JP5750700B2 - アゴニストの親和性を亢進する抗ヒトアデノシンA2a受容体モノクローナル抗体 - Google Patents
アゴニストの親和性を亢進する抗ヒトアデノシンA2a受容体モノクローナル抗体 Download PDFInfo
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Description
非特許文献1〜4に記載されている抗アデノシンA2a受容体抗体及びGPCR抗体はペプチドを免疫原としているため、エピトープが受容体の一次配列によって規定されるもの(リニアエピトープ)となる。そのようなリニアエピトープ性の抗体は、抗原の天然構造と変性構造を区別なく認識する性質を有しており、必ずしも生細胞膜に発現する機能的な上記受容体を普遍的かつ効率的に認識できるものではなかった。
本発明の一実施形態は、新規の抗アデノシンA2a受容体抗体である。この抗アデノシンA2a受容体抗体は、例えば、アデノシンA2a受容体の細胞外領域に特異的な結合性を有し、且つアデノシンA2a受容体の立体構造を認識する、抗アデノシンA2a受容体抗体である。この構成を有する抗アデノシンA2a受容体抗体は、後述する実施例で実証されているように、アデノシンA2a受容体とアゴニストとの親和性を増加させることができる。又は、アゴニストとの親和性を増加させることができるため、アデノシンA2a受容体へのアゴニスト作用を増加させることができる。そのようにアゴニスト作用を増加させる抗体を用いれば、疾患の治療を行うことができる。なお一般的に、抗体は低分子化合物に比べてターゲットへの結合特異性に優れており、組換えDNA技術等により適切に設計すれば副作用を抑えることも可能である。
また、本発明の実施形態に係る抗アデノシンA2a受容体抗体は、重鎖CDR1、2、及び3が、それぞれ配列番号7、8、及び9のアミノ酸配列を含む、抗アデノシンA2a受容体抗体であってもよい。この抗アデノシンA2a受容体抗体は、軽鎖CDR1、2、及び3が、それぞれ配列番号10、11、及び12のアミノ酸配列を含んでいてもよい。又は、VH、VL、重鎖FR1〜4、軽鎖FR1〜4が、それぞれ配列番号23、24、25、26、27、28、29、30、31、32のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
本発明の他の実施形態は、本発明の実施形態に係る抗アデノシンA2a受容体抗体を含む、アデノシンA2a受容体とアゴニストとの親和性増加剤である。この親和性増加剤を用いれば、アデノシンA2a受容体とアゴニストとの親和性の増加が関連する種々の機能を増加させることができる。例えば、アデノシンA2a受容体に対するアゴニスト作用を増加させることができる。又は、アゴニスト作用を増加させる作用を利用することで、疾患の治療を行うことができる。
(1)免疫および抗体産生ハイブリドーマのサブクローニング
ヒト由来アデノシンA2a受容体は、MagnaniらがPNAS (2008):105 10744-10749で報告している熱安定型変異体Rag-23の遺伝子配列を合成し、メタノール資化酵母で組換え発現させた後、精製を行うことで得た。精製したヒト由来アデノシンA2a受容体をマウスに腹腔注射することを数回繰り返すことで免疫応答を惹起し、抗血清価の上昇したマウスから脾臓細胞を摘出し、ミエローマ細胞と融合することで抗体産生ハイブリドーマを樹立した。
上述の通り免疫を行い、抗体価が十分に上昇したマウス脾臓細胞とミエローマ細胞をPEG法にて細胞融合を行い、各抗原5枚ずつ、計10枚の96穴細胞培養プレートに分種した。培養されたサブクローン株の培養上清に対して、リポソームELISAによって抗体産生能を確認した。このとき、アデノシンA2a受容体包埋リポソームに対し、終濃度40μMとなるようにアゴニストのNECAを添加後、4℃で1時間インキュベートすることによりアゴニスト型へ遷移させた。これをストレプトアビジンコートされたイムノプレートに固定化した後に、リポソームELISAを行った(リポソームELISAの具体的な手順は後述する)。これにより、アデノシンA2a受容体が機能的立体構造を保持した状態、且つアデノシンA2a受容体がアゴニスト型の状態で検定することが可能となった。そして、この時点で960穴の検体のうち、9割以上のウェルで抗体産生の陽性が確認された。陽性が確認されたウェルのうち、それぞれから100ウェル弱を、吸光度シグナルの高い順から、24穴細胞培養プレートを用いて拡大培養を行った。
上記の24穴細胞培養プレートに拡大培養を行った培養上清について、以下の手法を用いて、それぞれの抗体のキャラクタリゼーションを行った。
抗体の変性状態認識性を簡便に見分けるために、96ウェルプレートにアデノシンA2a受容体包埋リポソームを固定化したリポソームELISAを行った。一次スクリーニングと同様に、アデノシンA2a受容体包埋リポソームにアゴニストのNECAを添加して固定化しELISAを行った。これにより、アデノシンA2a受容体の機能的立体構造を保持した条件、且つアデノシンA2a受容体をアゴニスト型の状態で検定することが可能となった。各培養上清を用いて実施した結果を図1上部、図2上部に示す。この図中の数字は、大きいほど抗体のアデノシンA2a受容体への結合性が強いことを意味している。
抗体の非変性状態および変性状態認識性を簡便に見分けるために、上記(3−1)のリポソームELISAの際に、96ウェルのスロットを用いて作製されたドットブロットを並列して実施した。前者から得られるシグナルは非変性構造認識性を示し、後者から得られるシグナルは変性構造又は特定の構造を持たない膜外ループ認識性であることを示す。各培養上清を用いて実施した結果を図1下部、2下部に示す。図中、AbNは、免疫時に抗原として用いたアデノシンA2a受容体包埋リポソームに、ISCONOVA社のアジュバント「Abisco-100」を添加して免疫した場合の結果である。LALは、免疫時に抗原として用いたアデノシンA2a受容体包埋リポソームに、Lipid Aを包埋した場合の結果である。
二次スクリーニングに用いた培養上清(LAL、AbN、計190クローン)全てについてFSEC(Fluorescein Size Exclusion chromatography)を行った。アデノシンA2a受容体に、終濃度40μMとなるようにNECAを添加し、氷上で1時間程度反応させ、アデノシンA2a受容体をアゴニスト型へ遷移させた。ランニングバッファー(20mM HEPES(pH7.5), 150mM NaCl, 0.03% DDM)で10倍希釈した培養上清を、96穴プレートに140ulずつ2ウェルに分注した。そして、上記2ウェルの一方には終濃度2μg/mlとなるようにanti-mouse IgG-FITC conjugate(Jackson社)のみを添加して氷上で1時間程度反応させた。上記2ウェルのもう一方には、終濃度2μg/ml anti-mouse IgG-FITC conjugate、終濃度20μg/mlアゴニスト型アデノシンA2a受容体となるように添加して氷上で1時間程度反応させた。その後、高速液体クロマトグラフィーのシステムを用い、蛍光波長(Ex. 492nm, Em.520nm)にてゲルろ過分析を行い、抗体とアゴニスト型アデノシンA2a受容体との結合試験を行った。蛍光ゲルろ過の説明図を図3〜5に、A2a-Rag23 2nd screening (FSEC)の結果とシングルクローン化結果をまとめたものを表1、2に示す。なお表中のLDは限界希釈(Limiting Dilutionの略)を表し、○はシングルクローン化に成功した場合、△は抗体活性はあるがシングルクローン化できない場合、×は抗体活性が欠失した場合を表している。
以上の二次スクリーニングにおける諸解析の結果から、モノクローナル化に進める50株を選抜し、限界希釈法によりモノクローン株の樹立を試みた。その結果、30株でモノクローン株が樹立された(表1、2)。
抗体の非変性状態および変性状態認識性を簡便に見分けるために、96ウェルプレートにアデノシンA2a受容体包埋リポソームを固定化したELISAと、96ウェルのスロットを用いて作製されたドットブロットを並列して実施した。前者から得られるシグナルは非変性構造認識性を示し、後者から得られるシグナルは変性構造又は特定の構造を持たない膜外ループ認識性であることを示す。樹立したシングルクローンの各培養上清を用いて実施した結果を図6、および表3に示す。なお、FSECでN判定、IgM判定のものは除外してある。抗原は、SDSで変性させたアデノシンA2a受容体2μgを用いた。1次抗体は1%BSA/PBSで10倍希釈した培養上清を用いた。2次抗体はanti-Fc gamma-HRP×5000を用いた。
1アッセイあたり200ngのアデノシンA2a受容体に、終濃度40 μMとなるようにNECAを添加し、氷上で1時間程度反応させ、アデノシンA2a受容体をアゴニスト型へ遷移させた。ランニングバッファー(20mM HEPES(pH7.5), 150mM NaCl, 0.03% DDM)10倍希釈したシングルクローンの培養上清を、96穴プレートに140ulずつ2ウェルに分注した。上記2ウェルの一方には、終濃度2μg/mlとなるようにanti-mouse IgG-FITC conjugateのみ添加して氷上で1時間程度反応させた。上記2ウェルのもう一方には、終濃度2μg/ml anti-mouse IgG-FITC conjugate、終濃度20μg/mlアゴニスト型アデノシンA2a受容体となるように添加して氷上で1時間程度反応させた。その後、高速液体クロマトグラフィーのシステムを用い、蛍光波長(Ex. 492nm, Em.520nm)にてゲルろ過分析を行い、抗体とアゴニスト型アデノシンA2a受容体との結合試験を行った。その結果を表3(左から7列目)にまとめた。
(4−3−1)モノクローナル抗体によるリガンド飽和結合活性測定
ドットブロットの結果から構造認識抗体と予測されたモノクローナル抗体11クローン(LAL21−2、LAL22−1、LAL24−5、LAL25−1、LAL51−1、LAL94−1、AbN21−1、AbN21−2、AbN41−1、AbN42−1、AbN50−2)と、構造認識抗体と予測されなかったモノクローナル抗体AbN67−1についてプロテインG Sepharose Fast Flow(GE社)を用いてアフィニティ精製を行なった。アデノシンA2a受容体と精製抗体IgGを等モル量混合した後、放射性同位体標識したアンタゴニスト(ZM241385)、あるいはアゴニスト(NECA)を作用させたのち、Sephadex-50(GE)を充填したスピンカラムを用いて遊離のリガンドを除去し、アデノシンA2a受容体結合分のリガンドに由来する放射線カウント数をシンチレーションカウンターで測定し、リガンド結合量を算出した(表4)。
LAL25−1、LAL94−1のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをマウスに腹腔注射し、モノクローナル抗体が量産された腹水を獲得した。プロテインG Sepharose Fast Flow(GE社)を用いてアフィニティ精製を行った。アデノシンA2a受容体と精製した抗体IgGを等モル量混合した後、放射性同位体標識したアンタゴニスト(ZM241385)を作用させた後、放射性同位体非標識のリガンド(アンタゴニスト;Theophyline、SCH、Caffein、KW6002、XAC、アゴニスト;Adenosine、CGS、NECA、R−PIA)を段階的に添加し、Sephadex-50(GE)を充填したスピンカラムを用いてアデノシンA2a受容体から遊離した放射性同位体標識したアンタゴニスト(ZM241385)の放射線カウント数をシンチレーションカウンターで測定し、リガンド結合量を算出した(図7、8)。また、抗体IgGをC2838Fab(アデノシンA2a受容体への結合性を有するFab)に代えて、同様の操作を行った。なお、C2838及びC2838Fabは、特開2011-097869号公報に記載されている抗体であり、アデノシンA2a受容体への結合性を有している。
腹水より精製したモノクローナル抗体IgG(LAL25−1、LAL94−1、又はC2838)を用いて、アデノシンA2a受容体−抗体複合体の熱安定性実験を行った。1アッセイあたり10μgのアデノシンA2a受容体に終濃度40μMとなるようにNECAを添加し、氷上で1時間程度反応させアゴニスト型へ遷移させた。次にアゴニスト型アデノシンA2a受容体にバッファー(20mM HEPES(pH7.5),150mM NaCl,0.03% DDM)で50μg/mlに希釈したモノクローナル抗体IgGを200μl添加し、氷上で1時間程度反応させ複合体を形成した。4mg/mlのN-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide (CPM)をバッファー(20mM HEPES(pH7.5),150mM NaCl,0.03% DDM)で、100倍希釈し、室温で5分間平衡化させた。蛍光検出用の96穴プレートにCPM希釈溶液を3μl分注し、アデノシンA2a受容体−抗体複合体を150μl分注した。恒温機能付き蛍光プレートリーダーを用いて(SpectraMax M2e; Molecular Devise社)、40度でインキュベートしながら5分間隔で蛍光波長(Ex.387nm,Em.463nm)を測定した。
動物細胞安定発現用ベクターpcDNA3.1/Hygro(Invitrogen社)を用いて、N末端にDYKDDDDK配列、C末端に8xHisを付加したアデノシンA2a受容体(Rag-23)遺伝子を挿入した発現プラスミドを作製した。その発現プラスミドを、TransFast(Promega社)を用いてHEK293T細胞へトランスフェクションした。48時間後、100μg/mlのハイグロマイシン添加培地に交換し、薬剤選抜を行なった。2、3日ごとにハイグロマイシン添加培地を交換し約2週間継代培養後、限界希釈にてアデノシンA2a受容体安定発現株のシングルクローン化を行なった。シングルクローン化後、一次抗体にanti−FLAG−M2抗体(Sigma社)(FLAG−M2)、又はanti−His−tag抗体(MBL社)(OGHis)をそれぞれ1μg/ml、二次抗体にAlexa488標識anti-mouse-IgG(Molecular Probes社)1μg/mlにて抗原抗体反応を行い、フローサイトメトリー(Guava EasyCyte Plus; ミリポア社)により、各クローンのアデノシンA2a受容体発現の確認と発現強度の比較を検討し、FLAG−M2を作用させたときのヒストグラムの差が顕著なクローンを、アデノシンA2a受容体発現細胞とした。なお、OGHisを作用させたときもヒストグラムに若干の差が生じていたが、一般的に、His−tagが細胞内領域であっても、若干の反応性が見られることが知られている(Mancia at al., PNAS, 32007, 4303-8)。
LAL25−1、又はLAL94−1を発現するハイブリドーマからRNeasy Plus mini kit(Promega社)を用いてtotal RNA抽出した。SuperScripit III cDNA Synthesis kit(Invitrogen社)を用い、Olido(dT) primerによりcDNAを合成した。これを鋳型として、Phage Display: a laboratory manual" [CSHL Press, 2001] p.9.37-9.52のmix primerを参照し、VHおよびVL領域をコードする遺伝子配列をPCRにより増幅した。得られたPCR断片をZero Blunt TOPO cloning kit(Invitrogen社)を用いてクローニングし、塩基配列の決定を行った。決定した塩基配列から同領域のアミノ酸配列を決定した。
mouse monoclonal antibody Isotyping test kit(Serotec社)を用いてLAL25−1、及びLAL94−1のアイソタイピングを行った。その結果LAL25−1はIgG3, kappa、LAL94−1はIgG2a, kappaと同定された。
るところである。
Claims (22)
- アデノシンA2a受容体の細胞外領域に特異的な結合性を有し、アデノシンA2a受容体の立体構造を認識し、アデノシンA2a受容体とアゴニストとの親和性を増加させる、抗アデノシンA2a受容体抗体。
- アデノシンA2a受容体の細胞外領域に特異的な結合性を有し、アデノシンA2a受容体の立体構造を認識し、アデノシンA2a受容体に対するアゴニスト作用を増加させる、抗アデノシンA2a受容体抗体。
- アデノシンA2a受容体に対するアゴニスト作用を増加させる、請求項1に記載の抗アデノシンA2a受容体抗体。
- アゴニスト型のアデノシンA2a受容体と特異的に結合する抗体であり、前記アゴニスト型はアゴニストが結合したときのアデノシンA2a受容体の形態である、請求項1〜3いずれかに記載の抗アデノシンA2a受容体抗体。
- アゴニスト型のアデノシンA2a受容体の熱安定性を増加させる抗体であり、前記アゴニスト型はアゴニストが結合したときのアデノシンA2a受容体の形態である、請求項1〜4いずれかに記載の抗アデノシンA2a受容体抗体。
- 天然状態のアデノシンA2a受容体の細胞外領域に対して、特異的な結合性を有し、
変性状態のアデノシンA2a受容体の細胞外領域に対して、特異的な結合性を有しない、
請求項1〜5いずれかに記載の抗アデノシンA2a受容体抗体。 - モノクローナル抗体である、請求項1〜6いずれかに記載の抗アデノシンA2a受容体抗体。
- アデノシンA2a受容体の細胞外領域に特異的な結合性を有し、アデノシンA2a受容体とアゴニストとの親和性を増加させる、抗アデノシンA2a受容体抗体。
- a)重鎖CDR1、2、及び3が、それぞれ配列番号1、2、及び3のアミノ酸配列を含み、且つ軽鎖CDR1、2、及び3が、それぞれ配列番号4、5、及び6のアミノ酸配列を含む抗体、
b)重鎖CDR1、2、及び3が、それぞれ配列番号7、8、及び9のアミノ酸配列を含み、且つ軽鎖CDR1、2、及び3が、それぞれ配列番号10、11、及び12のアミノ酸配列を含む抗体、
からなる群から選ばれる1種以上の抗体である抗アデノシンA2a受容体抗体。 - アデノシンA2a受容体とアゴニストとの親和性を増加させる、請求項9に記載の抗アデノシンA2a受容体抗体。
- 前記a)の抗体は受託番号NITE P-1266のハイブリドーマにより生産される抗体であり、前記b)の抗体は受託番号NITE P-1265のハイブリドーマにより生産される抗体である、請求項9又は10に記載の抗アデノシンA2a受容体抗体。
- 抗原結合性断片である、請求項1〜11いずれかに記載の抗アデノシンA2a受容体抗体。
- 請求項1〜12いずれかに記載の抗アデノシンA2a受容体抗体をコードする、ポリヌクレオチド。
- 請求項13に記載のポリヌクレオチドで形質転換された形質転換体。
- 請求項1〜12いずれかに記載の抗アデノシンA2a受容体抗体を含む、アデノシンA2a受容体とアゴニストとの親和性増加剤。
- 請求項1〜12いずれかに記載の抗アデノシンA2a受容体抗体を含む、アデノシンA2a受容体とアンタゴニストとの親和性低下剤。
- 請求項1〜12いずれかに記載の抗アデノシンA2a受容体抗体を含む、アデノシンA2a受容体に対するアゴニスト作用増加剤。
- 請求項1〜12いずれかに記載の抗アデノシンA2a受容体抗体を含む、治療薬。
- 炎症性疾患、疼痛、又は眼科疾患の治療用の請求項18に記載の治療薬。
- 請求項1〜12いずれかに記載の抗アデノシンA2a受容体抗体を含む、試薬、診断薬、又は診断用キット。
- アデノシンA2a受容体とアゴニストとを接触させ、アゴニスト型のアデノシンA2a受容体を調整する工程、及び前記アゴニスト型のアデノシンA2a受容体に対する被検抗体の反応性を測定する工程を含む、
アデノシンA2a受容体とアゴニストとの親和性を増加させる抗アデノシンA2a受容体抗体のスクリーニング方法。 - 請求項2に記載の抗アデノシンA2a受容体抗体と、アデノシンA2a受容体を発現している細胞とを接触させる工程を含む、
アデノシンA2a受容体とアゴニストとの親和性を増加させる方法(但し、ヒトの治療方法を除く)。
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