JP5777338B2 - Hpvに起因する癌細胞の検出方法、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かの判定方法及びそれらに用いるプライマーセット並びにキット - Google Patents
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Description
Tolga Turan et al., Virology 349 (2006) 175-183
(A) 被験者から採取された子宮頸部の細胞からDNAを含有する試料を調製するステップ、
(B) 前記ステップ(A)で得られた試料に含まれるDNA中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換して変換試料を得るステップ、
(C) 前記ステップ(B)で得られた変換試料と、HPVのL1領域又はL2領域中のCpG部位を有する塩基配列における、CpG部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第1プライマーと、HPVのLCR又はE6領域中のCpG部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第2プライマーとを用いて、第1プライマーがハイブリダイズする部位から第2プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を増幅対象とする核酸増幅反応を行なうステップ、及び
(D) 前記ステップ(C)の核酸増幅反応の結果に基づいて、HPVに起因する癌細胞を検出するステップ、
を含み、
前記第1プライマーは、さらにメチル化CpG部位を含む領域にハイブリダイズし、
前記第2プライマーは、非メチル化CpG部位のシトシンが変換処理によって他の塩基に変換された配列を含む領域にハイブリダイズする、
HPVに起因する癌細胞の検出方法
を提供する。
また、本発明は、
(A) 被験者から採取された子宮頸部の組織からDNAを含有する試料を調製するステップ、
(B) 前記ステップ(A)で得られた試料に含まれるDNA中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換して変換試料を得るステップ、及び
(C) 前記ステップ(B)で得られた変換試料と、HPVのL1領域又はL2領域中のCpG部位を有する塩基配列における、CpG部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第1プライマーと、HPVのLCR又はE6領域中のCpG部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第2プライマーとを用いて、第1プライマーがハイブリダイズする部位から第2プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を増幅対象とする核酸増幅反応を行なうステップ、を含み、
前記第1プライマーは、さらにメチル化CpG部位を含む領域にハイブリダイズし、
前記第2プライマーは、非メチル化CpG部位のシトシンが変換処理によって他の塩基に変換された配列を含む領域にハイブリダイズし、
前記ステップ(C)の核酸増幅反応の結果を、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かの判定に用いる、
組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かの判定を補助する方法
を提供する。
(A)被験者の細胞からDNAを含有する試料を調製するステップ、
(B)前記ステップ(A)で得られた試料に含まれるDNA中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換して変換試料を得るステップ、
(C)前記ステップ(B)で得られた変換試料と、HPVのL1領域又はL2領域中のCpG部位を有する塩基配列における、CpG部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第1プライマーと、HPVのLCR又はE6領域中のCpG部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第2プライマーとを用いて、第1プライマーがハイブリダイズする部位から第2プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を増幅対象とする核酸増幅反応を行なうステップ、及び
(D)前記ステップ(C)の核酸増幅反応の結果に基づいて、HPVに起因する癌細胞を検出するステップ、
を含む方法である。本発明の癌細胞の検出方法は、例えば、前述したHPVに起因する癌の診断用キットを用いることにより、簡便に行なうことができる。
(a)界面活性剤を含有する溶液と、被験者の細胞とを混合して混合物を得るステップ、
(b)前記ステップ(a)で得られた混合物を遠心分離に供して、不溶物を沈殿させ、上清を得るステップ、及び
(c)前記ステップ(b)で得られた上清を分取するステップ、
により行なうことができる。前記ステップ(A)において、これらのステップ(a)〜(c)を行なうことにより、被験者の細胞からDNAを抽出し、DNAを含有する試料を調製することができる。
(A)被験者の組織からDNAを含有する試料を調製するステップ、
(B)前記ステップ(A)で得られた試料に含まれるDNA中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換して変換試料を得るステップ、
(C)前記ステップ(B)で得られた変換試料と、HPVのL1領域又はL2領域中のCpG部位を有する塩基配列における、CpG部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第1プライマーと、HPVのLCR又はE6領域中のCpG部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第2プライマーとを用いて、第1プライマーがハイブリダイズする部位から第2プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を増幅対象とする核酸増幅反応を行なうステップ、及び
(D)前記ステップ(C)の核酸増幅反応の結果に基づいて、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かを判定するステップ、
を含む方法である。
HPV16ゲノムが染色体に組み込まれている子宮頸部癌由来細胞株であるSiHa細胞のゲノムDNA1μgに、300μLの0.3M水酸化ナトリウム溶液を加え、37℃で10分間インキュベートした。その後、10M亜硫酸水素塩溶液(10M亜硫酸水素ナトリウム水溶液)300μLを添加し、80℃で40分間インキュベートすることにより、前記ゲノムDNAの亜硫酸水素塩処理を行なった。亜硫酸水素塩処理後の溶液中に含まれるDNAをDNA精製キット〔キアジェン社製、商品名:Qiaquick PCR purification kitを用いて精製した。精製したDNAに、最終濃度0.3Mとなるように、水酸化ナトリウムを添加し、室温で5分間インキュベートした。その後、得られた産物を核酸精製用スピンカラム(GEヘルスケア社製、商品名:MicroSpin S−300 HR Columns)で精製し、分析用試料を得た。
HPV16の感染が確認された子宮頸部の組織のうち、病理学的に異形成が起こっていない正常組織と、癌組織それぞれを、厚さ20μmに薄切して、正常組織試料及び癌組織試料を得た。得られた各組織試料に、1%(w/v)SDSと0.1M水酸化ナトリウムとを含む溶液500μLを添加した。得られた混合物を、100℃で20分間保温した。保温後の混合物を、4℃で遠心分離し、上清を回収した。
実験例1と同様の操作により、HPV18ゲノムが染色体に組み込まれている子宮頸部癌由来細胞株であるC4−1細胞を用い、HPV18ゲノムにおけるメチル化CpG部位及び非メチル化CpG部位の解析を行なった。具体的には、SiHa細胞のゲノムDNAに代えて、C4−1細胞のゲノムDNAを用い、かつ表2に示されるプライマーセット及びPCRサーマルプロファイルに代えて、表4に示されるプライマーセット及びPCRサーマルプロファイル(6)を用いてPCR反応を行なったことを除き、実験例1と同様の操作を行ない、増幅産物の塩基配列を決定した。
被験者から手術により摘出され、HPV16の感染が確認された14種類の子宮頸部の組織のパラフィンブロック(以下、「手術摘出試料」という)及び被験者の子宮頸部からコルポスコピー観察下でかきとられ、HPV16の感染が確認された7種類の子宮頸部の組織のパラフィンブロック(以下、「生検試料」という)のそれぞれを、厚さ10μmとなるように薄切し、組織試料を得た。
被験者から手術により摘出され、HPV18の感染が確認された癌組織のパラフィンブロック及び被験者から手術により摘出され、HPV58の感染が確認され、かつCIN3の段階の組織であると診断された子宮頸部の組織のパラフィンブロック(手術摘出試料)、並びに被験者の子宮頸部からコルポスコピー観察下でかきとられ、HPV58の感染が確認され、かつCIN3の段階の組織であると診断された患者由来の子宮頸部の組織のパラフィンブロック(生検試料)を用い、試験例2と同様の操作を行なうことにより、それぞれの分析用試料を得た。
HPVに起因する癌の診断用又は異形成の段階の診断用のキットを調製した。その一例を、以下に示す。かかるキットは、下記プライマーセットの各プライマーの水溶液が入ったヌクレアーゼフリーの容器と非メチル化シトシン変換剤である亜硫酸水素塩溶液(10M亜硫酸水素ナトリウム水溶液)が入ったヌクレアーゼフリーの容器とからなる。
容器1
フォワードプライマー水溶液(配列番号:10に示される塩基配列からなるプライマー16L1/LCR−Fをヌクレアーゼフリーの水に溶解することにより得られた水溶液)
容器2
リバースプライマー水溶液(配列番号:11に示される塩基配列からなるプライマー16L1/LCR−Rをヌクレアーゼフリーの水に溶解することにより得られた水溶液)
容器3
10M亜硫酸水素ナトリウム水溶液
配列番号:2は、プライマーの配列である。
配列番号:3は、プライマーの配列である。
配列番号:4は、プライマーの配列である。
配列番号:5は、プライマーの配列である。
配列番号:6は、プライマーの配列である。
配列番号:7は、プライマーの配列である。
配列番号:8は、プライマーの配列である。
配列番号:10は、プライマーの配列である。
配列番号:11は、プライマーの配列である。
配列番号:12は、プライマーの配列である。
配列番号:13は、プライマーの配列である。
配列番号:14は、プライマーの配列である。
配列番号:15は、プライマーの配列である。
配列番号:17は、プライマーの配列である。
配列番号:18は、プライマーの配列である。
配列番号:19は、プライマーの配列である。
配列番号:20は、プライマーの配列である。
配列番号:21は、プライマーの配列である。
配列番号:22は、プライマーの配列である。
配列番号:23は、プライマーの配列である。
配列番号:24は、プライマーの配列である。
配列番号:25は、プライマーの配列である。
配列番号:26は、プライマーの配列である。
配列番号:27は、プライマーの配列である。
配列番号:28は、プライマーの配列である。
配列番号:29は、プライマーの配列である。
配列番号:30は、プライマーの配列である。
配列番号:31は、プライマーの配列である。
配列番号:32は、プライマーの配列である。
配列番号:33は、プライマーの配列である。
配列番号:34は、プライマーの配列である。
配列番号:35は、プライマーの配列である。
配列番号:36は、プライマーの配列である。
Claims (13)
- (A) 被験者から採取された子宮頸部の細胞からDNAを含有する試料を調製するステップ、
(B) 前記ステップ(A)で得られた試料に含まれるDNA中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換して変換試料を得るステップ、
(C) 前記ステップ(B)で得られた変換試料と、HPVのL1領域又はL2領域中のCpG部位を有する塩基配列における、CpG部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第1プライマーと、HPVのLCR又はE6領域中のCpG部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第2プライマーとを用いて、第1プライマーがハイブリダイズする部位から第2プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を増幅対象とする核酸増幅反応を行なうステップ、及び
(D) 前記ステップ(C)の核酸増幅反応の結果に基づいて、HPVに起因する癌細胞を検出するステップ、
を含み、
前記第1プライマーは、さらにメチル化CpG部位を含む領域にハイブリダイズし、
前記第2プライマーは、非メチル化CpG部位のシトシンが変換処理によって他の塩基に変換された配列を含む領域にハイブリダイズする、
HPVに起因する癌細胞の検出方法。 - 前記ステップ(A)が、
(a) 界面活性剤を含有する溶液と、被験者の子宮頸部の細胞とを混合して混合物を得るステップ、
(b) 前記ステップ(a)で得られた混合物を遠心分離に供して、不溶物を沈殿させ、上清を得るステップ、及び
(c) 前記ステップ(b)で得られた上清を分取するステップ、
を含む、請求項1に記載の検出方法。 - 前記ステップ(A)が、ステップ(a)とステップ(b)との間において、
(a1) ステップ(a)で得られた混合物に物理的処理を施して、細胞からDNAを遊離させるステップをさらに含み、
前記ステップ(b)において、前記ステップ(a1)で得られた産物を遠心分離に供して、不溶物を沈殿させ、上清を得る、請求項2に記載の検出方法。 - (A) 被験者から採取された子宮頸部の組織からDNAを含有する試料を調製するステップ、
(B) 前記ステップ(A)で得られた試料に含まれるDNA中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換して変換試料を得るステップ、及び
(C) 前記ステップ(B)で得られた変換試料と、HPVのL1領域又はL2領域中のCpG部位を有する塩基配列における、CpG部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第1プライマーと、HPVのLCR又はE6領域中のCpG部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第2プライマーとを用いて、第1プライマーがハイブリダイズする部位から第2プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を増幅対象とする核酸増幅反応を行なうステップ、を含み、
前記第1プライマーは、さらにメチル化CpG部位を含む領域にハイブリダイズし、
前記第2プライマーは、非メチル化CpG部位のシトシンが変換処理によって他の塩基に変換された配列を含む領域にハイブリダイズし、
前記ステップ(C)の核酸増幅反応の結果を、組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かの判定に用いる、
組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かの判定を補助する方法。 - 請求項1〜3のいずれかに記載のHPVに起因する癌細胞の検出方法又は請求項4に記載の組織が高度異形成以上の段階の組織であるか否かの判定を補助する方法に用いるためのプライマーセットであって、
HPVのL1領域又はL2領域中のCpG部位を有する塩基配列における、CpG部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第1プライマーと、
HPVのLCR又はE6領域中のCpG部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする第2プライマーと
を含み、
前記第1プライマーは、さらにメチル化CpG部位を含む領域にハイブリダイズし、
前記第2プライマーは、非メチル化CpG部位のシトシンが変換処理によって他の塩基に変換された配列を含む領域にハイブリダイズし、
非メチル化シトシンが他の塩基に変換されたHPVのゲノムDNAの塩基配列からなる核酸のうち、第1プライマーがハイブリダイズする部位から第2プライマーがハイブリダイズする部位までの間の連続した塩基配列からなる核酸を核酸増幅反応により増幅するためのプライマーセット。 - 第1プライマーが、HPVのL1領域中のCpG部位を有する塩基配列における、CpG部位以外に存在するシトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーである、請求項5に記載のプライマーセット。
- 第2プライマーが、HPVのLCR中のCpG部位を有する塩基配列における、シトシンが他の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーである、請求項5又は6に記載のプライマーセット。
- 他の塩基が、ウラシル又はチミンである、請求項5〜7のいずれかに記載のプライマーセット。
- 第1プライマー及び第2プライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応法、鎖置換反応法、リガーゼ連鎖反応法又は転写増幅法により核酸を増幅するためのプライマーである、請求項5〜8のいずれかに記載のプライマーセット。
- 請求項5〜9のいずれかに記載のプライマーセットと、
核酸中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤とを含有してなる、HPVに起因する癌の診断用キット。 - 非メチル化シトシン変換剤が、亜硫酸水素塩である、請求項10に記載の診断用キット。
- HPVに起因する癌が、子宮頸癌、口腔癌又は咽頭癌である、請求項10又は11に記載の診断用キット。
- 請求項5〜9のいずれかに記載のプライマーセットと、
核酸中の非メチル化シトシンを他の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤とを含有してなる、異形成の段階の診断用キット。
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JPN6009027713; Virology Vol. 349, 2006, pp.175-183 * |
JPN6013054298; Virology Vol. 361, 2007, pp.185-193 * |
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