JP5789520B2 - ヒトsCD14−STの分析方法 - Google Patents
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Description
なお、本明細書における「分析」には、分析対象物質であるヒトsCD14−STの存在の有無を判定する「検出」と、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」とが含まれる。
このように、特許文献1には、血清検体の凍結融解や長時間室温放置で測定結果を誤る場合を想定しているが、一般的な検体保管条件に関する内容であって特段な取り扱いを喚起する記載はない。特許文献1は、むしろ、ヒトsCD14−STが生体内血清中で安定であることを開示するものである。
本発明は、このような状況下に鑑みてなされたものであり、全血検体を用いた場合でも、ヒトsCD14−STを正確に測定することのできる分析方法を提供することを課題とするものである。
1)非還元条件下SDS−PAGEでは、分子量13±2kDa、
2)N末端配列に配列番号1のアミノ酸配列を有する、及び
3)配列番号2に記載の16アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製した抗体に特異的に結合する。
Thr Thr Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Glu
1 5 10
配列番号2:
Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg Gln Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
例えば、特許第4040666号明細書には、ヒトsCD14−STの測定方法、より具体的には、配列番号2に記載の16アミノ酸残基からなるペプチド(特許第4040666号明細書に記載のS68ペプチド)を抗原として作製したポリクローナル抗体(S68抗体)、モノクローナル抗体(F1146−17−2抗体)と、抗CD14抗原モノクローナル抗体(例えば、F1031−8−3抗体、F1106−13−3抗体等)との組合せを用いたサンドイッチEIA系[特許第4040666号明細書の実施例7−(1)]が開示されており、本発明の分析方法に適用することができる。
また、後述の実施例では、検体中のヒトsCD14−STと抗sCD14−STマウスモノクローナル抗体(F1106−13−3抗体)感作磁性ラテックス及びALP(アルカリフォスファターゼ)標識抗sCD14−STウサギポリクローナル抗体(S68抗体)を結合させ、過剰のALP標識抗sCD14−STウサギポリクローナル抗体を除去した後、抗原抗体反応により形成された免疫複合体のALP酵素活性を、発光基質(CDP−Star;トロピックス社製)を用いた化学発光酵素免疫測定法(CLEIA;Chemiluminescent Enzyme Immunoassay)により測定し、検体中のヒトsCD14−ST濃度を求める方法を使用している。
採血管により採取した全血検体は、数回の転倒混和等で撹拌した後、そのまま測定に使用することもできるし、血漿分離して使用することもできる。血漿分離して使用するとは、遠心分離によって血漿と血球を2層に分けた状態で血漿成分を使用する場合と、さらに血漿成分のみを分注して使用する場合を含む。本発明の分析方法では、被検試料として全血検体を使用するが、採血後保存期間の終了後、血漿分離して使用する場合も、「全血検体を使用する」態様に含まれる。また、本実施例を含む本発明者の知見から、全血検体中のヒトsCD14−STを測定する場合、時間経過により測定値が変動することがあり、検体を調製する際や輸送する際の過度な物理的衝撃が測定値に影響を与える要因となる場合がある。
さらに具体的には、EDTA採血管により全血検体を採取した場合には6時間以内に分析を実施することが好ましく、ヘパリン採血管により全血検体を採取した場合には4時間以内に分析を実施することが好ましい。
後述の実施例で具体的データを示すように、血漿検体又は血清検体においては測定値に変化が認められない、採血から6〜8時間後の測定であっても、健常人の全血検体においてヒトsCD14−STの測定値の上昇が認められた。健常人と敗血症患者の間では、ヒトsCD14−ST測定値は50倍の差が認められることが知られており、健常人血中におけるヒトsCD14−ST濃度は極めて低い。このことにより、適切なカットオフ値を設定することで、高い感度および特異性で敗血症を診断することが可能となる(特許文献1の実施例12)。しかし、全血検体において、健常人のヒトsCD14−ST測定値が時間経過とともに上昇した場合、測定時間によって、カットオフ値より低値か高値かの判断に違いが生じてしまう可能性がある。このような状況下、本発明者らは全血検体においても検体を採取してから6時間以内(好ましくは4時間以内)であればヒトsCD14−STの測定値が変動しないことを見出したものであり、本発明の分析方法では、全血検体の採取から6時間以内に分析を実施するため、測定値上昇の影響を受けることなく、正確なヒトsCD14−STの測定を行うことができる。
ヒトsCD14−STを測定するための各検体は、ヒトsCD14−ST測定用の試薬を用いて測定した。この試薬は、第1抗体溶液として抗sCD14−STマウスモノクローナル抗体(F1106−13−3抗体;特許第4040666号明細書)感作磁性ラテックス溶液、第2抗体溶液としてALP(アルカリフォスファターゼ)標識抗sCD14−STウサギポリクローナル抗体(S68抗体)溶液、B/F分離用洗浄液、基質溶液等よりなり、後述の自動免疫発光測定装置に収載されるようにカートリッジに封入されている。
測定には、特許第3115501号公報等に開示されているものと同様の磁性粒子を用いた免疫測定を自動的に行うことのできる自動免疫発光測定装置(パスファースト;三菱化学メディエンス社製)を用いた。該装置は、液体の吸引・吐出ラインとして配設されたチップ内で磁力により効果的にB/F分離を行うことができ、高い洗浄効率を示す。該装置の測定ステップは下記のとおりである。
なお、基質としては、化学発光基質「CDP−Star」(トロピックス社製)を用い、光電子増倍管(PMT)により検出される発光カウントを測定結果とした。
以下、通常の運転方法に従い、各操作が行われる。
(1)希釈液を用いて任意の希釈倍率に調整された試料溶液、磁性粒子溶液、および、第2抗体溶液を混合し、抗原抗体反応を行わせて免疫複合体を生成させる。
(2)未反応の物質を除去するためにB/F分離を行う。まず、液体吸引ラインとしてセットされたチップを通じて反応液を吸引し、磁石をチップ外壁面に接触させて磁性粒子を捕集する。次に、磁性粒子がチップ内壁面に吸着保持された状態で溶液を吐出して分離を行った後、別の反応容器に充填されたB/F分離用の洗浄液を吸引・吐出して洗浄を行う。
(3)前記チップの外壁面から磁石を離脱させて磁力の影響をなくした後に、基質溶液を吸引・吐出し、チップ内壁面に吸着保持された磁性粒子を分散させ、酵素反応を行わせる。
(4)PMTにより発光量を測定する。
全血検体、血清検体、血漿検体について、室温で所定時間静置保存した後、実施例1の測定方法に従って、ヒトsCD14−STの測定を実施した。
具体的には、抗凝固剤(ヘパリン又はEDTA)を含む採血管を用いて健常人3人から採取した全血検体、血漿検体、血清検体を、室温で0時間、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、8時間、もしくは10時間(全血検体及び血漿検体のみ)静置保存し、その都度、測定を行うことで各検体の測定値経時変化を確認した。血清検体としては、プレイン採血管(テルモ社製)で採取した後、遠心し血清分離した試料を用いて行った。EDTA血漿検体はEDTA採血管(テルモ社製)を使用し、ヘパリン血漿検体はヘパリン採血管(テルモ社製)を使用して調製した。全血検体については上記の採血管で採取した後、血漿分離せずにそのまま使用した。
なお、データは示さないが、全血検体に過度な物理的衝撃、例えば、撹拌操作を実施すると、顕著な測定値の上昇が認められた。
血清検体の結果を図7に示す。同条件で静置保存していた血清検体の測定値には変化が見られなかった。
また、データは示さないが、血清検体および血漿検体の測定値は、少なくとも24時間まで室温静置した場合についても、充分な安定性を示すことを確認した。
全血検体の測定値の不安定性が何に由来しているものなのか検討した。
条件1:全血検体
条件2:全血検体を室温で各時間静置保存し、測定前に血漿分離を行った血漿
条件3:血漿検体
検体の調製方法及び測定方法は、いずれもヘパリン採血管を使用して実施例2に従った。結果を図8に示す。実施例1と同じように、全血検体(条件1)は4時間以降測定値の上昇が認められるものの、血漿検体(条件3)は8時間まで安定であった。一方、条件2で各時間保存した全血検体から分離した血漿検体は、全血検体(条件1)と同様に測定値の上昇が認められた。
以上より測定値の上昇は、血漿成分由来ではなく血球成分由来であることが示唆された。全血検体を採取後4時間以内にそのまま測定する必要があるのに加え、全血検体を採取後4時間以内に血漿分離しなければ、分離後の測定値の上昇が認められることから、正確な測定値を得るためには採取後4時間以内に血漿分離が必要であることがわかった。
健常人3人から抗凝固剤(ヘパリン又はEDTA)を含む採血管を用いて全血検体を採取し、室温で0時間、2時間、4時間、8時間静置保存し、その都度、市販のCRP測定試薬(PATHFAST hs CRP測定試薬;三菱化学メディエンス社製)を用いて、測定値経時変化を確認した。検体の調製方法及び測定方法は、試薬がCRP測定試薬であることを除き実施例2と同様に行った。
結果を図9(ヘパリン採血管)及び図10(EDTA採血管)に示す。実施例2のヒトsCD14−STの場合のように、採血後4時間以降に測定値が上昇するような傾向はなく、CRPは全血検体中で安定であることが確認された。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (4)
- 全血検体の採取から6時間以内に前記検体中のヒトsCD14−STを分析することを特徴とする、ヒトsCD14−STの分析方法。
- 全血検体の採取から4時間以内に前記検体中のヒトsCD14−STを分析する、請求項1に記載のヒトsCD14−STの分析方法。
- 全血検体のまま分析を実施する、請求項1又は2に記載のヒトsCD14−STの分析方法。
- 全血検体の採取を、ヘパリン採血管又はEDTA採血管を使用して実施する、請求項1〜3のいずれか一項に記載のヒトsCD14−STの分析方法。
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