JP6701450B2 - Dnaの産生方法及びdna断片連結用キット - Google Patents
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Description
本願は、2017年7月5日に日本に出願された特願2017−132084号及び2017年12月1日に日本に出願された特願2017−231732に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
[1] 2種類以上のDNA断片と、RecAファミリー組換え酵素活性をもつ蛋白質と、直鎖状2本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼと、を含む反応溶液を調製し、
前記反応溶液中で、前記2種類以上のDNA断片を、塩基配列が相同である領域同士又は塩基配列が相補である領域同士において互いに連結させて直鎖状又は環状のDNAを得る、DNAの産生方法。
[2] 前記反応溶液が、さらに、1本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼを含む、前記[1]のDNAの産生方法。
[3] 前記反応溶液が、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸の再生酵素及びその基質を含む、前記[1]又は[2]のいずれかのDNAの産生方法。
[4] 前記再生酵素がクレアチンキナーゼであり、前記基質がクレアチンリン酸である、前記再生酵素がピルビン酸キナーゼであり、前記基質がホスホエノールピルビン酸である、前記再生酵素がアセテートキナーゼであり、前記基質がアセチルリン酸である、前記再生酵素がポリリン酸キナーゼであり、前記基質がポリリン酸である、又は前記再生酵素がヌクレオシドジフォスフェートキナーゼであり、前記基質がヌクレオシド三リン酸である、前記[3]のDNAの産生方法。
[5] 前記2種類以上のDNA断片を連結させる反応の開始時点における前記反応溶液は、マグネシウムイオン源濃度が0.5〜15mMであり、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸の濃度が1〜1000μMである、前記[1]〜[4]のいずれかのDNAの産生方法。
[6] 前記2種類以上のDNA断片を連結させる反応を、25〜48℃の温度範囲内で行う、前記[1]〜[5]のいずれかのDNAの産生方法。
[7] 7個以上のDNA断片を連結させた直鎖状又は環状のDNAを得る、前記[1]〜[6]のいずれかのDNAの産生方法。
[8] 前記反応溶液は、塩化テトラメチルアンモニウム及びジメチルスルホキシドからなる群より選択される1種以上を含む、前記[1]〜[7]のいずれかのDNAの産生方法。
[9] 前記反応溶液は、ポリエチレングリコール、アルカリ金属イオン源、及びジチオスレイトールからなる群より選択される1種以上を含む、前記[1]〜[8]のいずれかのDNAの産生方法。
[10] 前記RecAファミリー組換え酵素活性をもつ蛋白質がuvsXであり、前記反応溶液はさらにuvsYを含む、前記[1]〜[9]のいずれかのDNAの産生方法。
[11] 前記塩基配列が相同である領域又は前記塩基配列が相補である領域が、前記DNA断片の末端又はその近傍に存在する、前記[1]〜[10]のいずれかのDNAの産生方法。
[12] 前記塩基配列が相同である領域又は前記塩基配列が相補である領域が、10bp以上500bp以下の長さである、前記[11]のDNAの産生方法。
[13] 前記2種類以上のDNA断片を連結させる反応の開始時点における前記反応溶液が、モル濃度が互いに等しい2種類以上のDNA断片を含有する、前記[1]〜[12]のいずれかのDNAの産生方法。
[14] 連結により得られた直鎖状又は環状のDNA中のギャップ及びニックをギャップリペア酵素群により修復する、前記[1]〜[13]のいずれかのDNAの産生方法。
[15] 連結により得られた直鎖状又は環状のDNAを50〜70℃で熱処理し、続いて10℃以下に急冷した後、ギャップリペア酵素群により修復する、前記[14]のDNAの産生方法。
[16] ギャップ及びニックが修復された直鎖状又は環状の2本鎖DNAを増幅させる、前記[14]又は[15]のDNAの産生方法。
[17] 連結により得られたDNAが直鎖状であり、当該直鎖状DNAを直接鋳型として用いてPCRを行う、前記[1]〜[13]のいずれかのDNAの産生方法。
[18] 連結により得られたDNAが、DnaA活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列を含む環状DNAであり、当該環状DNAと、環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群と、岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する2つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群と、2つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群と、dNTPと、を含む反応混合物を形成し、形成された反応混合物を等温条件下でインキュベートすることにより、前記環状DNA中のギャップ及びニックの修復、並びに増幅を行う、前記[1]〜[13]のいずれかのDNAの産生方法。
[19] 連結により得られた環状DNAを、予め50〜70℃で熱処理し、続いて10℃以下に急冷した後に、前記反応混合物を形成させる、前記[18]のDNAの産生方法。
[20] 連結により得られた直鎖状又は環状の環状DNAを微生物に導入し、当該微生物内で、前記環状DNA中のギャップ及びニックが修復された2本鎖DNAを増幅させる、前記[1]〜[13]のいずれかのDNAの産生方法。
[21] 2種類以上のDNA断片を、塩基配列が相同である領域同士又は塩基配列が相補である領域同士において互いに連結させて直鎖状又は環状のDNAを得るためのキットであって、RecAファミリー組換え酵素活性をもつ蛋白質と、直鎖状2本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼと、を含むDNA断片連結用キット。
[22]さらに、1本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼを含む、前記[21]のDNA断片連結用キット。
[23] さらに、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸の再生酵素及びその基質を含む、前記[21]又は[22]のいずれかのDNA断片連結用キット。
[24] さらに、塩化テトラメチルアンモニウム及びジメチルスルホキシドからなる群より選択される1種以上を含む、前記[21]〜[23]のいずれかのDNA断片連結用キット。
[25] さらに、ヌクレオシド三リン酸、デオキシヌクレオチド三リン酸、マグネシウムイオン源、アルカリ金属イオン源、ポリエチレングリコール、ジチオスレイトール、及び緩衝液からなる群より選択される1種以上を含む、前記[21]〜[24]のいずれかのDNA断片連結用キット。
本発明に係るDNA断片連結用キットにより、より簡便に、前記DNAの産生方法を実施することができ、DNA断片同士を、効率よく連結させることができる。
本発明に係るDNAの産生方法は、互いに塩基配列が相同である領域(以下、単に「相同領域」ということがある。)又は互いに塩基配列が相補である領域(以下、単に「相補領域」ということがある。)を有するDNA断片同士を、相同領域同士又は相補領域同士において互いに連結させることによって、直鎖状又は環状のDNAを産生する方法である。本発明に係るDNAの産生方法は、RecAファミリー組換え酵素蛋白質の存在下で連結反応を行うため、非常に連結効率に優れている。
本発明に係るDNA断片連結用キットは、2種類以上のDNA断片を塩基配列が相同である領域同士において互いに連結させて直鎖状又は環状のDNAを得るためのキットであって、RecAファミリー組換え酵素蛋白質を含む。直鎖状2本鎖DNA断片を連結するために用いられる場合には、当該キットはさらにエキソヌクレアーゼを含むことが好ましい。当該キットに備えられているRecAファミリー組換え酵素蛋白質とエキソヌクレアーゼとを、連結する目的の2種類以上のDNA断片を含む溶液に添加する。これにより、本発明に係るDNAの産生方法をより簡便に行うことができ、目的の連結体を容易に得ることができる。当該キットに含まれるRecAファミリー組換え酵素蛋白質及びエキソヌクレアーゼは、本発明に係るDNAの産生方法で使用されるものをそのまま用いることができる。当該キットに含まれるエキソヌクレアーゼとしては、3’→5’エキソヌクレアーゼが好ましく、少なくとも直鎖状2本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼを含むことがより好ましく、直鎖状2本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼと1本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼの両方を含むことがさらに好ましい。
2種類以上の直鎖状2本鎖DNA断片を、RecAファミリー組換え酵素蛋白質と3’→5’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、反応溶液中のマグネシウムイオン源濃度とATP濃度の影響を調べた。
2種類以上の直鎖状2本鎖DNA断片を、RecAファミリー組換え酵素蛋白質と3’→5’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、反応溶液中のPEG8000濃度と、ATP再生系の影響を調べた。
2種類以上の直鎖状2本鎖DNA断片を、RecAファミリー組換え酵素蛋白質と3’→5’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、反応溶液中のDMSO濃度の影響を調べた。
2種類以上の直鎖状2本鎖DNA断片を、RecAファミリー組換え酵素蛋白質と3’→5’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、反応溶液中のTMAC濃度の影響を調べた。
2種類以上の直鎖状2本鎖DNA断片を、RecAファミリー組換え酵素蛋白質と3’→5’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、反応溶液中のアルカリ金属イオン源の影響を調べた。
2種類以上の直鎖状2本鎖DNA断片を、RecAファミリー組換え酵素蛋白質と3’→5’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、反応溶液中の各直鎖状2本鎖DNA断片のモル比の影響を調べた。
2種類以上の直鎖状2本鎖DNA断片を、RecAファミリー組換え酵素蛋白質と3’→5’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、反応溶液中の3’→5’エキソヌクレアーゼの濃度と反応時間の影響を調べた。
2種類以上の直鎖状2本鎖DNA断片を、RecAファミリー組換え酵素蛋白質と3’→5’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、反応溶液中の直鎖状2本鎖DNA断片の濃度の影響を調べた。
2種類以上の直鎖状2本鎖DNA断片を、RecAファミリー組換え酵素蛋白質と3’→5’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、RecAファミリー組換え酵素蛋白質の種類の影響を調べた。
2種類以上の直鎖状2本鎖DNA断片を、RecAファミリー組換え酵素蛋白質と3’→5’エキソヌクレアーゼとを用いて連結して環状の連結体を形成し、これをRCR増幅した。
IHFは、IhfA及びIhfBの大腸菌共発現株から、硫安沈殿及びアフィニティーカラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
DnaGは、DnaGの大腸菌発現株から、硫安沈殿、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
DnaNは、DnaNの大腸菌発現株から、硫安沈殿及び陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
Pol III*は、DnaX、HolA、HolB、HolC、HolD、DnaE、DnaQ及びHolEの大腸菌共発現株から、硫安沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
DnaB及びDnaCは、DnaB及びDnaCの大腸菌共発現株から、硫安沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
DnaAは、DnaAの大腸菌発現株から、硫安沈殿、透析沈殿、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
GyrA及びGyrBは、GyrAの大腸菌発現株とGyrBの大腸菌発現株の混合物から、硫安沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
Topo IVは、ParCの大腸菌発現株とParEの大腸菌発現株の混合物から、硫安沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
Topo IIIは、Topo IIIの大腸菌発現株から、硫安沈殿及びアフィニティーカラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
RecQは、RecQの大腸菌発現株から、硫安沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、及びゲル濾過カラムクロマトグラフィーを含む工程で精製し、調製した。
RNaseH、Ligase、Pol Iは、市販の大腸菌由来の酵素を用いた(タカラバイオ社製)。
2種類以上の直鎖状2本鎖DNA断片を、RecAファミリー組換え酵素蛋白質と3’→5’エキソヌクレアーゼとを用いて連結して環状の連結体を形成し、これをRCR増幅する方法において、RCR増幅前の熱処理・急冷の影響を調べた。
26種類又は36種類の直鎖状2本鎖DNA断片を、RecAファミリー組換え酵素蛋白質と3’→5’エキソヌクレアーゼとを用いて連結して環状の連結体を形成し、これをRCR増幅した。
Gibson Assembly法(特許文献3)を利用して複数の2本鎖DNA断片を連結する方法に用いるキット「NEBuilder HiFi DNAアッセンブリー」(NEB社製)が市販されている。当該キットでは、末端に15〜20塩基の相同領域がある2種類以上の直鎖状2本鎖DNA断片を、5’→3’エキソヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ、及びDNAリガーゼを含む当該キットに添付の混合溶液(Master mix)に添加し、50℃で15〜60分間インキュベートする方法(NEB法)により連結する。
長鎖ゲノムの断片同士を連結し、環状連結体を形成し、その後RCR増幅で増幅させた。
2種類以上の直鎖状2本鎖DNA断片を、RecAファミリー組換え酵素蛋白質と3’→5’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、クレアチンキナーゼとクレアチンリン酸からなるATP再生経路を含む反応溶液中のクレアチンリン酸濃度の影響を調べた。
2種類以上の直鎖状2本鎖DNA断片を、RecAファミリー組換え酵素蛋白質と3’→5’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、クレアチンキナーゼとクレアチンリン酸からなるATP再生経路を含む反応溶液中のクレアチンキナーゼ濃度の影響を調べた。
2種類以上の直鎖状2本鎖DNA断片を、RecAファミリー組換え酵素蛋白質と3’→5’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、ピルビン酸キナーゼとホスホエノールピルビン酸からなるATP再生系の影響を調べた。
2種類以上の直鎖状2本鎖DNA断片を、RecAファミリー組換え酵素蛋白質と3’→5’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、ポリリン酸キナーゼとポリリン酸からなるATP再生系の影響を調べた。
2種類以上の直鎖状2本鎖DNA断片を、RecAファミリー組換え酵素蛋白質と3’→5’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、直鎖状2本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼと1本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼを併用する効果を調べた。
36種類の直鎖状2本鎖DNA断片を、RecAファミリー組換え酵素蛋白質と、直鎖状2本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼと、1本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼとを用いて連結して環状の連結体を形成し、これをRCR増幅した。
50種類の直鎖状2本鎖DNA断片を、RecAファミリー組換え酵素蛋白質と、直鎖状2本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼと、1本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼとを用いて連結して環状の連結体を形成し、これをRCR増幅した。
相同領域が、3’突出末端又はその近傍に存在するDNA断片を含む直鎖状2本鎖DNA断片を、RecAファミリー組換え酵素蛋白質と3’→5’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、直鎖状2本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼと1本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼを併用する効果を調べた。
2種類以上の直鎖状2本鎖DNA断片を、RecAファミリー組換え酵素蛋白質と3’→5’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、直鎖状2本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼと2種類の1本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼとを併用する効果を調べた。
2種類以上の直鎖状2本鎖DNA断片を、RecAファミリー組換え酵素蛋白質と3’→5’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、RecAファミリー組換え酵素蛋白質としてバクテリオフォージRecAホモログであるT4ファージUvsXを用いた。連結する直鎖状2本鎖DNA断片は、DCW34〜DCW43(配列番号34〜配列番号43)を用いた。
2種類以上の直鎖状2本鎖DNA断片を、UvsXと3’→5’エキソヌクレアーゼとを用いて連結する反応において、T4ファージUvsYを併用する効果を調べた。連結する直鎖状2本鎖DNA断片は、DCW34〜DCW43(配列番号34〜配列番号43)を用いた。
Claims (25)
- 2種類以上のDNA断片と、RecAファミリー組換え酵素活性をもつ蛋白質と、直鎖状2本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼと、を含む反応溶液を調製し、
前記反応溶液中で、前記2種類以上のDNA断片を、塩基配列が相同である領域同士又は塩基配列が相補である領域同士において互いに連結させて直鎖状又は環状のDNAを得る、DNAの産生方法。 - 前記反応溶液が、さらに、1本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼを含む、請求項1に記載のDNAの産生方法。
- 前記反応溶液が、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸の再生酵素及びその基質を含む、請求項1又は2に記載のDNAの産生方法。
- 前記再生酵素がクレアチンキナーゼであり、前記基質がクレアチンリン酸である、
前記再生酵素がピルビン酸キナーゼであり、前記基質がホスホエノールピルビン酸である、
前記再生酵素がアセテートキナーゼであり、前記基質がアセチルリン酸である、
前記再生酵素がポリリン酸キナーゼであり、前記基質がポリリン酸である、又は
前記再生酵素がヌクレオシドジフォスフェートキナーゼであり、前記基質がヌクレオシド三リン酸である、請求項3に記載のDNAの産生方法。 - 前記2種類以上のDNA断片を連結させる反応の開始時点における前記反応溶液は、マグネシウムイオン源濃度が0.5〜15mMであり、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸の濃度が1〜1000μMである、請求項1〜4のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。
- 前記2種類以上のDNA断片を連結させる反応を、25〜48℃の温度範囲内で行う、請求項1〜5のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。
- 7個以上のDNA断片を連結させた直鎖状又は環状のDNAを得る、請求項1〜6のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。
- 前記反応溶液は、塩化テトラメチルアンモニウム及びジメチルスルホキシドからなる群より選択される1種以上を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。
- 前記反応溶液は、ポリエチレングリコール、アルカリ金属イオン源、及びジチオスレイトールからなる群より選択される1種以上を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。
- 前記RecAファミリー組換え酵素活性をもつ蛋白質がuvsXであり、前記反応溶液はさらにuvsYを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。
- 前記塩基配列が相同である領域又は前記塩基配列が相補である領域が、前記DNA断片の末端又はその近傍に存在する、請求項1〜10のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。
- 前記塩基配列が相同である領域又は前記塩基配列が相補である領域が、10bp以上500bp以下の長さである、請求項11に記載のDNAの産生方法。
- 前記2種類以上のDNA断片を連結させる反応の開始時点における前記反応溶液が、モル濃度が互いに等しい2種類以上のDNA断片を含有する、請求項1〜12のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。
- 連結により得られた直鎖状又は環状のDNA中のギャップ及びニックをギャップリペア酵素群により修復する、請求項1〜13のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。
- 連結により得られた直鎖状又は環状のDNAを50〜70℃で熱処理し、続いて10℃以下に急冷した後、ギャップリペア酵素群により修復する、請求項14に記載のDNAの産生方法。
- ギャップ及びニックが修復された直鎖状又は環状の2本鎖DNAを増幅させる、請求項14又は15に記載のDNAの産生方法。
- 連結により得られたDNAが直鎖状であり、
当該直鎖状DNAを直接鋳型として用いてPCRを行う、請求項1〜13のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。 - 連結により得られたDNAが、DnaA活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列を含む環状DNAであり、
当該環状DNAと、環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群と、岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する2つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群と、2つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群と、dNTPと、を含む反応混合物を形成し、形成された反応混合物を等温条件下でインキュベートすることにより、前記環状DNA中のギャップ及びニックの修復、並びに増幅を行う、請求項1〜13のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。 - 連結により得られたDNAを、予め50〜70℃で熱処理し、続いて10℃以下に急冷した後に前記反応混合物を形成させる、請求項18に記載のDNAの産生方法。
- 連結により得られた直鎖状又は環状のDNAを微生物に導入し、当該微生物内で、前記DNA中のギャップ及びニックが修復された2本鎖DNAを増幅させる、請求項1〜13のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。
- 2種類以上のDNA断片を、塩基配列が相同である領域同士又は塩基配列が相補である領域同士において互いに連結させて直鎖状又は環状のDNAを得るためのキットであって、
RecAファミリー組換え酵素活性をもつ蛋白質と、直鎖状2本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼと、を含むDNA断片連結用キット。 - さらに、1本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼを含む、請求項21に記載のDNA断片連結用キット。
- さらに、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸の再生酵素、及びその基質を含む、請求項21又は22に記載のDNA断片連結用キット。
- さらに、塩化テトラメチルアンモニウム及びジメチルスルホキシドからなる群より選択される1種以上を含む、請求項21〜23のいずれか一項に記載のDNA断片連結用キット。
- さらに、ヌクレオシド三リン酸、デオキシヌクレオチド三リン酸、マグネシウムイオン源、アルカリ金属イオン源、ポリエチレングリコール、ジチオスレイトール、及び緩衝液からなる群より選択される1種以上を含む、請求項21〜24のいずれか一項に記載のDNA断片連結用キット。
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