JP5562295B2 - 分枝酵素の活性を改変した小麦、ならびにそれから得たデンプンおよびデンプン含有品 - Google Patents
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Description
表1.穀類で明らかにされているデンプン分枝酵素遺伝子
本発明は、小麦胚乳のSBEIIa活性を低下させると、修飾されたデンプンが産生され、特に小麦穀粒の相対的なアミロースレベルが高くなるという研究結果に基づいている。この予想外の結果は、SBEIIaの変異によってアミロペクチン/アミロースの特性が改変されなかったトウモロコシおよびコメでの研究結果と対照的である(Blauth他、2001年、Nakamura、2002年)。別の実施形態では、SBEIIb活性ならびにSBEIIa活性を低下させるなど、1種または複数の追加のデンプン生合成酵素活性を改変する。これら2種の活性をコードする遺伝子の変異には、SBEIIaおよびSBEIIbが、トウモロコシおよびコメでは関連していないのとは対照的に、小麦では密接に関連しているという驚くべき研究結果が役立つ。本発明者らは、予想外に、SBEIIa活性およびSBEIIb活性のレベルが低い小麦植物の穀粒が非しわ型であるということも発見した。
一態様では、本発明は、穀粒中のデンプンを改変した小麦植物を作製する方法、特にデンプン中のアミロース比率を少なくとも30%に増加させる方法を提供する。通常、6倍体の小麦およびデュラム小麦では、デンプン中のアミロース比率は、約18〜約30%の範囲であり、一部の変異体(SGP−1欠損)では最大約35%である。一実施形態では、本発明の方法は、アミロースを少なくとも30%含むデンプンを有する穀粒を結実する小麦植物を提供するために、親となる小麦植物または小麦種子に遺伝的変異を導入するステップを含む。本明細書で定義するデンプン中のアミロース比率は、重量/重量(w/w)、すなわち、穀粒から得たデンプンの重量に対するパーセンテージとしてアミロース重量を示した値に基づく。別の実施形態では、デンプン中のアミロース比率は、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、または少なくとも75%である(それぞれw/w)。本発明の別の実施形態では、この方法により、少なくとも80%または少なくとも90%(w/w)のアミロース比率が得られる。
別の態様では、本発明は、デンプン中のアミロース比率が少なくとも30%である穀粒を結実することができる小麦植物を提供する。別の実施形態では、アミロース比率は、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、または少なくとも80%である。別の実施形態では、その穀粒がデンプン中にこれらのレベルのうちのいずれかのアミロースを含む小麦植物は、野生型穀粒と比べて胚乳のSBEIIa遺伝子発現、SBEIIa酵素活性、またはその双方のレベルを低下させる遺伝的変異を含む。好ましい実施形態では、この遺伝的変異は、SBEIIa遺伝子の変異またはSBEIIa遺伝子発現の阻害物質をコードする導入核酸を含む。この阻害物質は、アンチセンスRNA分子、コサプレッションRNA分子、リボザイムRNA分子、二重鎖RNA分子、あるいはSBEIIaの発現および/または活性を阻害する類似の分子を含んでよい。
本発明は、野生型小麦穀粒から抽出したデンプンと比べて改変されたデンプンを含む小麦穀粒も提供する。本明細書では、ほぼ成熟した穀粒を穀粒と定義する。これには、商業的環境で収穫された穀粒が含まれる。一実施形態では、改変デンプンは、少なくとも一部には小麦穀粒の胚乳の発育中にSBEIIa活性を低下させた結果物である。先の実施形態と相互に排他的ではない別の実施形態では、この穀粒のアミロース比率(全デンプンに対するパーセンテージ)は上昇している。これは、野生型植物から得た穀粒と比べた、デンプン中のアミロペクチンの減少率として測定することができる。野生型小麦デンプンは、アミロースを約20〜30%、アミロペクチンを約70〜80%有する。本発明の穀粒は、好ましくはアミロースを少なくとも50%(w/w)含むデンプンを含有する。別の実施形態では、SBEIIa活性およびSBEIIb活性の双方が、胚乳の発育中に低められる。別の実施形態では、SBEIの活性も低められる。別の実施形態では、当技術分野でよく理解されている方法によって測定したアミロース比率がは、穀粒のデンプンの少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、または少なくとも90%(各w/w)である。アミロースレベルの上昇は、デンプン粒の形態が異常になること、または光学顕微鏡もしくは当技術分野で既知の他の方法で観察すると顆粒の複屈折性が失われていることによって、証明することができる。特定の実施形態では、ヨード滴定法によって、例えば、MorrisonおよびLaignelet(1983年)の方法のような分光光度的方法でよい、または高速液体クロマトグラフィー(HPLC、例えば、BateyおよびCurtin、1996年)によって、アミロース比率を測定する。
別の態様では、本発明は、本明細書で記述する小麦植物の穀粒から得た、アミロース比率が高くアミロペクチン比率が低いデンプンを提供する。好ましい実施形態では、デンプンは、野生型小麦に比べて胚乳のSBEIIaタンパク質、SBEIIa酵素活性、またはその双方のレベルが低下した小麦植物の穀粒から得られる。別の実施形態では、野生型小麦に比べて、SBEIIa活性およびSBEIIb活性の双方が低く、または、SBEIIa、SBEIIb、およびSBEIの3種すべてのレベルが低い。
SBEIIa、SBEIIbその他のデンプン生合成または修飾遺伝子の発現および/または活性は、1つまたは複数の遺伝的変異を小麦植物に導入することにより変わることがある。本明細書において用いる場合、「遺伝的変異」とは、この文脈において、対象とする遺伝子の発現または活性に影響を及ぼす、小麦植物ゲノムにおける遺伝性の任意の変化を意味する。遺伝的変異としては、点変異、挿入、置換、逆位、重複、転座および好ましくは欠失などの突然変異ならびに1つまたは複数の導入遺伝子のゲノムへの導入を含む。
元の残基 置換例
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln;His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Ala
His Asn;Gln
Ile Leu;Val
Leu Ile;Val
Lys Arg;Gln;Glu
Met Leu;Ile
Phe Met;Leu;Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp;Phe
Val Ile;Leu
SBElla、SBEIIbまたは他デンプン生合成または修飾遺伝子の発現および/または活性は、1つまたは複数の導入遺伝子を小麦植物にもたらすことによって変更され得る。本明細書で言う「導入遺伝子」は、バイオテクノロジーの技術分野における通常の意味を有し、組換えDNAまたはRNA技術によって製造されたか変更され、対象とする有機体または細胞(好ましくは小麦細胞)に導入された遺伝子配列を含む。導入遺伝子は、有機体または細胞に由来する遺伝子配列(例えば、アンチセンス配列)を含んでもよい。導入遺伝子は、典型的には、前記有機体または細胞に由来しない外来性の核酸を含む。「トランスジェニック」とは、導入遺伝子を含む有機体または細胞を指す。「非トランスジェニック」とは、ゲノム中にいかなる導入遺伝子も存在しないことを指す。安定した継承のために、好ましくは導入遺伝子を有機体または細胞のゲノムに組み込む。
小麦などの植物において遺伝子活性に変更を加える、特に低減する遺伝子工学アプローチは、当技術分野において周知である。これらの方法は、標的遺伝子のRNAと相補的でハイブリダイズすることができる適当なアンチセンス分子の発現のための、遺伝子コンストラクトの導入を含む。アンチセンス分子は標的遺伝子のmRNAの翻訳または処理または安定性に干渉し、それによって遺伝子の発現を不活性化すると考えられる。アンチセンス配列を考案する方法は周知の技術であり、これらの例は米国特許第5190131号、欧州特許明細書第0467349−A1号、欧州特許明細書第0223399−A1号および欧州特許明細書第0240208号に見ることができ、これらは参照によって本明細書に組み込まれる。植物におけるアンチセンス法の使用は、Bourque(1995年)とSenior(1998年)によって概説されている。Bourqueは、植物システムにおいてアンチセンス配列を使った遺伝子失活の多数の例を列挙している。彼女も、部分的な阻害がシステムにおいてかなりの変化を確かにもたらすであろうから、酵素活性の100%の抑制を達成することは必要ではないと述べている。Senior(1998年)は、アンチセンス法は、現在、植物で遺伝子形質発現を操作することの非常に安定した技術であると述べている。
使用し得る別の分子生物学的製剤アプローチは、コサプレッションである。コサプレッションのメカニズムは、十分理解されていないが、転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)を含むと考えられており、この点ではアンチセンス抑制の多くの例と、非常に類似している。それは、その発現のためには、プロモーターに関してセンス方向に植物内に遺伝子の余分なコピーまたはその断片を導入することが必要である。センス断片のサイズ、標的遺伝子領域との対応および標的遺伝子への配列同一性の程度は、上述のアンチセンス配列に関してと同様である。若干の例では、遺伝子配列のさらなるコピーは、標的植物遺伝子の発現の妨害をする。コサプレッションアプローチを実行する方法については、WO97/20936および欧州特許明細書第0465572号を参照されたい。
遺伝的変異を小麦植物に導入するために使用され得るさらなる方法は、二重鎖あるいは二本鎖RNAによって媒介される遺伝子サイレンシングである。この方法も、PTGSを含む。この方法では、失活させるべき標的遺伝子に相同で少なくとも部分的に二本鎖であるRNA産物(複数可)の合成を指示するDNAを導入する。したがって、DNAは、RNAに転写されるときハイブリダイズして二本鎖RNA領域を形成することができるセンスとアンチセンス配列からなる。好ましい実施形態において、センス配列とアンチセンス配列は、RNAに転写されるとき、スプライシングで除かれるイントロンからなるスペーサー領域によって分離されている。この構成は、遺伝子サイレンシングをより高効率にすることが示された。二本鎖領域は、1または2のDNA領域から転写される1または2のRNA分子を含んでもよい。二本鎖分子の存在は、二本鎖RNAおよびさらには標的植物遺伝子からの相同なRNA転写物も破壊する内在性植物システムからの応答を誘発し、標的遺伝子の活性を能率的に低減するか排除する。この技術を実施する方法については、オーストラリア特許明細書第99/29514−A号およびWO99/53050を参照されたい。特定の実施形態において、ハイブリダイズするセンス配列およびアンチセンス配列の長さは、少なくとも19の隣接するヌクレオチド、少なくとも30、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも500または少なくとも1000のヌクレオチドである。すべての遺伝子転写物と対応する全長配列を用いてもよい。特定の実施形態においては、長さは範囲100〜2000ヌクレオチドである。さらなる実施形態において、センス配列およびアンチセンス配列の標的とされた転写物への配列同一性の程度は、少なくとも85%、少なくとも90%または95〜100%である。RNA分子は、もちろん、分子を安定させるために機能してもよい無関係な配列を含んでもよい。RNA分子は、RNAポリメラーゼIIまたはRNAポリメラーゼIIIプロモーターの制御下に発現されるものでもよい。後者の例は、tRNAまたはsnRNAプロモーターを含む。二本鎖RNA分子は、互いに連結された複数の遺伝子からの配列を含んでもよく、それによって複数の遺伝子を標的としてもよい。
小麦の遺伝子形質発現の望ましい失活をもたらす遺伝的変異は、1つまたは複数のリボザイムをコードする核酸分子を含む。リボザイムは、1またはしばしば2つのハイブリダイズしている配列によって定義される特定のサイトで他のRNA分子を切断することができる、酵素または触媒機能を有するRNA分子である。RNAの切断により、標的遺伝子の発現を不活性化する。リボザイムはアンチセンス分子の働きをしてもよく、それが遺伝子失活に寄与してもよい。リボザイムは、ハイブリダイズしている配列の間で1つまたは複数の触媒領域(好ましくはハンマーヘッドまたはヘアピンタイプ)を含む。RNAseP、Group IまたはIIイントロンおよびデルタ型肝炎ウイルスタイプを含め、他のリボザイムのモチーフを用いてもよい。欧州特許明細書第0321201号および米国特許第6,221,661号が参照される。例えばWegener他(1994年)によって、遺伝子導入植物の遺伝子を不活性化するリボザイムの使用が示されている。
本発明は、遺伝子阻害分子をコードするRNAまたはDNA、好ましくはDNAを含む単離された核酸分子も提供する。ある実施形態において、核酸分子は、小麦SBEIIa遺伝子配列を標的とし、小麦穀粒の胚乳のその発現を失活させるアンチセンス、センス(コサプレッション)、二本鎖RNAまたはリボザイム分子をコードする。本発明はまた、プロモーター、エンハンサーおよび転写末端またはポリアデニル化配列などの1つまたは複数の調整要素を含む単離された核酸分子を含むかコードする遺伝子のコンストラクトを提供する。そのような要素は当技術分野において周知である。植物、特に小麦などの単子葉植物において、遺伝子のコンストラクトは、導入遺伝子の発現を助けるイントロン配列を含んでもよい。「イントロン」という用語は、その通常の意味では、転写されるが、タンパク質をコードせず、翻訳前にRNAからスプライシングにより除かれる遺伝子の部分を意味するように使われる。導入遺伝子が翻訳産物をコードするか、そうでなく転写領域のどこかをコードするならば、イントロンは5'−UTRまたはコード領域に組み入れられてもよい。
別の実施形態において、本発明の導入遺伝子または他の遺伝子コンストラクトは、小麦の胚乳内で調節されたか構成的な発現をもたらし得る転写開始領域(プロモーター)を含む。プロモーターは組織特異的で、選択的に、または、もっぱら胚乳の発現を与えるものでもよい。プロモーターは、(高分子グルテニンプロモーター、小麦SSIプロモーター、小麦SBEIIプロモーター、小麦GBSSプロモーターなどの)胚乳特異的または(ユビキチンプロモーターまたはCaMV35Sまたは強化された35Sプロモーターなどの)胚乳に非特異的なプロモーターのいずれから選択してもよい。プロモーターは、温度、光またはストレスなどの要因によって調整されてもよい。通常、プロモーターは、発現されるべき遺伝子配列の5'をもたらされる。コンストラクトは、nos3'またはocs3'ポリアデニル化領域または転写ターミネーターなどの転写を強化する他の要素も含んでもよい。例示したDNA領域は、適当な選択可能なマーカー遺伝子配列と他の要素を含むベクターに、または、ベクターがこれらの配列を含んで同時形質転換され得るベクターに取り込まれる。
小麦などの単子葉植物の形質転換法、すなわち、外来性の核酸の導入によって遺伝的変異を植物に導入し、プロトプラストまたは未熟な植物胚から植物を再生する方法は、当技術分野において知られており、例えば、Becker他、1994年、Cheng他、1997年、He他、1994年、Hess他、1990年、Nehra他、1994年、Vasil他、1992年、Vasil他、1993年、Weeks他、1993年、Weir他、2001年、オーストラリア特許出願番号第75460/94号、欧州特許出願番号第709462号、WO93/04178、WO89/12012、WO94/13822およびWO99/14314を参照されたい。望ましいヌクレオチド配列または遺伝子のコンストラクトおよび選択可能なマーカーを運ぶベクターは、組織栽培された植物または外植体の再生可能な小麦細胞またはプロトプラストなどの適当な植物システムに導入すればよい。選択可能なマーカー遺伝子は、小麦細胞に抗生物質または除草剤耐性を提供してもよいし、マンノースなどの基質の利用性を可能にするものでもよい。選択可能なマーカーは、好ましくはアスラム、ジェネテシン(geneticin)またはハイグロマイシン耐性を小麦細胞に与える。再生可能な小麦細胞は、好ましくは、未熟な胚の胚盤、成熟した胚、これらに由来するカルスまたは***組織に由来する。
小麦胚乳においてSBEIIa酵素その他のデンプン生合成酵素の活性の低減をもたらす遺伝的変異の導入は、それぞれの遺伝子内における適当な突然変異にもよって達成されてもよいし、遺伝子の調節配列内における適当な突然変異にもよって達成されてもよい。本明細書の文脈では、「誘発突然変異」は化学産物、放射線または生物ベースの突然変異生成(例えば、トランスポゾンまたはT−DNA挿入)の結果でもよい人工的に誘発された遺伝的変異である。遺伝子が阻害される程度は、ある程度、生産されるデンプンの特徴を決定する。突然変異はトランケーションまたはヌル変異でもよく、これらがデンプンの性質に重要な影響を及ぼすことは知られている。しかし、変更されたデンプン構造は、デンプンまたは小麦穀粒において対象とする特徴をもたらすのに十分にアミロペクチン合成酵素活性を低減する漏出突然変異からも生じるであろう。他の染色体再編成も有効であり得、これらは挿入、欠失、逆位、重複または点変異を含んでもよい。本明細書で用いられる「ヌル変異」は、対象とすべき遺伝子の活性の完全かまたは完全に近い損失をもたらす突然変異を指し、例えば、遺伝子活性がもはや見出されないものを指す。
別の面で、本発明は食糧生産に役立つ小麦(穀粒が相対的に高いアミロース含有量を有し低減されたアミロペクチン含有量を有するデンプンを含有する。)を提供する。好ましくは、穀粒が得られる小麦植物は、成長の間、胚乳で低減されたSBEIIa活性レベルを有する。本発明の小麦植物は、食糧生産のために、特に、商業的食糧生産のために役立つ。そのような食糧生産は、商業的食糧生産の成分となし得る小麦粉、生地その他の産物の製造を含んでもよい。
糊化は、過剰量の水中における分子秩序の熱による崩壊(破壊)であり、粒膨潤、結晶化温度、複屈折の喪失、粘性の増大とデンプン可溶化などの特性の同時的かつ非可逆的変化を伴う。トウモロコシのae(アミロース増量体)変異体からのハイアミロースデンプンは、通常のトウモロコシより高い温度を示した(Fuwa他、1999年、Krueger他、1987年)。他方、デンプン合成酵素IIa活性が欠如している大麦sex6変異体からのデンプンは低い糊化温度を有し、対照植物と比較したとき、糊化ピークに対するエンタルピーは減少した(Morell他、2003年)。
デンプンは人間の食餌における主要な炭水化物源であり、本発明とそれに由来する産物の穀粒は食物調製に用いることができる。例えば家畜生産において、または、ペットフードにおいて、食物は人または動物によって消費され得る。変更された小麦植物に由来する穀粒は食品加工の方法においてすぐに使うことができ、したがって、本発明は、前述の小麦植物を処理した穀粒または全粒から得られる、挽いたか、粉砕したか、粗挽きしたか、球状にしたか、ロール状にした穀粒または製品(小麦粉を含む。)を含む。これらの製品は、次いで、様々な食品、例えば、パン、ケーキ、ビスケットなどのデンプン質製品、または増粘剤または結着剤などの食品添加物中で、または、飲物、麺、パスタまたはインスタントスープに用いてもよい。本発明の穀粒に由来する穀粒または産物は、特に朝食用シリアルにおいて、または、押出加工された製品として望ましい。本発明のハイアミロースデンプンは、菓子類産業において有用なハイストレングスゲル類を形成するのに用いることもでき、または、より低温で短時間の硬化時間を可能にする。それらは、例えば、深揚げポテトその他の食品において油吸収を減らすためのコーティングとしても用い得る。
本明細書において、食物繊維は、健康な人間の小腸では吸収されずに大腸に入る炭水化物および炭水化物消化産物である。これは、抵抗性デンプン、β−グルカンならびに他の可溶性および不溶性炭水化物ポリマーを含む。それは、少なくとも部分的には、常駐微生物相によって大腸内で発酵可能な炭水化物部分を含むことを目的とする。
レジスタントスターチは、健康な人間の小腸に吸収されずに大腸に入るデンプンおよびデンプン消化産物の合計と定義される。したがって、レジスタントスターチは、消化されて小腸で吸収される産物を除外する。レジスタントスターチは物理的に接触しがたいデンプン(RS1形)、抵抗性顆粒(RS2)、老化デンプン(RS3)、化学修飾デンプン(RS4)を含む。食物で消費されるとき、本発明のデンプンの変更されたデンプン構造と特にハイアミロースレベルはレジスタントスターチの増加を引き起こす。デンプンは消化するにはいくぶん接触しがたいRS1形でもよい。V−複合体結晶度で測定されるデンプン−脂質会合体もレジスタントスターチのレベルに寄与しそうである。
血糖指数(GI)は、デンプンを含む食品の消化率に関するものであって、運動時、血中グルコース濃度に関する白パンまたはブドウ糖の効果を試験食物の効果と比較するものである。血糖指数は、食事後の血清グルコース濃度と血中グルコースホメオスタシスのためにインシュリンの必要量に関する食物の影響可能性の目安である。本発明の食品によって提供される1つの重要な特徴は、血糖インデックスが減少することである。さらにまた、食品は最終的な消化レベルが低く、したがって比較的低カロリーとなし得る。低カロリー産物は、粉砕小麦穀粒から作り出される小麦粉の含有に基づくものでもよい。そのような食品は、お腹を満たし、腸の健康を強化し、食後の血清グルコースと脂質濃度を減らすとともに低カロリー食品を提供するという効果を有し得る。
本発明は、アミロースレベルを上昇させ、アミロペクチンを低減させた修飾または改善されたデンプンを提供し、これらの特性は種々の産業の必要条件のいずれをも満たす。デンプンは、フィルム、紙、織物、段ボールおよび接着性産業(Young、1984年)で、例えば、サイズ剤として、広く非食品産業において使われている。小麦デンプンは、ブドウ糖シロップの生産のための、または、エタノール産生のための基質として用いてもよい。改変されていないデンプンの物性は若干のアプリケーションでその有用性を制限し、高価であるか他の不利益があることがあり得る化学修飾がしばしば必要となる。特に他の物性と組み合わせてアミロペクチン含有量を低減したために、本発明は収穫後改変の必要がより少ないデンプンを提供する。例えば、糊化温度、デンプンの剪断応力抵抗性、フィルム強さおよび/または水抵抗ならびに本発明の穀粒から製造される産物は、変更してもよい。デンプンは、ポリスチレンや他のパッキング材料の代わりとして生分解性のある緩い充填パッキング材料を調製するのに用いてもよい。
炭水化物の決定と分析
デンプンは、Schulman他(1991年)の方法を使用して小麦穀粒から分離した。デンプン含有量は、Megazyme(Bray、Co Wicklow、アイルランド共和国)によって供給される全デンプン分析キットを使用して測定した。次いで、デンプン含有量を対照植物と比較する。総穀粒重量からのデンプン重量を引いて穀粒の全非デンプン含有量を求め、総重量の低減がデンプン含有量の低減によるかどうか確定する。
胚乳の特定のタンパク質発現は、ウェスタンブロット手順によって分析した。胚乳はすべての母体組織から切り離し、およそ0.2mgの試料を、5mM EDTA、20%グリセリン、5mM DTTおよび1mMペファブロック(Pefabloc)を含む50mM KPi緩衝液(42mM K2HPO4と8mM KH2PO4)、pH7.5の600μl中でホモジナイズした。粉砕試料を13、000gで10分間遠心処理し、上清アリコートを使用まで−80℃で凍結した。総タンパク評価のために、0.25mg/mlBSA標準液0、20、40、60、80および100μlアリコートを用いてBSA標準曲線を準備した。試料(3μl)は蒸留水で全量100μlとし、1mlのCoomassie Plus Protein試薬を各々に加えた。吸光度はブランクとして標準曲線から0 BSA試料を用い、595nmで5分後に計測し、試料のタンパク質レベルを測定した。各々の胚乳から20μg総タンパクを含む試料を、0.34MTris−HCl(pH8.8)、アクリルアミド(8.0%)、過硫酸アンモニウム(0.06%)およびTEMED(0.1%)を含む8%非変性ポリアクリルアミドゲル上で泳動させた。電気泳動後、タンパク質はMorell他(1997年)によるニトロセルロース膜に移し、SBEIIaまたはSBEIIb特異抗体と免疫反応させた。
小麦のSBEIIaまたはSBEIIb遺伝子の発現を低減すべく二重鎖RNA(dsRNA)コンストラクトを作成した。そのようなコンストラクトにおいて、SBEIIaまたはSBEIIb遺伝子の一部に対応する望ましい核酸配列は、発現したRNAが塩基対合可能で二重鎖または二本鎖RNAを形成し得る相補領域を含むように、プロモーターに対しセンスとアンチセンスの両方に存在した。センスとアンチセンス配列の間のスペーサー領域は、形質転換植物においてRNAの一部として転写されるとき、堅い「ヘアピン」二重構造を作るためにスプライシングにより除かれるイントロン配列からなるものとした。イントロンを含むことで、二重鎖RNAコンストラクトによって与えられる遺伝子サイレンシングの効率が増すことが分かっている(Smith他、2000年)。望ましい核酸を、高分子量グルテニン(HMWG)プロモーター配列(Dx5サブユニット遺伝子、アクセッション番号X12928、Anderson他、1989年のプロモーター)とアグロバクテリウム由来ノパリンシンターゼ遺伝子(nos3')からのターミネーター配列に連結した。これは、dsRNA配列の胚乳特異的発現をもたらした。
virプラスミドpAL4404およびpSBlを運ぶ無害化したAgrobacteilum tumefaciens株LBA4404に小麦の形質転換のための遺伝子コンストラクトをエレクトロポーレーションによって導入し、続いてスペクチノマイシンを含む培地上で選択した。形質転換したアグロバクテリウム株を、2日間固化させたYEP培地上27℃でインキュベートした。次いでバクテリアを回収して、小麦接種のため、650nmで光学濃度2.4まで400mMアセトシリンゴンを含むTSIM1(100mg/lmyo−イノシトール、10g/lブドウ糖、50mg/l MES緩衝液pH5.5によるMS培地)に再懸濁させた。
形質転換は、以下の方法の1つまたは複数で測定した:
導入遺伝子の1つまたは複数についてのPCR分析。PCR分析は、StaceyおよびIsaac(1994年)によって記載されるミニプレップ法を使用し、新鮮な葉資料1〜2cm2から抽出されるゲノムDNAについて行った。PCR反応は、SBEIIa遺伝子からの断片(462bp)を増幅すべく設計された、例えば、プライマーSBEIIa−For:5'−CCCGCTGCTTTCGCTCATTTTG−3'[配列番号9]およびSBEIIa−Rev:5'−GACTACCGGAGCTCCCACCTTC−3'[配列番号10]を用いて、またはSBEIIb(505bp)についてSBEIIb−DupFor5'−AGATGTGAATGGCTGCTTGCTG−3'[配列番号11]およびSBEIIb−DupRev5'−CAGGTCGACCATATGGGAGAGC−3'[配列番号12]を用いて行った。反応条件は以下の通りとした:「ホットスタート」(94C、3分)後、30サイクルの変性(95℃、30秒)、アニーリング(55℃、30秒)、伸長(73℃、2分)後、73℃(5分)で1サイクル。
表2.SBEIIaとSBEIIbRNA二重鎖コンストラクトによる小麦の形質転換
デンプン顆粒形態
T0形質転換小麦植物から得た成熟したT1種子からのデンプン顆粒の形態を、光学顕微鏡法によって観察した。ds−SBEIIaで独立に形質転換した25本のT0植物とds−SBEIIbで独立に形質転換した12本の植物の各々からのそれぞれ10個の穀粒を分析した。各胚乳はデンプン顆粒を放出させるために穏やかに押しつぶし、それを水中に分散して、光学顕微鏡の下で視覚化した。分析した25のds−SBEIIa系統のうち、12個は変形顆粒(例えば、図4参照)を含む穀粒を有していたが、視覚的観察では異なる種子では変形レベルは様々であった。これに対し、12のds−SBEIIb系統のいずれも、光学顕微鏡法下で観察したとき胚乳中のデンプン顆粒の顕著な変形は示さなかった。結果を、表3と4にまとめて示す。
表3.ds−SBEIIaトランスジェニック小麦系統のT1種子のデンプン顆粒形態
10粒すべての種が通常の顆粒形態を有する場合は、形態を+として示し、ひどく変形した種子がある場合は−で、また、若干の異常がある(すなわち、少なくともいくつかの種子にある程度の変形があるが、ひどい変形のものはない)場合は+/−とした。
偏光下のデンプン顆粒を観察したところ、ds−SBEIIa穀粒については、変形顆粒(図5)のため、複屈折が著しく低減していたことが分かった。複屈折の損失は、系統50.lbからの種子では顆粒の94%で観察され、一方、同じ系統の別の種子からの正常な顆粒が完全な複屈折(表5)を示しており、変形フェノタイプと相関している。正常な顆粒による種子は、導入遺伝子が不足している分離体であると思われ、したがって、発現型的には正常である。
表5.ds−SBEIIaトランスジェニック小麦系統50.1bのT1種子からのデンプン顆粒の複屈折
ds−SBEIIa形質転換植物(温室で等しい条件下で生育)からの個々の穀粒を秤量した(表6)。植物50.1b、58.2a、61.2aおよび109からのひどく変形した顆粒を有する穀粒は、同じ条件下で生育した野生型植物の粒と比較して、平均重量で顕著な低減はなかった。したがって、デンプン生産は、大きく変形したデンプン顆粒を有する種子においてであっても実質的にされる低減するようには見えなかった。このデータは、胚乳中のSBEIIa活性の低減した野外生育小麦の収穫高がだいたい普通であることも示唆している。
表6.ds−SBEIIaトランスジェニック小麦系統からのT1種子の穀粒重量
5つの独立した形質転換系統を代表して13ds−SBEIIa形質転換T1植物からと、3つの独立した形質転換系統を代表して9ds−SBEIIaからの種子(T2)を、胚乳内のSBEIIaとSBEIIbタンパク質発現について、非変性PAGEとウェスタンブロッティングによって分析した。先に述べたように、ds−SBEIIb系統はすべて正常の顆粒形態を有するが、ds−SBEIIa植物はすべて異常なデンプン顆粒形態を有する系統からのものであった。SBEIIaの検出のために用いた抗体は、ウサギ由来の3KLHであり、これはアミノ酸配列AASPGKVLVPDESDDLGC[配列番号13]を有し、成熟SBEIIaのN末端からの配列に対応する合成ペプチドに対して誘導したものであり、使用に際して1:5000に希釈した。SBEIIbの検出のために用いた抗体はR6であり、これはアミノ酸配列AGGPSGEVMIGC[配列番号14]を有し、成熟SBEIIbのN末端からの推定配列に対応する合成ペプチドに対して誘導したものであり、使用前に1:6000に希釈した。使用した二次抗体は、GAR−ホースラディッシュペルオキダーゼ複合体とした(1:3000希釈)。免疫反応バンドは、アマシャムECL−検出システムを使用して明らかにした。
表7.T2 ds−SBEIIaトランスジェニック小麦系統からの胚乳タンパク質のウェスタンブロット分析
トランスジェニック小麦穀粒中でのアミロースおよびアミロペクチンレベル
実施例1に記載したように、6つのプールしたT1種子試料からのデンプンのアミロース含有量を測定した。プールした種子試料は、以下のようにしてトランスジェニック小麦系統から得た:
プール2−ds−SBEIIaトランスジェニック系統85.1aから正常顆粒を有していた種子
プール3−ds−SBEIIbトランスジェニック系統110.18aから正常顆粒を有していた種子
プール4−ds−SBEIIaトランスジェニック系統58.1a、58.2aおよび61.2a(一緒にプール)から変形顆粒を有していた種子
プール5−ds−SBEIIaトランスジェニック系統83.1bから正常顆粒を有していた種子
プール6−ds−SBEIIbトランスジェニック系統75.3xから正常顆粒を有していた種子
表8.トランスジェニック小麦系統のヨウ素還元法によって推定されるアミロース含有量
小麦cDNAのコンストラクトおよびゲノムライブラリー
小麦胚乳cDNAとゲノムライブラリーは、ファージベクター(Sambrook他、1989年)における標準分析法によって作成した。2つのcDNAライブラリー(一方は栽培品種Rosella(Rahman他、1999年)由来のRNAから、他方は栽培品種Wyuna(Rahman他、2001年)から作成した。RosellaライブラリーはベクターZAPII中にあってEcoRIとNotIプライマーを用い、他方、Wyunaライブラリーは試薬に伴って与えられるプロトコルに従ってZipLoxベクター(Life Technology)中に存在した。ライブラリーの力価は、大腸菌のY1090(ZL)株で試験して2×106pfuの力価であった。ゲノムライブラリーは、A.tauschii変異体10097由来のDNAから作成した。DNAをSau3Aで消化し、部分装填lambdaGEM12ベクター(Promega)にライゲートした。クローンフラグメントは、SacIまたはXhoI消化で放出できた。T.aestivum DNAのゲノムライブラリーは、Turner他(1999年)に記載されている。
小麦SBEI遺伝子配列のプローブを使って低ストリンジェンシーで(Rahman他、2001年)で、栽培品種Rosellaから調製されるライブラリーからcDNAを分離した。得られた最も長いクローン(sbe9と命名)の配列決定を行ったところ、SBEIIaタイプの配列(Genbank AF338432.1)をコードすることが分かった。その後、栽培品種Wyuna(Rahman他、2001年)から調製した胚乳cDNAライブラリーから、sbe9の位置536〜890に対応するプローブを用いて3つのクローンを分離した。ライブラリースクリーニングの条件は、25%ホルムアミド、5×SSC、0.1%SDS、10×デンハルト溶液、100μg/mlサケ***DNAで42℃、16時間のハイブリダイゼーション後、2×SSC、0.1%SDS、65℃、3×1時間(中程度のストリンジェンシー)で洗浄とした。クローンを配列決定することにより、3つの異なる配列が得られ、これらを以下、sr995およびsr997(図6)と表す。
遺伝子またはRNA転写配列における相違は、遺伝子レベルにせよRNAレベルにせよ、突然変異スクリーニングのためのA、BおよびDゲノム特異的プライマー設計の基礎として用い得る。例えば、図6は、Genbank アクセッションY11282を含むcDNA由来のSBEIIaヌクレオチド配列とcDNA sbe9(AF338432.1)、sr997およびsr995の部分配列と比較している。ゲノム配列はT.aestivum由来のSBEIIa遺伝子に利用可能である(例えば、表1参照)。ゲノム配列は、A、BおよびDゲノムに割り当てられた。比較は染色体の多型を示し、そのいずれもが配列を分子的手段によって識別するのに用いることができる。
BおよびDゲノム中のSBEIIbヌル変異の識別
300のオーストラリアの小麦の種類を含む1500の小麦寄託種の合計、オーストラリア冬穀物コレクション(AWCC、Australian Winter Cereal Collection、Tamworth、NSW Australia)からの900の小麦寄託種と300の小麦生産地種を、プライマーARA19F(上記参照)とARA23R(5'−CTGCGCATAAATCCAAACTTCTCG−3')[配列番号19]を用いて多形イントロン3領域に対応するSBEIIbマーカーを用いたPCR増幅でスクリーニングした。PCR増幅は、上述の条件を用いた。増幅産物を制限酵素RsaIで消化して、ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた。3つの系統(Aus12745、Aus17340およびAus10103)はDゲノムマーカーが欠けており、2つの系統(Aus12509およびAus12565)はBゲノムマーカー(図9)が欠けていた。これらの系統は、BまたはDゲノムのためのSBEIIb遺伝子において推定されるヌル変異体を表す。
以下の交配を実行した:
Aus17340a×Aus12509
Aus17340b×Aus12509
Aus17340a×Aus12565
Aus17340b×Aus12565
Aus12745 ×Aus12509
Aus12745 ×Aus12565
表9.BとDサブゲノムにおけるSBEIIbヌル変異体間の交配のF2集団のカイ二乗分析
BACクローンの単離
A.tauschii meyeri品種(Moullet他、1999年)から作られる大きな挿入コスミドバイナリーコスミド(BAC)ライブラリーをSBEIIb遺伝子のイントロン3領域(位置2019〜2391、図2)でプローブし、SBEIIb遺伝子を含むBACを単離した。4つのポジティブなクローンを単離して、BAC−4、−5、−9および−12と称した。これらがSBEIIb遺伝子を含んでいることを確認するために、これらのクローンからDNAを抽出し、HindIIIまたはEcoRlで消化し、同じプローブ(図12)を使ってサザンブロットハイブリダイゼーションを実行した。クローンBAC−5は、EcoRlを伴う〜7.5kBのサイズの1つの強いハイブリダイズバンドと、HindIIIを伴う〜6.1、3.6、2.3および1.7のサイズの4つのバンドを示した(図12)。これは、BAC−5上でのSBEIIbの存在を示した。BAC−5上での遺伝子の3'の存在を調べるため、SBEIIbcDNA配列に基づく、エキソン17を増幅するように設計された特定のプライマー(AR2b3pr2F、5'−GGATATGTATGATTTCATGG−3'[配列番号22]およびAR2b3pr2R、5'−CCATAAAGTTAAGATAACCC−3')[配列番号23]、および20(AR2b3pr1F、5'−GACATCAGACCACCAGTACG−3')[配列番号24]およびAR2b3pr1R、5'CTTCCCAGGCTTTAAACAGC−3')[配列番号25]を使ってPCR増幅を行った。プライマーのセットは両方とも、エキソン17については128bp、エキソン20については145bpサイズの期待される産物を増幅し、BAC−5がSBEIIbの3'末端を含むことを示した。これは、エキソン20からPCR産物を配列決定することによってさらに確かめられた。
Turner他(1999年)によって記載されたようにして、wSBE II−D1ゲノムクローンF2(Rahman他、2001年)とwSBEII−D2クローン(Rahman他、2001年)とのin situハイブリダイゼーションを、Aegilops tauschiiと小麦からの染色体潰砕物に対して実行した。ハイブリダイズした染色体の同一性を、染色体識別(Mukai他、1990年)のために使われる反復塩基配列である二重標識withpSc119.2によって確認した。wSBEIIクローンの両方とも染色体2(図13)の先端領域にハイブリダイズし、小麦における2つのSBEII遺伝子の近くを示した。
先に述べたように確認したSBEIIbヌル変異体を、プライマーSr913F(5'−ATCACTTACCGAGAATGGG−3')[配列番号27]およびE6R(5'−CTGCATTTGGATTCCAATTG−3')[配列番号28]を用いて、SBEIIa遺伝子における突然変異についてスクリーニングした。これらのプライマーは、wSBE II−D1のイントロン5領域を増幅して、A、BおよびDゲノム上でSBEIIa遺伝子を識別するように設計した。
上述の方法は、SBEIIaおよび/またはSBEIIbのA−ゲノム変異体を単離させるのに用いてもよい。例えば、SBEIIaおよび/またはSBEIIbに密接に結合するBAC−5領域は、遺伝子中でA−ゲノム突然変異をスクリーニングするためにプローブまたはPCRプライマーの設計のために使われる。A−ゲノム変異体は、B+D二重ヌル系統と交配してA+B+D3重ヌル系統を生産する。あるいは、B+Dゲノム二重ヌル変異体の突然変異生成は照射その他の手段で実行され、三重ヌル変異体は、SBEIIa活性を完全に欠いており、状況に応じてSBEIIb活性が特定される。非常に高いアミロース濃度を備えた非トランスジェニック小麦品種が提供される。
SBEIIaの活性低減に至る小麦におけるSBEIIa遺伝子の突然変異は、ガンマ線照射または化学的突然変異誘発、例えばエチルメタンスルホン酸エステル(EMS)を用いて達成する。ガンマ線誘発突然変異のために、種子は60Co源(ZikiryaevaおよびKasimov(1972年)から20〜50kRの量の照射を受ける。EMS突然変異生成は、Mullins他(1999年)に従って種子をEMS(0.03%、v/v)で処理して行う。B+D二重ヌルバックグラウンドでは、変異体穀粒は増加したアミロース含有量または変更したデンプン顆粒形態に基づいて特定され、上述の方法によって確認される。SBEIIb活性を保持するSBEIIaの変異体は再変異してもよく、子孫は、SBEIIaに加えてSBEIIb活性の喪失についてスクリーニングでき、または、SBEIIa変異体はSBEIIb変異体と交配して、突然変異を結合して、胚乳において実質的にSBEII活性が欠如している種類の非トランスジェニック小麦を生産する。
小麦(Triticum aestivum)のA、BおよびDゲノムからのデンプン合成酵素II(SSII)遺伝子は、糖−顆粒タンパク質(Starch Granule Proteins−1;SGP−1)としても知られている100−105kDaのポリペプチドをコードする。SSII(SGP−1)は、それぞれ染色体7B、7Aおよび7D(Denyer他、1995年;YamamoriおよびEndo1996年)短腕上遺伝子の相同的集合によってコードされるおよその分子量が100、104および105kDaである3つのポリペプチドからなる。Yamamori他(2000年)は、タンパク質電気泳動による分析で、A、BおよびDゲノムの特異的なSGP−1タンパク質の形態を欠いている系統を交配することによってSGP−1ヌル小麦を生産した。SGP−1ヌルな種子の検査は、突然変異がアミロペクチン構造の変化をもたらし、アミロース含有量を上昇させ、デンプン顆粒を変形させることを示した(Yamamori他、2000年)。そのうえ、成熟した穀粒についての電気泳動実験では、顆粒結合SBEII(SGP−2)とSSI(SGP−3)のレベルがかなり減少することが分かった。SGP−1ヌル系統をもたらす突然変異(複数可)の分子的基礎は知られていなかった。
デンプン顆粒中におけるデンプン合成酵素と分枝酵素の発現を、SGP−1ヌルにおいて調べ、野生型栽培品種Chinese Springのそれらと比較した。SGP−1ヌル系統では、種子発育のステージに関係なく、SSII(図14)の欠如に加え顆粒中のSBEIIとSSIの量においてほぼ90%〜96%の顕著な低減があった。特異的抗体の使用は、顆粒から得られるSBEIIバンドがChinese Springではおよそ1:3の比率のSBEIIaとSBEIIbを含むことを示した。SGP−1ヌル変異体においては、量があまりにも低かったため、相対的な比率を、抗体を用いて測定することはできなかった。また、穀粒成長の初期からGBSS Iレベルの低減があった。SGP−1変異体においては、SBEIIaとSBEIIbを含むデンプン顆粒結合ポリペプチドのレベル低減があることは、明らかである。デンプン−顆粒結合ポリペプチド(SBEIIおよびSSI)の低減は、SGP−1ヌル(Yamamori他、2000年)を産生するのに用いられる小麦系統の穀粒では観察されなかった、影響が特にSSIIの欠如に起因することを示唆している。
陰イオン交換クロマトグラフィーを通しての小麦デンプン分枝酵素の精製は、活性を3つのピークに分解した(図16、Morell他、1997年)。栽培品種Chinese Spring(CS)からの胚乳抽出は、ポリクローンナル抗体である抗−WBE−1(タンパク質のピーク1(図16B)のN末端配列に対応するアミノ酸配列を有する合成ペプチドに対して誘導されたもの)を用い、非変性PAGE上で4つのSBEIポリペプチドの存在を明らかにした。CSヌルの同染色体−四染色体系統の分析では、これらのポリペプチドが染色体7上にコード化されていることが分かった。免疫ブロットの上のバンドはA(Aバンド)、B(Bバンド)とD(DiとDiiバンド)ゲノムに割り当てられ、それぞれ、活性はA−メジャー活性、B−メジャー活性およびD−メジャー活性と名付けられた。陰イオン交換クロマトグラフィーによって得られる活性なピークを表している精製画分の免疫ブロット分析では、最初のピークがSBEI AメジャーおよびDメジャー活性を含み、第2のピークはSBEI B−メジャー活性を含むことが分かった(図16C)。
1つまたは複数のアイソフォームの発現が欠如しているヌル変異体を同定するため、非変性ゲル電気泳動の後、SBEI−メジャー免疫ブロット検出によって小麦生殖細胞質のコレクションをスクリーニングした。上述の抗wSBEI抗体を用いた。分析した182のオーストラリア6倍体小麦のアクセッションのうち、SBEI−Dメジャーを発現しない13系統、SBEI−Bメジャーを欠く16系統、SBEI−Aを欠く10系統、およびAとBアイソフォームの両方ともを欠く2つ(BindawarraとVectis)が同定された。これらの系統は、それぞれのゲノムSBEI遺伝子のヌル変異を有すると考えられる。SBEI−メジャー遺伝子のヌル変異の頻度(〜23%)はGBSS遺伝子(22%)(Boggini他、2001年)のそれと同様だった。
免疫ブロット分析から、栽培品種BindwarraとVectisがA−メジャーおよびB−メジャーSBEI活性を欠いていることは明らかであり、栽培品種CadouxがD−メジャーSBEI活性を欠くものとして同定された。Vectis×Cadouxの交配から得られる185系統のF2子孫集団を、イムノブロッティングでスクリーニングした。しかし、3つの活性のすべてを欠いている系統は得られず、そのような子孫は生存能力が低いか、あるいは、ゲノム間に何等かの相互作用があることが示唆された。そこで、B−メジャーおよびD−メジャー活性を欠いている子孫系統VC3.1.11を、A−メジャー活性を欠き遺伝子操作したChinese Spring(CS7AL−15)と交配した。二重ハプロイド系統をプライマーARBE1CF(5'−GGGCAAACGGAATCTGATCC−3')[配列番号32]およびARA9R(5'−CCAGATCGTATATCGGAAGGTCG−3')[配列番号33]を用いてPCRとイムノブロッティングの両方でスクリーニングを行い、160のうち2系統(A113とD13)は、非変性ゲル類の上でイムノブロッティングによって判断すると、SBEIメジャー活性を完全に欠いていた。図17は、A113(レーン6)を含む倍加半数体系統の代表的分離パターンを示す。
SBEIIaまたはSBEIIb遺伝子中に突然変異を有する小麦系統を特定するべく、2400の6倍体小麦アクセッションをA、BまたはDゲノム中、SBEIIbのヌル変異についてスクリーニングした。プライマーAR2bl9cF/AR2b23cRを各系統の小麦植物のゲノムDNA試料へのPCR反応で使用し、RsaIで増幅産物の消化を行いゲル電気泳動した。このマーカーはイントロン3領域(小麦SBEIIb遺伝子(図2)のヌクレオチド位置2085〜2336)を増幅して、SBEIIbに特異的だった。上の実施例で記載したように、このスクリーニングでは3つのDゲノムSBEII−ヌル変異体と2つのBゲノムSBEII−ヌル変異体の識別がなされた。SBEIIbと対応しているAゲノムバンドを欠いた変異体系統は検出されなかった。これは、変異体SBEIIb遺伝子を有する染色体2Aを含む小麦系統が自然に存在しないことを示唆した。
1)Wollaroi×MLT2B8またはMLT2D1(WollaroiバックグラウンドにおいてA−ゲノム SBEIIa/SBEIIbヌルデュラムを生じるため)
2)A−ゲノムヌルなデュラム(Wollaroi)×B−ゲノムヌルSBEIIa/SBEIIb小麦系統(AB2倍ヌルSBEIIa/SBEIIbデュラム(Wollaroi)を生じるため)
あるいは、
1)Wollaroi×B−ゲノムヌル小麦系統(B−ゲノムヌルなデュラムを生じるために)(Wollaroi)
2)B−ゲノムヌルなWollaroi×Aヌル小麦系統(AB2倍のヌルSBEIIa/SBEIIbデュラムを生じるために)。
これらの交配は、高アミロース6倍体小麦のそれと類似している健康に有利な特定の最終用途を有する高アミロースデュラムコムギの生成をもたらす。
SBEIIa/SBEIIb阻害遺伝子コンストラクトを含むトランスジェニック小麦植物の穀粒におけるデンプンのアミロース含有量をセファロースカラム分別法により決定する。この方法では、デンプン分子は、その分子量に基づいてカラム上で分離した。次いで、分離した画分を、デンプン分析キット(Sigma社)を利用し供給元の説明書に従って分析した。
表10.ヨード還元的定法により評価した小麦トランスジェニック系統のアミロース含有量
デンプン試料の鎖長分布は、デンプンのイソアミラーゼ脱分枝後、蛍光ラベル糖鎖電気泳動(Fluorophore−assisted carbohydrate electrophoresis:FACE)により測定した。トランスジェニック種子から由来のデンプン中のうち重合度6−11、重合度12−30および重合度31−60からの鎖長のパーセンテージを、非トランスジェニックの対照と比較して表11に示す。高アミローストランスジェニック系統由来のデンプンについて正規化した鎖長分布を同遺伝子型の非形質転換対照由来のデンプンについて正規化した鎖長分布から差し引いたモル差を、図21に示す。
表11.小麦トランスジェニック系統由来のイソアミラーゼ脱分枝デンプンの鎖長分布
ds−SBEIIaおよびds−SBEIIbトランスジェニック系統からの糊化温度を含むデンプンの物性を、Perkin Elmer Diamond示差走査熱量計を使って分析した。各デンプンおよそ20mgを、1:2の比率で水に混合し、すなわち、含水率66.7%として、DSCパンに封入した。1分当たり10℃の加熱速度を用いて、0から150℃まで試験試料と参照試料を加熱した。データは、装置で利用できるソフトウェアを使用して分析した。
表12.示差走査熱量計(DSC)で測定したトランスジェニック小麦デンプンの熱的性質
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Claims (22)
- 小麦植物から得られる穀粒であって、(i)デンプン、(ii)野生型穀粒と比べて低レベルの、胚乳のSBEIIaタンパク質、SBEIIa酵素活性、またはその双方、ならびに(iii)2種のSBEIIa遺伝子のヌル変異を含み、
前記穀粒のデンプン中のアミロース比率が少なくとも30%である穀粒。 - 前記穀粒のデンプン中のアミロース比率が少なくとも40%または少なくとも50%である請求項1に記載の穀粒。
- 平均重量が少なくとも36mgである請求項1に記載の穀粒。
- 穀粒から得たデンプン粒のうちの少なくとも50%が偏光下で観察すると非複屈折性に見える、請求項1に記載の穀粒。
- 前記デンプンの示差走査熱量計で測定した糊化温度が、野生型穀粒から得たデンプンと比べて上昇している請求項1に記載の穀粒。
- 殻のない状態での前記穀粒のデンプン含有量は、少なくとも25%(w/w)または少なくとも35%(w/w)である請求項1に記載の穀粒。
- 全粒、製粉した穀粒、粉砕した穀粒、精白した穀粒、圧扁した穀粒、粗挽きした穀粒、パーボイルドした穀粒、または挽き割りにした穀粒である、請求項1に記載の穀粒。
- 野生型小麦穀粒と比べて低レベルの胚乳のSBEIIbタンパク質、SBEIIb酵素活性、またはその双方をさらに含む、請求項1に記載の穀粒。
- 野生型小麦穀粒と比べて低レベルのSBEIタンパク質、SBEI酵素活性、またはその双方をさらに含む、請求項1に記載の穀粒。
- Triticum aestivum ssp.aestivumである小麦植物から得られる請求項1に記載の穀粒。
- 前記SBEIIa遺伝子が染色体2Aの長腕から欠けている変異を含むか、あるいは染色体2Aの長腕上のSBEIIa遺伝子が、ヌル変異を含む、請求項1に記載の穀粒。
- 前記ヌル変異がBゲノムおよびDゲノム上にある請求項1または請求項10に記載の穀粒。
- 前記ヌル変異が、ホモ接合性である請求項1に記載の穀粒。
- 請求項1から13のいずれか一項に記載の穀粒を結実することができる小麦植物。
- 小麦デンプンと、野生型小麦デンプン粒と比べて低レベルのSBEIIaタンパクとを含み、小麦デンプン中のアミロース比率が少なくとも30%である、請求項1から13のいずれか一項に記載の穀粒から得られる小麦デンプン粒。
- 請求項1から13のいずれか一項に記載の穀粒、請求項1から13のいずれか一項に記載の穀粒から得た小麦粉、全粒小麦粉、セモリナ粉、またはデンプン粒、またはこれらの任意の組合せを含む製品。
- i)1種のSBEIIa遺伝子のヌル変異を含む親小麦植物または小麦種子の突然変異誘発のステップと、
ii)2種のSBEIIa遺伝子のヌル変異を有するとともに穀粒を結実することのできる小麦植物の子孫の植物または親小麦植物の種子または種子を同定するステップとを含み、
前記穀粒は、(i)デンプン、(ii)野生型穀粒と比べて低レベルの、胚乳のSBEIIaタンパク質、SBEIIa酵素活性、またはその双方、ならびに(iii)2種のSBEIIa遺伝子のヌル変異を含み、前記穀粒のデンプン中のアミロース比率が少なくとも30%である、請求項14に記載の小麦植物を作製する方法。 - i)1種の第一のSBEIIa遺伝子のヌル変異を含む第一の小麦植物を同定するステップと、
ii)前記第一の小麦植物と1種の第二のSBEIIa遺伝子のヌル変異を有する第二の小麦植物とを交配するステップと、
iii)ヌル変異と結実した穀粒との両方を含む子孫の植物または種を同定するステップとを含み、
前記穀粒は、(i)デンプン、(ii)野生型穀粒と比べて低レベルの、胚乳のSBEIIaタンパク質、SBEIIa酵素活性、またはその双方、ならびに(iii)2種のSBEIIa遺伝子のヌル変異を含み、前記穀粒のデンプン中のアミロース比率が少なくとも30%である、請求項14に記載の小麦植物を作製する方法。 - 前記小麦植物がTriticum aestivum ssp.aestivumである請求項17または請求項18に記載の小麦植物を作製する方法。
- (i)小麦植物を栽培するステップと、(ii)前記小麦植物から穀粒を収穫するステップとを含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の穀粒を製造する方法。
- 請求項1から13のいずれか一項に記載の穀粒を得るステップと、前記穀粒からデンプンを抽出するステップとを含む、改変された小麦デンプンを製造する方法。
- 請求項1から13のいずれか一項に記載の穀粒を得るステップと、前記穀粒を製粉するステップとを含む、製粉した製品を製造する方法。
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