JP5759176B2 - 多糖シンターゼ(h) - Google Patents
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Description
本発明は、オーストラリア仮特許出願2007907071の優先権を主張するものであり、その内容を参照により本明細書に援用する。
本発明は、一般的には多糖シンターゼに関する。より具体的には、本発明は(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼに関する。
同じ分類群の野生型細胞と比較してそのレベルおよび/または活性が調節された、CslHによりコードされる(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼ;ならびに/あるいは
同じ分類群の野生型細胞と比較してその発現が調節されたCslH核酸
を含む細胞を提供する。
本発明の第7の態様に記載の穀粒を製粉することにより製造される穀粉;および
任意により、1以上の他の穀粒を製粉することにより製造されたる穀粉
を含む穀粉も提供する。
(i)本明細書において定義されるCslHによりコードされる(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼをコードする核酸分子;および/または
(ii)配列番号1に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも50%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子;および/または
(iii)ストリンジェントな条件下で、配列番号1に示されるヌクレオチド配列の1以上を含む核酸分子にハイブリダイズする核酸分子
を含むと理解されるべきである。
オオムギ(Hordeum vulgare)CslHゲノムヌクレオチド配列、例えば配列番号9および/または配列番号71に示される配列;
イネ(Oryza sativ)CslHゲノムヌクレオチド配列、例えば配列番号10、配列番号11および/または配列番号12のいずれか1以上に示される配列;ならびに/あるいは
コムギ(Triticum aestivum)CslHゲノムヌクレオチド配列、例えば配列番号78、配列番号79および/または配列番号80のいずれか1以上に示される配列。
ノックアウト構築物との相同組換えによる、細胞中のCslH核酸のノックアウトまたはノックダウンを含む、細胞中のCslH核酸の挿入突然変異(植物での標的化遺伝子破壊の例としては、Terada et al., Nat. Biotechnol. 20: 1030-1034, 2002を参照);
細胞中のCslH核酸の転写後遺伝子抑制(PTGS)またはRNAi(PTSGおよびRNAiの総説については、Sharp, Genes Dev. 15(5): 485-490, 2001、およびHannon, Nature 418: 244-51, 2002を参照);
CslH核酸を標的とするアンチセンス構築物での細胞の形質転換(植物のアンチセンス抑制の例については、van der Krol et al.、Nature 333: 866-869、van der Krol et al.、BioTechniques 6: 958-967、およびvan der Krol et al.、Gen. Genet. 220: 204-212を参照);
CslH核酸を標的とするコサプレッション構築物での細胞の形質転換(植物のコサプレッションの例については、van der Krol et al.、Plant Cell 2(4): 291-299を参照);
CslH核酸を標的とする二本鎖RNAをコードする構築物での細胞の形質転換(dsRNA介在遺伝子抑制の例については、Waterhouse et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13959-13964, 1998を参照);
CslH核酸を標的とするsiRNAまたはヘアピンRNAをコードする構築物での細胞の形質転換(siRNAまたはヘアピンRNA介在遺伝子抑制の例については、Lu et al.、Nucl. Acids Res. 32(21): e171、doi:10.1093/nar/gnh170, 2004を参照);ならびに/あるいは
CslH核酸と機能的に連結されるようなmiNRA標的配列の挿入(例えば、miRNAが媒介する遺伝子抑制の例については、Brown et al., Blood 110(13): 4144-4152, 2007参照)。
同じ分類群の野生型細胞と比較してそのレベルおよび/または活性が調節された、CslHによりコードされる(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼ;ならびに/あるいは
同じ分類群の野生型細胞と比較してその発現が調節されたCslH核酸
を含む細胞を提供する。
本発明の第7の態様に記載の穀粒を製粉することにより製造される穀粉;および
任意により、1以上の他の穀粒を製粉することにより製造されたる穀粉
を含む穀粉も提供する。
以下、本発明の実施形態を示す。
(1)細胞により生成される(1,3;1,4)−β−D−グルカンのレベルを調節する方法であって、該細胞中のCslHによりコードされる(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼのレベルおよび/または活性を調節するステップを含む方法。
(2)細胞中の(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼのレベルおよび/または活性を調節する方法であって、該細胞中のCslH核酸の発現を調節するステップを含む方法。
(3)(1,3;1,4)−β−D−グルカンの生成方法であって、単離されたCslH核酸で細胞を形質転換するステップ、および該細胞に該単離されたCslH核酸を発現させるステップを含む方法。
(4)前記細胞が植物細胞である、(1)〜(3)のいずれか1に記載の方法。
(5)前記細胞が単子葉植物細胞である、(4)に記載の方法。
(6)前記細胞が穀類植物細胞である、(4)または(5)に記載の方法。
(7)(3)に記載の方法により生成された(1,3;1,4)−β−D−グルカン。
(8)以下:
同じ分類群の野生型細胞と比較してそのレベルおよび/または活性が調節された、CslHによりコードされる(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼ;ならびに/あるいは
同じ分類群の野生型細胞と比較してその発現が調節されたCslH核酸
のいずれか1以上を含む細胞。
(9)同じ分類群の野生型細胞と比較してそのレベルが調節された(1,3;1,4)−β−D−グルカンをさらに含む、(8)に記載の細胞。
(10)(1)または(2)に記載の方法により作製された、(8)または(9)に記載の細胞。
(11)植物細胞である、(8)〜(10)のいずれか1に記載の細胞。
(12)単子葉植物細胞である、(11)に記載の細胞。
(13)穀類植物細胞である、(11)または(12)に記載の細胞。
(14)(8)〜(13)のいずれか1に記載の1以上の細胞を含む多細胞構造物。
(15)植物全体、植物組織、植物器官、植物部分、植物繁殖材料、または培養植物組織からなるリストより選択される、(14)に記載の多細胞構造物。
(16)穀類植物、またはその組織、器官もしくは部分を含む、(14)または(15)に記載の多細胞構造物。
(17)穀粒を含む、(16)に記載の多細胞構造物。
(18)そのレベルが調節された(1,3;1,4)−β−D−グルカンを含む穀粒であって、そのレベルおよび/または活性が調節された、CslHによりコードされる(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼ、ならびに/あるいはその発現が調節されたCslH核酸を含む1以上の細胞を含む、上記穀粒。
(19)以下:
(17)または(18)に記載の穀粒を製粉することにより製造される穀粉;および
任意により、1以上の他の穀粒を製粉することにより製造される穀粉
を含む穀粉。
(20)単離されたCslH核酸、又はその相補体、逆相補体もしくは断片。
(21)(20)に記載の単離された核酸分子を含む遺伝子構築物またはベクター。
(22)(20)に記載の単離された核酸分子または(21)に記載の遺伝子構築物を含む細胞。
(23)植物細胞である、(22)に記載の細胞。
(24)単子葉植物細胞である、(23)に記載の細胞。
(25)穀類植物細胞である、(23)または(24)に記載の細胞。
(26)(22)〜(25)のいずれか1に記載の1以上の細胞を含む多細胞構造物。
(27)植物全体、植物組織、植物器官、植物部分、植物繁殖材料、または培養植物組織からなるリストより選択される、(26)に記載の多細胞構造物。
(28)穀類植物、またはその組織、器官もしくは部分を含む、(26)または(27)に記載の多細胞構造物。
(29)穀粒を含む、(28)に記載の多細胞構造物。
(30)CslHによりコードされる(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼポリペプチドまたはその断片を規定するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
(31)ポリペプチドまたはその断片が、CslHによりコードされる1以上の(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼエピトープを含む、(31)に記載の単離されたポリペプチド。
(32)(30)または(31)に記載の単離されたポリペプチドまたはその断片に対して生起された抗体またはそのエプトープ結合性フラグメント。
オオムギ中の候補CSLH遺伝子を、コメCSLH配列とともに、中止になったStanford cell wall website、NCBI、HarvEST、GrainGenes、Barley Gene IndexおよびBarley BaseなどのオンラインESTデータベースに照会することによりまず同定する。オオムギ由来の全CSLH関連ESTは、全長3’非翻訳領域(UTR)およびタンパク質のCOOH末端の488個の(予測では約750の)アミノ酸残基をコードする領域に含まれる約1,500bpの単一の連続配列にアライメントできた(表2)。この遺伝子をHvCslH1と名付けた。HvCslH1由来プローブを用いたオオムギBACライブラリのスクリーニングにより、すべてがHvCslH1を含むいくつかのゲノムクローンが同定され、これにより、欠落した5’末端が得られた(データ非掲載)。単一の2,256bpORFを含み、推定分子量82.6kDaおよびpI7.0であるタンパク質をコードする、2,430bpのHvCslH1 cDNA断片をPCR増幅した(図6A)。ARAMEMNONを用いたこの配列の概念上の翻訳の分析により、5つから9つの膜貫通ドメイン(TMD)が見出され、さまざまなプログラムの間のコンセンサスは、2つのNH2末端および4つのCOOH末端のTMD(図6B)であり、成熟タンパク質の両末端は、細胞質性であることが予測される。このトポロジーもまた、細胞質内にD,D,D,QFKRWモチーフを含む大型の中心ドメインを配置している(図6C)。ヌクレオチドレベルでは、HvCslH1は、3種のコメCSLH遺伝子と、68〜74%の同一性(62〜69%のアミノ酸同一性)を有している(実施例6を参照されたい)(Hazen et al., Plant Physiol 128: 336-340, 2002)。系統発生学的再構成は、HvCslH1が、おそらくOsCSLH1のオオムギオーソログであることを示している(図7)。Sloop×Halcyonの倍加半数体集団を使用するHvCslH1の遺伝子マッピング(Read et al., Aust J Agr Res 54: 1145-1153, 2003)は、HvCslH1は染色体2Hの短腕上にあり、Burtonらにより報告された(Plant Physiol 146: 1821-1833, 2008)4種のHvCSLF遺伝子(HvCSLF3、4、8、10)のクラスターからおよそ1.5cMであり、非発芽オオムギ穀粒中のβ−グルカン含有量を調節する主要QTL内にあった(Han et al., Theor Appl Genet 91: 921-927, 1995;図8)ことを示している。
BACライブラリのスクリーニングを用い、全長HvCslHファミリーメンバーの完全なセットを得た。オオムギゲノム(品種モレックス)の6.5等価体を含むBACフィルターをスクリーニングし、3種の明らかに陽性のクローンを同定した(データ非掲載)。HindIIIを用いて消化したこれらのクローン由来のBAC DNAのブロットを検出した場合、同じ3種のクローンである3−5−10、3−7−3および3−7−8が陽性であると検証された。BAC 3−5−10および3−7−8の消化パターンは同一であると思われ、多くのバンドはBAC 3−7−3と共通であり、このことは、3種のBACはすべて、オオムギゲノムの同一の領域または非常に類似した領域を含むことを示している。ゲノムDNAのブロットを同じプローブとハイブリダイズさせた場合、単一のバンドが、HindIII、EcoRIまたはEcoRVを用いて消化したレーンに観察され、BAC消化の結果を裏付けた。すべてのHvCslH ESTもまた単一の遺伝子に由来するので(表2)、これらのデータは、オオムギゲノム中にはCSLH遺伝子が1種だけ存在することを強く示唆している。
シロイヌナズナにおける異種発現のために、HvCslH1 ORFを、Gatewayを可能にするバイナリーベクターのpGWB15にクローニングし(Nakagawa et al., J Biosci Bioeng 104: 34-41, 2007;図15)、HvCslH1をCaMV 35Sプロモーターの制御下に置き、3×HAエピトープタグをコードされるタンパク質のNH2末端に付加した(図1A)。形質転換シロイヌナズナ種子の初期選択により、PCRでHvCslH1の含有が確認されたいくつかの推定トランスジェニック実生を同定した。これらのT1植物のRNAブロット分析により、ロゼット葉中におよそ90%のHvCslH1転写産物が蓄積したことが示された(図1B)。抗HAタグ抗体を使用するウェスタンブロッティングを使用して、これらの系統におけるHvCslH1タンパク質を検出した(図1C)。混合したミクロソーム膜の分画(50,000〜100,000×gのペレット)を、プールされた3週齢のカナマイシン耐性T2実生から調製した。抗HA抗体を用いたウェスタンブロッティングは、HvCslH1転写産物を含有する28の系統のうちわずか4系統だけが予想サイズ(約90kDa)のポリペプチドを蓄積したことを示した(図1C)。分子量がより大きいタンパク質およびより小さいタンパク質が検出されることもあった(例えば、レーン11)。90kDaのタンパク質は、総タンパク質抽出物(データ非掲載)または非形質転換シロイヌナズナ植物から調製された混合膜分画(図1C、Col−0レーン)中には観察されなかった。HAタグ付加HvCslH1が、HvCslH1 mRNAを発現する植物系統の一部だけに蓄積する理由、あるいは、HvCslH1のタンパク質レベルと、HvCslH1の転写産物のレベル(図1BおよびCを比較されたい)または植物中に存在するHvCslH1トランスジーンの数(データ非掲載)のいずれかとの間に相関がない理由は知られていないが、このことは以前から観察されていた(Burton et al., Science 311: 1940-1742, 2006)。HAタグ付加HvCslH1を発現する8、11、16および24系統と検出可能なレベルのタンパク質を発現しない6系統(対照)を、次の実験のために選択した。
11系統由来の高圧凍結葉の切片を、金標識抗HA抗体とともにインキュベートし、HvCslH1の細胞内位置を決定した。標識は、小胞体およびゴルジ由来小胞に見出されたが、細胞膜には見出されなかった(図4A、B)。同様の結果が、根および実生の標識切片において観察された(データ非掲載)。
さまざまなオオムギ組織において、HvCslH1転写産物のレベルを、定量的RT−PCR(QPCR)を使用して決定した。遺伝子特異的プライマーを表4に表す。
本明細書に提示したデータは、イネ科植物特異的CSLH遺伝子ファミリーのメンバーであるHvCslH1の産物が、シロイヌナズナにおいてβ−グルカンの生合成を仲介することを示している。オオムギは、ESTデータベース分析、ゲノムDNAブロット分析およびBACライブラリのスクリーニングに基づき、CSLH遺伝子を一つだけ有すると思われる。パンコムギ、イタリアンライグラス(Lolium multiflorum)、トールフェスク(Festuca arundinacae)およびミナトカモジグサ(Brachypodium distachon)(すべてイチゴツナギ亜科(Pooideae))などの他のイネ科植物のEST分析は、オオムギと同様の1種の同定CSLH遺伝子を有するが、トウモロコシ、ソルガムおよびサトウキビ(すべてキビ亜科(Panicoideae))、コメなど(エールハルタ亜科(Ehrhartoideae))は、複数のCSLH遺伝子を有すると思われる。HvCslH1 cDNAのエピトープタグ付加形態を、シロイヌナズナにおいて異種発現させた場合、タンパク質が検出された4つの植物系統の3つが、β−グルカン特異的モノクローナル抗体により認識された多糖類を、それらの細胞壁に蓄積した。トランスジェニック系統の単離細胞壁を、特異的(1,3;1,4)−β−D−グルカンエンドヒドロラーゼを用いて消化した場合、特有の三糖類(G4G3GR)および四糖類(G4G4G3GR)が、オオムギ胚乳由来のβ−グルカンに見出される比と同様の比で検出され、トランスジェニックシロイヌナズナ系統由来の細胞壁が、β−グルカンを含んだことを実証する。さらに、エピトープタグ付加HvCslH1は、トランスジェニック植物細胞の小胞体およびゴルジ由来小胞において見出された。HvCslH1を発現したトランスジェニックシロイヌナズナ系統の形態学的表現型は、野生型植物と同一であると思われる。
バイナリーベクターの構築および植物の形質転換
HvCslH1 ORFを、オオムギ品種スクーナーの成葉頂のcDNAから、Herculase(登録商標)(Stratagene)を用い、プライマーHvH1TOPOfおよびHvH1TOPOr(表3)を使用して増幅し、PCR産物を、pENTR/D−TOPO(Invitrogen)にクローニングした。製造業者(Invitrogen)のプロトコルを使用し、LR反応を使用して、NH2末端に3×HAタグを含むデスティネーションベクターpGWB15にcDNAをクローニングし(Nakagawa et al., J Biosci Bioeng 104: 34-41, 2007)、DNA配列決定により、予測配列を確認した。HvCslHl::pGBW15構築体を、大腸菌(Escherichia coli)からアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)AGL1株に、三親接合を介し、ヘルパープラスミドpRK2013を使用して移した。シロイヌナズナCol−0植物を、フローラルディップ法を使用して形質転換した(Clough and Bent, Plant J 16: 735-743, 1998)。
T1植物の成熟ロゼット葉からTRIzol(登録商標)(Invitrogen)を使用して抽出した、約10μgの総RNA試料を調製し、1%w/vアガロース−ホルムアルデヒドゲル上で分離した(Farrell, RNA methodologies: A laboratory guide for isolation and characterization, Academic Press, Inc., San Diego, 1993)。RNAをHybond(商標)N+膜に転写し、Gene Images CDP−Star検出モジュール(Amersham-Biosciences)に概説された方法に従って、プレハイブリダイズおよびハイブリダイズを行った。プライマーH1F2およびHvH1TOPOr(表3)を用いて増幅したHvCslH1断片を、Gene Images Random Primeラベリングモジュール(Amersham)を使用し、製造業者のプロトコルに従って標識し、プローブとして使用した。
RNA抽出、cDNA合成およびQPCRを、Burton et al.(Plant Physiol 146, 1821-1833, 2008)に記載された変法を用いて、Burton et al.(Science 311, 1940-1942, 2006; Plant Physiol 134, 224-236, 2004)に記載のように実施した。オオムギ対照遺伝子のプライマー配列を表4に記載する。
in situ PCRを、Koltai & Bird(Plant Physiol 123: 1203-1212, 2000)の方法に従って、下記の変形を加え実施した。組織を切片にした後、ゲノムDNAを、37℃において6時間、1×DNase緩衝液および4U RNase非含有DNase(Promega)中で処理することによって取り出した。cDNAの合成を、RNase Hステップを省き、遺伝子特異的プライマー(1μg、表3)を逆転写に使用したことを除き、Thermoscript(商標)RT(Invitrogen)を使用して実施した。PCRを、1×PCR緩衝液、200μm dNTP(Promega)、0.2nmolジゴキシゲニン−11−dUTP(Roche)、2mM MgCl2、200ngの各プライマーおよび2U Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen)を含む、最終容量50μL中で実施した。サイクリングパラメーターは、下記のとおりである:初期変性96℃2分、次いで、94℃30秒、59℃30秒、72℃1分を40サイクル。その後切片を洗浄し、1.5Uのアルカリホスファターゼ結合抗ジゴキシゲニンFabフラグメント(Roche)とともにインキュベートし、Koltai & Bird(2000、上記)により概説されたように、10〜20分発色させた。陰性対照切片では、逆転写酵素を省き、すべてのHv 18S rRNAプライマーを含み、ゲノムDNAから任意の増幅があったかどうかを確認した。
HvCslH1トランスジェニック植物のT1種子を回収し、約100個の種子を、50mg/Lカナマイシン(Sigma)を含有する1×MS寒天培地上に撒いた。3週間後、カナマイシン耐性の実生をプールし、液体窒素中で凍結し、ホモジナイズ用緩衝液(50mM NaPO4緩衝液、pH7.5、0.5Mスクロース、20mM KCl、10mM DTT、0.2mM PMSF、83μL植物プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma、P9599))を含む乳鉢および乳棒で4℃において粉砕した。ホモジネートを、50μMメッシュのフィルターを通してろ過し、S/Nを、6,000×gで10分間、4℃において遠心した。S/Nをデカントし、50,000×gで30分間、4℃において、4.5mlの超遠心管(Beckmann)において遠心した。50,000×gのS/Nをデカントし、ペレットを、10mM Tris−MES緩衝液、pH7.5に、ガラス−テフロンホモジナイザーを使用して再懸濁した。再懸濁したペレットを、Tri−MES緩衝液を用いて4.5mLに希釈し、100,000×gで、1時間、4℃において遠心した。ペレットを、上に概説したように、0.25Mスクロース、10mM Tris−MES緩衝液、pH7.5に再懸濁した。タンパク質濃度を、Bradfordアッセイ試薬(BioRad)を使用して測定し、ウシ血清アルブミンを標準として使用した。
膜タンパク質(30μg)の試料を、60℃において20〜60分間、200mMジチオスレイトールおよび試料緩衝液(37.5mM Tris−HCl、pH7.0、10%グリセロール、3%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.025%ブロモフェノールブルー)中でインキュベートし、SDS:タンパク質比を1.5mgSDS対30μgのタンパク質にして、その後8%SDS−PAGEゲルに添加した。電気泳動後、ゲルをニトロセルロース(OSMONIC(商標)Nitropure 22μm)に、0.05%SDSを含有するTowbin緩衝液(25mM Tris塩基、192mMグリシン、20%メタノール)中で4℃において100V、90分間かけてブロットした。次いで、膜を、3%w/v粉乳を含有するTris緩衝生理食塩水(TBS;20mM Tris塩基、150mM NaCl)において一晩ブロッキングし、その後、1%BSAを含有するTBSで1:1000に希釈したラット抗HAポリクローナル抗体(Roche)中で室温で1時間インキュベートした。膜を0.05%SDS(TBST)を含有するTBSで3回洗浄し、次いで、3%w/v脱脂粉乳を含有するTBSで1:1000に希釈した抗ラットIgG HRP結合抗体(Dako)中でインキュベートした。膜をTBSTで3回洗浄し、その後、シグナルを、SuperSignal(登録商標)West Pico化学発光基質(Pierce)を用いて検出した。
シロイヌナズナ組織を固定し、Burton et al.(Science 311, 1940-1942, 2006)に従って、抗(1,3;1,4)−β−D−グルカン特異的抗体(Meikle et al., Plant J 5: 1-9, 1994)を用いて標識した。抗HA抗体を用いた標識のために、植物組織を2つの銅のプランチェットの間に置き、Leica EM高圧フリーザーにおいて急速に凍結させた(2.7×105kPaおよび−10,000℃s−1の適切な速度に設定する)。プランチェットを、−50℃、72時間に設定したLeica自動凍結置換装置中で100%エタノールに移した。試料を、室温(RT)で一晩置き、取り出し、LR White樹脂でろ過し、Burton et al.(2006、上記)に記載のようにゼラチンカプセルに包埋した。包埋した葉組織の切片をフォルムバー被覆金グリッド上に回収し、1%w/v BSAを含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS;137mM NaCl、10mM NaPO4、2.7mM KCl、pH7.4)で1:200に希釈したラット抗HAポリクローナル抗体中で室温で1時間、次いで4℃で一晩インキュベートした。グリッドをPBSで数回洗浄し、次いで、1%w/v BSAを含有するPBSで1:20に希釈した18nm金(Jackson ImmunoResearch)と結合した抗ラット二次抗体中で室温で1時間インキュベートした。次いで、グリッドを洗浄し、染色後、Burton et al.(2006、上記)に記載のようにTEM下で見た。
アルコール不溶性画分(AIR)を、植物材料を液体窒素中で、乳鉢と乳棒を使用して粉砕することによって調製した。5倍量の80%エタノールをホモジネートに加え、その後4℃において1時間回転することによって混合した。3,400×gで5分間遠心後、上清を取り除き、残留物を室温で80%エタノール中で1時間、2回還流し、その後50%エタノール中で1時間、2回還流した。エタノール可溶性画分を取り除き、AIRを100%エタノールで1回洗浄し、その後40℃において真空乾燥させた。
AIR(100mg、上記のように調製)を、5mLの20mM NaPO4緩衝液、pH6.5中で2時間、50℃において、200rpmで振とうしてインキュベーター中で連続混合しながらインキュベートした。2時間後、懸濁液を遠心分離(3,400×g、5分)にかけ、上清(S/N)を取り除いた。別の5mLの緩衝液を加え、インキュベートおよび遠心分離を繰り返した。この2次インキュベートで得たS/Nを、酵素非含有陰性対照として使用した。ペレット化したAIRを、5mLのNaPO4緩衝液に再懸濁し、これに、100μlの(1,3;1,4)−β−D−グルカンエンドヒドロラーゼ(McCleary et al., J Inst Brew 91: 285-295, 1985)を加えた。混合物を、連続混合しながら、50℃において2時間インキュベートし、その後S/Nを、(1,3;1,4)−β−D−グルカンエンドヒドロラーゼ放出オリゴ糖として回収した。陰性対照および(1,3;1,4)−β−D−グルカンエンドヒドロラーゼ処理S/Nを、グラファイト化カーボンカートリッジ上で、Packer et al.(Glycoconj J 15: 737-747, 1998)により記載のように脱塩し、乾燥させた。
乾燥させた(1,3;1,4)−β−D−グルカンエンドヒドロラーゼ放出オリゴ糖を、100μLのMilli H2Oに溶解し、20μLを、0.2M NaOH中の50mM NaOAcを用いて平衡化したCarboPac PA1カラム(Dionex)に、パルスアンペロメトリック検出装置(PAD)およびオートサンプラーを搭載したDionex BioLC ICS 300システム(Dionex)を使用して注入した。オリゴ糖を、0.2M NaOH中50mMのNaOAcから0.2M NaOH中350mMまでの線形勾配で、15分かけて、1mL/分で溶出した。ラミナリビオース(Seigaku)、マルトースおよびセロビオース(双方ともSigma)を、標準として流した。
残りの(1,3;1,4)−β−D−グルカンエンドヒドロラーゼ放出オリゴ糖のアリコート(30μL)を凍結乾燥させ、DMSOに溶解し、NaOH法(Ciucanu and Kerek, Carb Research 131: 209-217, 1984)を使用してメチル化した。メチル化オリゴ糖を、ジクロロメタン(DCM)中に分配し、DCM相をMilliQ水で3回洗浄した。DCM相を、N2気流下で乾燥させ、その後10μLの50%アセトニトリルに再溶解した。1μLのアリコートを、1μLの2,5−ジヒドロキシ安息香酸マトリックス(50%アセトニトリルに溶解して10mg/mL)と混合し、1μLの混合物を、MALDI TOF質量分析計(Voyager DSTR, Applied Biosystems)において分析するために、MALDIプレートにスポットした。
BLASTサーチツール(Altschul et al., Nucl Acids Res 25: 3389-3402, 1997)を使用して、CSLH ESTを、現在中止になったStanford Cell Wall website、NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、HarvEST(http://harvest.ucr.edu/)、GrainGenes(http://wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml)、Barley Gene Index(http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html)およびBarley Base(www. barleybase.org)を含む、公共のデータベースに照会することにより得た。配列を、Sequencer(商標)3.0(GeneCodes)またはVector NTI(登録商標)Advance 9.1.0(Invitrogen)のモジュールであるContigExpressのいずれかを使用して、コンティグに組み立てた。DNAまたはタンパク質の配列を、ClustalX(Thompson et al., Nucl Acids Res 24: 4876-4882, 1997)を使用してアライメントした。系統発生学的分析を、固有近隣結合アルゴリズムを使用して実施し、ツリーのロバスト性は、1000回のブートストラップ反復を使用して評価した。配列類似性を、MatGat 2.02(http://bitincka.com/ledion/matgat/)(Campanella et al., BMC Bioinformatics 4: 29, 2003)を使用して計算した。膜貫通ドメインは、ARAMEMNON(http://aramemnon.botanik.uni-koeln.de)(Schwacke et al., Plant Physiol 131: 16-26, 2003)に記載の一連のプログラムを使用して予測した。翻訳後修飾を予測するモチーフは、Toolsメニュー(http://www.expasy.org/tools/#pattern)のExPasyに記載のプログラムを使用して同定した。タンパク質パラメーターは、ExPasy(http://www.expasy.org/cgi-bin/protparam)のProtParamを使用して計算した。
非Yd2 品種モレックス(Clemson University Genomics Institute, CUGI)由来のオオムギゲノムの6.5等価体を含有するBACフィルターを、プレハイブリダイゼーション溶液(0.53M NaPO4緩衝液 pH7.2、7.5%w/v SDS、1mM EDTA、11μg/mlサケ***DNA)中で、65℃において6時間ブロッキングした。プライマーH1F1およびH1R1またはH1R5(表3)を用いて増幅した、放射性標識cDNAおよびgDNA断片を加え、65℃において、24時間インキュベートした。フィルターを、2×SSC、0.1%SDSで、室温で3回洗浄した。最終の洗浄を、1×SSC、0.1%SDSを用いて実施した。フィルターを、X線フィルムに2dで撮影した。陽性BACクローンを同定し、CUGIウェブサイト(http://www.genome.clemson.edu)に支持されたように整理した。クローンを、25μg/mlクロラムフェニコールを含有するLB寒天上に画線し、37℃において一晩増殖させた。各クローンのコロニーを採取し、25μg/mlクロラムフェニコールを含有するLB寒天上に載せた、グリッドの付いたナイロン膜に置き、37℃で一晩インキュベートした。DNAを、膜上に固定し、0.4M NaOHに浸したろ紙上に20分間置くことによって変性させ、次いで、中和溶液(1.5M NaCl、0.5M Tris−HCl pH7.2、1mM EDTA)に浸したろ紙上に置くことによって中和した。次いで、膜を、2×SSC、0.1%SDSで3回洗浄し、標準的条件(Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989)を使用してハイブリダイズを行った。
陽性クローンを、25μg/mlクロラムフェニコールを含有するLBブロス中で、37℃において一晩培養した。細胞を、遠心分離(12,000×g、3分)によってペレット化し、このペレットを90μLのTES緩衝液(25mM Tris−HCl pH8.0、10mM EDTA、15%w/vスクロース)に再懸濁した。溶解溶液(0.2M NaOH、1%SDS)のアリコート(180μL)を加え、ゆっくりと混合し、その後135μLの3M NaOAc pH4.6を加えた。染色体DNAを遠心分離(12,000×g、15分)によってペレット化した。S/Nを回収し、2μLのRNase A(10mg/mL)を加え、37℃において1時間インキュベートした。Tris飽和フェノール−クロロホルム(比1:1)の400μLのアリコートを加え、試料を再度遠心分離にかけた(12,000×g、5分)。S/Nを回収し、BAC DNAを、2〜3倍の冷却95%エタノールを使用して、室温で10分かけて沈殿させた。BAC DNAを、遠心分離(15,000×g、15分)によりペレット化し、70%エタノールで洗浄し、20〜50μLのTEに再懸濁し、4℃において保存した。
Siebert et al.(Nucl Acids Res 23: 1087-1088, 1995)のアダプターライゲーション法を使用して、公知のCSLH EST配列の上流のゲノムDNA断片を増幅した。オオムギゲノムDNAを消化するために使用した制限酵素は、EcoRV、NruI、PvuII、ScaIまたはSspIであった。一次PCR反応を、2μLのライゲートDNA(1:10希釈)、1×PCR緩衝液、2mM MgCl2、アダプタープライマーAP1およびアンチセンスプライマーH1R7各100ng(表3)、0.4mM dNTPならびに1単位のTaqポリメラーゼ(Invitrogen)を含有する25μL量で実施した。サイクルパラメーターは、下記のとおりであった:96℃2分、次いで94℃30秒間、59℃30秒間、72℃1分間を40サイクル、および最終ステップ72℃で7分間。二次PCR反応を、1μLの一次PCR産物を用いて、アダプタープライマーAP2およびネスティッドプライマーH1R6各100ngを使用して実施した。反応組成およびサイクルパラメーターは、アニーリング温度に61℃を使用した以外は上記と同じであった。
配列決定のために、0.5から1μgの単離BAC DNAを、5pmolのプライマーおよび1×Big Dye Terminator v3.1(BDT)ミックス(Applied Biosystems, USA)と、最終容量20μLで混合した。サイクルパラメーターは、下記のとおりであった:96℃15分、次いで96℃10秒間、55℃10秒間および60℃4分間を65サイクル。DNAを、0.1容量の3M NaOAc pH5.2および2.5容量の95%エタノールを用いて氷上で10分間沈殿させ、次いで12,000×gで30分回転させることによってペレット化した。ペレットを70%エタノールですすぎ、乾燥させ、配列決定のためにAGRF(Brisbane, Australia)に送付した。
遺伝子マッピングを、60系統のSloop×Halcyonの倍加半数体(DH)マッピング集団を使用して実施した(Read et al., Aust J Agric Res 54: 1145-1153, 2003)。DNAブロットハイブリダイゼーション(Sambrook et al.,1989、上記)の標準的方法を使用して、プライマーH1F1およびH1R5(表3)を使用してPCR増幅したHvCslH1プローブを、6種の制限酵素(BamHI、DraI、EcoRI、EcoRV、HindIII、XbaI)の1種を用いて消化した、親系統のゲノムDNAを含有する膜とハイブリダイズさせた。次いで、二遺伝子ハイブリッド集団を、明らかな多型をもたらす酵素(DraI)を用いて消化した。多型をスコア化し、HvCslH1マップの位置を、MapManager QTバージョン0.30(Manly et al., Mamm genome 12: 930-932, 2001)の「find best location」機能を使用して決定した。マップの位置は、http://www.barleyworld.org/において利用可能な供給源を使用したQTLデータと相関した。
シロイヌナズナの種子を、滅菌溶液(次亜塩素酸ナトリウム(有効塩素2%)、Tween−20数滴)中で15分間表面滅菌し、次いで滅菌MilliQ水で4回すすいだ。表面滅菌種子を、50mLの滅菌1×MS培地(4.33g/L MurashigeおよびSkoogの基礎塩類(Phytotechnology Laboratories)、2%w/vスクロース、1%w/vバクトアガー)を含有する85×25mmのペトリ皿に広げた。形質転換体の選択のために、50mg/Lのカナマイシン(Sigma)を培地に加えた。プレートを、4℃の低温室に3〜5日置き、同時に発芽させた。次いで、低温湿性処理プレートを、昼と夜の温度がそれぞれ23℃および17℃の環境制御成長キャビネット(Thermoline L+MモデルTPG1260 TO-5x400、Smithfield、NSW、Australia)に移した。ロゼット葉における平均光強度レベルは、16時間の明サイクルで、三足蛍光灯(Sylvania Standard F30W/133-T8 Cool White)により供給された、約70μE m−2S−1であった。MSプレート上で3週間後、個々の苗を、水和させた直径42mmのJiffyペレットに移した。トレイに6つのペレットを9列並べ、3つのトレイを個々に2×3.5フィート金網台の棚に置き育てた。相対湿度を測定し、60から70%の間にした。植物に、地下灌漑によって2〜3日ごとに、Peter’s Professional(商標)General Purpose植物用肥料(Scotts Australia)を補給した水道水を与えた。
DNAを、単一のシロイヌナズナの葉から、Edwards et al.(Nucl Acids Res 19: 1349, 1991)に記載の方法に従って抽出した。ゲノムDNAの1μLアリコートを、プライマーH1F2およびHvCslH1TOPOr(表3)を使用する、下記のサイクリング計画:94℃2分、その後94℃20秒、57℃30秒、72℃30秒を35サイクルで、トランスジェニック植物のPCRスクリーニングにおいて鋳型として使用した。
コメおよびオオムギ双方におけるCslH配列に関するDNAおよびアミノ酸配列のアライメントを実施し、配列間の同一性および類似性のパーセントを計算し、その結果を図10に示す。DNAおよびタンパク質配列をアライメントし、http://bitincka.com/ledion/matgat/からダウンロードしたMatGATバージョン2.02におけるデフォルトパラメーターを使用して比較した。
タグ付加HvCslH1タンパク質が抗HA抗体を使用して検出された、2種のトランスジェニックシロイヌナズナ系統15−8および15−11を、OsCslF2、H37およびH17−4を含む他の2種のトランスジェニックシロイヌナズナ系統と、Burton et al.(Science 311: 1940-1942, 2006)により記載されたように、遺伝的に異種交配させるために選択した。HvCslH1およびOsCSLF2タンパク質を同じ細胞型の中に発現することによって、単一遺伝子(CSLHまたはCSLFだけ)トランスジェニックシロイヌナズナ植物において観察されるレベルより高いレベルの(1,3;1,4)−β−D−グルカンが細胞壁中に堆積される可能性があると考えられた。さらに、このことは、免疫電子顕微鏡研究および化学的細胞壁分析において、(1,3;1,4)−β−D−グルカン検出の助けになるはずである。
CslH1遺伝子の全長cDNA配列を、オオムギ栽培品種ヒマラヤから、オオムギEST配列、コメCslH1遺伝子配列(LOC_Os10g20090)に基づくプライマーを使用するcDNAからのPCR、および5’RACEの組み合わせを使用して単離した。
CslH1遺伝子の発現を、半定量的(RT−PCRおよびゲル電気泳動)と定量的(リアルタイムPCR)法により調査した。
トランスジェニックコムギ植物を、バイオリスティック形質転換により、発現が胚乳組織においてのみ起こるようにグルテニンプロモーターの制御下で全長ゲノムHvCslH1(品種ヒマラヤ)遺伝子により作出させた(図23)。系統を、トランスジーンの有無に関して、若葉材料のPCRによりスクリーニングした。12種のPCR陽性系統および3種のPCR陰性系統(H1−2、−7および11)を、成熟まで温室において成長させた。RNAを、開花約15日後に成長中の穀粒から単離し、cDNAを、Superscript IIIを使用して調製した。その後、オオムギトランスジーンの発現を、リアルタイムPCRにより分析した。使用したプライマーは、コムギおよびオオムギの遺伝子双方を増幅するので、表5は、内在性のコムギCslH遺伝子と比較した相対的発現レベルを示す。
植物材料
オオムギ(Hordeum vulgare)栽培品種ヒマラヤおよびコムギ(Triticum aestivum)栽培品種チャイニーズ・スプリング、ウェストニア(Westonia)およびボブホワイト(Bob White26)を、標準的温室条件下で成長させた。
植物DNAを、十分に膨張した葉の組織から、CTABに基づく方法(Murray and Thompson, Nucleic Acids Res. 8: 4321-4325, 1980)を使用して単離した。総RNAを、葉および子葉鞘の組織から、Qiagen社のRNAeasyキットを使用して単離した。RNAを、成長中の胚乳からフェノールSDS法およびLiCl沈殿(Clarke et al., Functional and Integrative Genomics 8, 211-221, 2007)を使用して単離した。RNAは、DNAseを用いて、Ambion社の「DNAフリー」キットを使用して処理し、次いでcDNAを、SuperscriptlII逆転写酵素を使用して、製造業者(Clontech)の指示書に従って合成した。
CslH遺伝子をクローニングする方法は、CslF遺伝子のクローニングおよび特性決定において記載された方法と同様であった(Burton et al., Plant Physiol 146: 1821-1833, 2008)。コメセルロースシンターゼ様H1遺伝子(LOC_Os10g20090)のオオムギホモログの1.8kb仮想コンセンサス配列(TC140327)を、TIGRデータベースにおいて同定した。PCRプライマー対(SJ27−SJ73およびSJ72−SJ75)を、コメCslH1配列に基づいて設計し、これらを用いてcDNA由来の配列を増幅した。次いで、遺伝子の5’末端を5’RACEにより、SMART cDNAライブラリと、ネステッドCslH1プライマーSJ28およびSJ79を使用して、製造業者(Clontech)の指示書に従って増幅した。
総RNAを、7日齢の植物の第1葉、さまざまな年齢の濃い色の成長した子葉鞘および開花後4日(DPA)間隔をあけて回収した成長中の穀粒の切片から単離し、DNAse処理し、Superscript IIIを用いて製造業者(Invitrogen)の指示書に従って逆転写した。PCR反応を、HotStarTaq(Qiagen)を使用して実施した。cDNAを希釈し、1μl当たり1ngの元のRNAと等量のレベルでPCR反応に使用した。半定量的RT−PCRのためにはCslH1プライマーSJ72およびSJ74、CslF遺伝子のためのプライマー対は下記のとおりであった;(CslF6;SJ107−SJ82)、(CslF4;SJ94−SJ95)、(CslF9;SJ97−SJ93)、(CslF3;SJ44−SJ38)、(CslF8;SJ96−SJ37)。アニーリング温度は59℃を使用した。試験増幅を実施して、増幅が飽和(チューブリンの24サイクルを除き、およそ32〜35サイクル)でなかったことを確実にし、産物を、アガロースゲル電気泳動後の臭化エチジウム染色によって分析した。リアルタイムPCRを3連の試料について、Rotorgene6000装置(Corbett Life Sciences, AU)においてHotStarTaq(Qiagen)、SybrGreenならびにプライマーSJ183およびSJ164ならびにアニーリング温度60℃を使用して実施した。相対的発現レベルを、コムギ0dpa試料を比較因子(1に設定)として用いて、装置のソフトウェアを使用して計算した。この試料のCt値は25.5サイクルであった。15dpaにおけるトランスジェニック穀粒の分析のために、相対的発現値を、チューブリンに対して正規化し、最も低い発現系統(H1−13)と比較した。
HvCslH1転写産物を、発芽後0.5から7日の成長中の子葉鞘において測定した。HvCslH1転写産物は、伸長段階の完了および葉の出現後にだけ蓄積されることが示された。発現の最も高いレベルは、子葉鞘が老化(ねじれおよび収縮)する7日後に見られた(Gibeaut et al., Planta 221:729-738, 2005)。
全長オオムギ品種ヒマラヤのゲノムCslH配列(配列番号71)を、プライマーSJ91およびSJ85を使用して増幅し、高分子量グルテニンBx17プロモーターの1.9kb断片とノパリンシンターゼターミネーターの間に、EcoRI断片として挿入した(図23)。Bx17プロモーターは、成長中の胚乳において高レベルの発現をもたらす(Reddy and Appels, Theor Appl Genet 85: 616-624, 1993)。
オオムギCslH cDNA(配列番号1)の全長コード領域を、2種のGateway可能なオオムギ形質転換ベクターに移した。ベクターpRB474は、胚乳特異的発現を提供するオートムギグロブリンプロモーターを含有し(Vickers et al., Plant Mol Biol 62: 195-214, 2006)、ベクターpMDC32(Curtis and Grossniklaus, Plant Physiol. 133: 462-9, 2003)は、すべての植物組織において構成的発現を駆動する二重35Sプロモーターを含有する。
ベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに移し、オオムギ栽培品種ゴールデンプロミスの未熟胚盤を、確立されたプロトコルを使用して形質転換し、トランスジェニック植物の2種の集団を作製した。トランスジーンの挿入は、サザンブロッティングにより確認した。植物236−1から236−18は、オートムギグロブリンプロモーターにより駆動されるオオムギCslH遺伝子を含有する。植物237−1および2は、35Sプロモーターにより駆動されるオオムギCslH遺伝子を含有する。植物208−2、−3、−5および−7は対照植物であり、オートムギグロブリンプロモーターのみを有する空ベクターpRB474についてトランスジェニックである。
葉および受粉後7および14日(DAP)の成長中の穀粒の試料を、236種の植物から回収した。総RNAを、TRIzol試薬(Invitrogen)を使用して、標準的プロトコルに従って抽出し、cDNAを、Burton et al.(Plant Physiol 146: 1821-1833, 2008)に従って合成した。定量的リアルタイムPCR(QPCR)を、Burton et al.(2008、上記)に従って実施した。CslH遺伝子の転写産物レベルを、トランスジェニック穀粒の胚乳において、一般的に非常に低い野生型胚乳レベルと比較した。
トランスジェニック植物由来のT1種子を回収した。個々の個体植物由来のバルクT1穀粒の試料を粉砕して粉にし、存在するβ−グルカンの量を、Megazyme法(上記)を使用して分析した。個々の植物からのデータを、2回の再現の平均値として表し、β−グルカンの量を穀粒重量のパーセントとして、下記の表8に示す。
Claims (13)
- 植物細胞により生成される(1,3;1,4)−β−D−グルカンのレベルを増加させる方法であって、該植物細胞中のCslHによりコードされる(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼのレベルおよび/または活性を増加させるステップを含み、該CslHによりコードされる(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼは、
(i)配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むか;または、
(ii)配列番号2と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、かつ(1,3;1,4)−β−D−グルカンの合成を触媒するか、またはグルコピラノシル単量体の重合を触媒する、
前記方法。 - 前記(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼのレベルおよび/または活性が、植物細胞中のCslH核酸の発現を増加させることにより増加される、請求項1に記載の方法。
- (1,3;1,4)−β−D−グルカンの生成方法であって、単離されたCslH核酸で植物細胞を形質転換するステップ、および該植物細胞に該単離されたCslH核酸を発現させるステップを含み、該CslH核酸は、
(i)配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むか;または、
(ii)配列番号2と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、かつ(1,3;1,4)−β−D−グルカンの合成を触媒するか、またはグルコピラノシル単量体の重合を触媒する、
(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼをコードする、前記方法。 - 前記植物細胞が穀類植物細胞である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 以下:
同じ分類群の野生型植物細胞と比較してそのレベルおよび/または活性が増加された、CslHによりコードされる(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼであって、該CslHによりコードされる(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼは、
(i)配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むか;または、
(ii)配列番号2と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、かつ(1,3;1,4)−β−D−グルカンの合成を触媒するか、またはグルコピラノシル単量体の重合を触媒する、
前記レベルおよび/または活性が増加されたCslHによりコードされる(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼ;ならびに/あるいは
同じ分類群の野生型植物細胞と比較してその発現が増加されたCslH核酸であって、該CslH核酸は、
(i)配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むか;または、
(ii)配列番号2と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、かつ(1,3;1,4)−β−D−グルカンの合成を触媒するか、またはグルコピラノシル単量体の重合を触媒する、
(1,3;1,4)−β−D−グルカンシンターゼをコードする、前記発現が増加されたCslH核酸
のいずれか1以上を含む植物細胞であって、同じ分類群の野生型植物細胞と比較してそのレベルが増加された(1,3;1,4)−β−D−グルカンを含む、前記植物細胞。 - 請求項1または2に記載の方法により作製された、請求項5に記載の植物細胞。
- 穀類植物細胞である、請求項5または6に記載の植物細胞。
- 請求項5〜7のいずれか1項に記載の1以上の植物細胞を含む多細胞構造物。
- 植物全体、植物組織、植物器官、植物部分、植物繁殖材料、または培養植物組織からなるリストより選択される、請求項8に記載の多細胞構造物。
- 穀類植物、またはその組織、器官もしくは部分を含む、請求項8または9に記載の多細胞構造物。
- 穀粒を含む、請求項10に記載の多細胞構造物。
- 同じ分類群の野生型細胞と比較して食物繊維含有量が増加された細胞を含む、請求項9〜11のいずれか1項に記載の多細胞構造物。
- 同じ分類群の野生型細胞と比較して(1,3;1,4)−β−D−グルカンレベルが増加し、かつ同じ分類群の野生型細胞と比較して食物繊維含有量が増加した細胞を含む、請求項12に記載の多細胞構造物。
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