从该第一位置行进到该第二位置；并且

启动该泵，以便产生使该液体移动通过该两个磁体的压力。

11.如权利要求1所述的***，其中，该至少一个致动器是多个致动器，每个致动器与多个液体导管相关联，并且每个液体导管只与一个致动器相关联。

12.如权利要求1所述的***，其中，每个磁体只与一个液体导管相关联。

13.如权利要求1所述的***，其中，每个磁体只与两个液体导管相关联。

14.如权利要求1所述的***，其中，每个磁体与两个以上的液体导管相关联。

15.如权利要求1所述的***，其中，该至少两个磁体正是三个磁体。

16.如权利要求1所述的***，其中：

每个液体导管具有沿着该流动轴线间隔开的远端和近端；

该***进一步包括与每个液体导管的近端处于流体连通的歧管，以便每个液体导管通过该歧管与至少一个其他液体导管处于流体连通。

17.如权利要求16所述的***，其中，每个流体导管通过该歧管只与一个其他流体导管处于流体连通。

18.如权利要求16所述的***，其中，每个流体导管通过该歧管只与两个其他流体导管处于流体连通。

19.如权利要求16所述的***，其中，每个流体导管通过该歧管只与三个其他流体导管处于流体连通。

20.如权利要求1所述的***，该***进一步包括可操作地附接至每个流体导管的远端的管导，该管导被适配为将每个流体导管的每个远端引导到预定位置。

21.如权利要求20所述的***，该***进一步包括可操作地附接至该管导的管导控制器，该管导控制器被编程以对该管导进行定位，以便该管导将每个流体导管的每个远端引导至预定位置。

22.如权利要求21所述的***，其中，各流体导管的各远端的预定位置被安排成以便各流体导管的远端与以下基质上的预定部位对齐，该基质具有适于固定复合液体池的稳固特征。

23.如权利要求1所述的***，其中每个液体导管限定一条纵向轴线。