JP5762523B2 - 血液サンプルを分析するための方法およびシステム - Google Patents
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Description
本発明は、一般に、粒子分析器を使用して血液サンプルを分析するための方法およびシステムに関し、より具体的には、網状赤血球およびゴースト化され難い(hard−to−ghost)細胞を決定することに関する。
本発明は、粒子分析データ処理に関する。本発明は、特定の用途に対する例証的実施形態を参照して本明細書で説明されているが、本発明は、それらに限定されないことを理解されたい。本明細書の教示にアクセスできる当業者であれば、その範囲内の付加的な修正、用途、および実施形態、ならびに本発明が非常に有用である付加的な分野を認識するであろう。
上記の背景の節で説明されるように、血液サンプルの中の赤血球の分布を決定する自動化された能力は、いくつかの用途にとって重要な能力である。本明細書で開示される方法およびシステムは、血液サンプルの中の細胞の集団の改良型の自動化された測定をもたらす。一実施形態では、ゴースト化され難い細胞は、本明細書で提供される方法を使用して、区別され、列挙される。
一側面では、血液サンプルの中の網状赤血球を分析するための方法が提示される。図2は、本発明の一実施形態による、網状赤血球を評価する際のステップのフローチャートである。ステップ202では、血液サンプルが、粒子分析器内の分析のために調製される。調製は、血液サンプルをゴースト化すること、および/または好適な色素もしくは染色液でサンプルを染色することを含むことができる。図3は、一実施形態による、調製ステップ202をさらに詳細に示す。ステップ302では、網状赤血球をさらに示すように、血液サンプルを生体染色と組み合わせることができる。例えば、網状赤血球の細胞内リボ核酸(RNA)を沈殿させる非蛍光色素を使用することができる。好適な染色の例は、New Methylene Blue(Coulter Retic PakTMの試薬Aとして知られている)、Oxazine 750、およびBrilliant Cresyl Blueを含むが、それらに限定されない。沈殿させられたRNAは、より高い密度を有し、このことは、各細胞中のRNA含有量の表示(delineation)を増強する。網状赤血球を測定するために非蛍光色素を使用することには、所望であれば蛍光色素を利用することによって、血液サンプルが他の構成物質についてさらに分析されることを可能にする追加利点がある。好適な蛍光色素の実施例は、チアゾールオレンジおよびポリメチンを含むが、それらに限定されない。付加的な予備ステップが、本発明の種々の実施形態で可能である。例えば、いくつかの実施形態では、蛍光測定を使用して、サンプルの付加的な特性を測定するように、蛍光色素を血液サンプルと組み合わせることができる。
一側面では、本発明の方法は、網状赤血球情報を計算することに基づいて、より正確なサンプルデータを有することで、報告される網状赤血球検出の精度の向上を可能にする。いくつかの血液サンプルでは、初期ゴースト化過程後に、ゴースト化されなかった、または部分的にしかゴースト化されなかったいくつかの細胞、すなわち、「ゴースト化され難い」細胞が残ることが観察されている。本発明の目的で、「ゴースト化され難い細胞」という用語は、そのもともとのヘモグロビン含有量の少なくとも約30%より多くを保持した細胞を指す。言い換えれば、ゴースト化され難い細胞は、そのもともとのヘモグロビンの70%未満が除去されている。好ましくは、細胞は、もともとのヘモグロビン含有量の50%より多くを有し、さらに好ましくは、70%より多くを有する。例えば、低張の酸溶液を血液サンプルと組み合わせることによる、ゴースト化過程は、細胞からヘモグロビンを取り除くことを目的としている。ゴースト化されていないか、または非効率的にゴースト化がされていると(すなわち、細胞がそれらのヘモグロビン含有量の約30%未満を放出するとき)、赤血球は、網状赤血球と明確に区別されない場合がある。ゴースト化され難い細胞と比較した、ゴースト化した細胞からの差異の別の図は、図6で見ることができ、この図は、軸方向光損失対UMALSの散布図の上部分に位置付けられているゴースト化され難い細胞の集団610を示す。ゴースト化され難い細胞が血液サンプルに存在し、光散乱および軸方向光損失を使用して血液サンプルが分析されるときに、ゴースト化され難い細胞の集団は密集し、概して、網状赤血球領域内に位置付けられるために、成熟赤血球からの網状赤血球の区別は失敗する場合がある。本発明のいくつかの実施形態は、血球の全集団の中でゴースト化され難い細胞を検出することを伴う。
本発明の一側面は、血液サンプルの中のゴースト化され難い細胞を列挙することに関する。血液サンプル中のゴースト化され難い細胞の集団と血液病理との間に相関が存在することが、本発明の発明者らによって予想外に発見されている。具体的には、ゴースト化され難い細胞の数は、種々の疾患に罹患している患者から収集された分析血液サンプルの中で増加させられることが分かっており、疾患の例は、異常血色素症(例えば、鎌状赤血球貧血およびサラセミア)、血液悪性疾患(例えば、白血病およびリンパ腫)、凝血および出血性障害、ならびにHIV/AIDS、悪性腫瘍、および自己免疫障害を含むが、それらに限定されない。加えて、散布図中のゴースト化され難い細胞の位置を正常サンプルと比較するときに、これらの疾患に関するさらなる情報を取得することができる。図8に戻って、検出後、ステップ813のように、ゴースト化され難い細胞を列挙することができる。細胞の計数または列挙は、ここで画定されているゴースト化され難い細胞等、境界が明瞭な細胞の集団のための十分に確立された技法である。一実施形態では、ゴースト化され難い画分は、赤血球集団全体に対するゴースト化され難い細胞の比として報告される。別の実施形態では、ゴースト化され難い細胞は、割合または絶対数として報告することができる。該値は、研究専用(RUO)パラメータとして使用することができ、またはインビトロ診断(IVD)パラメータに発展させることができる。図10(A〜C)は、健康な個人(図10(A))から、ならびに鎌状赤血球貧血(図10(B))およびサラセミア(図10(C))に罹患した患者からの、血液サンプルの中のゴースト化され難い細胞の集団1010のサイズの差異を図示する。図10(A)および11によって図示されるように、全RBC集団のうちのゴースト化され難い細胞の%は、ごくわずかであり、すなわち、健康な個人から提供された血液サンプル中の約0.01%未満である。また、いくつかのある病理に罹患した患者からの血液サンプルは、増加したゴースト化され難い細胞の集団を含有することも決定されている(図12に図示されている)。そのような病理は、腎不全、肝臓がん、HIV、鎌状赤血球貧血、およびサラセミアを含む。ある診断された疾患状態を有する患者の血液サンプル中の全RBC集団のうちのゴースト化され難い細胞の%は、健康な個人のゴースト化され難い細胞の集団のサイズから少なくとも10倍増加させられる。いくつかの血液サンプルでは、疾患または障害に罹患した患者のゴースト化され難い細胞の集団は、健康な個人のものより少なくとも100倍大きい。本発明の発明者らによる、この傾向の発見は、ある病理の存在にさらに関係してもよい、ゴースト化され難い細胞の異常集団の存在を決定するのに有用となり得る。
図9は、本発明の一実施形態による、血液サンプルを分析するシステムを示す。粒子分析器910は、リンク940を使用してコンピュータ901に連結される。コンピュータ901は、随意で、リンク950を使用してディスプレイ920および/または外部記憶デバイス921に連結される。コンピュータ901は、プロセッサ902と、メモリ903と、内部記憶装置904と、入力モジュール905と、出力モジュール906と、網状赤血球モジュール907を含むことができる。網状赤血球モジュール907は、検出器モジュール961と、分析器モジュール963と、微分器モジュール965と、レポータモジュール967とを含むことができる。
Claims (27)
- 血球サンプルの中のゴースト化され難い細胞を計数する自動化された方法であって、
(a)血球サンプルを、核酸を染色する核酸染色液および該血球サンプルの中の赤血球からヘモグロビンを除去するゴースト化試薬と混合して、ゴースト化した血球サンプルを生成するステップであって、ここで、該ゴースト化した血球サンプルは、残留するヘモグロビンを含むゴースト化され難い細胞を含む、ステップと、
(b)該ゴースト化した血球サンプルをサイトメトリのフローセルに通すステップと、
(c)2つの異なる光学的測定値を使用して、該サイトメトリのフローセルにおいて該ゴースト化した血球サンプルを分析するステップと、
(d)軸方向光損失測定値および光散乱測定値を使用して、該ゴースト化した血球サンプルの中のゴースト化され難い細胞を他の細胞から区別するステップと、
(e)該ゴースト化され難い細胞を計数するステップと、
を含む、方法。 - 前記血液サンプルと前記核酸染色色素との混合と、前記ゴースト化試薬との混合とは、別々に行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記染色は、蛍光性または非蛍光性である、請求項1に記載の方法。
- 前記光散乱測定値は、***角光散乱(UMALS)、下中央角光散乱(LMALS)、および低角光散乱(LALS)からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記血球サンプルの中のゴースト化され難い細胞の数を閾値と比較し、該閾値を超えるゴースト化され難い細胞の数を報告することによって、ゴースト化され難い細胞の異常集団の存在を決定するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 血液サンプルの中のゴースト化され難い細胞を検出する方法であって、
(a)該血液サンプルを、赤血球からヘモグロビンを除去するゴースト化試薬と混合して、ゴースト化した血液サンプルを生成するステップであって、ここで、該ゴースト化した血液サンプルは、残留するヘモグロビンを含むゴースト化され難い細胞を含む、ステップと、
(b)軸方向光損失測定値を含む検出によって、サイトメトリのフローセルにおいて該ゴースト化した血液サンプルを評価して、事象データを生成するステップと、
(c)該事象データの軸方向光損失測定値を使用して、ゴースト化され難い細胞を同定するステップと、
を含む、方法。 - 前記軸方向光損失測定値を使用した、前記ゴースト化され難い細胞の前記同定は、該軸方向光損失測定値を第1の閾値に対して比較し、光散乱測定値を第2の閾値に対して比較するステップを含み、該ゴースト化され難い細胞は、該第1の閾値を上回る軸方向光損失測定値、および該第2の閾値より低い光散乱測定値を有するものとして同定される、請求項6に記載の方法。
- 前記光散乱測定値は、***角光散乱(UMALS)、下中央角光散乱(LMALS)、および低角光散乱(LALS)からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
- 前記光散乱測定値は、UMALSである、請求項8に記載の方法。
- 直流インピーダンス測定値を収集するステップをさらに含む、請求項6に記載の方法。
- 血液サンプルの中のゴースト化され難い細胞を計数する方法であって、
(a)該血液サンプルを、赤血球からヘモグロビンを除去するゴースト化試薬と混合して、ゴースト化した血液サンプルを生成するステップであって、ここで、該ゴースト化した血液サンプルは、残留するヘモグロビンを含むゴースト化され難い細胞を含む、ステップと、
(b)軸方向光損失測定値を含む検出によって、サイトメトリのフローセルにおいて該ゴースト化した血液サンプルを評価して、事象データを生成するステップと、
(c)該事象データの軸方向光損失測定値を使用して、ゴースト化され難い細胞を同定するステップと、
(d)該軸方向光損失測定値を使用して、該ゴースト化され難い細胞の集団を計数するステップと、
(e)該血液サンプルの中の該ゴースト化され難い細胞の集団を報告するステップと、を含む、方法。 - 前記ゴースト化され難い細胞の集団を報告するステップは、全赤血球に対する該ゴースト化され難い細胞の集団の比を報告するステップを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記ゴースト化され難い細胞の集団を報告するステップは、全赤血球集団のうちのゴースト化され難い細胞の%を報告するステップを含む、請求項11に記載の方法。
- 患者サンプルの中のゴースト化され難い細胞の異常集団を検出する方法であって、
(a)該患者由来の血液サンプルを、赤血球からヘモグロビンを除去するゴースト化試薬と混合して、ゴースト化した血液サンプルを生成するステップであって、ここで、該ゴースト化した血液サンプルは、残留するヘモグロビンを含むゴースト化され難い細胞を含む、ステップと、
(b)軸方向光損失測定値を含む検出によって、サイトメトリのフローセルにおいて該ゴースト化した血液サンプルを評価して、事象データを生成するステップと、
(c)該事象データの軸方向光損失測定値を使用して、ゴースト化され難い細胞を同定するステップと、
(d)該軸方向光損失測定値を使用して、該ゴースト化され難い細胞の集団を計数するステップと、
(e)ゴースト化され難い細胞の数が閾値を超えるときに、ゴースト化され難い細胞の異常集団の存在を決定するステップと、
を含む、方法。 - ゴースト化され難い細胞の前記異常集団は、異常血色素症と関連付けられる、請求項14に記載の方法。
- 異常血色素症は、鎌状赤血球貧血またはサラセミアを含む、請求項15に記載の方法。
- 血液サンプルを分析する方法であって、
(a)該血液サンプルを、赤血球からヘモグロビンを除去するゴースト化試薬と混合して、ゴースト化した血液サンプルを生成するステップであって、ここで、該ゴースト化した血液サンプルは、残留するヘモグロビンを含むゴースト化され難い細胞を含む、ステップと、
(b)軸方向光損失測定値を含む検出によって、サイトメトリのフローセルにおいて該ゴースト化した血液サンプルを測定し、事象データを生成するステップと、
(c)該軸方向光損失測定値に基づき、該事象データを使用して、ゴースト化され難い細胞集団を同定するステップと、
(d)該事象データから該ゴースト化され難い細胞の集団をフィルタリングして取り除くステップと、
(e)該ゴースト化され難い細胞の集団を伴わない該事象データを分析して、血球分布パターンを同定するステップと、
を含む、方法。 - 命令を記憶するコンピュータ可読媒体であって、該命令は、実行される場合、
(a)サイトメトリのフローセルにおけるゴースト化した血液サンプルの軸方向光損失測定値を含む検出に基づいて、事象データを生成するステップであって、ここで、該ゴースト化した血液サンプルは、残留するヘモグロビンを含むゴースト化され難い細胞を含む、ステップと、
(b)該軸方向光損失測定値に基づき、該事象データを使用して、ゴースト化され難い細胞集団を同定するステップと、
を含む方法を使用して、少なくとも1つのプロセッサに血液サンプルを分析させる、コンピュータ可読媒体。 - 前記方法はさらに、
(c)前記事象データから前記ゴースト化され難い細胞の集団をフィルタリングして取り除くステップと、
(d)該ゴースト化され難い細胞の集団を伴わない該事象データを分析して、血球分布パターンを同定するステップと、
を含む、請求項18に記載のコンピュータ可読媒体。 - 前記方法はさらに、
(c)前記軸方向光損失測定値を使用して、前記ゴースト化され難い細胞の集団を計数するステップと、
(d)ゴースト化され難い細胞の数が閾値を超えるときに、ゴースト化され難い細胞の異常集団の存在を決定するステップと、
を含む、請求項18に記載のコンピュータ可読媒体。 - 前記方法はさらに、
(c)前記軸方向光損失測定値を使用して、前記ゴースト化され難い細胞の集団を計数するステップと、
(d)前記血液サンプルの中の該ゴースト化され難い細胞の集団を報告するステップと、
を含む、請求項18に記載のコンピュータ可読媒体。 - 少なくとも1つのプロセッサと、
該少なくとも1つのプロセッサに連結され、かつサイトメトリのフローセルを備える、粒子分析器と、
該少なくとも1つのプロセッサに連結され、かつ該フローセルにおけるゴースト化した血液サンプルの軸方向光損失測定値を含む検出に基づいて、事象データを生成するように構成される、検出器モジュールであって、ここで、該ゴースト化した血液サンプルは、残留するヘモグロビンを含むゴースト化され難い細胞を含む、検出器モジュールと、
該少なくとも1つのプロセッサに連結され、かつ該軸方向光損失測定値に基づき、該事象データを使用して、ゴースト化され難い細胞の集団を同定するように構成される、分析器モジュールと、
を備える、血液サンプルを分析するためのシステム。 - 前記分析器モジュールはさらに、前記軸方向光損失測定値を使用して、前記ゴースト化され難い細胞の集団を計数するように構成される、請求項22に記載のシステム。
- 前記分析器モジュールはさらに、
前記事象データから前記ゴースト化され難い細胞の集団をフィルタリングして取り除き、
該ゴースト化され難い細胞の集団を伴わない該事象データを分析して、血球分布パターンを同定する
ように構成される、請求項22に記載のシステム。 - 前記ゴースト化され難い細胞は、そのもともとのヘモグロビンの少なくとも30%を含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ゴースト化され難い細胞は、そのもともとのヘモグロビンの少なくとも30%を含む、請求項18〜21のいずれか一項に記載のコンピュータ可読媒体。
- 前記ゴースト化され難い細胞は、そのもともとのヘモグロビンの少なくとも30%を含む、請求項22〜24のいずれか一項に記載のシステム。
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