JP2008193923A - Protein library - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、蛋白質ライブラリおよびこれを用いて新規な蛋白質を同定する方法に関する。 The present invention relates to a protein library and a method for identifying a novel protein using the same.
α型神経毒（α-neurotoxin）は、ｅｌａｐｉｄａｅ科をはじめとするヘビ毒に多く見いだされる蛋白質群であり、そのうちのいくつかは共通するスリーフィンガー様スキャフォールドを含む。このタイプの神経毒は、通常は６０−７０アミノ酸（ＭＷ：７−８ｋＤａ）を含む小さい蛋白質であり、４−５個のジスルフィド結合、３−５個のアンチパラレルβシート、およびスリーフィンガー構造を形成する３つの突起ループを含む（非特許文献１）。スリーフィンガー様スキャフォールドの分子は、温度に対して高い安定性を有し、６０−７０℃に耐えられる（非特許文献２）。ジスルフィド・フレームワークの形は、βシートを形成するアミノ酸残基の種類が異なっていても、これらの分子の間で高度に保存されている。天然のレセプターへの結合事象に関与するアミノ酸もまた非常に高い頻度で保存されている（非特許文献３、４）。神経毒はそれぞれのレセプターに対して非常に高い特異性を有しており、この特性はループの先端の残基により付与される。天然のレセプターとの相互作用にはループＩ、ループＩＩおよびテール領域が関与することが知られており、例えば、ヘビ神経毒の１つであるα-cobratoxin (Naja kaouthia 由来）では、Ｉ５−Ｄ８、Ｋ２３、Ｗ２５、Ｄ２７、Ａ２８、Ｆ２９、Ｒ３３、Ｒ３６、Ｋ４７およびＦ６５などの残基に点突然変異を導入することにより標的との結合特性が変化することが報告されており、これらの残基が相互作用に関与していることが示唆されている。一方、結晶学および変異実験を用いた最近の研究によれば、ループＩＩＩは標的との結合には関与していないようである（非特許文献３、５）。 α-neurotoxin is a group of proteins frequently found in snake venoms such as the elapidae family, some of which contain a common three-finger-like scaffold. This type of neurotoxin is a small protein, usually containing 60-70 amino acids (MW: 7-8 kDa), with 4-5 disulfide bonds, 3-5 antiparallel β-sheets, and a three-finger structure. 3 protrusion loops to be formed are included (Non-Patent Document 1). Three-finger-like scaffold molecules have high stability to temperature and can withstand 60-70 ° C. (Non-patent Document 2). The shape of the disulfide framework is highly conserved among these molecules, even though the types of amino acid residues that make up the β-sheet are different. Amino acids involved in binding events to natural receptors are also conserved at a very high frequency (Non-Patent Documents 3 and 4). Neurotoxins have very high specificity for their respective receptors, and this property is conferred by residues at the end of the loop. Interaction with the natural receptor is known to involve loop I, loop II and the tail region. For example, α-cobratoxin (from Naja kaouthia), one of the snake neurotoxins, is I5-D8. , K23, W25, D27, A28, F29, R33, R36, K47 and F65 have been reported to change target binding properties by introducing point mutations. Is implicated in the interaction. On the other hand, according to recent studies using crystallography and mutation experiments, loop III does not appear to be involved in target binding (Non-Patent Documents 3 and 5).
蛋白質スキャフォールドを利用して蛋白質のコンビナトリアルライブラリを作製し、抗体に代わる新規な蛋白質を発見する試みが行われている（非特許文献６）。この方法においては、蛋白質のフレームワーク領域の構造を維持しながら、相互作用に関与する領域（例えばループ領域）のアミノ酸配列がランダムであるように設計された蛋白質ライブラリを作製し、所望の標的と接触させて、その標的に結合しうる蛋白質を選択し、その構造を決定することにより、所望の標的に結合しうる新規な蛋白質を同定することができる。 Attempts have been made to create a combinatorial library of proteins using protein scaffolds and to discover novel proteins that replace antibodies (Non-patent Document 6). In this method, while maintaining the structure of the framework region of the protein, a protein library designed so that the amino acid sequence of the region involved in the interaction (for example, the loop region) is random is prepared, and the desired target is selected. By selecting a protein that can be contacted and binding to the target and determining its structure, a novel protein that can bind to the desired target can be identified.
スリーフィンガー様スキャフォールドは、比較的サイズが小さく、安定性が高いため、このような蛋白質ライブラリを作製するのに適していると考えられる。これまでに複数の研究グループが、ループＩまたはループＩＩ、あるいはこれらの両方に部位特異的な突然変異を導入することにより結合特性に関わるアミノ酸残基を解析する試みは行われてきた。しかしながら、スリーフィンガーの親和性向上や認識特異性を変える試みはなされてきていない。 Three-finger-like scaffolds are considered to be suitable for preparing such protein libraries because they are relatively small in size and high in stability. To date, several research groups have attempted to analyze amino acid residues involved in binding properties by introducing site-specific mutations into Loop I or Loop II, or both. However, no attempt has been made to improve the affinity or recognition specificity of three fingers.
本発明は、スリーフィンガー様スキャフォールドを利用して所望の標的に結合しうる新規な蛋白質を同定するための蛋白質ライブラリを提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a protein library for identifying a novel protein that can bind to a desired target using a three-finger-like scaffold.
本発明者らは、スリーフィンガー様スキャフォールドの親和性や認識特異性を進化工学的手段であるIn vitro virus法（Nemoto N, et al., FEBS lett, 414,405-408, 1997)、またはcDNA display法(Biyani M, et al. Nucleic Acids Research, 34, e140, 2006)と組み合わせることで変化させる試みを行った。その結果、本来アセチルコリンレセプターに結合するスリーフィンガーのループ先端部分をランダムにしたライブラリからIL-6Rに特異的に結合するスリーフィンガーの取得に成功した。 The present inventors have used the in vitro virus method (Nemoto N, et al., FEBS lett, 414, 405-408, 1997), or cDNA display, which is an evolutionary engineering tool to determine the affinity and recognition specificity of a three-finger-like scaffold. An attempt was made to change it by combining with the law (Biyani M, et al. Nucleic Acids Research, 34, e140, 2006). As a result, we succeeded in obtaining a three finger that specifically binds to IL-6R from a library in which the loop tip of the three finger that originally binds to the acetylcholine receptor was randomized.
しかしながら、スリーフィンガーは４つのS-S結合を持つことから、大腸菌等で発現した後、リフォールディングした際に機能を持つ形で回収することが難しいという欠点を有する。また、ペプチド化学合成を行うには60残基以上の合成は難度が高く、４つのS-S架橋を有するために高度な技術とコストがかかるという問題がある。 However, since three fingers have four S—S bonds, they have the disadvantage that it is difficult to recover them in a functional form when they are expressed in E. coli and then refolded. In addition, the synthesis of 60 residues or more is difficult to perform peptide chemical synthesis, and there is a problem that high technology and cost are required since it has four S—S bridges.
本発明者らは、さらに鋭意研究を行った結果、スリーフィンガーのうちの1本の指の部分のみでスリーフィンガーそのものと同等の効果を示すことを初めて見出した。 As a result of further earnest studies, the present inventors have found for the first time that only one finger portion of the three fingers exhibits the same effect as the three fingers themselves.
本発明の一つの態様としては、生体反応を制御するレセプターとリガンドの結合によるシグナルの伝達を阻害または新たなリガンド創製により、低分子化と薬剤としての高機能化をはかる目的で、上記の方法で取得した親和性を有する３−Fペプチドをシーケンスした後、スリーフィンガーのN末端側の１番目のループをコードする部分のみについて再度ペプチド合成を行う。 In one embodiment of the present invention, the above-described method is used for the purpose of reducing the molecular weight and enhancing the functionality as a drug by inhibiting the signal transmission caused by the binding of a receptor that controls a biological reaction and the ligand, or creating a new ligand. After sequencing the 3-F peptide having affinity obtained in step 3, peptide synthesis is performed again only for the portion encoding the first loop on the N-terminal side of the three fingers.
本発明は、スリーフィンガー様スキャフォールドを有する蛋白質のＮ末端側１番目のループ領域を有するポリペプチドを利用して所望の標的に結合しうる新規な蛋白質を同定するための蛋白質ライブラリ、および該ライブラリを用いた新規蛋白質の同定方法に関する。 The present invention relates to a protein library for identifying a novel protein capable of binding to a desired target using a polypeptide having a first loop region on the N-terminal side of a protein having a three-finger-like scaffold, and the library The present invention relates to a novel protein identification method using
本発明者らは、スリーフィンガー様スキャフォールドを有する蛋白質のアミノ酸配列の一部を改変して、天然のパートナーとは異なる標的と結合する蛋白質を作製するためには、βシートを形成すると予測される部分の一部のアミノ酸配列も含むループＩ（Ｎ末端側１番目のループ）領域中のアミノ酸配列を改変することが効率的であることを見いだした。 In order to produce a protein that binds to a target different from the natural partner by modifying a part of the amino acid sequence of a protein having a three-finger-like scaffold, the present inventors are expected to form a β sheet. It has been found that it is efficient to modify the amino acid sequence in the loop I (first loop on the N-terminal side) region including a part of the amino acid sequence.
本発明は、スリーフィンガー様スキャフォールドを有する蛋白質のＮ末端側１番目のループ領域を有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって、
Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域、のアミノ酸残基がランダム化されていることを特徴とする蛋白質ライブラリを提供する。
The present invention is a protein library comprising a group of a plurality of proteins having a first loop region on the N-terminal side of a protein having a three-finger-like scaffold,
Provided is a protein library characterized in that amino acid residues in a region from the second amino acid on the C-terminal side of C1-Cys to the seventh amino acid on the N-terminal side of C2-Cys are randomized.
スリーフィンガー様スキャフォールドとは、α型神経毒に見いだされる、４個（場合により５個）のジスルフィド結合、３〜５個のアンチパラレルβシート、およびスリーフィンガー構造を形成する３つの突起ループを含む構造をいう。図２０に、スリーフィンガー様スキャフォールドを有する代表的な蛋白質のアミノ酸配列のアライメントを示す。図の左端の数字はアミノ酸の長さである。このアライメントに示されるそれぞれの蛋白質の名称と起源生物を以下の表に示す。 Three-finger-like scaffolds consist of four (optionally five) disulfide bonds, 3-5 antiparallel β-sheets, and three protruding loops that form a three-finger structure found in α-type neurotoxins. Refers to the structure containing. FIG. 20 shows an amino acid sequence alignment of a typical protein having a three-finger-like scaffold. The number at the left end of the figure is the length of the amino acid. The names and origin organisms of each protein shown in this alignment are shown in the table below.
本明細書においては、スリーフィンガー様スキャフォールドのアミノ酸配列において、ジスルフィド結合を形成する保存システインを、Ｎ末端側から順番にそれぞれＣ１〜Ｃ８と称する。また、Ｃ１とＣ２の間、Ｃ３とＣ４の間、およびＣ５とＣ６の間の領域を、それぞれループＩ、ループＩＩ、およびループＩＩＩと称する。例えば、図２０の第１列に示される蛋白質ＣＴｘ３のアミノ酸配列においては、Ｃ１−ＣｙｓはＮ末端側から３番目のシステインを、Ｃ２−ＣｙｓはＮ末端側から１７番目のシステインを示し、この間の領域、すなわちＮ末端側から４番目−１６番目のアミノ酸の領域はループＩと称される。 In the present specification, in the amino acid sequence of a three-finger-like scaffold, conserved cysteines that form disulfide bonds are referred to as C1 to C8 in order from the N-terminal side. The regions between C1 and C2, between C3 and C4, and between C5 and C6 are referred to as loop I, loop II, and loop III, respectively. For example, in the amino acid sequence of protein CTx3 shown in the first column of FIG. 20, C1-Cys represents the third cysteine from the N-terminal side, and C2-Cys represents the 17th cysteine from the N-terminal side. The region, that is, the region of the 4th to 16th amino acids from the N-terminal side is called loop I.
本発明においては、ループＩの特定の領域をランダム化することにより、スリーフィンガー様スキャフォールドのフレームワークを保ったまま、標的との結合特性の異なる種々の蛋白質からなるライブラリが得られることが見いだされた。すなわち、Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域、をランダム化することができる。 In the present invention, it has been found that by randomizing a specific region of Loop I, a library composed of various proteins having different binding properties to the target can be obtained while maintaining the three-finger-like scaffold framework. It was. That is, the region from the second amino acid on the C-terminal side of C1-Cys to the seventh amino acid on the N-terminal side of C2-Cys can be randomized.
ここで、Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域とは、例えば、図２０の第１列に示される蛋白質ＣＴｘ３のアミノ酸配列において、５番目のトレオニンから１０番目のプロリンまでの領域をいう。 Here, the region from the second amino acid on the C-terminal side of C1-Cys to the seventh amino acid on the N-terminal side of C2-Cys is, for example, the amino acid sequence of protein CTx3 shown in the first column of FIG. The region from the 5th threonine to the 10th proline.
好ましくは、本発明の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質は、それぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在している。特に好ましくは、本発明の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質は、ピューロマイシンを介してそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと結合している。 Preferably, each protein constituting the protein library of the present invention is present in a form associated with a polynucleotide encoding the respective protein. Particularly preferably, each protein constituting the protein library of the present invention is bound to a polynucleotide encoding each protein via puromycin.
本明細書において、「対応づけられた形で存在する」とは、蛋白質とそれをコードするポリヌクレオチドとが、これらを１対１で対応づけることが可能な様式で存在することを意味する。このような対応付け技術はディスプレイ技術とも称され、多くの技術が当該技術分野において知られている。例えば、ライブラリの各メンバー蛋白質は、ピューロマイシン等の化学物質を介してそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと結合していてもよい（インビトロウイルス法）。このような無細胞翻訳系を利用した対応付け技術には、リボソームディスプレイ、ＳＴＡＢＬＥ（非共有結合ＤＮＡディスプレイ）、マイクロビーズドロップレット法、共有結合ＤＮＡディスプレイなどがある。あるいは、ファージディスプレイ、イーストディスプレイ、バクテリアディスプレイ等のディスプレイ技術におけるように、個々のファージや細胞中に、ライブラリの各メンバー蛋白質とそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドの対が含まれていてもよい。 In the present specification, “existing in a correlated form” means that a protein and a polynucleotide encoding the protein are present in a manner that allows a one-to-one correspondence between them. Such a matching technique is also called a display technique, and many techniques are known in the technical field. For example, each member protein of the library may be bound to a polynucleotide encoding each protein via a chemical substance such as puromycin (in vitro virus method). Such association techniques using a cell-free translation system include ribosome display, STABLE (non-covalent DNA display), microbead droplet method, and covalent DNA display. Alternatively, as in display technologies such as phage display, yeast display, and bacterial display, each phage or cell may contain each member protein of the library and a polynucleotide pair encoding each protein.
特に好ましくは、本発明の蛋白質ライブラリは、以下のアミノ酸配列：
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV（配列番号１）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である）
を有する複数の蛋白質の群を含む。
Particularly preferably, the protein library of the present invention has the following amino acid sequence:
LVCY (X) 6 PGTLETCPDDFTCV (SEQ ID NO: 1)
(Wherein X is any amino acid residue)
A plurality of protein groups.
別の観点においては、本発明は、上述の本発明の蛋白質ライブラリをコードするポリヌクレオチドライブラリを提供する。 In another aspect, the present invention provides a polynucleotide library encoding the protein library of the present invention described above.
別の観点においては、本発明は、以下の各工程を含む、標的と結合しうる蛋白質を同定する方法を提供する：
（ａ）スリーフィンガー様スキャフォールドを有する蛋白質のＮ末端側１番目のループ領域を有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって、
Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域、
のアミノ酸残基がランダム化されている蛋白質ライブラリを用意し、
（ｂ）前記蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ、
（ｃ）前記標的と結合した蛋白質を選択し、そして
（ｄ）前記選択された蛋白質のアミノ酸配列を決定する。
In another aspect, the present invention provides a method for identifying a protein that can bind to a target, comprising the following steps:
(A) a protein library comprising a group of a plurality of proteins having a first loop region on the N-terminal side of a protein having a three-finger-like scaffold,
A region from the second amino acid on the C-terminal side of C1-Cys to the seventh amino acid on the N-terminal side of C2-Cys,
A protein library in which the amino acid residues are randomized,
(B) contacting the protein library with the target;
(C) selecting a protein bound to the target, and (d) determining the amino acid sequence of the selected protein.
好ましい態様においては、上述の工程（ａ）の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質は、それぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており、蛋白質のアミノ酸配列を決定する工程（ｄ）は、その蛋白質に結合しているポリヌクレオチドの塩基配列を決定することにより行われる。 In a preferred embodiment, each protein constituting the protein library in the step (a) is present in a form associated with a polynucleotide encoding each protein, and the step of determining the amino acid sequence of the protein ( d) is performed by determining the base sequence of the polynucleotide bound to the protein.
また別の観点においては、本発明は、以下の各工程を含む、標的と結合しうる蛋白質を同定する方法を提供する：
（ａ）スリーフィンガー様スキャフォールドを有する蛋白質のＮ末端側１番目のループ領域を有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって、
Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域、
のアミノ酸残基がランダム化されている蛋白質ライブラリを用意し、ここで前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており、
（ｂ）前記蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ、
（ｃ）前記標的と結合した蛋白質を選択し、
（ｄ）前記選択された蛋白質をコードするポリヌクレオチドを増幅し、転写し、および翻訳することにより、第２の蛋白質ライブラリを製造し、ここで前記第２の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており、
（ｅ）前記第２の蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ、
（ｆ）前記標的と結合した蛋白質を選択し、
（ｇ）必要により工程（ｄ）−（ｆ）を繰り返し、そして
（ｈ）選択された蛋白質のアミノ酸配列を決定する。
In another aspect, the present invention provides a method for identifying a protein capable of binding to a target, comprising the following steps:
(A) a protein library comprising a group of a plurality of proteins having a first loop region on the N-terminal side of a protein having a three-finger-like scaffold,
A region from the second amino acid on the C-terminal side of C1-Cys to the seventh amino acid on the N-terminal side of C2-Cys,
A protein library in which amino acid residues are randomized, wherein each protein constituting the protein library is present in a form associated with a polynucleotide encoding each protein,
(B) contacting the protein library with the target;
(C) selecting a protein bound to the target;
(D) Amplifying, transcribing, and translating the polynucleotide encoding the selected protein to produce a second protein library, wherein each protein constituting the second protein library is Exists in a form associated with a polynucleotide encoding the protein of
(E) contacting the second protein library with the target;
(F) selecting a protein bound to the target;
(G) Repeat steps (d)-(f) if necessary, and (h) determine the amino acid sequence of the selected protein.
さらに別の観点においては、本発明は、以下の各工程を含む、標的と結合しうる蛋白質を同定する方法を提供する：
（ａ）スリーフィンガー様スキャフォールドを有する蛋白質のＮ末端側１番目のループ領域を有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって、
Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域、
のアミノ酸残基がランダム化されている蛋白質ライブラリを用意し、ここで前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており、
（ｂ）前記蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ、
（ｃ）前記標的と結合した蛋白質を選択し、
（ｄ）前記選択された蛋白質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を決定し、
（ｅ）決定された塩基配列に基づいて、一部の配列が前記決定された塩基配列と同じであり残りの配列が前記決定された塩基配列と異なる塩基配列を有する複数のポリヌクレオチドの群を調製し、転写し、および翻訳することにより、第２の蛋白質ライブラリを製造し、ここで前記第２の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており、
（ｆ）前記第２の蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ、
（ｇ）前記標的と結合した蛋白質を選択し、
（ｈ）必要により工程（ｄ）−（ｇ）を繰り返し、そして
（ｉ）選択された蛋白質のアミノ酸配列を決定する。
In yet another aspect, the present invention provides a method for identifying a protein that can bind to a target, comprising the following steps:
(A) a protein library comprising a group of a plurality of proteins having a first loop region on the N-terminal side of a protein having a three-finger-like scaffold,
A region from the second amino acid on the C-terminal side of C1-Cys to the seventh amino acid on the N-terminal side of C2-Cys,
A protein library in which amino acid residues are randomized, wherein each protein constituting the protein library is present in a form associated with a polynucleotide encoding each protein,
(B) contacting the protein library with the target;
(C) selecting a protein bound to the target;
(D) determining a base sequence of a polynucleotide encoding the selected protein;
(E) Based on the determined base sequence, a group of a plurality of polynucleotides, wherein a part of the sequence is the same as the determined base sequence and the remaining sequence has a base sequence different from the determined base sequence. A second protein library is produced by preparing, transcribing and translating, wherein each protein constituting the second protein library is associated with a polynucleotide encoding the respective protein. Exists,
(F) contacting the second protein library with the target;
(G) selecting a protein bound to the target;
(H) Repeat steps (d)-(g) if necessary, and (i) determine the amino acid sequence of the selected protein.
別の観点においては、本発明は、以下のアミノ酸配列：
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV（配列番号１）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である）
を有する蛋白質を提供する。
In another aspect, the invention provides the following amino acid sequence:
LVCY (X) 6 PGTLETCPDDFTCV (SEQ ID NO: 1)
(Wherein X is any amino acid residue)
A protein having
具体的には、本発明は以下を提供する。
〔１〕スリーフィンガー様スキャフォールドを有する蛋白質のＮ末端側１番目のループ領域を有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって、
Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域、
のアミノ酸残基がランダム化されていることを特徴とする蛋白質ライブラリ、
〔２〕前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質が、それぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在している、〔１〕記載の蛋白質ライブラリ、
〔３〕前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質が、ピューロマイシンを介してそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと結合している、〔２〕記載の蛋白質ライブラリ、
〔４〕前記蛋白質ライブラリが、以下のアミノ酸配列：
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV（配列番号１）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である）
を有する複数の蛋白質の群を含む、〔１〕−〔３〕のいずれかに記載の蛋白質ライブラリ、
〔５〕〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の蛋白質ライブラリをコードするポリヌクレオチドライブラリ、
〔６〕標的と結合しうる蛋白質を同定する方法であって、
（ａ）スリーフィンガー様スキャフォールドを有する蛋白質のＮ末端側１番目のループ領域を有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって、
Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域、
のアミノ酸残基がランダム化されている蛋白質ライブラリを用意し；
（ｂ）前記蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ；
（ｃ）前記標的と結合した蛋白質を選択し；そして
（ｄ）前記選択された蛋白質のアミノ酸配列を決定する、
の各工程を含む方法、
〔７〕工程（ａ）の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質が、それぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており、蛋白質のアミノ酸配列を決定する工程（ｄ）が、その蛋白質に結合しているポリヌクレオチドの塩基配列を決定することにより行われる、〔６〕記載の方法、
〔８〕前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質が、ピューロマイシンを介してそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと結合している、〔７〕記載の方法、
〔９〕前記蛋白質ライブラリが、以下のアミノ酸配列：
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV（配列番号１）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である）
を有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリである、〔６〕−〔８〕のいずれかに記載の方法、
〔１０〕標的と結合しうる蛋白質を同定する方法であって、
（ａ）スリーフィンガー様スキャフォールドを有する蛋白質のＮ末端側１番目のループ領域を有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって、
Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域、
のアミノ酸残基がランダム化されている蛋白質ライブラリを用意し、ここで前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており；
（ｂ）前記蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ；
（ｃ）前記標的と結合した蛋白質を選択し；
（ｄ）前記選択された蛋白質をコードするポリヌクレオチドを増幅し、転写し、および翻訳することにより、第２の蛋白質ライブラリを製造し、ここで前記第２の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており；
（ｅ）前記第２の蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ；
（ｆ）前記標的と結合した蛋白質を選択し；
（ｇ）必要により工程（ｄ）−（ｆ）を繰り返し；そして
（ｈ）選択された蛋白質のアミノ酸配列を決定する、
の各工程を含む方法、
〔１１〕前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質が、ピューロマイシンを介してそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと結合している、〔１０〕記載の方法、
〔１２〕前記蛋白質ライブラリが、以下のアミノ酸配列：
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV（配列番号１）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である）
を有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリである、〔１０〕または〔１１〕に記載の方法、
〔１３〕標的と結合しうる蛋白質を同定する方法であって、
（ａ）スリーフィンガー様スキャフォールドを有する蛋白質のＮ末端側１番目のループ領域を有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって、
Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域、
のアミノ酸残基がランダム化されている蛋白質ライブラリを用意し、ここで前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており；
（ｂ）前記蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ；
（ｃ）前記標的と結合した蛋白質を選択し；
（ｄ）前記選択された蛋白質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を決定し；
（ｅ）決定された塩基配列に基づいて、一部の配列が前記決定された塩基配列と同じであり残りの配列が前記決定された塩基配列と異なる塩基配列を有する複数のポリヌクレオチドの群を調製し、転写し、および翻訳することにより、第２の蛋白質ライブラリを製造し、ここで前記第２の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており；
（ｆ）前記第２の蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ；
（ｇ）前記標的と結合した蛋白質を選択し；
（ｈ）必要により工程（ｄ）−（ｇ）を繰り返し；そして
（ｉ）選択された蛋白質のアミノ酸配列を決定する、
の各工程を含む方法、
〔１４〕前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質が、ピューロマイシンを介してそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと結合している、〔１３〕記載の方法、
〔１５〕前記蛋白質ライブラリが、以下のアミノ酸配列：
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV（配列番号１）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である）
を有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリである、〔１３〕または〔１４〕に記載の方法、
〔１６〕以下のアミノ酸配列：
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV（配列番号１）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である）
を有する蛋白質。
Specifically, the present invention provides the following.
[1] A protein library comprising a group of a plurality of proteins having a first loop region on the N-terminal side of a protein having a three-finger-like scaffold,
A region from the second amino acid on the C-terminal side of C1-Cys to the seventh amino acid on the N-terminal side of C2-Cys,
A protein library characterized in that the amino acid residues of
[2] The protein library according to [1], wherein each protein constituting the protein library is present in a form associated with a polynucleotide encoding the protein,
[3] The protein library according to [2], wherein each protein constituting the protein library is bound to a polynucleotide encoding each protein via puromycin,
[4] The protein library has the following amino acid sequence:
LVCY (X) 6 PGTLETCPDDFTCV (SEQ ID NO: 1)
(Wherein X is any amino acid residue)
A protein library according to any one of [1]-[3], comprising a group of a plurality of proteins having
[5] A polynucleotide library encoding the protein library according to any one of [1] to [4],
[6] A method for identifying a protein capable of binding to a target,
(A) a protein library comprising a group of a plurality of proteins having a first loop region on the N-terminal side of a protein having a three-finger-like scaffold,
A region from the second amino acid on the C-terminal side of C1-Cys to the seventh amino acid on the N-terminal side of C2-Cys,
A protein library in which amino acid residues are randomized;
(B) contacting the protein library with the target;
(C) selecting a protein bound to the target; and (d) determining the amino acid sequence of the selected protein.
A method comprising the steps of
[7] Each protein constituting the protein library in step (a) is present in a form associated with a polynucleotide encoding each protein, and the step (d) for determining the amino acid sequence of the protein comprises: The method according to [6], wherein the method is performed by determining the base sequence of a polynucleotide bound to the protein;
[8] The method according to [7], wherein each protein constituting the protein library is bound to a polynucleotide encoding each protein via puromycin.
[9] The protein library has the following amino acid sequence:
LVCY (X) 6 PGTLETCPDDFTCV (SEQ ID NO: 1)
(Wherein X is any amino acid residue)
A method according to any one of [6]-[8], which is a protein library comprising a plurality of protein groups having
[10] A method for identifying a protein capable of binding to a target,
(A) a protein library comprising a group of a plurality of proteins having a first loop region on the N-terminal side of a protein having a three-finger-like scaffold,
A region from the second amino acid on the C-terminal side of C1-Cys to the seventh amino acid on the N-terminal side of C2-Cys,
A protein library in which the amino acid residues are randomized, wherein each protein constituting the protein library is present in a form associated with a polynucleotide encoding the protein;
(B) contacting the protein library with the target;
(C) selecting a protein bound to the target;
(D) Amplifying, transcribing, and translating the polynucleotide encoding the selected protein to produce a second protein library, wherein each protein constituting the second protein library is Present in association with a polynucleotide encoding the protein of
(E) contacting the second protein library with the target;
(F) selecting a protein bound to the target;
(G) repeating steps (d)-(f) if necessary; and (h) determining the amino acid sequence of the selected protein.
A method comprising the steps of
[11] The method according to [10], wherein each protein constituting the protein library is bound to a polynucleotide encoding each protein via puromycin.
[12] The protein library has the following amino acid sequence:
LVCY (X) 6 PGTLETCPDDFTCV (SEQ ID NO: 1)
(Wherein X is any amino acid residue)
A method according to [10] or [11], wherein the protein library comprises a group of a plurality of proteins having
[13] A method for identifying a protein capable of binding to a target,
(A) a protein library comprising a group of a plurality of proteins having a first loop region on the N-terminal side of a protein having a three-finger-like scaffold,
A region from the second amino acid on the C-terminal side of C1-Cys to the seventh amino acid on the N-terminal side of C2-Cys,
A protein library in which the amino acid residues are randomized, wherein each protein constituting the protein library is present in a form associated with a polynucleotide encoding the protein;
(B) contacting the protein library with the target;
(C) selecting a protein bound to the target;
(D) determining a base sequence of a polynucleotide encoding the selected protein;
(E) Based on the determined base sequence, a group of a plurality of polynucleotides, wherein a part of the sequence is the same as the determined base sequence and the remaining sequence has a base sequence different from the determined base sequence. A second protein library is produced by preparing, transcribing and translating, wherein each protein constituting the second protein library is associated with a polynucleotide encoding the respective protein. Exists;
(F) contacting the second protein library with the target;
(G) selecting a protein bound to the target;
(H) repeat steps (d)-(g) if necessary; and (i) determine the amino acid sequence of the selected protein;
A method comprising the steps of
[14] The method according to [13], wherein each protein constituting the protein library is bound to a polynucleotide encoding each protein via puromycin.
[15] The protein library has the following amino acid sequence:
LVCY (X) 6 PGTLETCPDDFTCV (SEQ ID NO: 1)
(Wherein X is any amino acid residue)
A method according to [13] or [14], wherein the protein library comprises a group of a plurality of proteins having
[16] The following amino acid sequence:
LVCY (X) 6 PGTLETCPDDFTCV (SEQ ID NO: 1)
(Wherein X is any amino acid residue)
Having a protein.
本発明の蛋白質ライブラリにおいては、スリーフィンガー様スキャフォールドのループＩの領域の一部のアミノ酸配列がランダム化されており、このライブラリから、天然の標的、例えば、ｎＡＣｈＲやＡＣｈＢＰとは異なる任意の標的と結合する蛋白質を選択することができる。本明細書において、蛋白質ライブラリとは、アミノ酸配列の異なる複数の蛋白質の集合を意味する。また、本明細書においては、蛋白質ライブラリのそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドの集合をポリヌクレオチドライブラリと称する。ランダム化とは、蛋白質の任意の所与の位置に２種類以上のアミノ酸残基が存在するような蛋白質の集合を用意することをいう。ランダム化された蛋白質においては、所与の位置に全ての可能なアミノ酸残基が同様の確率でまたは異なる確率で存在してもよく、所与の位置に選択された特定の２種類以上のアミノ酸残基が存在してもよい。例えば、配列中の特定の位置において２０種類のアミノ酸残基が各５％の確率で存在することができるが、各アミノ酸残基の存在の確率は５％に限定されず、様々でありうる。また、後述する子孫ライブラリの場合に見られるように、前回のラウンドで得られた配列情報に基づいてアミノ酸配列の特定の位置のみをランダム化し、残りの位置の配列が固定されているようにライブラリを作製してもよい。標的とは、本発明の方法により選択される蛋白質が結合しうる任意の物質であり、例えば、蛋白質、糖類、糖蛋白質、核酸、低分子化合物などが含まれる。例としては、レセプター、細胞表面抗原、抗体、ホルモン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス表面抗原等が挙げられる。蛋白質と標的との結合は、共有結合、疎水性結合、静電的結合、水素結合、ファンデルワールス結合のいずれでもよい。 In the protein library of the present invention, the amino acid sequence of a part of the loop I region of the three-finger-like scaffold is randomized, and any target different from the natural target, for example, nAChR or AChBP, is obtained from this library. Proteins that bind to can be selected. In this specification, a protein library means a set of a plurality of proteins having different amino acid sequences. In the present specification, a set of polynucleotides encoding each protein in the protein library is referred to as a polynucleotide library. Randomization refers to preparing a set of proteins in which two or more amino acid residues are present at any given position in the protein. In a randomized protein, all possible amino acid residues at a given position may be present with similar or different probabilities, and two or more specific amino acids selected at a given position Residues may be present. For example, 20 kinds of amino acid residues can be present with a probability of 5% at specific positions in the sequence, but the probability of the presence of each amino acid residue is not limited to 5% and may vary. Also, as will be seen in the case of the offspring library described later, the library is such that only specific positions of the amino acid sequence are randomized based on the sequence information obtained in the previous round, and the sequence of the remaining positions is fixed. May be produced. A target is an arbitrary substance to which a protein selected by the method of the present invention can bind, and includes, for example, a protein, a saccharide, a glycoprotein, a nucleic acid, a low molecular weight compound, and the like. Examples include receptors, cell surface antigens, antibodies, hormones, DNA, RNA, virus surface antigens and the like. The bond between the protein and the target may be any of a covalent bond, a hydrophobic bond, an electrostatic bond, a hydrogen bond, and a van der Waals bond.
本発明の蛋白質ライブラリの１つの好ましい態様は、Micrurus corallinusから単離された新規なヘビ神経毒であるＣＴｘ３（Kubo、T.、et al.、(2002)、Program No. 137.16.、32nd Annual Meeting of Society for Neuroscience、Washington、DC、3rd November、2002）に基づく蛋白質ライブラリである。ＣＴｘ３は、６１アミノ酸を含むスリーフィンガー型の毒素であり、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）やアセチルコリン結合蛋白質（ＡＣｈＢＰ）（神経毒の天然の標的）に結合してこれらを阻害することが見いだされている。図１９Ａに、ＣＴｘ３と、既知のヘビ神経毒であるα−ブンガロトキシン（α−Ｂｇｔｘ）およびコブラトキシン（Ｃｂｔｘ）の一次アミノ酸配列のマルチプルアラインメントを示す。相同な配列はブロックで示されている。ＢＩＡＣＯＲＥ Ｊ装置（Ｂｉａｃｏｒｅ）により測定して、ＣＴｘ３とＡＣｈＢＰとの解離定数（Ｋｄ）は２９．５±７．９ｎＭである。 One preferred embodiment of the protein library of the present invention is CTx3 (Kubo, T., et al., (2002), Program No. 137.16., 32nd Annual Meeting, a novel snake neurotoxin isolated from Micrurus corallinus. of Society for Neuroscience, Washington, DC, 3rd November, 2002). CTx3 is a three-finger toxin containing 61 amino acids, and found to bind to and inhibit nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) and acetylcholine binding protein (AChBP) (natural target of neurotoxins). ing. FIG. 19A shows multiple alignments of primary amino acid sequences of CTx3 and the known snake neurotoxins α-bungarotoxin (α-Bgtx) and cobratoxin (Cbtx). Homologous sequences are indicated by blocks. The dissociation constant (Kd) between CTx3 and AChBP is 29.5 ± 7.9 nM as measured by a BIACORE J apparatus (Biacore).
本発明者らは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．０（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｉｎｃ．、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）のＰｒｏｔｅａｎソフトウエア部品を用いてＣＴｘ３の二構造を予測し、既知のα−ブンガロトキシン（α−Ｂｇｔｘ）の構造と比較して、ループおよびβシートの形成に関与する残基を推定した（図１９Ｂ）。図１９Ｃは、予測二次構造の情報から得られる、βシートおよびループの概略図を示す。数字はループを形成するターンの開始および停止位置を示し、１番目のアミノ酸を１として表す。 We have predicted the two structures of CTx3 using the Protean software component of Lasergene Version 6.0 (DNASTAR, Inc., Wisconsin, USA), and the structure of a known α-bungarotoxin (α-Bgtx) As compared to, the residues involved in the formation of loops and β-sheets were estimated (FIG. 19B). FIG. 19C shows a schematic diagram of the β sheet and loop obtained from the predicted secondary structure information. The numbers indicate the start and stop positions of the turn forming the loop, and the first amino acid is represented as 1.
本発明の蛋白質ライブラリは、図１に示すように、ＣＴｘ３のＴ５−Ｐ１０（６アミノ酸）（以下ループＩと称する）がランダム化されていることを特徴とする。それ以外の位置のアミノ酸配列は固定されており、この部分がスリーフィンガー様スキャフォールドのフレームワークを決定する。すなわち、本発明のＣＴｘ３に基づく蛋白質ライブラリのアミノ酸配列は、例えば、以下のように表すことができる：
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV（配列番号１）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である）。
The protein library of the present invention is characterized in that CTx3 T5-P10 (6 amino acids) (hereinafter referred to as loop I) is randomized, as shown in FIG. The amino acid sequence at other positions is fixed, and this part determines the framework of the three-finger-like scaffold. That is, the amino acid sequence of the protein library based on CTx3 of the present invention can be expressed, for example, as follows:
LVCY (X) 6 PGTLETCPDDFTCV (SEQ ID NO: 1)
(Wherein X is any amino acid residue).
なお、本発明の蛋白質ライブラリのアミノ酸配列は、特に制限されないが、配列番号：１に記載のポリペプチドにおいてＮ末端およびＣ末端のそれぞれから最初のシステイン残基（例えば、配列番号１のＮ末端から３番目およびＣ末端から２番目のシステイン）を有するものが好ましく、例えば、これら以外のシステイン残基は（例えば、配列番号１のＣ末端から８番目のシステイン）は他のアミノ酸に改変されていてもよい。 The amino acid sequence of the protein library of the present invention is not particularly limited, but in the polypeptide described in SEQ ID NO: 1, the first cysteine residue from each of the N-terminus and C-terminus (for example, from the N-terminus of SEQ ID NO: 1) Those having the third and second cysteine from the C-terminal) are preferred. For example, other cysteine residues (for example, the eighth cysteine from the C-terminal of SEQ ID NO: 1) are modified with other amino acids. Also good.
さらに当業者は、図２０に示されるアライメントを参照することにより、スリーフィンガー様スキャフォールドを有する他の蛋白質についても、ＣＴｘ３に基づく蛋白質ライブラリ同様にして蛋白質ライブラリを製造し、使用することができる。 Furthermore, by referring to the alignment shown in FIG. 20, those skilled in the art can produce and use a protein library for other proteins having a three-finger-like scaffold in the same manner as a protein library based on CTx3.
本発明の蛋白質ライブラリは、通常のペプチド合成の技術を用いて、手動または自動により製造することができる。あるいは、蛋白質ライブラリの各メンバー蛋白質をコードするポリヌクレオチドのライブラリを製造し、無細胞系で、または細菌や動物細胞中で蛋白質を発現させることにより製造してもよい。すなわち、本発明は、上述の本発明の蛋白質ライブラリをコードするポリヌクレオチドライブラリを提供する。このようなポリヌクレオチドライブラリの製造方法および発現（転写および翻訳）方法は、当該技術分野においてよく知られている。 The protein library of the present invention can be produced manually or automatically using ordinary peptide synthesis techniques. Alternatively, a library of polynucleotides encoding each member protein of the protein library may be produced and expressed by expressing the protein in a cell-free system or in bacteria or animal cells. That is, the present invention provides a polynucleotide library encoding the above-described protein library of the present invention. Such polynucleotide library production and expression (transcription and translation) methods are well known in the art.
本発明の蛋白質ライブラリは、標的と結合しうる蛋白質を同定する目的のために、インビトロまたはインビボで種々の方法において、例えば、無細胞翻訳系やファージディスプレイ技術を用いる方法において用いることができる。 The protein library of the present invention can be used in various methods in vitro or in vivo, for example, in a method using a cell-free translation system or a phage display technique, for the purpose of identifying a protein that can bind to a target.
別の観点においては、本発明は、本発明の蛋白質ライブラリを用いて標的と結合しうる蛋白質を同定する方法を提供する。この方法においては、まず本発明の蛋白質ライブラリを標的と接触させる。蛋白質ライブラリと標的との接触は、適当な緩衝液中に蛋白質ライブラリと標的とを加えて所定の時間インキュベートすることにより行うことができる。接触の条件は、標的との親和性の高い蛋白質が標的と結合したまま残り、親和性の低い蛋白質が結合しないように設定することができる。また、標的の特性、本発明にしたがって選択されるべき蛋白質の用途、予測される非特異的結合の程度などを考慮することができる。さらに、下記に詳細に説明するように、複数のラウンドの選択を行う場合にはラウンドごとに接触の条件を変更してもよい。次に、蛋白質ライブラリのうち、標的と結合していない蛋白質を除去し、標的と結合した蛋白質を選択する。この選択工程を容易にするためには、蛋白質ライブラリおよび標的のいずれかを固相に固定化しておくことが便利である。固相としては、ガラスまたはプラスチックのプレート、ビーズ、多孔性粒子、膜、磁気粒子などの、当該技術分野において知られる任意のものを用いることができる。このようにして選択された蛋白質を回収して、そのアミノ酸配列を決定することにより、標的と結合する蛋白質を同定することができる。 In another aspect, the present invention provides a method for identifying a protein that can bind to a target using the protein library of the present invention. In this method, the protein library of the present invention is first contacted with a target. The contact between the protein library and the target can be performed by adding the protein library and the target in an appropriate buffer and incubating for a predetermined time. The contact condition can be set so that a protein having a high affinity with the target remains bound to the target and a protein having a low affinity does not bind. In addition, the characteristics of the target, the use of the protein to be selected according to the present invention, the expected degree of non-specific binding, etc. can be taken into account. Furthermore, as will be described in detail below, when a plurality of rounds are selected, the contact condition may be changed for each round. Next, proteins that are not bound to the target are removed from the protein library, and proteins that are bound to the target are selected. In order to facilitate this selection step, it is convenient to immobilize either the protein library or the target on a solid phase. As the solid phase, any known in the art such as glass or plastic plate, beads, porous particles, membranes, magnetic particles, etc. can be used. By recovering the protein thus selected and determining its amino acid sequence, the protein that binds to the target can be identified.
あるいは、蛋白質ライブラリをマイクロアレイのフォーマットで、各コンパートメントにどのような配列の蛋白質が存在するかがわかるように製造して、標的と接触させてもよい。マイクロアレイに標識した標的を加えてインキュベートした後、未結合蛋白質を洗い流し、マイクロアレイ上に残存する標識を検出する。標的が結合しているコンパートメントの位置から、標的と結合しうる蛋白質の配列を知ることができる。 Alternatively, a protein library may be produced in a microarray format so as to know what sequence of protein is present in each compartment and contacted with the target. After adding the labeled target to the microarray and incubating, the unbound protein is washed away and the label remaining on the microarray is detected. From the position of the compartment to which the target is bound, the sequence of the protein that can bind to the target can be known.
本発明の１つの好ましい態様においては、本発明の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質が、それぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在するように、蛋白質ライブラリを製造する。このような蛋白質−ポリヌクレオチドライブラリを用いると、ポリヌクレオチドの塩基配列を決定することにより、標的と結合した蛋白質のアミノ酸配列の決定を容易に行うことができる。 In one preferred embodiment of the present invention, a protein library is produced so that each protein constituting the protein library of the present invention is present in a form associated with a polynucleotide encoding each protein. When such a protein-polynucleotide library is used, the amino acid sequence of the protein bound to the target can be easily determined by determining the base sequence of the polynucleotide.
さらに、ポリヌクレオチドと対応づけられた形の蛋白質ライブラリを用いると、標的に結合した蛋白質の群を選択した後、この蛋白質をコードするポリヌクレオチドの群を回収して、これを増幅し、転写し、および翻訳することにより、第２の蛋白質ライブラリを製造することができる。この第２の蛋白質ライブラリは、個々の蛋白質は元の蛋白質ライブラリと同じランダム化領域およびフレームワーク領域を有するが、ライブラリ全体として標的との親和性が増加しており、ランダム化領域の配列の多様性が減少しているはずである。本明細書においてはこの多様性の減少を「濃縮」と称する。次に、この第２の蛋白質ライブラリを用いて、最初の工程と同様に標的と結合する蛋白質を選択し、この蛋白質をコードするポリヌクレオチドから第３の蛋白質ライブラリを製造する。このようにして、多数ラウンドの選択およびライブラリの生成を行うことにより、標的との親和性がより高い蛋白質の集合を得ることができる。 Furthermore, using a protein library in a form associated with a polynucleotide, after selecting a group of proteins bound to a target, the group of polynucleotides encoding the protein is recovered, amplified, and transcribed. , And translation can produce a second protein library. In this second protein library, each protein has the same randomized region and framework region as the original protein library, but the library as a whole has increased affinity with the target, and the randomized region has a variety of sequences. Sex should be decreasing. This reduction in diversity is referred to herein as “concentration”. Next, using the second protein library, a protein that binds to the target is selected in the same manner as in the first step, and a third protein library is produced from the polynucleotide encoding the protein. In this way, by performing multiple rounds of selection and library generation, a set of proteins with higher affinity for the target can be obtained.
さらに別の態様においては、上述のように第２の蛋白質ライブラリを製造する際に、分子進化の手法を適用することができる。すなわち、標的に結合するとして選択された蛋白質の配列を決定した後、その配列の一部をさらにランダム化したいわゆる子孫ライブラリを作製する。配列の一部のランダム化とは、例えば、選択された蛋白質のランダム化領域のアミノ酸配列に１個あるいは複数の変異を導入し、残りのアミノ酸配列は固定化したアミノ酸配列を設計する、などの方法により行うことができる。このようにして、一部のアミノ酸配列が前ラウンドで選択された蛋白質のアミノ酸配列と同じであり残りのアミノ酸が異なる複数の蛋白質の群からなる第２の蛋白質ライブラリを製造することができる。次に、この第２の蛋白質ライブラリを用いて標的と結合する蛋白質を選択し、以下同様にして、複数のラウンドの選択およびライブラリのさらなるランダム化を行うことができる。このようにして、標的に結合しうる蛋白質にさらに変異を導入して人工的な分子進化を促進することが可能となる。 In yet another aspect, molecular evolution techniques can be applied when producing the second protein library as described above. That is, after determining the sequence of the protein selected to bind to the target, a so-called progeny library is prepared by further randomizing part of the sequence. Randomization of part of the sequence means, for example, that one or more mutations are introduced into the amino acid sequence of the randomized region of the selected protein, and the remaining amino acid sequence is designed as an immobilized amino acid sequence. It can be done by a method. In this way, it is possible to produce a second protein library comprising a group of a plurality of proteins having a partial amino acid sequence that is the same as the amino acid sequence of the protein selected in the previous round and the remaining amino acids are different. The second protein library can then be used to select a protein that binds to the target, and in the same manner, multiple rounds of selection and further randomization of the library can be performed. In this manner, it is possible to further introduce a mutation into a protein that can bind to a target to promote artificial molecular evolution.
ポリヌクレオチドと結合した蛋白質から構成される蛋白質ライブラリの好適な１つの例は、ピューロマイシンを利用したインビトロウイルス（ＩＶＶ）である。本明細書においてインビトロウイルス（ＩＶＶ）とは、蛋白質とこれをコードするポリヌクレオチドがピューロマイシンを介して結合している複合体をいい、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−蛋白質、ＤＮＡ／ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−蛋白質、およびＤＮＡ−ピューロマイシン−蛋白質が含まれる。ピューロマイシンは、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端と類似する構造を有する蛋白質合成阻害剤であり、所定の条件下ではリボソーム上の伸張中の蛋白質の３’末端に特異的に結合する性質を有する。適当なリンカーを介してｍＲＮＡとピューロマイシンとを結合させておき、無細胞翻訳系でｍＲＮＡから蛋白質を合成すると、合成された蛋白質とこれをコードするｍＲＮＡとがピューロマイシンを介して結合している複合体が生ずる（Nemoto et al、FEBS Lett.、414、405-408、1997）。次に、この複合体のライブラリから所望の機能をもつ蛋白質を選択する。ｍＲＮＡと蛋白質の複合体を用いて選択した後に逆転写によりＤＮＡを合成してもよく、あるいはｍＲＮＡから逆転写によりＤＮＡを合成して、ＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッドと蛋白質の複合体の形とした後に、蛋白質を選択してもよい。所望の機能をもつ蛋白質を選択した後、ＤＮＡの配列を分析することにより、蛋白質を同定することができる。ピューロマイシンとしては、伸張中の蛋白質の３’末端に特異的に結合する機能を有する限り、任意のピューロマイシン誘導体を用いることができる。ピューロマイシンの安定性を高めるための修飾、複合体の検出のための標識、精製を容易にするためのアフィニティー部位、他の分子への結合を容易にするためのリンカー部位などを含むよう設計された種々の誘導体が市販されているか、または容易に製造することができる。 One suitable example of a protein library composed of proteins bound to polynucleotides is in vitro virus (IVV) using puromycin. In this specification, in vitro virus (IVV) refers to a complex in which a protein and a polynucleotide encoding the same are bound via puromycin, and mRNA-puromycin-protein, DNA / mRNA-puromycin-protein. And DNA-puromycin-protein. Puromycin is a protein synthesis inhibitor having a structure similar to the 3 'end of aminoacyl-tRNA, and has a property of specifically binding to the 3' end of a growing protein on a ribosome under a predetermined condition. When mRNA and puromycin are bound via an appropriate linker and the protein is synthesized from the mRNA in a cell-free translation system, the synthesized protein and the mRNA encoding the same are bound via puromycin. A complex is formed (Nemoto et al, FEBS Lett., 414, 405-408, 1997). Next, a protein having a desired function is selected from the library of the complex. After selecting using a complex of mRNA and protein, DNA may be synthesized by reverse transcription, or after synthesizing DNA from mRNA by reverse transcription to form a complex of DNA / mRNA hybrid and protein, A protein may be selected. After selecting a protein having a desired function, the protein can be identified by analyzing the DNA sequence. Any puromycin derivative can be used as the puromycin as long as it has a function of specifically binding to the 3 'end of the extending protein. Designed to include modifications to increase puromycin stability, labels for complex detection, affinity sites to facilitate purification, linker sites to facilitate binding to other molecules, etc. Various derivatives are commercially available or can be easily prepared.
以下に、実施例で作成し使用したＣＴｘ３に基づくライブラリを例として、本発明のライブラリーの作製方法を説明する。以下の方法を要約すれば、スリーフィンガー−インビトロウイルス（３Ｆ−ＩＶＶ）ライブラリを作製し、該方法を用いて標的結合蛋白質（３−Ｆペプチド）を同定する。次いで、同定した３−Ｆペプチドをシーケンスした後、スリーフィンガーのＮ末端側の１番目のループをコードする部分のみを再度ペプチド合成し、該ペプチドに対して、例えば公知のアミノ酸変異導入技術等を利用して、該ループ領域の一部のアミノ酸がランダム化したポリペプチドを取得することができる。 In the following, the method for preparing the library of the present invention will be described using the library based on CTx3 prepared and used in the examples as an example. To summarize the following method, a three finger-in vitro virus (3F-IVV) library is generated and the method is used to identify a target binding protein (3-F peptide). Next, after the identified 3-F peptide is sequenced, only the portion encoding the first loop on the N-terminal side of the three finger is synthesized again, and for example, a known amino acid mutation introduction technique or the like is applied to the peptide. By using this, a polypeptide in which a part of the amino acids in the loop region is randomized can be obtained.
以下のＣＴｘ３は単なる例示のためにのみ用いられ、本発明の範囲はこの特定の蛋白質に基づくライブラリに限定されるものではない。 The following CTx3 is used for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to this particular protein-based library.
ＣＴｘ３のスリーフィンガー様スキャフォールドに基づいて、アセチルコリンレセプターへの結合に関与すると推定されているアミノ酸を含む３つのループ領域がランダム化されている構造を有する。図１に示されるように、ループを形成していると予測される領域およびその周辺のアミノ酸残基をランダム化した。ベータシートを形成しているアミノ酸は変更していない。 Based on the three-finger-like scaffold of CTx3, it has a structure in which three loop regions containing amino acids that are presumed to be involved in binding to the acetylcholine receptor are randomized. As shown in FIG. 1, the region predicted to form a loop and the surrounding amino acid residues were randomized. The amino acids forming the beta sheet are not changed.
ＣＴｘ３遺伝子を含む３Ｆ−ＩＶＶライブラリ用の全長コンストラクトは、ループ部分のアミノ酸配列をランダム化したＣＴｘ３遺伝子の５’側にＳＰ６プロモーター、キャップ部位、Ｘｅｎｏｐｕｓグロブリン非翻訳配列（ＵＴＲ）および翻訳開始部位を含むＳＰ６−ＵＴＲフラグメントを付加し、３’側にスペーサー（ＧＧＧＳ）２、Ｃ−末端Ｈｉｓ６−タグ、スペーサー（ＧＧＧＳ）およびＹ−タグ配列を付加するよう設計した（図２）。ＳＰ６−ＵＴＲはＣＴ３ｘ遺伝子のインビトロ転写および翻訳に、Ｈｉｓ６−タグ配列はライブラリの精製に、Ｙ−タグ配列はｍＲＮＡとピューロマイシンリンカーへのライゲーションに用いるための配列である。スペーサーは、合成したタンパク質のフォールディングをスムーズにするために導入した。得られた全長コンストラクトを直接配列決定してループ領域のランダム化の程度を評価したところ、図４に示されるように、ループ領域がランダム化されていることが確認された。 The full length construct for the 3F-IVV library containing the CTx3 gene contains an SP6 promoter, a cap site, a Xenopus globulin untranslated sequence (UTR) and a translation initiation site on the 5 ′ side of the CTx3 gene obtained by randomizing the amino acid sequence of the loop portion. An SP6-UTR fragment was added and designed to add spacer (GGGS) 2, C-terminal His6-tag, spacer (GGGS) and Y-tag sequence on the 3 ′ side (FIG. 2). SP6-UTR is used for in vitro transcription and translation of CT3x gene, His6-tag sequence is used for library purification, and Y-tag sequence is used for ligation to mRNA and puromycin linker. A spacer was introduced to facilitate the folding of the synthesized protein. When the obtained full-length construct was directly sequenced and the degree of randomization of the loop region was evaluated, it was confirmed that the loop region was randomized as shown in FIG.
ＩＶＶは、リボソーム上の伸張中のペプチドと、これをコードするｍＲＮＡとがピューロマイシンを介して結合している複合体である。下記の実施例においてＩＶＶを形成するために用いたピューロマイシン・ビオチン・リンカーの構造を図５に示す。 IVV is a complex in which an elongating peptide on a ribosome is bound to mRNA encoding the peptide via puromycin. The structure of the puromycin biotin linker used to form IVV in the examples below is shown in FIG.
ピューロマイシン・ビオチン・リンカーは、Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓとビオチン・ループとの２つの修飾オリゴヌクレオチドを二官能性試薬（ＥＭＣＳ）を用いて架橋させることにより合成する。Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓは、スペーサーの一方の端にピューロマイシンが結合しており、他方の端にチオール基を有しており、フルオレセインで標識されている。 The puromycin biotin linker is synthesized by cross-linking two modified oligonucleotides, Puro-FS and biotin loop, using a bifunctional reagent (EMCS). Puro-FS has puromycin bound to one end of the spacer, has a thiol group at the other end, and is labeled with fluorescein.
ビオチン・ループは、ステムループ構造をとることができる塩基配列を有し、ループ部分にビオチンが結合している。ステム部分は制限酵素ＰｖｕＩＩの認識部位を形成する。ビオチンはＩＶＶの精製のために用いることができ、制限酵素部位におけるＤＮＡの切断によりＩＶＶを回収することができる。ビオチン・ループのステムから３’側の配列は、上述のＣＴｘ３全長コンストラクト中のＹ−タグ配列と対応しており、ＣＴｘ３コンストラクトから生成したｍＲＮＡの３’側の配列とアニーリングすることができる。ｍＲＮＡとのライゲーションはビオチン・ループの５’末端で生ずる。ビオチン・ループの３’末端近傍のｄＴは１級アミノ基を有するよう誘導化されており、このアミノ基を介して二官能性試薬によりＰｕｒｏ−Ｆ−Ｓと結合させる。さらに、ビオチン・ループの３’末端は、ライゲーションしたｍＲＮＡからの逆転写を行う際のプライマーとして機能する。 The biotin loop has a base sequence that can take a stem-loop structure, and biotin is bound to the loop portion. The stem part forms a recognition site for the restriction enzyme PvuII. Biotin can be used for purification of IVV, and IVV can be recovered by cleavage of DNA at the restriction enzyme site. The sequence 3 'from the stem of the biotin loop corresponds to the Y-tag sequence in the CTx3 full-length construct described above, and can be annealed to the sequence 3' of the mRNA generated from the CTx3 construct. Ligation with mRNA occurs at the 5 'end of the biotin loop. The dT near the 3 'end of the biotin loop is derivatized to have a primary amino group and is linked to Puro-FS via a bifunctional reagent via this amino group. Furthermore, the 3 'end of the biotin loop functions as a primer for reverse transcription from the ligated mRNA.
Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓのチオール基を還元し、ビオチン・ループとＥＭＣＳとのコンジュゲートを加え、Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓの末端チオール基とビオチン・ループ上のアミノ基とを結合させて、ピューロマイシン・ビオチン・リンカーを得る。 The thiol group of Puro-FS is reduced, a conjugate of biotin loop and EMCS is added, the terminal thiol group of Puro-FS is bound to the amino group on the biotin loop, and puromycin Obtain a biotin linker.
ランダム化ＣＴｘ３遺伝子の全長コンストラクトからＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼによりｍＲＮＡを生成する。次に、ｍＲＮＡのＹタグ配列をピューロマイシン・ビオチン・リンカーにアニーリングさせ、ライゲーション部位でＴ４ ＲＮＡリガーゼによりライゲーションさせて、ｍＲＮＡとピューロマイシン・ビオチン・リンカーとを結合させる。 MRNA is generated from the full length construct of the randomized CTx3 gene by SP6 RNA polymerase. Next, the Y tag sequence of mRNA is annealed to a puromycin biotin linker and ligated with T4 RNA ligase at the ligation site to bind the mRNA to the puromycin biotin linker.
次に、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・ビオチン・リンカーを無細胞翻訳系で翻訳させて蛋白質を生成し、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・ビオチン・リンカー−蛋白質の複合体を形成させる。この複合体をビオチンを介してストレプトアビジンと結合させた後、逆転写酵素反応によりＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを形成し、得られたＤＮＡ／ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・ビオチン・リンカー−蛋白質を制限酵素ＰｖｕＩＩで消化することにより、ストレプトアビジンから切り離す。得られたＤＮＡ／ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−蛋白質を、Ｃ−末端Ｈｉｓ６−タグを利用してＮｉ−ＮＴＡ磁気ビーズにより精製する。以上のようにして、３Ｆ−ＩＶＶライブラリを形成することができる。 Next, mRNA-puromycin / biotin / linker is translated in a cell-free translation system to produce a protein, and a complex of mRNA / puromycin / biotin / linker-protein is formed. After binding this complex to streptavidin via biotin, a DNA / RNA hybrid is formed by a reverse transcriptase reaction, and the resulting DNA / mRNA-puromycin / biotin / linker-protein is digested with the restriction enzyme PvuII. To separate it from streptavidin. The resulting DNA / mRNA-puromycin-protein is purified by Ni-NTA magnetic beads using the C-terminal His6-tag. As described above, a 3F-IVV library can be formed.
製造したＣＴｘ３に基づくスリーフィンガー様スキャフォールドの蛋白質ライブラリの有用性を確認するために、インターロイキン６レセプターに特異的かつ高い親和性を有する結合／阻害蛋白質の同定を行った。インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、細胞増殖、分化、および細胞機能を制御する多機能性サイトカインであり、種々の疾患、例えば慢性関節リウマチやキャッスルマン病の病因に関連する。ＩＬ−６の活性は、ＩＬ−６レセプター（ＩＬ−６Ｒ）を介して発揮される。ＩＬ−６はＩＬ−６Ｒと相互作用して低アフィニティー複合体を形成し、これは次にｇｐ１３０とともにシグナリングに必須の高アフィニティー複合体を形成する。ＩＬ−６Ｒの阻害剤は、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの結合を妨害し、その結果、（ＩＬ−６）−（ＩＬ−６Ｒ）−ｇｐ１３０複合体の形成を阻害し、このことによりシグナリングカスケードを阻害すると考えられている（Nishimoto、N.、Kishimoto、T. and Yoshizaki、K. (2000)、Ann Rheum Dis、59 (suppl 1)、i21-i27）。 In order to confirm the usefulness of the produced protein library of the three finger-like scaffold based on CTx3, a binding / inhibitory protein having specific and high affinity for the interleukin 6 receptor was identified. Interleukin-6 (IL-6) is a multifunctional cytokine that controls cell proliferation, differentiation, and cell function and is associated with the pathogenesis of various diseases such as rheumatoid arthritis and Castleman's disease. The activity of IL-6 is exerted through the IL-6 receptor (IL-6R). IL-6 interacts with IL-6R to form a low affinity complex that in turn forms a high affinity complex essential for signaling with gp130. Inhibitors of IL-6R interfere with the binding of IL-6 to IL-6R and consequently inhibit the formation of (IL-6)-(IL-6R) -gp130 complex, thereby signaling It is thought to inhibit the cascade (Nishimoto, N., Kishimoto, T. and Yoshizaki, K. (2000), Ann Rheum Dis, 59 (suppl 1), i21-i27).
３Ｆ−ＩＶＶライブラリをＩＬ−６Ｒ誘導化セファロースビーズとともにインキュベートし、数回洗浄した後に、ＩＬ−６Ｒに結合した蛋白質を含むＩＶＶを溶出する。溶出した生成物をＰＣＲ増幅し、さらにＳＰ６−ＵＴＲの配列を付加する。上述のようにして転写させ、得られたｍＲＮＡをピューロマイシンリンカーにライゲーションさせ、翻訳させ、逆転写させて、ＤＮＡ／ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカー−蛋白質複合体を得る。この複合体は、第２の３Ｆ−ＩＶＶライブラリとして、次のラウンドで使用することができる。このようにして、複数ラウンドの選択および蛋白質ライブラリ生成を行うことができる。第２ラウンド以降の選択のラウンドにおいては、標的の濃度やインキュベーション時間を減少させ、洗浄の回数を増加させることにより、選択圧を順次高くして、より結合親和性の高い蛋白質を濃縮することができる。 The 3F-IVV library is incubated with IL-6R derivatized Sepharose beads, washed several times, and then IVV containing protein bound to IL-6R is eluted. The eluted product is PCR amplified, and the SP6-UTR sequence is added. Transcription as described above, the resulting mRNA is ligated to a puromycin linker, translated, and reverse transcribed to obtain a DNA / mRNA-puromycin linker-protein complex. This complex can be used in the next round as a second 3F-IVV library. In this way, multiple rounds of selection and protein library generation can be performed. In the second and subsequent rounds of selection, the target concentration and incubation time can be reduced, and the number of washings can be increased to increase the selection pressure sequentially and concentrate proteins with higher binding affinity. it can.
１０ラウンドの選択およびライブラリの生成により、ＩＬ−６Ｒと結合しうる複数の蛋白質を得ることができた。これらの蛋白質のうち、以下のアミノ酸配列：
LVCYQLLACRPGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIPACETPASCCQTDKCNG（配列番号２８）；
LVCYQLLACRPGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIPTPRARTGCCQTDKCNG（配列番号２９）；または
LVCYAPLPYTPGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIPACETPASCCQTDKCNG（配列番号３０）
を有する蛋白質がＩＬ−６Ｒに対して高い親和性を示した。
By 10 rounds of selection and library generation, multiple proteins capable of binding to IL-6R could be obtained. Of these proteins, the following amino acid sequences:
LVCYQLLACRPGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIPACETPASCCQTDKCNG (SEQ ID NO: 28);
LVCYQLLACRPGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIPTPRARTGCCQTDKCNG (SEQ ID NO: 29); or
LVCYAPLPYTPGTLETCPDDFTCVATRHTLGHNLTQYCSHACAIPACETPASCCQTDKCNG (SEQ ID NO: 30)
A protein having a high affinity for IL-6R.
さらに、後述の実施例で示すように、これらの３−Ｆの４つのS-S結合を形成するシステイン残基のうち、Ｎ末端側から２番目のシステイン残基をグリシンに変えて、さらに１つのループをもつペプチドへ分断しこれをペプチド合成した。該ペプチドは、スリーフィンガー様スキャフォールドを有する蛋白質のＮ末端側１番目のループ領域を有する蛋白質である。本発明は、該蛋白質のＮ末側Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域のアミノ酸残基がランダム化されていることを特徴とする蛋白質ライブラリであり、具体例としては、LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV（配列番号１）の配列からなる複数の蛋白質群を含むライブラリである。 Further, as shown in the Examples below, among the cysteine residues that form the four SS bonds of 3-F, the second cysteine residue from the N-terminal side is changed to glycine, and one more loop The peptide was divided into peptides having synthesize this peptide. The peptide is a protein having a first loop region on the N-terminal side of a protein having a three-finger-like scaffold. The present invention is characterized in that the amino acid residues in the region from the second amino acid at the C-terminal side of the N-terminal C1-Cys of the protein to the seventh amino acid at the N-terminal side of C2-Cys are randomized. A specific example is a library including a plurality of protein groups consisting of the sequence of LVCY (X) 6 PGTLETCPDDFTCV (SEQ ID NO: 1).
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
〔実施例１〕
スリーフィンガー様スキャフォールドの蛋白質ライブラリの作製
インビトロウイルス（ＩＶＶ）法による進化分子工学を用いて、標的と結合しうるスリーフィンガー型のポリペプチドを取得するために、３つのループ領域をランダム化した蛋白質ライブラリ（３Ｆ−ＩＶＶライブラリ）を作製した。スリーフィンガー様スキャフォールドのシステインのフレームワークは、いくつかの短い神経毒の間で保存されていることが知られている。アセチルコリンレセプターへの結合に関与すると推定されているアミノ酸を含む部分およびその周辺のアミノ酸残基をランダム化した。ループＩのＴ５−Ｐ１０（６アミノ酸）、ループＩＩのＫ２５−Ｖ３４（１０アミノ酸）およびループＩＩＩのＡ４６−Ｈ５２（７アミノ酸）をランダム化した（図１９）。ベータシートを形成しているアミノ酸は変更しなかった。
[Example 1]
Preparation of three finger-like scaffold protein library Protein obtained by randomizing three loop regions in order to obtain a three finger type polypeptide capable of binding to a target using evolution molecular engineering by in vitro virus (IVV) method A library (3F-IVV library) was prepared. The cysteine framework of the three finger-like scaffold is known to be conserved among several short neurotoxins. Randomized amino acid residues in and around the portion containing amino acids presumed to be involved in binding to the acetylcholine receptor. Loop I T5-P10 (6 amino acids), Loop II K25-V34 (10 amino acids) and Loop III A46-H52 (7 amino acids) were randomized (FIG. 19). The amino acids forming the beta sheet were not changed.
３Ｆ−ＩＶＶライブラリ用の全長コンストラクトの調製：
３Ｆ−ＩＶＶライブラリ用の全長コンストラクトは、ループ部分のアミノ酸配列をランダム化したＣＴｘ３遺伝子の５’側にＳＰ６プロモーター、キャップ部位、Ｘｅｎｏｐｕｓグロブリン非翻訳配列（ＵＴＲ）および翻訳開始部位を含むＳＰ６−ＵＴＲフラグメントを付加し、３’側にスペーサー（ＧＧＧＳ）２、Ｃ−末端Ｈｉｓ６−タグ、スペーサー（ＧＧＧＳ）およびＹ−タグ配列を付加するよう設計した（図２）。ＳＰ６−ＵＴＲはＣＴ３ｘ遺伝子のインビトロ転写および翻訳のために、Ｈｉｓ６−タグ配列はライブラリの精製のために、Ｙ−タグ配列はｍＲＮＡとピューロマイシンリンカーへのライゲーションのために、それぞれ付加されている。
Preparation of full length constructs for 3F-IVV libraries:
The full length construct for the 3F-IVV library is an SP6-UTR fragment containing an SP6 promoter, a cap site, a Xenopus globulin untranslated sequence (UTR) and a translation initiation site on the 5 ′ side of the CTx3 gene in which the amino acid sequence of the loop portion is randomized And a spacer (GGGS) 2, a C-terminal His6-tag, a spacer (GGGS) and a Y-tag sequence were designed on the 3 ′ side (FIG. 2). SP6-UTR is added for in vitro transcription and translation of CT3x gene, His6-tag sequence is added for library purification, and Y-tag sequence is added for ligation to mRNA and puromycin linker.
ＣＴｘ３のヌクレオチド配列を４つのフラグメントに分割し、各フラグメントに対応するオリゴヌクレオチドを慣用のホスホルアミダイト化学により合成した。最初の３つのフラグメントはそれぞれ、３Ｆ遺伝子のループ配列に対応するランダム化ヌクレオチドおよび非ランダム化ベータシート配列に対応するヌクレオチドを含む。第１のフラグメントの５’末端にはＳＰ６−ＵＴＲの一部が含まれている。第４のフラグメントは、Ｙ−タグ、スペーサー（ＧＧＧＳ）２、Ｃ−末端Ｈｉｓ６−タグ、スペーサー（ＧＧＧＳ）を含む。これらの４つのフラグメントは、それぞれ３’側にオーバーラップ配列を含む。この実験に用いたオリゴヌクレオチドの一覧を以下に示す。ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴを表し、ＳはＣまたはＧを表す。 The CTx3 nucleotide sequence was divided into four fragments and the oligonucleotides corresponding to each fragment were synthesized by conventional phosphoramidite chemistry. The first three fragments each contain a randomized nucleotide corresponding to the loop sequence of the 3F gene and a nucleotide corresponding to the non-randomized beta sheet sequence. The 5 ′ end of the first fragment contains a portion of SP6-UTR. The fourth fragment, Y- tag, a spacer (GGGS) 2, C-terminal His 6 - including tag spacer (GGGS). Each of these four fragments contains an overlapping sequence on the 3 ′ side. A list of oligonucleotides used in this experiment is shown below. N represents A, G, C or T, and S represents C or G.
Ｆ１： 5'-CGCTCAACTTTGGCAGATCTACCATGGGAGGTTCACTTGTATGTTACACA(NNS)6CCTCCTG GAACCTTAGAGACTTG-3' （配列番号３１）
Ｆ２： 5’-ACGCATGAGAACAATACTGGGTAAC(SNN)10TTTTTTAACACATGTGAAATCATCTGGACAA GTCTCTAAGGTTCCAGG-3' （配列番号３２）
Ｆ３： 5’-TCCGTTGCATTTGTCTGTTTGGCAACA(SNN)7AAACTCATAGGACGCCGGTATCGCACACGC ATGAGAACAATACTGGGT-3’ （配列番号３３）
Ｆ４： 5’-tttccccgccgccccccgtcctTGAGCCACCTCCAGAACCACCGCCATGGTGGTGATGATGGTGAGACCCTCCGCCTGAGCCTCCACCTCCGTTGCATTTGTCTGTTTGG- 3’ （配列番号３４）
ＳＰ６−ＵＴＲ： 5’-ATTTAGGTGACACTATAGAATACAAGCTTGCTTGTTCTTTTTGCAGAAGCTCAGAATAAACG CTCAACTTTGGCAGATCTACCATGG-3’ （配列番号３５）
F1: 5'-CGCTCAACTTTGGCAGATCTACCATGGGAGGTTCACTTGTATGTTACACA (NNS) 6 CCTCCTG GAACCTTAGAGACTTG-3 '(SEQ ID NO: 31)
F2: 5'-ACGCATGAGAACAATACTGGGTAAC (SNN) 10 TTTTTTAACACATGTGAAATCATCTGGACAA GTCTCTAAGGTTCCAGG-3 '(SEQ ID NO: 32)
F3: 5'-TCCGTTGCATTTGTCTGTTTGGCAACA (SNN) 7 AAACTCATAGGACGCCGGTATCGCACACGC ATGAGAACAATACTGGGT-3 '(SEQ ID NO: 33)
F4: 5'-tttccccgccgccccccgtcctTGAGCCACCTCCAGAACCACCGCCATGGTGGTGATGATGGTGAGACCCTCCGCCTGAGCCTCCACCTCCGTTGCATTTGTCTGTTTGG-3 '(SEQ ID NO: 34)
SP6-UTR: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAATACAAGCTTGCTTGTTCTTTTTGCAGAAGCTCAGAATAAACG CTCAACTTTGGCAGATCTACCATGG-3 '(SEQ ID NO: 35)
下線を付した配列はＰＣＲ用のオーバーラップ配列を示す。Ｆ４において、小文字で示される配列はＹ−タグ配列を示し、これは転写されたｍＲＮＡをピューロマイシン−リンカーにライゲーションさせるための配列である。 Underlined sequences indicate overlapping sequences for PCR. In F4, the sequence shown in lower case indicates the Y-tag sequence, which is a sequence for ligating the transcribed mRNA to the puromycin-linker.
ライブラリ生成のためにＰＣＲを３工程で行った（図３を参照）：
工程１ 最初の３つのフラグメント（ランダム化配列を含む）のＰＣＲによりＦ１−Ｆ２−Ｆ３を生成する。
工程２ Ｆ１−Ｆ２−Ｆ３とＦ４とのＰＣＲによりＦ１−Ｆ２−Ｆ３−Ｆ４を生成する。
工程３ ＳＰ６−ＵＴＲとＦ１−Ｆ２−Ｆ３−Ｆ４とのＰＣＲにより全長コンストラクトを生成する。
PCR was performed in three steps for library generation (see Figure 3):
Step 1 F1-F2-F3 is generated by PCR of the first three fragments (including randomized sequences).
Step 2 F1-F2-F3-F4 is generated by PCR with F1-F2-F3 and F4.
Step 3 A full-length construct is generated by PCR with SP6-UTR and F1-F2-F3-F4.
ＰＣＲは、２５ユニットのＫＯＤポリメラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ、Ｊａｐａｎ）および１００ｐｍｏｌｅの各フラグメントを用いて製造元から供給されたバッファ中で行った。９４℃を１５秒間、６４℃を１０秒間および７４℃を３０秒間を２５サイクル行い、生成物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析し、全長コンストラクト（ＳＰ６−ＵＴＲ）−Ｆ１−Ｆ２−Ｆ３−Ｆ４（約３７０塩基対）を含む対応するバンドを切り出した。標準的な方法によりＤＮＡを抽出し、分光高度計で２６０ｎｍで測定した。１００ピコモルの各フラグメントから出発して、出発物質からの最終収率２４％が得られた。 PCR was performed in the buffer supplied by the manufacturer with 25 units of KOD polymerase (Toyobo, Japan) and 100 pmole of each fragment. 25 cycles of 94 ° C. for 15 seconds, 64 ° C. for 10 seconds and 74 ° C. for 30 seconds are analyzed by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), and the full length construct (SP6-UTR) -F1-F2- The corresponding band containing F3-F4 (about 370 base pairs) was excised. DNA was extracted by standard methods and measured with a spectrophotometer at 260 nm. Starting from 100 pmoles of each fragment, a final yield of 24% from the starting material was obtained.
配列決定による初期ライブラリの質の評価：
次に、上述で得られた全長コンストラクトを直接配列決定してループ領域のランダム化の程度を評価した。図４に示されるように、ランダム化ヌクレオチド（ループに対応）は、非ランダム化ピークと比較して短いピークを有していた。ランダム化部分における短いピークは、種々のヌクレオチドが種々のＤＮＡコピーの同じ位置に存在するための不適切なシグナルによるものであり、一方非ランダム化部分においてはＤＮＡのすべてのコピーに単一のヌクレオチドが存在して、鋭い明確なピークを与える。このことは、コンストラクト中にランダム化部分が首尾良く挿入されたことを示す。
Assessment of initial library quality by sequencing:
Next, the full length construct obtained above was directly sequenced to evaluate the degree of randomization of the loop region. As shown in FIG. 4, the randomized nucleotide (corresponding to the loop) had a short peak compared to the non-randomized peak. The short peak in the randomized portion is due to an improper signal because different nucleotides are present at the same position in different DNA copies, while in the nonrandomized portion a single nucleotide is present in all copies of DNA. Present and give a sharp clear peak. This indicates that the randomized portion has been successfully inserted into the construct.
さらに、ライブラリをクローニングして、２０個の単一コロニーを無作為に取り出し、配列決定した。２０個のクローンのすべてにおいて、ランダム化ヌクレオチドは異なっており、ライブラリが適切な多様性からなることが確認された。ヌクレオチドの組成についても、ＳについてはＣまたはＧのいずれか、Ｎについては４つのヌクレオチドのいずれかを含むことが確認された。したがって、上述の方法により作製したライブラリは、多様性および質の点で満足しうるものであった。 In addition, the library was cloned and 20 single colonies were randomly picked and sequenced. In all 20 clones, the randomized nucleotides were different, confirming that the library was of adequate diversity. The nucleotide composition was also confirmed to contain either C or G for S and any of the 4 nucleotides for N. Therefore, the library prepared by the above method was satisfactory in terms of diversity and quality.
ピューロマイシン・ビオチン・リンカーの合成：
ＩＶＶは、リボソーム上の発生しつつあるペプチドと、これをコードするｍＲＮＡとがピューロマイシンを介して結合している複合体である。ＩＶＶを形成するためのピューロマイシン・ビオチン・リンカーの構造を図５に示す。ビオチン・ループの３’末端は、ライゲーションしたｍＲＮＡからの逆転写の際のプライマーとして機能する。ビオチンは、ＩＶＶの精製のために用い、制限酵素部位におけるＤＮＡの切断により、ＩＶＶを回収することができる。
Synthesis of puromycin biotin linker:
IVV is a complex in which a developing peptide on a ribosome is bound to mRNA encoding the peptide via puromycin. The structure of puromycin biotin linker for forming IVV is shown in FIG. The 3 ′ end of the biotin loop functions as a primer for reverse transcription from the ligated mRNA. Biotin can be used to purify IVV, and IVV can be recovered by cleaving DNA at the restriction enzyme site.
ピューロマイシン・ビオチン・リンカーは、ヘテロ二官能性試薬（ＥＭＣＳ）を用いて以下の２つの修飾オリゴヌクレオチドを架橋させることにより合成した。
Puro-F-S：5’-(S)-TC(F)-(Spc18)-(Spc18)-(Spc18)-(Spc18)-CC-(Puro)-3’
ビオチン・ループ：
5’-CCCGGTGCAGCTGTTTCATC(T-B)CGGAAACAGCTGCACCCCCCGCCGCCCCCCG(T)CCT-3’（配列番号３６）
The puromycin biotin linker was synthesized by crosslinking the following two modified oligonucleotides using a heterobifunctional reagent (EMCS).
Puro-FS: 5 '-(S) -TC (F)-(Spc18)-(Spc18)-(Spc18)-(Spc18) -CC- (Puro) -3'
Biotin loop:
5'-CCCGGTGCAGCTGTTTCATC (TB) CGGAAACAGCTGCACCCCCCGCCGCCCCCCG (T) CCT-3 '(SEQ ID NO: 36)
（Ｓ）は５’−チオール−モディフィアーＣ６、（Ｆ）はフルオレセイン−ｄＴ、（Ｐｕｒｏ）はピューロマイシンＣＰＧ、（Ｓｐｃ１８）はスペーサーホスホルアミダイト１８、（Ｔ）はアミノ−モディフィアーＣ６ｄＴ、（Ｔ−Ｂ）はビオチン−ｄＴを表す。すべての修飾ホスホルアミダイト試薬はＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ、ＵＳＡ）から購入した。 (S) is 5'-thiol-modifier C6, (F) is fluorescein-dT, (Puro) is puromycin CPG, (Spc18) is spacer phosphoramidite 18, (T) is amino-modifier C6dT, ( TB) represents biotin-dT. All modified phosphoramidite reagents were purchased from Glen Research (Sterling, VA, USA).
Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓのチオール基の還元反応は室温で６時間行った。反応液は総量１００μｌ中に１０ｎｍｏｌのＰｕｒｏ−Ｆ−Ｓ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、５０ｍＭリン酸バッファ（ｐＨ７）を含む。架橋反応の前に、ＮＡＰ５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により５０ｍＭリン酸バッファ（ｐＨ７）を用いて生成物を精製した。 The reduction reaction of the thiol group of Puro-FS was performed at room temperature for 6 hours. The reaction solution contains 10 nmol of Puro-FS, 1 mM TCEP, 50 mM phosphate buffer (pH 7) in a total volume of 100 μl. Prior to the cross-linking reaction, the product was purified using 50 mM phosphate buffer (pH 7) on a NAP5 column (Amersham).
１０ｎｍｏｌのビオチン・ループおよび２０μｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２μｍｏｌのＥＭＣＳを０．２Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７）に加えて総量１００μｌとした。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、ＮＡＰ５カラムにより１ｍＭリン酸バッファ（ｐＨ７）を用いて精製して、過剰のＥＭＣＳを除去した。ビオチン・ループとＥＭＣＳとのコンジュゲートを含む画分を回収し、沈殿により濃縮した後、スピードバキュームで乾燥した。生成物を１０μｌの０．２Ｍリン酸バッファ（ｐＨ７）に溶解し、上述のように還元したＰｕｒｏ−Ｆ−Ｓを加え、反応混合物を４℃で一晩撹拌することにより、Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓとビオチン・ループとを結合させて、ピューロマイシン・ビオチン・リンカーを得た。この溶液にＴＣＥＰを最終濃度４ｍＭで加え、室温で１５分間インキュベートした。ピューロマイシン・ビオチン・リンカーおよびビオチン・ループをエタノール沈殿により濃縮して、過剰のＰｕｒｏ−Ｆ−Ｓを除去した。さらに、これを０．１Ｍ ＴＥＡＡで平衡化したＣ１８調製用カラム（５ｍｍ内径；２５０ｍｍ長さ；ＡＲ−３００、Ｗａｔｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）に負荷し、８０％アセトニトリル（１５から３５％）の直線勾配で０．５ｍｌ／分間で合計３３分間の溶出を行うことにより、過剰のビオチン・ループを除去した。各画分を変性尿素ＰＡＧＥで分析した。このようにして精製したピューロマイシン・ビオチン・リンカーはスピードバキュームで乾燥し、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水で１０μＭの最終濃度に希釈した。 10 μmol biotin loop and 2 μmol EMCS in 20 μl dimethylformamide (DMF) were added to 0.2 M phosphate buffer (pH 7) to a total volume of 100 μl. The reaction mixture was stirred at room temperature for 30 minutes and purified with 1 mM phosphate buffer (pH 7) on a NAP5 column to remove excess EMCS. The fraction containing the conjugate of biotin loop and EMCS was collected, concentrated by precipitation, and then dried by speed vacuum. The product is dissolved in 10 μl 0.2 M phosphate buffer (pH 7), Puro-FS reduced as described above is added, and the reaction mixture is stirred at 4 ° C. overnight to purify the Puro-FS. And a biotin loop were combined to obtain a puromycin biotin linker. TCEP was added to this solution at a final concentration of 4 mM and incubated at room temperature for 15 minutes. Puromycin biotin linker and biotin loop were concentrated by ethanol precipitation to remove excess Puro-FS. This was further loaded onto a C18 preparation column (5 mm ID; 250 mm length; AR-300, Waters, MA, USA) equilibrated with 0.1 M TEAA and a linear gradient of 80% acetonitrile (15 to 35%). Excess biotin loop was removed by elution at 0.5 ml / min for a total of 33 minutes. Each fraction was analyzed by denaturing urea PAGE. The puromycin biotin linker purified in this way was dried with speed vacuum and diluted to a final concentration of 10 μM with diethylpyrocarbonate (DEPC) -treated water.
ライブラリＤＮＡの転写：
ランダム化ＣＴｘ３遺伝子の全長コンストラクトＤＮＡを９４℃に加熱し、ゆっくり冷却することによりアニーリングさせて、適切に塩基対形成した二本鎖ＤＮＡを形成した。テンプレートＤＮＡを、Ｒｉｂｏ ＭＡＸ大量合成システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）を用いて、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼにより転写させて、ｍＲＮＡを生成した。ＤＮａｓｅＩを加えることにより反応を停止させ、フェノール／クロロホルム法により精製した。ＲＮＡ濃度は分光光度計により２６０ｎｍで測定した。
Transcription of library DNA:
Randomized CTx3 gene full-length construct DNA was annealed by heating to 94 ° C. and slowly cooling to form properly base-paired double-stranded DNA. Template DNA was transcribed with SP6 RNA polymerase using a Ribo MAX mass synthesis system (Promega, Madison, USA) to generate mRNA. The reaction was stopped by adding DNase I and purified by the phenol / chloroform method. RNA concentration was measured at 260 nm with a spectrophotometer.
ピューロマイシン−リンカーのｍＲＮＡへのライゲーション：
ｍＲＮＡのＹタグ配列をリンカーにアニーリングさせ、ライゲーション部位でＴ４ ＲＮＡリガーゼによりライゲーションさせて、ｍＲＮＡとピューロマイシン・ビオチン・リンカーとを結合させた。ｍＲＮＡは、１ｘリガーゼバッファ（Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）中で９４℃に加熱し、ゆっくり冷却することにより、Ｙ−タグ配列を介してピューロマイシン・ビオチン・リンカー（１：１比）とアニーリングさせた。Ｔ４キナーゼおよびＴ４ＲＮＡリガーゼ（Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）を加え、２５℃で１時間反応させることにより、ｍＲＮＡとピューロマイシン・ビオチン・リンカーとをライゲーションさせた（図５Ｂ）。生成したｍＲＮＡ−ピューロマイシン・ビオチン・リンカーは、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ライゲーション効率および生成物の純度はポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した。
Ligation of puromycin-linker to mRNA:
The Y tag sequence of mRNA was annealed to the linker, and ligated with T4 RNA ligase at the ligation site to bind the mRNA to the puromycin biotin linker. The mRNA was annealed with puromycin biotin linker (1: 1 ratio) via Y-tag sequence by heating to 94 ° C. in 1 × ligase buffer (Takara, Japan) and cooling slowly. T4 kinase and T4 RNA ligase (Takara, Japan) were added and reacted at 25 ° C. for 1 hour to ligate mRNA and puromycin biotin linker (FIG. 5B). The resulting mRNA-puromycin biotin linker was purified using the RNeasy kit (Qiagen). Ligation efficiency and product purity were confirmed by polyacrylamide gel electrophoresis.
インビトロウイルス形成：
ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・ビオチン・リンカーを、Ｒｅｃｔｉｃ Ｌｙｓａｔｅ ＩＶＴ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）を用いて３０℃で１０分間翻訳させた。翻訳後、６５ｍＭ ＭｇＣｌ２および７５０ｍＭ ＫＣｌの存在下で３７℃で２時間インキュベートすることにより、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・ビオチン・リンカー−蛋白質の複合体を形成させた。この複合体をビオチン−ストレプトアビジン相互作用を利用して精製し、続いてＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）反応により、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを形成した。次に、ＤＮＡ／ｍＲＮＡ−ピューロマイシン・ビオチン・リンカー−蛋白質を制限酵素ＰｖｕＩＩで消化することにより、ビオチン−ストレプトアビジン複合体から切断した。得られたＤＮＡ／ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−蛋白質を、Ｃ−末端Ｈｉｓ６−タグを利用してＮｉ−ＮＴＡ磁気ビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、Ｂｅａｃｏｎ２０００（Ｐａｎｖｅｒａ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）により定量した。以上のようにして、３Ｆ−ＩＶＶライブラリを形成した。推計サイズ１×１０１１の分子が得られ、これを以後の実験においてＩＬ−６Ｒ結合蛋白質の選択の出発物質として用いた。
In vitro virus formation:
The mRNA-puromycin biotin linker was translated for 10 minutes at 30 ° C. using a Rectic Lysate IVT Kit (Ambion, Texas, USA). After translation, mRNA-puromycin biotin linker-protein complex was formed by incubating at 37 ° C. for 2 hours in the presence of 65 mM MgCl 2 and 750 mM KCl. This complex was purified using biotin-streptavidin interaction, followed by M-MLV reverse transcriptase (Takara, Japan) reaction to form a DNA / RNA hybrid. The DNA / mRNA-puromycin biotin linker-protein was then cleaved from the biotin-streptavidin complex by digestion with the restriction enzyme PvuII. The resulting DNA / mRNA-puromycin-protein was purified with Ni-NTA magnetic beads (Qiagen) using the C-terminal His6-tag and quantified with Beacon 2000 (Panvera, Wisconsin, USA). A 3F-IVV library was formed as described above. Molecules with an estimated size of 1 × 10 11 were obtained and used as starting material for the selection of IL-6R binding protein in subsequent experiments.
ライブラリの質の評価：
初代３Ｆ−ＩＶＶライブラリのアフィニティーを固定化ＩＬ−６ＲおよびＣＴｘ３の天然のリガンドであるＡＣｈＢＰに対する結合アッセイにより調べて、ライブラリの質を評価した。等量の３Ｆ−ＩＶＶライブラリを２５０ｎＭの固定化ＩＬ−６ＲまたはＡＣｈＢＰとともにＰＢＳ中で室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで数回洗浄した後、結合した物質を溶出し、ＰＣＲ増幅し、ゲル電気泳動により分析した。ＰＣＲプライマーの配列は以下のとおりである：
PCR-フォワード： 5’-GAAGCTCAGAATAAACGCTCAACTTTGGCAGATCT-3’ （配列番号３７）
PCR-リバース： 5’-TTTCCCCGCCGCCCCCCGTCCTGCTTCCGCCGTGATGAT-3’ （配列番号３８）
Library quality assessment:
The affinity of the primary 3F-IVV library was examined by binding assays to immobilized IL-6R and CTx3 natural ligand AChBP to assess library quality. An equal volume of 3F-IVV library was incubated with 250 nM immobilized IL-6R or AChBP in PBS for 30 minutes at room temperature. After washing several times with PBS-T, the bound material was eluted, PCR amplified and analyzed by gel electrophoresis. The sequence of the PCR primers is as follows:
PCR-forward: 5'-GAAGCTCAGAATAAACGCTCAACTTTGGCAGATCT-3 '(SEQ ID NO: 37)
PCR-reverse: 5'-TTTCCCCGCCGCCCCCCGTCCTGCTTCCGCCGTGATGAT-3 '(SEQ ID NO: 38)
３Ｆ−ＩＶＶライブラリの出発量の１／５０および１／２５０の希釈物を用いたＰＣＲ産物も同様にゲル電気泳動して、シグナル強度の比較により、ＩＬ−６に結合した３Ｆ−ＩＶＶライブラリのパーセントを求めた。 PCR products using dilutions of 1/50 and 1/250 of the starting amount of the 3F-IVV library were also gel electrophoresed and the percent of 3F-IVV library bound to IL-6 by signal intensity comparison. Asked.
結果を図６に示す。ライブラリのＩＬ−６ＲおよびＡＣｈＢＰに対する結合は、それぞれ約０．３％および０．２％であることがわかった。このことは、初代３Ｆ−ＩＶＶライブラリの両方のレセプターへの結合は無視しうる程度であることを示す。 The results are shown in FIG. Binding of the library to IL-6R and AChBP was found to be about 0.3% and 0.2%, respectively. This indicates that the binding of the primary 3F-IVV library to both receptors is negligible.
〔実施例２〕
３Ｆ−ＩＶＶライブラリからのＩＬ−６Ｒ結合蛋白質の選択：
上述のようにして構築した３Ｆ−ＩＶＶライブラリを用いて、新規なＩＬ−６Ｒの結合分子および／または阻害分子の発見を試みた。選択圧を順次高くする条件下で、３Ｆ−ＩＶＶライブラリの生成と選択との一連のラウンドを繰り返すことにより、ＩＬ−６Ｒに結合する蛋白質を選択した。
[Example 2]
Selection of IL-6R binding protein from 3F-IVV library:
Using the 3F-IVV library constructed as described above, an attempt was made to discover a novel binding molecule and / or inhibitor of IL-6R. A protein that binds to IL-6R was selected by repeating a series of rounds of generation and selection of the 3F-IVV library under conditions where the selection pressure was sequentially increased.
ＩＬ−６Ｒ（−）誘導化および（ＩＬ−６Ｒ）誘導化セファロースの調製：
ＩＬ−６ＲをアミンカップリングによりＮＨＳ活性化セファロース４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に固定化した。同様にして、ＩＬ−６ＲなしのＩＬ−６Ｒ（−）誘導化セファロース４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗビーズを同時に調製した。カップリング効率は、初期および未結合レセプターの吸光度を２８０ｎｍで測定することにより評価した。
Preparation of IL-6R (−) derivatized and (IL-6R) derivatized Sepharose:
IL-6R was immobilized on NHS activated Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) by amine coupling. Similarly, IL-6R (−) derivatized Sepharose 4 Fast Flow beads without IL-6R were prepared simultaneously. Coupling efficiency was evaluated by measuring the absorbance of the initial and unbound receptor at 280 nm.
ＩＬ−６Ｒ結合蛋白質の選択：
３Ｆ−ＩＶＶライブラリからＩＬ−６Ｒに結合する分子を選択した。選択の各ラウンドは、ＩＬ−６Ｒ（−）誘導化およびＩＬ−６Ｒ誘導化セファロースビーズを用いて、１００ｍＭＮａＣｌおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中でバッチ選択モードで行った。
Selection of IL-6R binding protein:
Molecules that bind to IL-6R were selected from the 3F-IVV library. Each round of selection was performed in batch selection mode in PBS containing 100 mM NaCl and 0.1% Tween-20 using IL-6R (-) derivatized and IL-6R derivatized Sepharose beads.
ＩＬ−６Ｒ結合蛋白質を選択する前に、ライブラリをＩＬ−６Ｒ（−）誘導化セファロースと２時間プレインキュベートすることにより、非特異的セファロース結合蛋白質を除去した。次に、このライブラリをＩＬ−６Ｒセファロースと１時間インキュベートした。インキュベート後、ＩＬ−６Ｒセファロースを同じバッファで数回洗浄し、５０ｍＭＤＴＴ（ジチオスレイトール）を含む同じバッファで溶出した。溶出した生成物をＰＣＲフォワードおよびリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。 Prior to selecting IL-6R binding protein, non-specific Sepharose binding protein was removed by preincubating the library with IL-6R (−) derivatized Sepharose for 2 hours. This library was then incubated with IL-6R Sepharose for 1 hour. After incubation, IL-6R Sepharose was washed several times with the same buffer and eluted with the same buffer containing 50 mM DTT (dithiothreitol). The eluted product was PCR amplified using PCR forward and reverse primers.
増幅産物を精製し、これをテンプレートとして用いて、さらにＳＰ６−ＵＴＲを用いてＰＣＲ増幅した。得られた増幅産物をゲル精製し、上述のようにして転写させ、得られたｍＲＮＡをピューロマイシンリンカーにライゲーションさせ、翻訳させ、逆転写した。得られたＩＶＶを精製し、Ｂｅａｃｏｎ２０００により定量して、次のラウンドで用いた。以降の選択のラウンドにおいては、ＩＬ−６Ｒの濃度を３００ｎＭから３０ｎＭに、インキュベーション時間を１時間から１５分間にそれぞれ徐々に減少させ、洗浄の回数を３から１５に徐々に増加させることにより、選択圧を順次高くした。このようにして１０ラウンドの選択を行った後、溶出したプールをＰＣＲで増幅し、ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）にクローニングした。 The amplification product was purified and used as a template, and further PCR amplified using SP6-UTR. The resulting amplification product was gel purified and transcribed as described above, and the resulting mRNA was ligated to a puromycin linker, translated and reverse transcribed. The resulting IVV was purified and quantified by Beacon 2000 and used in the next round. In subsequent rounds of selection, the IL-6R concentration was selected from 300 nM to 30 nM, the incubation time was gradually decreased from 1 hour to 15 minutes, and the number of washes was gradually increased from 3 to 15 The pressure was gradually increased. After 10 rounds of selection in this way, the eluted pool was amplified by PCR and cloned into a TA cloning vector (Invitrogen, Carlsbad).
３Ｆ−ＩＶＶライブラリからのＩＬ−６Ｒ結合蛋白質の選択の進行をモニターするために、ラウンド５および１０のＤＮＡプールを直接配列決定した。結果を図７に示す。ランダム化部分のピークの長さは選択の進行とともに増加していた。このことは、ＩＬ−６Ｒ結合蛋白質の選択にしたがってライブラリの多様性が低下したことを示す。 To monitor the progress of selection of IL-6R binding proteins from the 3F-IVV library, the round 5 and 10 DNA pools were directly sequenced. The results are shown in FIG. The length of the randomized peak increased with the progress of selection. This indicates that the diversity of the library decreased according to the selection of IL-6R binding protein.
ＩＬ−６Ｒ結合蛋白質の評価：
ラウンド１０のＩＶＶプール（Ｒ１０プール）のＩＬ−６Ｒに対する結合能力および特異性を評価するために、種々の条件下で結合分析を行った。結果を図８に示す。図中、１／５０は出発量の５０倍希釈を示し、１／２５０は２５０倍希釈を示し、１／１は希釈なしを示す。Ｒ１０プールは、非誘導化セファロース（ダミービーズ）について無視しうるアフィニティー（〜０．２％）を示したが、ＩＬ−６Ｒセファロースには有意に結合した（〜２％）。このことは、このプールがＲ１０プールとＩＬ−６Ｒとの間のアフィニティーにより濃縮されたことを示す（図８−１、２）。
Evaluation of IL-6R binding protein:
To evaluate the binding ability and specificity of the round 10 IVV pool (R10 pool) to IL-6R, binding analysis was performed under various conditions. The results are shown in FIG. In the figure, 1/50 indicates a 50-fold dilution of the starting amount, 1/250 indicates a 250-fold dilution, and 1/1 indicates no dilution. The R10 pool showed negligible affinity (˜0.2%) for non-derivatized Sepharose (dummy beads) but significantly bound to IL-6R sepharose (˜2%). This indicates that this pool was enriched by the affinity between the R10 pool and IL-6R (FIGS. 8-1 and 2).
ＩＬ−６Ｒとのアフィニティーが蛋白質部分とＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッド部分とのいずれで生じているかを確認するために、Ｒ１０プールをプロテイナーゼＫで消化して蛋白質部分を除去した。この条件下では、プールは無視しうる程度（〜０．２％）にしかＩＬ−６Ｒセファロースに結合しなかった（図８−３）。このことは、Ｒ１０プールが蛋白質−ＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッドではなく蛋白質−蛋白質相互作用を介してＩＬ−６Ｒに結合したことを示す。 In order to confirm whether the affinity with IL-6R was generated in the protein portion or the DNA / mRNA hybrid portion, the R10 pool was digested with proteinase K to remove the protein portion. Under these conditions, the pool bound to IL-6R Sepharose only to a negligible extent (˜0.2%) (FIG. 8-3). This indicates that the R10 pool bound to IL-6R through a protein-protein interaction rather than a protein-DNA / mRNA hybrid.
さらに、８倍過剰の可溶性ＩＬ−６Ｒを加えて、２５０ｎＭのＩＬ−６Ｒセファロースとの間の競合実験を行った。溶出物は無視しうる量（〜０．２％）のＩＶＶを含んでおり、ＩＬ−６ＲセファロースがＲ１０プールに対して可溶性ＩＬ−６Ｒと競合したことが確認された（図８−４）。以上のことから、Ｒ１０プールはＩＬ−６Ｒに結合し、この結合はＩＶＶの蛋白質部分を介して生じていることが示された。 In addition, competition experiments with 250 nM IL-6R Sepharose were performed with an 8 fold excess of soluble IL-6R. The eluate contained negligible amounts (˜0.2%) of IVV, confirming that IL-6R Sepharose competed with soluble IL-6R for the R10 pool (FIGS. 8-4). From the above, it was shown that the R10 pool binds to IL-6R, and this binding occurs via the protein portion of IVV.
ＩＬ−６Ｒ結合蛋白質の配列の確認：
Ｒ１０プールをクローン化し、無作為に選択した２０個のクローンの一次配列を決定してアライメントにより分析した。３つのループ配列は異なるが、残りの配列はほぼ同一であった。Ｒはラウンドを示し、１０は１０番目のラウンドを示し、続く数字はクローン番号を示す。配列の分析により、プールはループ配列の類似性に基づいて５つのグループに分けることができた（図９）。ほぼ同一の配列を含むクローンの組をグループＩとしてグループ化し、これは配列決定されたクローンの７０％を占めた。グループＩＩおよびＩＩＩがこれに続き、それぞれ約１０％を含み、グループＩＶおよびＶはそれぞれ約５％を含んでいた。非ランダム化配列は数個の変異を除いてほとんど変化していなかった。わずかの変異の存在は、おそらくはライブラリが６５０サイクルのＰＣＲに供されたためにポリメラーゼのプルーフリーディングに失敗があったためであろう。
Confirmation of the sequence of IL-6R binding protein:
The R10 pool was cloned and the primary sequence of 20 randomly selected clones was determined and analyzed by alignment. The three loop sequences were different, but the remaining sequences were nearly identical. R represents a round, 10 represents the 10th round, and the following number represents the clone number. By sequence analysis, the pools could be divided into 5 groups based on the similarity of the loop sequences (FIG. 9). A set of clones containing nearly identical sequences were grouped as Group I, accounting for 70% of the sequenced clones. Groups II and III were followed by about 10% each, and groups IV and V each contained about 5%. Non-randomized sequences remained almost unchanged except for a few mutations. The presence of slight mutations was probably due to a failure in polymerase proofreading because the library was subjected to 650 cycles of PCR.
蛋白質の調製：
得られたＩＬ−６Ｒ結合蛋白質についてさらに詳細に調べるために、クローンＲ15-L1から蛋白質を調製した。蛋白質は、ｐＢＡＤ／ＴＯＰＯＴｈｉｏ融合発現キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）を用いてチオレドキシン融合蛋白質として調製した。また、対照実験において用いるためにチオレドキシンも調製した。プールのクローン化ＤＮＡをＰＣＲ増幅し（Ｃ−末端Ｈｉｓ６−タグをコード）、ｐＢＡＤ／ＴＯＰＯＴｈｉｏ融合発現ベクター中にクローニングし、大腸菌をトランスフォームした。配列決定によりフレームの確認を行った。
Protein preparation:
In order to investigate the obtained IL-6R binding protein in more detail, a protein was prepared from clone R15-L1. The protein was prepared as a thioredoxin fusion protein using the pBAD / TOPOthio fusion expression kit (Invitrogen, Carlsbad). Thioredoxin was also prepared for use in control experiments. Pooled cloned DNA was PCR amplified (encoding C-terminal His6-tag) and cloned into pBAD / TOPOthio fusion expression vector to transform E. coli. The frame was confirmed by sequencing.
ポジティブクローンを５０μｇ／ｍｌのアンピリシンを含むＬＢ培地で１６時間前培養した。少量の前培養物を新たなＬＢ−アンピリシン培地に移し、ＯＤ６００が０．５に達するまで増殖させた。培養物を０．０２％アラビノースで３７℃で４時間誘導した。３０００ｒｐｍで２０分間で細胞を回収し、１μｇ／ｍｌＤＮａｓｅ、１μｇ／ｍｌＲＮａｓｅおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）の存在下でＢｕｇｂｕｓｔｅｒ蛋白質抽出試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）で溶解した。短時間インキュベーションした後、溶解物を遠心分離し、上清（可溶性画分）およびペレット（不溶性画分）に分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。可溶性画分は発現したペプチドのＨｉｓ６−タグについてＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）アフィニティーで非変性条件下でほぼ均一にまで精製した。不溶性画分は精製してインクルージョンボディーとし、５０ｍＭＣＡＰＳ、ｐＨ１１．０、０．３％Ｎ−ラウロイルサルコシン（Ｎｏｖａｇｅｎ）および０．１％β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を含むバッファに溶解し、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティーカラムで変性条件下でほぼ均一にまで精製した。精製後、変性した蛋白質を酸化還元条件下で再フォールディングさせた。蛋白質は、抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａ．．ＨｉｓＨＲＰ、Ｑｉａｇｅｎ）によりＨｉｓ６−タグについてのウエスタンブロッティングにより確認した。蛋白質濃度は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準物質としてＢｉｏ−ｒａｄ蛋白質アッセイキット（Ｂｉｏ−ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳＡ）により、およびＢＳＡ等の既知の蛋白質の濃度を標準としてＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の蛋白質バンドのデンシトメトリにより測定した。 Positive clones were pre-cultured for 16 hours in LB medium containing 50 μg / ml ampicillin. A small amount of preculture was transferred to fresh LB-ampylicin medium and grown until OD 600 reached 0.5. Cultures were induced with 0.02% arabinose for 4 hours at 37 ° C. Cells were harvested at 3000 rpm for 20 minutes and lysed with Bugbuster protein extraction reagent (Novagen) in the presence of 1 μg / ml DNase, 1 μg / ml RNase and protease inhibitor cocktail (Sigma). After a brief incubation, the lysate was centrifuged and separated into a supernatant (soluble fraction) and a pellet (insoluble fraction) and analyzed by SDS-PAGE. The soluble fraction was purified to near homogeneity under non-denaturing conditions with Ni-NTA (Qiagen) affinity for the His6-tag of the expressed peptide. The insoluble fraction was purified to an inclusion body, dissolved in a buffer containing 50 mM CAPS, pH 11.0, 0.3% N-lauroyl sarcosine (Novagen) and 0.1% β-mercaptoethanol (Sigma), and Ni-NTA Purification to near homogeneity under denaturing conditions on an affinity column. After purification, the denatured protein was refolded under redox conditions. The protein was confirmed by Western blotting for the His6-tag with an anti-His antibody (Penta. HisHRP, Qiagen). The protein concentration is determined by the protein band on SDS-PAGE using Bio-rad protein assay kit (Bio-rad, Hercules, USA) with bovine serum albumin (BSA) as a standard substance and the concentration of a known protein such as BSA as a standard. It was measured by densitometry.
直接結合アッセイ：
精製した蛋白質を７、７０および７００ｎＭの濃度で、１ｘＰＢＳ中で１μＭビオチン化ＩＬ−６Ｒとともに室温で１時間インキュベートした。ストレプトアビジン磁気ビーズを混合物に加え、さらに１５分間インキュベートした。ビーズをＰＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ０．１％）で数回洗浄し、溶出し、抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａ．．ＨｉｓＨＲＰ、Ｑｉａｇｅｎ）およびＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、ウエスタンブロッティングによりペプチドのＨｉｓ６−タグについて分析した。バックグラウンドをモニターするために、蛋白質のＳＡビーズに対するアフィニティーも測定した。
Direct binding assay:
Purified protein was incubated for 1 hour at room temperature with 1 μM biotinylated IL-6R in 1 × PBS at concentrations of 7, 70 and 700 nM. Streptavidin magnetic beads were added to the mixture and incubated for an additional 15 minutes. Beads were washed several times with PBS-T (Tween 0.1%), eluted, by Western blotting using anti-His antibody (Penta..HisHRP, Qiagen) and ECL detection system (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden). The peptide was analyzed for the His6-tag. To monitor background, the affinity of the protein for SA beads was also measured.
ペプチドＲ15-L1のＩＬ−６Ｒに対する結合は、１０倍増加濃度の蛋白質および一定量の１μＭのＩＬ−６Ｒで試験した。ペプチドは濃度依存的様式でＩＬ−６Ｒに結合することが明らかになった（図１０）。最も高い濃度のペプチド（７００ｎＭ）で無視しうる程度のバックグラウンドが観察された。 The binding of peptide R15-L1 to IL-6R was tested with a 10-fold increasing concentration of protein and a fixed amount of 1 μM IL-6R. It was revealed that the peptide binds to IL-6R in a concentration dependent manner (FIG. 10). Negligible background was observed at the highest concentration of peptide (700 nM).
間接的結合アッセイ：
融合ペプチドの結合アフィニティー（Ｋｄ）は、Ｆｒｉｇｕｅｔら（Friguet、 B.、 Chaffotte、 A. F.、 Djavadi-Ohaniance、 L. and Goldberg M. E. (1985)、 J. Immunol. Methods.、 77、 305-319)に記載の方法にしたがい、いくつかの改変を加えて測定した。ＰＢＳ中の一定量のペプチド（５０ｎＭ）を種々の量のＩＬ−６Ｒ（１ｎＭ−１μＭ）とともに、平衡に達するまでインキュベートした。また、チオレドキシンもアッセイしてバックグラウンドをモニターした。混合物を一定量の固定化ＩＬ−６Ｒ（２００ｎＭ）に加え、さらに３０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで数回洗浄した後、固定化ＩＬ−６Ｒに結合したペプチド（すなわち、可溶性ＩＬ−６Ｒに結合しない）を溶出し、抗Ｈｉｓ抗体（Ｐｅｎｔａ．．ＨｉｓＨＲＰ、Ｑｉａｇｅｎ）およびＢｉｏ−ｒａｄ Ｃｈｅｍｉｃｄｏｃ（Ｂｉｏ−ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳＡ）のＥＣＬ検出システムを用いて、ウエスタンブロッティングによりペプチドのＨｉｓ６−タグについて分析した。シグナルはデンシトメトリによりＢｉｏ−ｒａｄ Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅソフトウエアを用いて定量した。結果を図１２に示す。検出シグナルは、可溶性レセプター濃度の増加にともなって減少し、このことは、ペプチドの可溶性レセプターへの結合は濃度依存的であることを示す。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＵＳＡ）を用いてシグナル強度（Ｙ−軸）を可溶性ＩＬ−６Ｒ濃度（Ｘ−軸）に対してプロットし、非線形回帰曲線への当てはめにより解離定数を計算した。その結果、Ｒ15-L1について解離定数１１５ｎＭを得た。この範囲の解離定数での相互作用は非常に強く、イムノグロブリンに匹敵する。このことは、本発明にしたがう３Ｆ−ＩＶＶライブラリから未知の高分子標的に対して強く結合する分子を取得することが可能であることを実証する。
Indirect binding assay:
The binding affinity (Kd) of the fusion peptide is described in Friguet et al. (Friguet, B., Chaffotte, AF, Djavadi-Ohaniance, L. and Goldberg ME (1985), J. Immunol. Methods., 77, 305-319). According to the above method, measurement was performed with some modifications. A constant amount of peptide (50 nM) in PBS was incubated with various amounts of IL-6R (1 nM-1 μM) until equilibrium was reached. Thioredoxin was also assayed to monitor background. The mixture was added to a fixed amount of immobilized IL-6R (200 nM) and incubated for an additional 30 minutes. After several washes with PBS-T, the peptide bound to immobilized IL-6R (ie, not bound to soluble IL-6R) was eluted, anti-His antibody (Penta..HisHRP, Qiagen) and Bio-rad Chemicaldoc The peptides were analyzed for His6-tag by Western blotting using the ECL detection system of (Bio-rad, Hercules, USA). The signal was quantified by densitometry using the Bio-rad Quantity One software. The results are shown in FIG. The detection signal decreases with increasing soluble receptor concentration, indicating that the binding of the peptide to the soluble receptor is concentration dependent. Signal intensity (Y-axis) was plotted against soluble IL-6R concentration (X-axis) using Graph Pad Prism 4 (GraphPad software Inc., San Diego, USA), and dissociation constant by fitting to a non-linear regression curve. Was calculated. As a result, a dissociation constant of 115 nM was obtained for R15-L1. Interactions with dissociation constants in this range are very strong and comparable to immunoglobulins. This demonstrates that it is possible to obtain molecules that bind strongly to unknown macromolecular targets from a 3F-IVV library according to the present invention.
阻害アッセイ：
競合阻害実験によりペプチドＲ15-L1によるＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの相互作用の阻害をアッセイした。一定量のビオチン化ＩＬ−６（４５ｎＭ）および種々の量のペプチド（１ｎＭ−２μＭ）を一定量の固定化ＩＬ−６Ｒ（３５０ｎＭ）とともにインキュベーションして、ＩＬ−６Ｒについて競合させた。ＩＬ−６の濃度は、予め間接結合法により決定したＩＬ−６Ｒの解離定数（２０ｎＭ）の約２倍高い４５ｎＭと設定した。数回の洗浄の後、生成物を溶出してビオチン化ＩＬ−６（阻害分析用）およびＨｉｓ６−タグペプチド（結合分析用）について、ウエスタンブロッティングおよびＥＣＬ検出システムにより分析した。グラフは上述のようにしてプロットした。
Inhibition assay:
Inhibition of the interaction between IL-6 and IL-6R by peptide R15-L1 was assayed by competitive inhibition experiments. A fixed amount of biotinylated IL-6 (45 nM) and various amounts of peptide (1 nM-2 μM) were incubated with a fixed amount of immobilized IL-6R (350 nM) to compete for IL-6R. The concentration of IL-6 was set to 45 nM, which is about twice as high as the dissociation constant (20 nM) of IL-6R determined in advance by the indirect binding method. After several washes, the product was eluted and analyzed for biotinylated IL-6 (for inhibition analysis) and His6-tag peptide (for binding analysis) by Western blotting and ECL detection system. The graph was plotted as described above.
結果を図１１に示す。Ｒ15-L1は濃度（用量）依存的に相互作用を阻害した。同様の条件下では、チオレドキシンは結合せず、（ＩＬ−６）−（ＩＬ−６Ｒ）相互作用を阻害しなかった。さらに、阻害は競合するペプチドのＩＬ−６Ｒへの結合により生じたことが確認された（図１１Ａ２）。シグナル強度対ペプチドの濃度のプロットから、ＩＣ５０を計算したところ、１０２ｎＭの値が得られた（図１１Ｂ）。 The results are shown in FIG. R15-L1 inhibited the interaction in a concentration (dose) dependent manner. Under similar conditions, thioredoxin did not bind and did not inhibit the (IL-6)-(IL-6R) interaction. Furthermore, it was confirmed that the inhibition was caused by binding of the competing peptide to IL-6R (FIG. 11A2). From a plot of signal intensity versus peptide concentration, IC50 was calculated and a value of 10 2 nM was obtained (FIG. 11B).
特異性アッセイ：
１００ｎＭのペプチドＲ15-L1を１μＭの種々の可溶性蛋白質（ＩＬ−６Ｒ、ＡＣｈＢＰおよびＩｇＧ）とともに室温で１時間インキュベーションした。混合物をさらに３００ｎＭのＩＬ−６Ｒセファロースとともに１時間インキュベーションして、未結合蛋白質を捕捉した。よく洗浄した後に溶出し、ウエスタンブロッティングによりペプチドのＨｉｓ６−タグについて分析した。結果を図１２に示す。ＩＬ−６Ｒのレーンは弱いバンドを含むが、ＡＣｈＢＰおよびＩｇＧは強いバンドを含み、このことは、Ｒ15-L1がＩＬ−６Ｒに特異的に結合するがＡＣｈＢＰおよびＩｇＧには結合しないことを示す。
Specificity assay:
100 nM peptide R15-L1 was incubated with 1 μM of various soluble proteins (IL-6R, AChBP and IgG) for 1 hour at room temperature. The mixture was further incubated with 300 nM IL-6R Sepharose for 1 hour to capture unbound protein. After eluting after washing well, the peptide was analyzed for His6-tag by Western blotting. The results are shown in FIG. The lane for IL-6R contains a weak band, whereas AChBP and IgG contain a strong band, indicating that R15-L1 specifically binds IL-6R but not AChBP and IgG.
〔実施例３〕
スリーフィンガー（３−F）からシングルフィンガー（１−F）への改変
３−Fの４つのS-S結合を形成するシステイン残基のうち、N末端側から2番目のシステイン残基をグリシンに変えてさらに（図１３）のように１つのループをもつペプチドに分断しこれをペプチド合成した。ペプチド合成はIL-6Rに結合する2種類の３−Fを選んだ。今回はアゴニスト効果をもつ「１０−１４」という３−Fからデザインした10-14-L１（配列：LVCYAPLP YTPGTLETGPDDFTCV／配列番号３９）とアンタゴニスト効果をもつ３−F「15-L1」からデザインした10-15−L１（配列：LVCYQLLAGRPGTLETGPDDFTCV／配列番号４０）をジーンワールド社（日本）に依頼して化学合成を行った。
Example 3
Modification from three finger (3-F) to single finger (1-F) Among the cysteine residues forming the four SS bonds of 3-F, the second cysteine residue from the N-terminal side is changed to glycine Further, as shown in FIG. 13, the peptide was divided into peptides having one loop, and this was synthesized. For peptide synthesis, two types of 3-F binding to IL-6R were selected. This time, 10-14-L1 (sequence: LVCYAPLP YTPGTLETGPDDFTCV / SEQ ID NO: 39) designed from 3-F called “10-14” with agonistic effect and 3-F “15-L1” designed with antagonistic effect10 -15-L1 (sequence: LVCYQLLAGRPGTLETGPDDFTCV / SEQ ID NO: 40) was commissioned to Gene World (Japan) for chemical synthesis.
細胞アッセイ
まず最初に細胞アッセイは、アメリカＡＴＣＣ（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）よりＤＳ−１細胞を購入し以下のようにＩＬ−６依存増殖アッセイを行った。
Cell Assay First, as a cell assay, DS-1 cells were purchased from US ATCC (The American Type Culture Collection), and an IL-6-dependent proliferation assay was performed as follows.
細胞培養条件は、
・培地：ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ペニシリン、カナマイシン
・継代用培地としては上記にＩＬ−６を１０Ｕ／ｍｌとなるよう添加した。
・培養は３７℃、５％ＣＯ２にて行った。
２．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ にて２４ｗｅｌｌ プレートにＤＳ−１細胞をまき、２４時間培養した後、（３７℃、５％ＣＯ２）以下のようにＩＬ−６を添加し刺激を行った。
ＩＬ−６（Ｕ／ｍｌ）０、０．３１２、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０
それぞれの濃度に対して３つのｗｅｌｌを用いて培養し、刺激後３６時間後および４２時間後に細胞数を計数した。
細胞数（３ｗｅｌｌの平均）を縦軸に、ＩＬ−６の濃度を横軸に取り、グラフを作成した。（図１４）
この実験から、ＤＳ−１細胞のＩＬ−６容量依存的な増殖が確認された。
Cell culture conditions are
-Medium: RPMI 1640, 10% FBS, 10 mM HEPES, penicillin, kanamycin-As a subculture medium, IL-6 was added to the above to 10 U / ml.
-Cultivation was performed at 37 ° C. and 5% CO 2 .
DS-1 cells were seeded on a 24-well plate at 2.0 × 10 4 cells / well, cultured for 24 hours, and then stimulated by adding IL-6 as follows (37 ° C., 5% CO 2 ). .
IL-6 (U / ml) 0, 0.312, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10
The cells were cultured using 3 wells for each concentration, and the number of cells was counted 36 hours and 42 hours after stimulation.
A graph was prepared by taking the number of cells (average of 3 wells) on the vertical axis and the concentration of IL-6 on the horizontal axis. (Fig. 14)
From this experiment, IL-6 volume-dependent proliferation of DS-1 cells was confirmed.
次に、ＩＬ−６の代わりに「１０−１４」、「１０−１４−Ｌ１」を以下のような最終濃度になるように添加して同様の実験を行ったものがそれぞれ図１５、１６である。
濃度（単位はＭ／ｌ）はいずれも、
１０−１１、１０−１０、１０−９、１０−８、１０−７、１０−６
である。
この結果、「１０−１４」、「１０−１４−Ｌ１」はいずれもアゴニスト効果を有し、しかも、その効果が変わらないことがわかった。
Next, “10-14” and “10-14-L1” instead of IL-6 were added so as to have the following final concentrations, and the same experiment was performed as shown in FIGS. is there.
Concentration (unit is M / l)
10 −11 , 10 −10 , 10 −9 , 10 −8 , 10 −7 , 10 −6
It is.
As a result, it was found that both “10-14” and “10-14-L1” have an agonistic effect, and the effect does not change.
次に「１５−Ｌ１」に関するアンタゴニスト効果は以下のように行った。ポシティブコントロールとしてＡｎｔｉ−ＩＬ−６Ｒモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ＩＬ−６ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｈｕｍａｎ、Ｇｏａｔ−ｐｏｌｙ； Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ：型番ＡＦ−２２７−ＮＡ）を用いた。 Next, the antagonistic effect on “15-L1” was performed as follows. Anti-IL-6R monoclonal antibody (Anti-IL-6 receptor, Human, Goat-poly; R & D systems: Model number AF-227-NA) was used as a positive control.
２．２×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ にて２４ｗｅｌｌプレートにＤＳ−１細胞をまき、２４時間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）後、ＩＬ−６（１０Ｕ／ｍｌ）とＡｎｔｉ−ＩＬ−６Ｒモノクローナル抗体、１５−Ｌ１を以下の容量で同時に添加し刺激を行った。 DS-1 cells are seeded on a 24-well plate at 2.2 × 10 4 cells / well, incubated for 24 hours (37 ° C., 5% CO 2 ), then IL-6 (10 U / ml) and Anti-IL-6R monoclonal Stimulation was performed by simultaneously adding the antibody, 15-L1, in the following volume.
Ａｎｔｉ−ＩＬ−６Ｒモノクローナル抗体（Ｕ／ｍｌ）０、０．０３、０．０６、０．１３、０．２５、０．５、１、２
１０−１５−Ｌ１（Ｍ） ０、１０−１１、１０−１０、１０−９、１０−８、１０−７、１０−６
Anti-IL-6R monoclonal antibody (U / ml) 0, 0.03, 0.06, 0.13, 0.25, 0.5, 1, 2
10-15-L1 (M) 0, 10-11 , 10-10 , 10-9 , 10-8 , 10-7 , 10-6
それぞれの濃度に対して３つのｗｅｌｌを用いて培養し、刺激後３６時間後および４２時間後に細胞数をカウントした。カウントした細胞数（３ｗｅｌｌの平均）を縦軸に、Ａｎｔｉ−ＩＬ−６Ｒモノクローナル抗体、１０−１５−Ｌ１の濃度を横軸に取り、グラフを作成した（平均±標準誤差）。［今回は４２時間培養の結果を示す。］（図１７、１８） Culture was performed using three wells for each concentration, and the number of cells was counted 36 hours and 42 hours after stimulation. The number of cells counted (average of 3 wells) was plotted on the vertical axis, and the concentrations of Anti-IL-6R monoclonal antibody and 10-15-L1 were plotted on the horizontal axis, and a graph was prepared (mean ± standard error). [This time shows the results of 42 hours culture. ] (FIGS. 17 and 18)
この実験から、１０−１５−Ｌ１がＩＬ−６（１０Ｕ／ｍｌ）存在下でＡｎｔｉ−ＩＬ−６Ｒモノクローナル抗体と同様にＤＳ−１細胞の増殖を抑えることが確認できた。つまり、アンタゴニスト効果があることを確認した。 From this experiment, it was confirmed that 10-15-L1 suppressed the proliferation of DS-1 cells in the presence of IL-6 (10 U / ml) in the same manner as the Anti-IL-6R monoclonal antibody. That is, it was confirmed that there was an antagonistic effect.
上記の結果から、スリーフィンガーのうちの1本の指の部分のみでスリーフィンガーそのものと同等の効果を有することが示された。 From the above results, it was shown that only one finger portion of the three fingers has the same effect as the three fingers themselves.
Claims (16)
Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域、
のアミノ酸残基がランダム化されていることを特徴とする蛋白質ライブラリ。 A protein library comprising a group of a plurality of proteins having a first loop region on the N-terminal side of a protein having a three-finger-like scaffold,
A region from the second amino acid on the C-terminal side of C1-Cys to the seventh amino acid on the N-terminal side of C2-Cys,
A protein library characterized in that the amino acid residues of are randomized.
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV（配列番号１）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である）
を有する複数の蛋白質の群を含む、請求項１−３のいずれかに記載の蛋白質ライブラリ。 The protein library has the following amino acid sequence:
LVCY (X) 6 PGTLETCPDDFTCV (SEQ ID NO: 1)
(Wherein X is any amino acid residue)
The protein library according to any one of claims 1 to 3, comprising a group of a plurality of proteins having:
（ａ）スリーフィンガー様スキャフォールドを有する蛋白質のＮ末端側１番目のループ領域を有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって、
Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域、
のアミノ酸残基がランダム化されている蛋白質ライブラリを用意し；
（ｂ）前記蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ；
（ｃ）前記標的と結合した蛋白質を選択し；そして
（ｄ）前記選択された蛋白質のアミノ酸配列を決定する、
の各工程を含む方法。 A method for identifying a protein that can bind to a target, comprising:
(A) a protein library comprising a group of a plurality of proteins having a first loop region on the N-terminal side of a protein having a three-finger-like scaffold,
A region from the second amino acid on the C-terminal side of C1-Cys to the seventh amino acid on the N-terminal side of C2-Cys,
A protein library in which amino acid residues are randomized;
(B) contacting the protein library with the target;
(C) selecting a protein bound to the target; and (d) determining the amino acid sequence of the selected protein.
The method including each process of these.
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV（配列番号１）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である）
を有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリである、請求項６−８のいずれかに記載の方法。 The protein library has the following amino acid sequence:
LVCY (X) 6 PGTLETCPDDFTCV (SEQ ID NO: 1)
(Wherein X is any amino acid residue)
The method according to claim 6, which is a protein library including a group of a plurality of proteins having
（ａ）スリーフィンガー様スキャフォールドを有する蛋白質のＮ末端側１番目のループ領域を有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって、
Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域、
のアミノ酸残基がランダム化されている蛋白質ライブラリを用意し、ここで前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており；
（ｂ）前記蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ；
（ｃ）前記標的と結合した蛋白質を選択し；
（ｄ）前記選択された蛋白質をコードするポリヌクレオチドを増幅し、転写し、および翻訳することにより、第２の蛋白質ライブラリを製造し、ここで前記第２の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており；
（ｅ）前記第２の蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ；
（ｆ）前記標的と結合した蛋白質を選択し；
（ｇ）必要により工程（ｄ）−（ｆ）を繰り返し；そして
（ｈ）選択された蛋白質のアミノ酸配列を決定する、
の各工程を含む方法。 A method for identifying a protein that can bind to a target, comprising:
(A) a protein library comprising a group of a plurality of proteins having a first loop region on the N-terminal side of a protein having a three-finger-like scaffold,
A region from the second amino acid on the C-terminal side of C1-Cys to the seventh amino acid on the N-terminal side of C2-Cys,
A protein library in which the amino acid residues are randomized, wherein each protein constituting the protein library is present in a form associated with a polynucleotide encoding the protein;
(B) contacting the protein library with the target;
(C) selecting a protein bound to the target;
(D) Amplifying, transcribing, and translating the polynucleotide encoding the selected protein to produce a second protein library, wherein each protein constituting the second protein library is Present in association with a polynucleotide encoding the protein of
(E) contacting the second protein library with the target;
(F) selecting a protein bound to the target;
(G) repeating steps (d)-(f) if necessary; and (h) determining the amino acid sequence of the selected protein.
The method including each process of these.
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV（配列番号１）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である）
を有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリである、請求項１０または１１に記載の方法。 The protein library has the following amino acid sequence:
LVCY (X) 6 PGTLETCPDDFTCV (SEQ ID NO: 1)
(Wherein X is any amino acid residue)
The method according to claim 10 or 11, which is a protein library comprising a group of a plurality of proteins having
（ａ）スリーフィンガー様スキャフォールドを有する蛋白質のＮ末端側１番目のループ領域を有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリであって、
Ｃ１−ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２−ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域、
のアミノ酸残基がランダム化されている蛋白質ライブラリを用意し、ここで前記蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており；
（ｂ）前記蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ；
（ｃ）前記標的と結合した蛋白質を選択し；
（ｄ）前記選択された蛋白質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を決定し；
（ｅ）決定された塩基配列に基づいて、一部の配列が前記決定された塩基配列と同じであり残りの配列が前記決定された塩基配列と異なる塩基配列を有する複数のポリヌクレオチドの群を調製し、転写し、および翻訳することにより、第２の蛋白質ライブラリを製造し、ここで前記第２の蛋白質ライブラリを構成する各蛋白質はそれぞれの蛋白質をコードするポリヌクレオチドと対応づけられた形で存在しており；
（ｆ）前記第２の蛋白質ライブラリを前記標的と接触させ；
（ｇ）前記標的と結合した蛋白質を選択し；
（ｈ）必要により工程（ｄ）−（ｇ）を繰り返し；そして
（ｉ）選択された蛋白質のアミノ酸配列を決定する、
の各工程を含む方法。 A method for identifying a protein that can bind to a target, comprising:
(A) a protein library comprising a group of a plurality of proteins having a first loop region on the N-terminal side of a protein having a three-finger-like scaffold,
A region from the second amino acid on the C-terminal side of C1-Cys to the seventh amino acid on the N-terminal side of C2-Cys,
A protein library in which the amino acid residues are randomized, wherein each protein constituting the protein library is present in a form associated with a polynucleotide encoding the protein;
(B) contacting the protein library with the target;
(C) selecting a protein bound to the target;
(D) determining a base sequence of a polynucleotide encoding the selected protein;
(E) Based on the determined base sequence, a group of a plurality of polynucleotides, wherein a part of the sequence is the same as the determined base sequence and the remaining sequence has a base sequence different from the determined base sequence. A second protein library is produced by preparing, transcribing and translating, wherein each protein constituting the second protein library is associated with a polynucleotide encoding the respective protein. Exists;
(F) contacting the second protein library with the target;
(G) selecting a protein bound to the target;
(H) repeat steps (d)-(g) if necessary; and (i) determine the amino acid sequence of the selected protein;
The method including each process of these.
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV（配列番号１）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である）
を有する複数の蛋白質の群を含む蛋白質ライブラリである、請求項１３または１４に記載の方法。 The protein library has the following amino acid sequence:
LVCY (X) 6 PGTLETCPDDFTCV (SEQ ID NO: 1)
(Wherein X is any amino acid residue)
15. The method according to claim 13 or 14, which is a protein library comprising a group of a plurality of proteins having:
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV（配列番号１）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である）
を有する蛋白質。 The following amino acid sequence:
LVCY (X) 6 PGTLETCPDDFTCV (SEQ ID NO: 1)
(Wherein X is any amino acid residue)
Having a protein.
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