JP5726917B2 - ポリタグプローブ - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年２月２６日出願の保留中の米国仮特許出願第６１／３０８６７０号に対する優先権を主張し、その内容はその全体がここに参照により援用される。

発明の分野
本発明は、核酸の検出のためのプローブ及びプローブシステム、特に標的核酸プローブの検出配列にハイブリダイズする複数の検出配列及び検出核酸プローブを含み、かつ複数の検出可能な部分、例えばハプテンを更に含む標的核酸プローブを含むプローブ及びプローブシステムを提供する。

発明の背景
分子細胞遺伝学的手法、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、発色インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）銀インサイツハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）は、分子技術による染色体の視覚的評価（核型分析）を分子技術と組み合わせる。分子細胞遺伝学的手法は、細胞内で、核酸プローブのその相補的核酸に対するハイブリダイゼーションに基づいている。特定の染色体領域に対するプローブは、中期染色体上又は間期の核内で（例えば組織サンプル内）、その相補配列を認識してハイブリダイズするであろう。プローブは、診断や研究の様々な目的のために開発されている。例えば、特定のプローブは、従来の細胞遺伝学的染色の方法を模倣し、染色体分析のために個々の染色体の識別を可能にする染色体の縞模様を生成する。他のプローブは単一染色体に由来し、標識された場合、細胞内の特定の染色体を識別するための「染色体の塗料」として、使用することができる。更に他のプローブは特定の染色体構造、例えば染色体のセントロメア又はテロメアを同定する。

一意的なプローブは特定の染色体領域又はゲノム中で単一コピーＤＮＡ配列へハイブリダイズする。これらが、目的の症候群又は状態に関連付けられた染色体の重要な領域又は遺伝子を識別するために使用するプローブである。中期染色体上で、そうしたプローブは各染色分体へハイブリダイズし、通常、染色体あたり２つの小さな離散信号を与える。

一意的な配列プローブのハイブリダイゼーションは、微小欠損症候群、染色体転座、遺伝子増幅及び異数性症候群、腫瘍性疾患並びに病原体感染症など、構成的な遺伝子異常を含む、多数の疾患や症候群に関連付けられている染色体異常の検出を可能としている。最も一般的にはこれらの技術は、顕微鏡スライドの標準的細胞遺伝学的調製物に適用される。さらに、これらの方法は、ホルマリン固定された組織、血液及び骨髄の塗抹標本、および直接固定された細胞もしくは他の核の分離株のスライドに使用することができる。

例えば、これらの技術は癌の診断および予後の両方の腫瘍細胞を特徴付けるためにしばしば使用されている。多数の染色体異常が、癌の発症と関連している（例えば、特定の骨髄性疾患に関連付けられてトリソミー８など異数性；慢性骨髄性白血病におけるＢＣＲ／ＡＢＬ転位などの転座；及び悪性形質転換に関連付けられた特定の核酸配列の増幅）。分子技術は、そうした後天性の染色体異常の検出及び特徴付けにおいて、標準的な細胞遺伝学的検査を強化することができる。例えば、ＦＩＳＨは非***性細胞における早期再発や残存病変を探すために使用されてきた。癌細胞の免疫細胞化学的検出及びＦＩＳＨ技術が、確定された細胞集団における染色体異常を研究するために組み合わされている。

本開示は、診断及びインサイツハイブリダイゼーションの研究用途で使用するために、改善されたプローブとそのようなプローブを作成する方法を提供する。

本発明は、核酸の検出のためのプローブ及びプローブシステム、特に、標的核酸プローブの検出配列にハイブリダイズする、複数の検出配列及び検出核酸プローブを含み、かつ複数の検出可能な部分、例えばハプテンを更に含む標的核酸プローブを含むプローブ及びプローブシステム、を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は標的核酸配列に相補的な核酸配列を含む標的プローブ部分、少なくとも一の検出プロ−ブ配列に相補的で、かつ標的核酸配列に非相補的である複数の配列を含む検出標的部分、操作可能に結合しているプローブ部分と検出部分、を含む核酸部分子を提供する。幾つかの実施態様において、核酸分子は、ＲＮＡ及びＤＮＡからなる群から選択される核酸である。幾つかの実施態様において、核酸分子の標的プローブ部分は、ＬＮＡおよびＰＮＡからなる群から選択される核酸アナログを含む。幾つかの実施態様において、少なくとも１つの検出プローブ配列に相補的な複数の配列は、実質的に同一である反復配列である。幾つかの実施態様において、検出標的部分は、実質的に同一である約５回より大きい反復配列を含む。幾つかの実施態様において、検出標的部分は、実質的に同一である約１０回より大きい反復配列を含む。幾つかの実施態様において、実質的に同一である反復配列は、長さが約１０から約１００ヌクレオチドである。幾つかの実施態様において、標的プローブ部分は、長さが約１０から約２００ヌクレオチドである。幾つかの実施態様において、標的プローブ部分は、標的核酸配列に９９％以上相補的である。幾つかの実施態様において、標的核酸配列は、細胞の標的核酸配列である。幾つかの実施態様において、標的核酸配列は、一次プローブ配列である。幾つかの実施態様において、一次プローブ配列は、細胞標的核酸配列に相補的な部分、及び細胞標的核酸配列に相補的ではないアダプター部分を含み、及び核酸分子の標的プローブ部分はアダプター部分に相補的である。

幾つかの実施態様において、本発明は、第一の標的核酸配列に相補的な核酸配列を含む第一の標的プローブ部分を含む第一の核酸分子、及び少なくとも１つの検出プローブ核酸配列に相補的で標的核酸配列に非相補的である複数の第一の検出標的配列を含む第一の検出標的部分、及び第１の核酸分子の検出標的部分の検出標的配列に相補的な第一の検出プローブ部分、及び検出プローブ部分の５ 'または３'のいずれかに少なくとも１つの第一の検出可能な部分を含む第一の検出可能な成分部分を含む第二の核酸分子、を含む第一標的核酸配列を検出するためのシステムを提供する。幾つかの実施態様において、第二の核酸分子の検出可能な成分部分は、検出可能な部分が核酸分子に組み込まれている、複数の検出可能部分を含む。幾つかの実施態様において、検出可能な部分は直接検出可能である。幾つかの実施態様において、検出可能な部分は間接的に検出可能である。幾つかの実施態様において、検出可能な部分は、シグナル発生部分と一対の結合部分の第一のメンバーからなる群から選択される。幾つかの実施態様において、シグナル発生部分は、量子ドット、フルオロフォア、蛍光タンパク質、酵素、及びコロイド金からなる群から選択される。幾つかの実施態様において、一対の結合部分の第一のメンバーは、ハプテンである。幾つかの実施態様において、ハプテンは、ビオチン、２,４-ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、フルオレセイン誘導体、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、５-ニトロ-３-ピラゾールカルバミド（ニトロピラゾール、ＮＰ）、４,５,-ジメトキシ-２-ニトロシンナミド（ニトロシンナミド、ＮＣＡ）、２-（３,４-ジメトキシフェニル）-キノリン-４-カルバミド（フェニルキノロン、ＤＰＱ）、２,１,３-ベンゾオキサジアゾール-５-カルバミド（ベンゾフラザン、ＢＦ）、３-ヒドロキシ-２-キノキサリンカルバミド（ヒドロキシキノキサリン、ＨＱ）、４-（ジメチルアミノ）アゾベンゼン-４'-スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）、ロテノンイソキサゾリン（Ｒｏｔ）、（Ｅ）-２-（２-（２-オキソ-２,３-ジヒドロ-１Ｈ-ベンゾ［ｂ］［１,４］ジアゼピン-４-イル）フェノキシ(phenozy)）アセトアミド（ベンゾジアゼピン、ＢＤ）、７-（ジエチルアミノ）-２-オキソ-２Ｈ-クロメン-３-カルボン酸（クマリン ３４３、ＣＤＯ）、２-アセトアミド-４-メチル-５-チアゾールスルホンアミド（チアゾールスルホンアミド、ＴＳ）、及びｐ-メトキシフェニルピラゾポドフィルアミド（p-Mehtoxyphenylpyrazopodophyllamide）（Ｐｏｄｏ）からなる群から選択される。幾つかの実施態様において、第二の核酸分子は、少なくとも５つの検出可能な部分を含む。幾つかの実施態様において、第二の核酸分子は、少なくとも１０の検出可能な部分を含む。幾つかの実施態様において、システムは、一対の結合部分の第一のメンバーに結合する特異的結合剤をさらに含む。幾つかの実施態様において、特異的結合剤は、一対の結合部分の第一のメンバーに結合しシグナル発生部分を含む特異的結合剤を含む。幾つかの実施態様において、特異的結合部分は、アビジンおよび抗原結合分子からなる群から選択される。幾つかの実施態様において、抗原結合分子は、抗体またはその断片である。幾つかの実施態様において、抗体またはその断片は、ハプテンに結合する。幾つかの実施態様において、特異的結合部分は、量子ドット、フルオロフォア、蛍光タンパク質、酵素、及びコロイド金からなる群から選択されるシグナル発生部分を含む。幾つかの実施態様において、第二の核酸分子は、ＲＮＡ及びＤＮＡからなる群から選択される核酸である。幾つかの実施態様において、第二の核酸分子は、ＬＮＡおよびＰＮＡヌクレオチドからなる群から選択される核酸アナログを含む。幾つかの実施態様において、標的核酸配列は、細胞の標的核酸配列である。幾つかの実施態様において、標的核酸配列は、第一の一次プローブ配列の一部である。幾つかの実施態様において、第一の一次プローブ配列は、細胞標的核酸配列に相補的な部分、及び細胞標的核酸配列に相補的ではないアダプター部分を含み、及び核酸分子の標的プローブ部分はアダプター部分に相補的である。幾つかの実施態様において、システムは、少なくとも第三及び第四の核酸分子、第三の核酸分子は、第二の標的核酸配列に相補的な核酸配列と、少なくとも１つの検出プローブ核酸配列に相補的で、標的核酸配列に非相補的である、複数の第二の検出配列を含む第二の検出標的部分を含む、第三の核酸分子、及び第三の核酸分子の第二の検出部分に第二の検出配列に相補的な第二の検出プローブ部分を含む、第四の核酸分子、及び検出プローブ部分の５’又は３’の何れかに少なくとも１つの第二の検出可能な部分を含む第二の検出可能な成分部分を更に含む。幾つかの実施態様において、第二の標的核酸配列は、第二の細胞の標的核酸配列である。幾つかの実施態様において、第二の標的核酸配列は、第二の一次プローブ配列である。幾つかの実施態様において、第二の一次プローブ配列は、細胞標的核酸配列に相補的な部分、及び細胞標的核酸配列に相補的ではないアダプター部分を含み、及び核酸分子の標的プローブ部分はアダプター部分に相補的である。

幾つかの実施態様において、本発明は、第一の核酸分子が標的核酸配列にハイブリダイズする条件下で、サンプルを、第一の標的核酸配列と相補的な核酸配列を含む標的プローブ部分と、少なくとも１つの検出プローブ核酸配列に相補的であって標的核酸配列に非相補的である、複数の第一の検出標的配列を含む検出標的部分を含む第一の核酸分子と接触させること；第二の核酸分子の検出プローブ部分が第一の核酸分子の第一の検出標的配列にハイブリダイズするような条件下で、第一の核酸分子を、各々が第一の核酸分子の検出配列に相補的な検出プローブ部分、及び検出プローブ部分の５’又は３’の何れかの少なくとも１つの第一の検出可能部分を含む検出可能成分部分を含む複数の第二の核酸分子と接触させること；及び少なくとも１つの第一の検出可能部分を検出することを含む、サンプル中の第一の標的核酸を検出する方法を提供する。幾つかの実施態様において、検出は、直接検出である。幾つかの実施態様において、検出は、間接検出である。幾つかの実施態様において、サンプルは、組織サンプル、生物サンプル、固体基材上のサンプル、マイクロタイタープレート上のサンプル、及び磁性粒子上のサンプルからなる群から選択される。幾つかの実施態様において、標的核酸配列は、ゲノムＤＮＡ、核ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及び細胞質核酸からなる群から選択される。幾つかの実施態様において、標的核酸は、組織または生物から単離される。幾つかの実施態様において、検出は、比色検出、放射検出、蛍光検出、顕微鏡的検出からなる群から選択される検出を含む。幾つかの実施態様において、検出は、第二の核酸分子上の少なくとも１つの検出可能な部分に結合する特異的結合剤とサンプルを接触させることを含む。幾つかの実施態様において、第一の核酸分子の標的プローブ部分、及び標的核酸配列、及び第二の核酸の検出プローブ部分、及び第一の核酸分子の検出標的配列は、摂氏約１０度以内の融点を有する。幾つかの実施態様において、標的核酸配列は、細胞の標的核酸配列である。幾つかの実施態様において、標的核酸配列は、一次プローブ配列である。幾つかの実施態様において、一次プローブ配列は、細胞標的核酸配列に相補的な部分、及び細胞標的核酸配列に相補的ではないアダプター部分を含み、及び核酸分子の標的プローブ部分はアダプター部分に相補的である。幾つかの実施態様において、本方法は、第一の核酸分子の標的プロ−ブ部分が標的核酸配列にハイブリダイズする条件下で、サンプルを、第二の標的核酸配列と相補的な核酸配列を含む標的プローブ部分と、少なくとも１つの検出プローブ核酸配列に相補的であって標的核酸配列に非相補的である、複数の第二の検出標的配列を含む標的プローブ部分を含む第三の核酸分子と接触させること；第四の核酸分子の検出プローブ部分が第三の核酸分子の第二の検出標的配列にハイブリダイズするような条件下で、第三の核酸分子を、各々が第三の核酸分子の検出配列に相補的な検出プローブ部分、及び検出プローブ部分の５’又は３’の何れかの少なくとも１つの第二の検出可能部分を含む検出可能成分部分を含む複数の第四の核酸分子と接触させること；及び少なくとも１つの第二の検出可能部分を検出することを更に含む。幾つかの実施態様において、第一及び第二の標的核酸配列は、同じ分子の一部である。幾つかの実施態様において、第一及び第二の検出可能な部分は同一である。幾つかの実施態様において、第二の標的核酸配列は、第二の細胞の標的核酸配列である。幾つかの実施態様において、第二の標的核酸配列は、第二の一次プローブ配列である。幾つかの実施態様において、第二の一次プローブ配列は、細胞標的核酸配列に相補的な部分、及び細胞標的核酸配列に相補的ではないアダプター部分を含み、及び核酸分子の標的プローブ部分はアダプター部分に相補的である。

幾つかの実施態様において、本発明は、標的核酸配列に相補的な核酸配列を含む標的プローブ部分を含む第一の核酸分子、少なくとも１つの検出プローブ核酸配列に相補的で、標的核酸配列に非相補的である複数の検出標的配列を含む、長さがおよそ２００ヌクレオチドよりも大きい検出標的部分、第１の核酸分子の検出部分での検出配列に相補的な検出プローブ部分を含む第二の核酸分子、及び検出プローブ部分の５’または３’の何れかの少なくとも１つの検出可能部分を含む検出可能な成分部分、を含むキットを提供する。幾つかの実施態様において、キットは、少なくとも一つの検出可能な部分に結合する特異的結合剤をさらに含む。幾つかの実施態様において、特異的結合剤はシグナル発生部分にコンジュゲートした特異的結合部分を含む。幾つかの実施態様において、キットは、第二の標的プローブ部分及び第二の検出標的部分を含む少なくとも第二の核酸分子を含む。幾つかの実施態様において、標的核酸配列は、細胞の標的核酸配列である。幾つかの実施態様において、標的核酸配列は、一次プローブ配列である。幾つかの実施態様において、一次プローブ配列は、細胞標的核酸配列に相補的な部分、及び細胞標的核酸配列に相補的ではないアダプター部分を含み、及び核酸分子の標的プローブ部分はアダプター部分に相補的である。

図１は、本発明の一実施態様の概略図を与える。 図２は、３つの異なるポリタグ（ＰｏｌｙＴａｇ）リボプローブによる１８Ｓ ｒＲＮＡの検出のためのドットプロット染色である。 図３ａと図３ｂは、アクチンｍＲＮＡの検出の蛍光顕微鏡写真である。 図４は、第１７染色体セントロメアの検出の顕微鏡写真である。 図５と図５ｂは、５コピー（５ａ）又は１０−コピー（５ｂ）のｓｓＤＮＡのポリタグプローブによるＰＴＥＮ遺伝子を検出するためのＳＩＳＨアッセイの結果の顕微鏡写真である。 図６は、一次プローブと続くポリタグプローブとのハイブリダイゼーションによる、ＰＴＥＮ遺伝子を検出するためのＳＩＳＨアッセイの結果の結果の顕微鏡写真である。

定義
特に説明がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を持つ。分子生物学の一般的な用語の定義は、 オックスフォード大学出版局により出版されたBenjamin Lewin, Genes V, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)；ブラックウェルサイエンス社（Blackwell Science Ltd.,）により出版された、Kendrewら (編), The Encyclopedia of Molecular Biology,1994(ISBN 0-632-02182-9); 及びVCH出版社（VCH Publishers, Inc.）により出版されたRobert A. Meyers (編), Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference，1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見いだすことができる。

文脈が明確に示さない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、複数の指示物を含む。同様に、単語「ｏｒ」は、文脈が明確に示さない限り、「ａｎｄ」を含む。用語「複数」は、フレーズの「一以上」、つまり、二又はそれ以上と同義に用いられる。さらに、核酸又はポリペプチドについて与えられる、全ての塩基の大きさ又はアミノ酸の大きさ、及び全ての分子量又は分子量の値は、概算値であり、説明のために提供されることが理解されるべきである。用語「含む（comprises）」は「含む（includes）」を意味する。略語「例えば（e.g.）」は、ラテン語の例えば（exempli gratia）に由来し、本明細書では非限定的な例を示すために用いられる。略語「例えば（e.g.）」は、用語「例えば（for example）」と同義である。本明細書に記載されるものと類似又は同等な方法及び材料が、本開示の実施又は試験において使用可能であるが、適切な方法及び材料は以下に記載される。

本開示の様々な実施態様の総括を容易にするため、以下の特定用語の説明が与えられる。

抗体：「抗体」は、まとめて、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子（一例として、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、それらの組み合わせ、および任意の脊椎動物、例えば、ヒト、ヤギ、ウサギ、およびマウス等の哺乳類における免疫応答中に産生される同様の分子を含むが、それらに限定されない）、及び、他の分子（例えば、対象の分子の結合定数、すなわち、生物試料における他の分子の結合定数よりも少なくとも１０^３Ｍ^−１より大、少なくとも１０^４Ｍ^−１より大、または少なくとも１０^５Ｍ^−１より大である結合定数を有する抗体および抗体断片）への結合を実質的に除いて、対象の分子（または対象の極めて類似する分子の群）に特異的に結合する、抗体断片を指す。

より具体的には、「抗体」は、抗原のエピトープを特異的に認識して結合する少なくとも１つの軽鎖もしくは重鎖免疫グロブリン可変領域を含んでなるポリペプチドリガンドを指す。抗体は重鎖および軽鎖からなり、これらの各々は可変重（Ｖ_Ｈ）領域および可変軽（Ｖ_Ｌ）領域と呼ばれる可変領域を有する。一緒になって、Ｖ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域は抗体により認識される抗原を結合することに関与する。

これには、インタクトな免疫グロブリンならびに当該技術分野において周知であるそれらの変異体及び一部が包含される。抗体断片には、タンパク質分解抗体断片［例えば、当該技術分野において既知であるようなＦ（ａｂ’）_２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片およびＦａｂ断片］、組換え抗体断片（例えばｓＦｖ断片、ｄｓＦｖ断片、二重特異性のｓＦｖ断片、二重特異性ｄｓＦｖ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、ダイアボディ、及びトリアボディ（当該技術分野で知られている）及び、ラクダ科動物抗体が挙げられる（例えば、米国特許第６０１５６９５号；同６００５０７９号−同５８７４５４１号；同５８４０５２６号；同５８００９８８号；及び同５７５９８０８号を参照のこと）。ｓｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域および免疫グロブリンの重鎖領域が、リンカーによって結合される融合タンパク質であるが、ｄｓＦｖｓにおいて、鎖は突然変異してジスルフィド結合を導入し、鎖の関連を安定化している。該用語は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ共役体（例えば、二重特異性抗体）等の遺伝子組み換え形態も含む。Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)、Kuby,J.,Immunology,3rd Ed.,W.H.Freeman&Co.,New York,1997も参照されたい。

典型的に、天然に存在する免疫グロブリンはジスルフィド結合により相互に連結される重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。２つのタイプの軽鎖、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）がある。抗体分子の機能活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（もしくはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥがある。

各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域を含有する（これらの領域ははまた、「ドメイン」としても知られている）。組み合わせて、重鎖および軽鎖可変領域は抗原に特異的に結合する。軽鎖および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」もしくは「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域により遮られる「フレームワーク」領域を含有する。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は特定されている（引用することにより本明細書に組み込まれる、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services,1991を参照）。Ｋａｂａｔデータベースは、現在、オンラインで維持されている。異なる軽鎖もしくは重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。構成する軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、３次元空間においてＣＤＲを配置しそして並べる働きをする。

ＣＤＲは、抗原のエピトープへの結合に主に関与する。各鎖のＣＤＲは、Ｎ末端から開始して順次番号が付され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と典型的に呼ばれ、そしてまた特定のＣＤＲが位置する鎖によっても典型的に同定される。従って、Ｖ_ＨＣＤＲ３はそれが存在する抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、一方、Ｖ_ＬＣＤＲ１はそれが存在する抗体の軽鎖の可変ドメインからのＣＤＲ１である。ＲＥＴに結合する抗体は特定のＶ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域配列、従って、特定のＣＤＲ配列を有する。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。抗体ごとに異なるのはＣＤＲであるが、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置のみが抗原結合に直接関与する。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ばれる。

「結合または安定な結合」は、２つの物質又は分子間の結合、例えば、一つの核酸分子（例えば、結合領域）のその他（又はそれ自身）に対するハイブリダイゼーションを指す。核酸分子は、標的核酸分子に結合する又は安定に結合する。十分な量の核酸分子が塩基対を形成するか、又はその標的核酸分子へハイブリダイズし、その結合の検出を可能にする。

「結合領域」は、標的分子に固有である標的核酸分子のセグメントまたは部分であり、いくつかの例では反復的な（または他の望ましくない）核酸配列を含まないか又は実質的に含まない。結合領域の核酸配列及びその対応する標的核酸分子は、２つが適切なハイブリダイゼーション条件下でインキュベートされる場合、２つの分子はハイブリダイズし、検出可能な複合体を形成するように、十分な核酸配列相補性を有する。標的核酸分子は複数の異なる結合領域、例えば、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１０００の一意的な結合領域を含むことができる。特定の実施例では、結合領域は、典型的には長さが数百塩基対から数千塩基対である。しかし、幾つかの実施例では、結合領域は、より短く、例えば５０から２００塩基対の長さである。標的核酸配列由来の結合領域を得る場合、標的配列は哺乳類細胞などの細胞内ではその天然型で、又はクローニング型で（例えばばベクター中に）得ることができる。

核酸分子は、例えば、ワトソン-クリック塩基対、フーグスティーン塩基対、または逆フーグスティーン塩基対を形成することにより、鎖がお互いに結合（ハイブリダイズ）し、２つの分子が十分な数の相補性ヌクレオチドを共有し、安定な２本鎖又は３本鎖を形成する場合、別の核酸分子と相補的であると言われる。安定な結合は、核酸分子が、必要な条件下で標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）に検出可能に結合したままである場合に生じる。

相補性とは、一方の核酸分子（例えば標的核酸プローブ）の塩基が二番目の核酸分子（例えばゲノム標的核酸分子）の塩基と塩基対を形成する度合いである。相補性は便宜上パーセンテージにより、すなわち、２つの分子間又は２つの分子の特定領域又はドメイン内で塩基対を形成するヌクレオチドの割合いにより、記述される。

本開示において、「十分な相補性」とは、十分な数の塩基対が１つの核酸分子又はその領域と標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）との間に存在し、検出可能な結合を獲得することを意味する。結合条件の確立に関わる定性的及び定量的な検討事項の徹底した処置が、Beltz et al. Methods Enzymol. 100:266-285, 1983, and by Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に与えられる。

「コンピュータに実装されたアルゴリズム」は、ユーザの指示で計算装置により行われ又は実行されるアルゴリズム又はプログラム（コンピュータ可読媒体で実行可能なコードのセット）である。本開示の文脈において、コンピューターに実装されたアルゴリズムは、特定の特徴を持つポリヌクレオチド配列の選択、例えば標的核酸配列の反復性（又は別の所望されない、例えばバックグランドを生じる）核酸配列又は一意的結合領域の同定などを容易にする（例えば自動化する）ために使用することができる。典型的には、ユーザは、配列データベースにアクセスすることができるコンピューターへコマンドを入力することでアルゴリズムの実行を開始して、一又は複数の選択閾値を設定する。配列のデータベースはコンピュータの記憶媒体内に包含することができ、又は遠隔地に格納され、イントラネット又はインターネット経由で近くまたは遠隔地にあるコンピュータや記憶媒体との間の接続を介してアクセスすることができる。アルゴリズムを開始した後に、例えば、選択条件を満たす1つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列を選択するために、アルゴリズム又はプログラムがコンピュータによって実行される。最も一般的には、選択されたポリペプチド配列は、（例えば、画面上に）表示されるか又は（例えば、印刷形式またはコンピュータ可読媒体上に）出力される。

用語「コンジュゲートする、連結する、結合する、又はリンクする」とは、一つの分子を別の分子に共有結合性にリンクして、より大きな分子を作ることを指す。例えば、二本のポリペプチドを一本の連続したポリペプチド分子にすること、又はハプテン又は他の分子を、例えばｓｃＦｖ抗体などのポリペプチドに共有結合すること。特定の文脈において、その用語は、抗体など特異的結合分子を量子ドットなどのシグナル発生部分に結合させるための参照が含まれる。結合は、化学的または組換え手段によりどちらかによる。「化学的手段」は、１つの分子を生成せしめるために２つの分子間で形成される共有結合があるような抗体部分とエフェクター分子との間の反応をさす。

用語「連結された」とは、第一の原子もしくは分子に適用する場合、第二の原子もしくは分子に「連結される」ことは、直接連結される及び間接的に連結されるの両方であることができる。二次抗体は、間接的連結の例を提供する。間接的連結の１つの具体例はウサギ抗ハプテン一次抗体であり、それはマウス抗ウサギＩｇＧ抗体により結合され、次にそれは検出可能な標識に共有結合されているヤギ抗マウスＩｇＧ抗体により結合される。

第一及び第二の核酸（例えば、結合領域と標的核酸配列）に関して「対応する」という用語は、その第一及び第二の核酸が、第一及び／又は第二の核酸の全配列の少なくとも一部分において実質的な配列同一性又は相補性を有することを示す。従って、もし結合領域が、標的核酸配列の少なくとも一部と（例えば、もしそれが少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、あるいは１００％、同一又は相補的ならば）実質的な配列同一性または相補性を有する場合（例えば、逆相補性）、結合領域は、標的核酸配列に対応している。例えば、結合領域が、二本鎖標的核酸配列（例えば、ゲノム標的ＤＮＡ配列）の一方の鎖に実質的な配列同一性を有している場合、又は結合領域が、一本鎖標的核酸配列（例えば、ＲＮＡまたはＲＮＡウイルスゲノム）に実質的に相補的である場合、結合領域は、標的核酸配列に対応することができる。

「ゲノム」は生物の全遺伝子構成成分である。真核生物の場合には、ゲノムは、細胞の染色体の一倍体セットに含まれている。原核生物の場合には、ゲノムは単一の染色体に含まれ、場合によっては、エピソームなど１つまたは複数の染色体外遺伝的要素（例えば、プラスミド）に含まれる。ウイルスゲノムは、特定のウイルスに応じて、１つ以上の一本鎖または二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子の形を取ることができる。

用語 「ハプテン」は、典型的には抗体と特異的に結合することができる小分子であるが、典型的には担体分子との組み合わせ以外で免疫原性であることが実質的に不可能である分子を指す。

用語「単離された」とは、生物学的成分（例えば核酸分子、タンパク質、又は細胞）に関して、生物の細胞、又は生物それ自体において（そこでは他の染色体及び染色体外ＤＮＡやＲＮＡ、タンパク質及び細胞、及びオルガネラなどの成分が天然に生じる）、他の生物学的成分から実質的に分離又は精製されている生物学的成分を指す。「単離された」核酸分子は、標準的な精製方法で精製された核酸分子を含む。その用語はまた、増幅またはクローニングすることによって調製された核酸、並びに化学的に合成された核酸を包含する。

「標識」は、その分子の検出を容易にするために、直接的または間接的に別の分子にコンジュゲートした検出可能な化合物又は組成物である。特異的な、非限定的な標識の例として、蛍光及び蛍光発生部分、発色部分、ハプテン、アフィニティタグ、および放射性同位元素を含む。標識は直接的に検出可能（例えば、光学的に検出可能）であるか又は間接的に検出可能（例えば、同様に検出可能な1つまたは複数の追加の分子との相互作用を介して）である。本明細書で開示されるプローブの文脈において典型的な標識は以下に記載される。核酸を標識するための方法、様々な目的のために有用な標識の選択の指針は、例えば、 Sambrook and Russell, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) 及びAusubel et al., in Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Intersciences (1987,更新を含む)に議論されている。

用語「多重」は、複数の異なるコンジュゲートを用いて、所望されるように、サンプル中の複数の標的を実質的に同時か又は逐次に、検出されることを可能にする実施態様を指す。多重化とは、核酸、一般的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質を、両方個別に、かつ任意の及び全ての組み合わせで、同定及び／又は定量することを含み得る。多重化とはまた、その解剖学的文脈において、細胞内の遺伝子、メッセンジャー及びタンパク質の２つ以上を検出することを含めることができる。

「核酸」とは、一本鎖又は２本鎖の何れかの形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーで、他に限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で核酸にハイブリダイズする天然ヌクレオチドのアナログを包含する。用語「ヌクレオチド」は、限定されないが、糖に結合した塩基（ピリミジン、プリン又はそれらの合成アナログ）、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）にあるようなアミノ酸に結合した塩基を包含するモノマーを含む。ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの１つのモノマーである。ヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチドの塩基配列を意味する。

核酸「セグメント」は、標的核酸分子の補欠部分又は部分配列である。核酸セグメントは、様々な方法で標的核酸分子から仮想的に又は実際に派生させることができる。例えば、標的核酸分子（例えば、ゲノムの標的核酸分子など）のセグメントは、制限断片である核酸セグメントを生成する１つまたは複数の制限酵素で消化することによって得ることができる。核酸セグメントはまた、増幅により、ハイブリダイゼーション（例えば、サブトラクティブハイブリダイゼーション）により、人工合成により、又は配列が標的核酸分子に対応する一以上の核酸を生成する任意の別の方法により、標的核酸分子から生成することができる。核酸セグメントの特定な例は結合領域である。

「プローブ」又は「核酸プローブ」とは、標的核酸分子（例えば、ゲノムの標的核酸分子）とハイブリダイズすることが可能で、かつ標的へハイブリダイズした場合に、直接的又は間接的のどちらかで検出されることが可能である核酸分子である。従って、プローブは、標的の核酸分子の検出、及び幾つかの例では、定量化を許容する。特定の実施例では、プローブは、標的核酸分子由来の結合領域を含み、標的核酸分子の少なくとも一部分に特異的にハイブリダイズすることが可能である複数の核酸分子を包含する。プローブは、「標識核酸プローブ」と呼ぶことができ、プローブが直接的又は間接的に検出可能な部分又は「標識」へ結合され、プローブを検出可能な状態にすることを意味している。

用語「量子ドット」は、量子閉じ込めに起因する大きさに依存する電子的および光学的特性を示すナノスケール粒子を指す。量子ドットは例えば半導体材料（例えばカドミウムセレニドおよび硫化鉛）から、および晶子（分子ビームエピタクシーを介して成長した）等から構成されてきた。種々の表面化学および蛍光特性を有する様々な量子ドットがインビトロジェンコーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ユージーン、オレゴン州から市販されている（例えば、米国特許第６８１５０６４号，同第６６８２５９６号および同第６６４９１３８号明細書を参照にされたい。その各々の特許は引用により本明細書に編入する）。また量子ドットはエビデントテクノロジーズ（Ｅｖｉｄｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（トロイ、ニューヨーク州）からも市販されている。他の量子ドットには、ＺｎＳＳｅ、ＺｎＳｅＴｅ、ＺｎＳＴｅ、ＣｄＳＳｅ、ＣｄＳｅＴｅ、ＳｃＳＴｅ、ＨｇＳＳｅ、ＨｇＳｅＴｅ、ＨｇＳＴｅ、ＺｎＣｄＳ、ＺｎＣｄＴｅ、ＺｎＣｄＴｅ、ＺｎＨｇＳ、ＺｎＨｇＳｅ、ＺｎＨｇＴｅ、ＣｄＨｇＳ、ＣｄＨｇＳｅ、ＣｄＨｇＴｅ、ＺｎＣｄＳＳｅ、ＺｎＨｇＳＳｅ、ＺｎＣｄＳｅＴｅ、ＺｎＨｇＳｅＴｅ、ＣｄＨｇＳＳｅ、ＣｄＨｇＳｅＴｅ、ＩｎＧａＡｓ、ＧａＡｌＡｓおよびＩｎＧａＮ量子ドットのような合金量子ドットがある（合金量子ドットおよびその作成法は、例えば米国特許出願公開第２００５／００１２１８２号及び国際公開第２００５／００１８８９号に開示されている）。

「サンプル」は、被験者から得た、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）、タンパク質、又はそれらの組合わせを含む生物学的標本である。例としては、限定されないが、染色体の調製物、末梢血、尿、唾液、組織生検、手術標本、骨髄、羊水のサンプル、および剖検材料が含まれる。一例において、サンプルはゲノムＤＮＡ又はＲＮＡを含む。幾つかの例において、サンプルとは、例えば、顕微鏡スライドに置くことができる細胞遺伝学的調製物である。特定の例において、サンプルは直接使用されるか、または（例えば、ホルマリンを使用して）例えば固定することにより、使用する前に操作することができる。

用語 「シグナル発生部分」は、アッセイによって検出可能なシグナルを発生する組成物または分子を指す。
用語「特異的結合部分」は、結合対のメンバーを指す。特異的結合対は、それらが、別の分子への結合を実質的に排除してお互いに結合することを特徴とする一対の分子である（例えば、特異的結合対は、生物学的サンプル中の他の分子との結合対の２つのメンバーのどちらかについての結合定数よりも、少なくとも１０^３Ｍ^−１より大きい、１０^４Ｍ^−１より大きい、又は１０^５Ｍ^−１より大きい結合定数を有し得る）。特異的結合部分の特定の例は、特異的結合タンパク質（例えば、抗体、レクチン、ストレプトアビジンなどのアビジン、プロテインＡ）、核酸配列、及びタンパク質−核酸を含む。特異的結合部分は、そうした特異的結合タンパク質が特異的に結合している分子（又はその一部）を含むことができる。

用語「特異的結合剤」は、シグナル発生部分にコンジュゲートした特異的結合部分を含む分子を指す。

「被検体」は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物（例えば、獣医学的被検体）などの任意の多細胞脊椎動物生物を含む。

「標的の核酸配列又は分子」は、核酸分子の定義された領域又は特定の部分、例えば、ゲノム（例えば、目的の遺伝子を含む遺伝子又は哺乳動物のゲノムＤＮＡなど）である。標的核酸配列が標的ゲノム配列である一例において、そのような標的は、（例えば、正常細胞内で）染色体上の位置により定義されることができ、例えば、細胞遺伝学的命名法に従い、染色体上の特定の位置を参照することにより；遺伝地図上の位置への参照により；仮想的又は集合したコンティグへの参照により；その特異的な配列または機能により；その遺伝子またはタンパク質名により；又はゲノムの他の遺伝子配列の中からそれを一意的に同定する任意の他の手段によって定義することができる。いくつかの例では、標的核酸配列は、哺乳類又はウイルスのゲノム配列である。別の例では、標的核酸配列は、ＲＮＡ配列である。

「細胞標的核酸配列」は、原核細胞、真核細胞、組織、ウイルス、またはその他の生物学的実体に存在するか又は抽出された、標的核酸配列（例えば、ゲノムＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列）である。標的核酸配列はまた、プローブ配列（例えば、細胞標的核酸配列に結合する部分を有する第一のプローブ配列）内、またはアッセイで使用するために合成された他の核酸配列内に存在してもよい。

いくつかの例では、標的核酸配列（例えばゲノム核酸配列）の変化は疾患又は病気と「関連する」。すなわち、標的核酸配列の検出は、疾患又は病気に関してサンプルの状態を推論するために使用することができる。例えば、標的核酸配列は２つ（又はそれ以上の）区別可能な形態で存在し得、第一の形態は疾患又は病気の非存在と関連し、第二（又は異なる）形態は疾患又は病気の存在と関連する。二つの異なる形態は、例えばポリヌクレオチド多型などによって、定性的に区別することができ、及び／又は二つの異なる形態は、例えば細胞内に存在する標的核酸配列のコピー数などによって、定量的に区別することができる。

「ベクター」は、ベクターに対して天然型ではない他の（外来の）核酸配列のための担体としてはたらく任意の核酸である。適切な宿主細胞に導入されると、ベクターはそれ自身（それによって、外来の核酸配列）を複製し得、又は外来核酸配列の少なくとも一部を発現し得る。一つの文脈において、ベクターは直鎖状または環状核酸であって、その中へ、複製（例えば生産）及び／又は標準的な組換え核酸技術（例えば制限酵素消化）を用いて操作する目的のため、目的の標的核酸配列が導入（例えば、クローニング）される。ベクターは、宿主細胞内で複製することを可能とする核酸配列、例えば複製起点などを含めることができます。ベクターはまた、当技術分野で知られている１つ以上の選択マーカー遺伝子および他の遺伝的要素を含めることができる。一般的なベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ファージミド、人工染色体（例えば、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＨＡＣ、ＹＡＣ）及びこれらの型のベクターの一以上の特徴を取り込んだハイブリッドを含有する。典型的には、ベクターは、標的核酸配列の挿入を容易にする１カ所又は複数の固有の制限部位（場合によってはマルチクローニングサイト）を含む。

発明の詳細な説明
本発明は、例えば、タンパク質、核酸、脂質、ホルモンなどを含む生体分子を含む生物学的サンプル中の標的生体分子の検出のためのプローブ及びプローブシステムを提供する。好ましい実施態様では、プローブ及びプローブシステムは、生物学的サンプル中のＤＮＡやＲＮＡなどの標的核酸を検出するために使用される。更に好ましい実施態様では、プローブ及びプローブシステムは、インサイツハイブリダイゼーション法、例えば、蛍光インサツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比色インサツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、及び銀インサイツハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）のために利用される。幾つかの実施態様において、生物学的サンプルは組織切片（生検によって得られたような）、または細胞診標本（例えばパパニコロウスメアまたは血液塗抹など）が含まれる。開示されたコンジュゲートを使用することができる他の型のアッセイは、当業者に容易に明らかであり、特定の実施例は以下に議論される。

本発明の１つの非限定的な実施態様は、図１に記載されている。図１を参照すると、サンプルは標的核酸１を含む。本発明の標的核酸プローブ５は、標的プローブ部分１０及び、複数の検出配列２０を含む検出配列部分１５を含む。標的核酸プローブ５の標的プローブ部分１０は、標的核酸１の領域に相補的であり、適切な条件下で核酸１を標的にハイブリダイズする。検出配列２０は、検出配列部分１５が、検出配列２０である複数の反復配列を含むように、好ましくは同一配列を有する。幾つかの実施態様において、そのシステムは、検出プローブ部分３０と検出可能成分部分３５を含む、検出プローブ２５を更に含む。検出プローブ部分３０は、検出プローブ部分３０が適切な条件下で検出配列２０にハイブリダイズするように、標的核酸プローブ５の検出配列２０に相補的である核酸配列を含む。検出可能な成分部分３５は、好ましくは複数の検出可能な部分４０を含む。例えば、示された実施態様において、検出可能な部分４０は好ましくはハプテンである。更に図１を参照し、幾つかの実施態様において、本発明のシステムは、検出可能な部分４０に結合する特異的結合剤４５を更に含む。幾つかの実施態様において、特異的結合剤４５は、検出可能なシグナルを作り出すシグナル発生部分５０を含み、例えば、シグナル発生部分は好ましくは蛍光性化合物又は量子ドットであり得る。

本発明のプローブ及びプローブシステムは以下により詳述される。
Ａ.ポリタグプローブシステム
本発明は、核酸の検出のためのプローブ及びプローブシステム、特に、標的核酸プローブの検出配列にハイブリダイズする、複数の検出配列及び検出核酸プローブを含み、かつ複数の検出可能な部分、例えばハプテンを更に含む標的核酸プローブを含むプローブ及びプローブシステム、を提供する。本明細書に開示されたプローブ及びプローブシステムは、標的核酸配列、例えば、疾患に関連するか又は病原菌に関連したゲノム標的核酸配列、又はＲＮＡ標的核酸配列などを検出するために用いることができる。例えば、プローブは、中期又は間期の核の染色体調製物、又は組織切片へプローブのハイブリダイゼーションを含む、インサイツハイブリダイゼーション手法において用いることができる。

１．標的核酸プローブ
幾つかの実施態様において、本発明は、標的核酸プローブを提供する。幾つかの実施態様において、標的核酸プローブは、標的プローブ部分及び検出標的部分を含む核酸分子である。

幾つかの実施態様において、標的プローブ部分は、標的核酸配列（例えば、細胞の標的核酸配列又はプローブなどの人工核酸配列）に相補的である核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、標的プローブ部分は、ハイブリダイゼーション、例えば、インサイツハイブリダイゼーション、サザンブロッティング法、またはノーザンブロット法に適した条件下で、標的核酸配列にハイブリダイズする。好ましくは、標的プローブ部分は、ＲＮＡ（リボ核酸）、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ＬＮＡ（ロックト核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、またはそれらの組み合わせなどの任意の適切な核酸を含み、デオキシリボヌクレオチドなどの標準ヌクレオチド、及びヌクレオチドアナログを含み得る。幾つかの実施態様において、標的核酸プローブの標的プローブ部分は、細胞標的核酸配列に相補的である。幾つかの実施態様において、標的核酸プローブは、細胞の標的核酸配列に直接ハイブリダイズされる。別の実施態様において、標的核酸プローブの標的プローブ部分は、一次プローブなどの人工標的核酸配列に相補的である。これらの実施態様において、細胞の標的核酸配列とアダプター部分に相補的である細胞標的プローブ部分を含む一次プローブは、細胞の標的核酸配列にハイブリダイズされる。標的核酸プローブは、好ましくは、一次プローブのアダプター部分に相補的でありハイブリダイズすることができる標的プローブ部分（一次プローブの標的プローブ部分）を含む。従って、一次プローブは細胞標的核酸配列にハイブリダイズされ、その後、標的核酸プローブは一次プローブにハイブリダイズされる。これらの実施態様は、所望の標的核酸配列を検出するためのプローブシステムの柔軟な設計を可能にする。一次プローブが利用されている実施態様では、一次プローブのアダプター部分は異なるアダプター部分に特異的な一連の標準的核酸プローブを使用することができる。一次プローブは、細胞の標的核酸配列に特異的な部分と、特定の標準化された標的核酸プローブに特異的であるアダプター部分とともに合成される。このシステムは、異なるアダプター部分を持つ一次プローブ、及び異なるアダプター部分の各々に特異的な一連の標的核酸プローブを用いて多重化を可能とする。

幾つかの実施態様において、標的プローブ部分は、標的核酸配列にに８０％以上相補的であり、好ましくは、標的核酸配列に９０％以上相補的であり、より好ましくは、標的核酸配列に９９％以上相補的であり、最も好ましくは、標的核酸配列に約１００％相補的である。標的プローブ部分の長さは可変できる。幾つかの実施態様において、標的プローブ部分は、長さ約１０、２０、５０、１００、または２００ヌクレオチドの標的核酸に相補的である配列を含む。幾つかの実施態様において、標的核酸に相補的である標的プローブ部分は、最大で長さが約２０、５０、１００、２００、１０００、または５０００ヌクレオチドである。幾つかの実施態様において、標的核酸に相補的である標的プローブ部分は、長さが約１０から約５００，約１０から約２００，又は約１０から約１００ヌクレオチドである。一般に、これらの標的プローブ部分の設計は、当該分野で標準的である実践を用いて遂行される。例えば、得られたプローブが、標的核酸に結合することを犠牲にして自分自身に折り重なるか、またはお互いにハイブリダイズするような自己相補性を有する配列は一般的に回避される。

標的プローブ部分の長さを選択する際の１つの考慮事項は、標的核酸を含むサンプルの複雑さである。例えば、ヒトゲノムは、長さが約３×１０^９塩基対である。任意の１０ヌクレオチド配列は、３０億塩基対において約２８６１回の頻度で現れる。この長さの標的プローブ部分は、ヒトゲノムの大きさの配列を持つ標的内にある１０ヌクレオチド領域に一意的に結合する機会は乏しいであろう。しかし仮に、標的配列がプラスミド３キロバイト以内であった場合は、そのようなオリゴヌクレオチドは、一意的に結合することが非常に合理的な機会がある可能性がある。これと同じ計算により、１６ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド（すなわち、１６量体）が３×１０^９塩基対に一回現れることが、数学的に可能性がある配列の長さの最小値であることが分かる。このレベルの特異性はまた、２つ以上の短い核酸配列が協調的な方法で（すなわち、それらが両方もしくは全てがそれらの意図した標的配列に結合している場合にのみ、意図した複合体を生成することができるように）結合するように形成されている場合、２つ以上の短い核酸配列によって提供される場合があり、ここでその短い配列の組み合わせが所望の特異性を提供する。

標的プローブ部分の長さを選択する際の第二の考慮事項は、標的プローブ部分が機能することが期待されるであろう温度範囲である。平均塩基含有量（５０％のＧ−Ｃ塩基）の１６量体は、とりわけ、プローブとその標的の濃度、反応の塩濃度、及びヌクレオチドの正確な順序に依存する、約４１℃の計算されるＴ_ｍを有するであろう。実際問題として、長い標的プローブ部分は、通常、ハイブリダイゼーションの特異性を高めるために選択される。例えば、長さが２０から２５ヌクレオチドの標的プローブ部分は、Ｔｍの近傍（Ｔｍの約５℃以内）の温度で行う反応で使用した場合、非常に特異的である可能性があるため、使用することができる。

好ましい実施態様において、標的プローブ部分がユーザーによって定義された適切な条件下で、標的核酸にハイブリダイズするように、標的核酸プローブの標的プローブ部分はこれらの考慮事項を考慮して設計されている。

標的プローブ部分は、手動で、又は、温度、長さ、ＧＣ含量などの所望のパラメータに基づいて、プライマーの選択を最適化する、コンピュータ実装されたアルゴリズムの支援を受けて選択することができる。インターネットを介して又はパーソナルコンピューター上で使用する数多くのコンピューターに実装されたアルゴリズムが入手できる。例えば、標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）から複数の結合領域を生成するため、反復的な（または他の望ましくない、例えば、バックグラウンドを生みだす）核酸配列を欠いた配列の領域が、例えば手動で、あるいはコンピューター・アルゴリズムを使用して、同定される。数キロから数百キロベースまたがる標的核酸配列内（例えば、ゲノム標的核酸配列）において、実質的に又は完全に反復が無い（または他の望ましくない、例えば、バックグラウンドを生じる）核酸配列である典型的な多くの結合領域が同定される。

幾つかの実施態様において、標的核酸プローブは、標的プローブ部分に対する５’又は３’の何れか、好ましくは標的プローブ部分の３’の検出標的部分を更に含む。幾つかの好ましい実施態様において、標的核酸プローブの検出対象部分は、１つまたは複数の検出標的配列を含む。幾つかの実施態様において、検出標的配列は、検出標的配列が検出プローブとのハイブリダイゼーションによって検出することができるように、検出プローブ核酸配列（詳細は後述）に相補的な配列である。

幾つかの実施態様において、検出部分は、複数の検出標的配列を含む。幾つかの実施態様において、検出標的配列が同じ検出プローブとハイブリダイズすることができるように、与えられた標的核酸プローブにおける検出標的配列は同一または実質的に同一である。他の実施態様において、検出標的配列の配列は検出標的配列が２つ以上の異なる検出プローブにハイブリダイズするように変更される。本発明は、以下の指定範囲にある範囲においてサポートを提供することが理解されるであろう。検出部分内に含まれる検出標的配列の数は変わることがある。従って、幾つかの実施態様において、検出部分は約５、１０、２０、３０、５０、又は１００より大きい検出標的配列、最大約１００の検出標的配列を含む。幾つかの実施態様において、検出部分は約５から３０の間、５から５０の間、１０から５０の間、１０から１００の間、１０から２００の間、２０から４０の間、２０から５０の間、２０から１００の間、又は２０から２００の間の検出標的配列を含む。標的部分の長さは変えることができる。幾つかの実施態様において、検出部分の全長は、長さが約２０から約２０００ヌクレオチド、約１００から約２０００ヌクレオチド、約２０から約５００ヌクレオチド、約１００から約２０００ヌクレオチド、約１００から約１５００ヌクレオチド、約１００から約１０００ヌクレオチド、約２００から約２０００ヌクレオチド、約２００から約１５００ヌクレオチド、約２００から約１０００ヌクレオチド、又は約２００から約５００ヌクレオチドである。検出標的配列の長さは変えることができる。幾つかの実施態様において、検出標的配列は、長さが約１０、２０、５０、又は７５ヌクレオチドより長く、最大で約１００又は２００ヌクレオチドである。幾つかの実施態様において、検出標的配列は、スペーサー配列によって分離されている。幾つかの実施態様において、スペーサー配列は長さが約１０ヌクレオチドから最大で約２０、５０、又は１００ヌクレオチドに及ぶ。幾つかの実施態様において、スペーサー配列は、制限エンドヌクレアーゼの一以上の制限部位を含む。

検出標的配列は、標的プローブ部分の設計について説明したもののような考慮事項を用いている。幾つかの実施態様において、検出標的配列は、効率的及び／又は特異的に検出プローブとハイブリダイズするように設計されている。幾つかの実施態様において、標的核酸プローブの標的核酸配列へのハイブリダイゼーション及び検出プローブの検出標的配列へのハイブリダイゼーションが、実質的に同一の条件、例えば、温度、時間、緩衝液、及び塩濃度、のもとで起きるように、検出標的配列（及び対応する検出プローブ配列）の塩基組成が選択される。

標的核酸プローブは、任意の公知の方法により合成することができる。幾つかの実施態様において、標的核酸プローブをコードする配列は、プラスミド発現ベクターにクローニングされる。標的核酸プローブは、標的核酸プローブをコードするＲＮＡ分子を提供するために、好ましくはＲＮＡポリメラーゼによりベクターから転写される。幾つかの実施態様において、標的核酸プローブは、例えば、ホスホロアミダイトアナログを用いて、化学的に合成される。幾つかの実施態様において、ＤＮＡプローブは、プラスミドＤＮＡの増殖、精製、制限酵素消化によって合成され、標的核酸プローブをコードするＤＮＡ分子を提供する。二本鎖ＤＮＡは、続いてハイブリダイゼーションプロトコルにおける使用のための一本鎖に溶融させることができる。幾つかの実施態様において、標的核酸プローブは、非対称ＰＣＲにより合成される。幾つかの実施態様において、一方のプライマーは、例えば、核酸アナログ（例えば、ＬＮＡ）である可能性がある。このプロセスは、ロックトヌクレオチド及び標準的ｄＮＴＰから作成される検出標的部分を含む標的特異的部分を有するプローブを生成する。幾つかの実施態様において、ＬＮＡ含有プライマーは、望まれるストランドの精製を容易にするためにビオチンを含有する。

２．検出プローブ及び特異的結合剤
幾つかの実施態様において、本発明は、検出プローブを提供する。幾つかの実施態様において、検出プローブは、検出プローブ部分及び検出可能な成分部分を含む核酸分子である。幾つかの実施態様において、検出プローブの検出可能な成分部分は、特定の結合剤で検出可能である複数の検出可能な部分を含む。

幾つかの実施態様において、検出プローブ部分は、上述したように、検出標的配列に相補的である核酸配列を含む。幾つかの実施態様において、検出プローブ部分の核酸配列は、ハイブリダイゼーションに適した条件、例えば、インサイツハイブリダイゼーション、サザンブロッティング法、またはノーザンブロット法に適した条件下で、検出標的配列にハイブリダイズする。好ましくは、検出プローブ部分は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、またはそれらの組み合わせなどの任意の適切な核酸を含み、デオキシリボヌクレオチドなどの標準ヌクレオチド、並びにヌクレオチドアナログを含み得る。ＬＮＡ及びＰＮＡはＤＮＡとＤＮＡもしくはＤＮＡとＲＮＡとの間に形成されたものよりも安定している（すなわち、Ｔ_ｍが増大した）ハイブリダイゼーション複合体を形成する核酸アナログの２つの例である。ＬＮＡ及びＰＮＡアナログは、プローブとして用いることができるハイブリッド核酸分子を提供するために、化学合成中に伝統的なＤＮＡ及びＲＮＡのヌクレオシドと組み合わせることができる。ＬＮＡ及びＰＮＡアナログの使用は、ハイブリダイゼーションのパラメーター、例えばハイブリダイゼーション複合体のＴｍなどを変更することができる。これは、標的核酸配列への標的プローブ部分のハイブリダイゼーションに必要な条件と同一又は類似している条件の下で、ターゲット核酸プローブの検出標的配列にハイブリダイズする検出プローブの設計を可能にする。

検出プローブ部の長さは変えることができるが、標的核酸プローブの検出標的配列に対する相補性のために設計される。幾つかの実施態様において、検出標的配列は、長さが約１０、２０、５０、又は７５ヌクレオチドより大きく、最大で約１００又は２００ヌクレオチドである。検出プローブ部分は、好ましくは、標的プローブ部分の設計について説明したもののような考慮事項を用いて設計される。幾つかの実施態様において、標的プローブ部分は、効率的及び／又は特異的に検出標的配列とハイブリダイズするように設計される。幾つかの実施態様において、標的核酸プローブの標的核酸配列へのハイブリダイゼーション及び検出プローブの検出標的配列へのハイブリダイゼーションが、実質的に同一の条件、例えば、温度、時間、緩衝液、及び塩濃度、のもとで起きるように、検出プローブ部分（及び対応する検出標的配列）の塩基組成が選択される。

幾つかの実施態様において、検出可能な成分部分は、１つ以上の検出可能な部分を含む。幾つかの実施態様において、検出可能な部分は直接検出可能であり、他の実施態様において、検出可能な部分は、間接的に検出可能である。幾つかの実施態様において、検出可能な部分は、検出プローブに組み込まれる。幾つかの実施態様において、検出可能な部分は、検出可能なシグナルを生成するシグナル生成部分である。幾つかの実施態様において、検出可能な部分は検出プローブの合成に用いられるヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに結合している。例えば、望まれる検出可能な部分に結合しているヌクレオシドホスホロアミダイトは、当技術分野で知られているように、化学合成を介して検出プローブを合成するために使用される。幾つかの実施態様において、検出可能な成分部分は、複数の検出可能な部分を含む。例えば、幾つかの実施態様において、検出可能な成分部分は、約５から約５０、約５から約２５、約５から約２０、約５から約１５、又は約５から約１０の検出可能な部分を含む。標的核酸プローブ上の複数の検出標的配列の組み合わせは、各標的核酸プローブへの複数の検出プローブのハイブリダイゼーションを可能にすることが認識されるであろう。各検出プローブが複数の検出可能な部分を含む場合、検出シグナルの増幅が起きる。

幾つかの実施態様において、検出可能な部分を間接的に検出される。幾つかの実施態様において、検出可能な部分は、第一及び第二のメンバーを含む結合分子対の第一のメンバーである。これらの実施態様において、結合対の第一のメンバーにコンジュゲートしたヌクレオチドは、好ましくは、結合対の第一のメンバーにコンジュゲートしたヌクレオシドホスホルアミダイトの使用を介して、検出プローブに組み込まれる。シグナル発生部分にコンジュゲートした結合対の第二のメンバー（すなわち特異的結合部分）を含む特異的結合剤は、結合対の第一のメンバーへの結合を介して検出プローブを検出するために使用される。適切な結合分子対の例としては、アビジン及びビオチン及びハプテン及び抗ハプテン抗体を含むが、これらに限定されない。例えば、幾つかの実施態様において、検出プローブの検出可能な成分の部分は、複数のビオチン化ヌクレオチドを含む。これらのビオチン化ヌクレオチドは、直接検出可能な部分にコンジュゲートしたアビジンを含んでなる化合物を使用することによって検出される。他の実施態様において、検出プローブの検出可能な成分部分は、複数のハプテニル化（haptenylated）ヌクレオチドを含む。これらのハプテニル化ヌクレオチドは、直接検出可能な部分にコンジュゲートした抗ハプテン抗体を含んでなる化合物を使用することによって検出される。

従って、幾つかの実施態様において、本発明は、結合分子対の第一のメンバーに結合している１つ以上のヌクレオチドを含む検出プローブを提供する。幾つかの実施態様において、結合分子対の第一のメンバーは、ハプテンである。幾つかの実施態様において、検出プローブの検出可能な成分部分は、ハプテン分子（例えばニトロ芳香族化合物（例えば、ジニトロフェニル（ＤＮＰ））、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニンなど）に共有結合したｄＮＴＰを組込んだ核酸分子である。（例えば、標識プローブへの組み込みを容易にするために）ハプテン及び他の標識をｄＮＴＰにコンジュゲートするための方法は、当技術分野で周知である。方法の例については、例えば、米国特許第５２５８５０７号、同４７７２６９１号、同５３２８８２４号、及び同４７１１９５５号を参照のこと。実際に、数多くの標識されたｄＮＴＰが、例えば、Invitrogen Detection Technologies（モレキュラープローブ（Molecular Probes）、ユージーン、オレゴン州）から市販されている。標識は、直接的または間接的にｄＮＴＰの上の任意の位置、例えば、リン酸（例えば、α、β又はγリン酸）や糖などでｄＮＴＰへ結合させることができる。

様々なハプテンが検出プローブの検出可能な成分部分で使用することができる。そのようなハプテンは、限定されないが、ピラゾール、特にニトロピラゾール;ニトロフェニル化合物; ベンゾフラザン;トリテルペン;尿素及びチオ尿素類、特にフェニル尿素、更に具体的にはフェニルチオ尿素;ロテノン及びロテノン誘導体、ここではロテノイドとも言う;オキサゾール及びチアゾール、特にオキサゾール及びチアゾールスルホンアミド;クマリンおよびクマリン誘導体;ポドフィロトキシン及びポドフィロトキシン誘導体に代表されるシクロリグナン;及びそれらの組み合わせが挙げられる。ハプテンの具体的な例としては、限定されないが、２,４-ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、ビオチン、フルオレセイン誘導体（ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、テキサスレッドなど）、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、５-ニトロ-３-ピラゾールカルバミド（ニトロピラゾール、ＮＰ）、４,５,-ジメトキシ-２-ニトロシンナミド（ニトロシンナミド、ＮＣＡ）、２-（３,４-ジメトキシフェニル）-キノリン-４-カルバミド（フェニルキノロン、ＤＰＱ）、２,１,３-ベンゾオキサジアゾール-５-カルバミド（ベンゾフラザン、ＢＦ）、３-ヒドロキシ-２-キノキサリンカルバミド（ヒドロキシキノキサリン、ＨＱ）、４-（ジメチルアミノ）アゾベンゼン-４'-スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）、ロテノンイソキサゾリン（Ｒｏｔ）、（Ｅ）-２-（２-（２-オキソ-２,３-ジヒドロ-１Ｈ-ベンゾ［ｂ］［１,４］ジアゼピン-４-イル）フェノキシ(phenozy)）アセトアミド（ベンゾジアゼピン、ＢＤ）、７-（ジエチルアミノ）-２-オキソ-２Ｈ-クロメン-３-カルボン酸（クマリン ３４３、ＣＤＯ）、２-アセトアミド-４-メチル-５-チアゾールスルホンアミド（チアゾールスルホンアミド、ＴＳ）、及びｐ-メトキシフェニルピラゾポドフィルアミド（p-Mehtoxyphenylpyrazopodophyllamide）（Ｐｏｄｏ）が挙げられる。これらのハプテンとそれらのプローブにおける使用については、共同所有の出願である、米国特許出願公開第２００８０３０５４９７号、同２００８０２６８４６２号、及び同２００８００５７５１３号により詳細が説明されている。

検出プローブの検出可能な成分部分がハプテンを含む実施態様では、結合分子対の第二のメンバーは、好ましくは、抗原結合分子などのハプテンに結合する分子である。適切な抗原結合分子の例としては、限定されないが、抗体、免疫グロブリン又は免疫グロブリン様分子（一例として、限定するものでないが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含む）、抗体断片、例えば、当該技術分野において知られているＦ（ａｂ’）_２断片、抗体断片Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片など、組換え抗体断片（例えばｓＦｖ断片、ｄｓＦｖ断片、二重特異性のｓＦｖ断片、二重特異性ｄｓＦｖ断片、Ｆ（ａｂ）’_２断片、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、ダイアボディ、及びトリアボディ（当該技術分野で知られている）及び、ラクダ科動物抗体が挙げられる（例えば、米国特許第６０１５６９５号；同６００５０７９号−同５８７４，５４１号；同５８４０５２６号；同５８００９８８号；及び同５７５９８０８号を参照のこと）。好ましい実施態様において、検出可能なシグナルを生成する検出可能な部分は、抗原結合分子に、付着するか、そうでなければ共有結合している。適切な第二の結合対のメンバーは、限定されないが、検出可能なシグナルを生成する検出可能な部分にコンジュゲートしている抗ＤＮＰ抗体、抗ビオチン抗体、抗ＦＩＴＣ抗体、抗ＤＩＧ抗体、抗ＮＰ抗体、抗ＮＣＡ抗体は、抗ＤＰＱ抗体、抗ＢＦ抗体、抗ＨＱ抗体、抗ダブシル抗体、抗Ｒｏｔ抗体、抗ＢＤ抗体、抗ＣＤＯ抗体、抗ＴＳ抗体、および抗Ｐｏｄｏ抗体が挙げられる。更なる実施態様において、結合分子対の第二のメンバーは、検出可能な部分を含まない抗ハプテン一次抗体である。これらの実施態様において、シグナルを発生する検出可能な部分を含む二次抗抗体（例えば、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体など）は、検出可能なシグナルを発生するために利用される。

上述したように、検出プローブは、直接的に検出可能であるか又は間接的に検出可能であってよい。幾つかの直接的検出の実施態様では、検出プローブは、検出可能なシグナルを発生する検出可能な部分（例えば、シグナル発生部分）を含み、一方幾つかの間接的検出の実施態様では、検出可能なシグナルを発生するシグナル発生部分にコンジュゲートしている結合分子対（例えば二次抗体など）のメンバーを含む特異的結合剤が利用されている。これらの実施態様では、検出可能なシグナルを発生する様々なシグナル発生部分が、検出プローブに組み込まれ得、又は結合対のメンバーにコンジュゲートされ得る。

好ましい実施態様において、シグナル生成部分は、光子（無線周波数、マイクロ波周波数、赤外線周波数、可視周波数と紫外線周波数の光子を含む）の吸収、放出及び／又は散乱を含む、任意の公知又は未発見のメカニズムによって検出することができる。シグナル生成部分は着色、蛍光、燐光及び発光分子や物質を含む。一つの物質を別の物質に変換し、（例えば、無色の物質を着色物質に変換したり、又はその逆であったり、又は沈殿物を生成するか、サンプルの濁度を増加させるなどにより）検出可能な差を与える触媒（酵素など）、及び常磁性分子及び磁性分子または物質を包含する。

シグナル発生部分の特定の例においては、蛍光分子（又は蛍光色素）が含まれる。多数の蛍光色素が、当業者に知られており、例えばインビトロジェンから選択することができ、例えば、The Handbook--A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Invitrogen Detection Technologies、モレキュラープローブ（Molecular Probes）、ユージーン、オレゴン州)を参照。核酸分子又は抗原結合分子などのタンパク質に結合させる（例えば、化学的にコンジュゲートさせる）ことができる特定の蛍光色素は、限定されないが、以下を包含する；４-アセトアミド-４'-イソチオシアン酸スチルベン-２,２'-ジスルホン酸、アクリジン及びアクリジンイソチオシアネートなどのアクリジン及び誘導体、５-((２-アミノエチル）アミノナフタレン-１-スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４-アミノ-Ｎ-[３-(ビニルスルホニル)フェニル］ナフタルイミド-３,５ジスルホン酸（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ-(４-アニリノ-ｌ-ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ブリリアントイエロー、例えば、クマリン、７-アミノ-４-メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）などのクマリン及び誘導体、７-アミノ-４-トリフルオロメチルクルアリン（７-ａｍｉｎｏ-４-ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｃｏｕｌｕａｒｉｎ）（クマリン１５１）；シアノシン；４',６-ジアミジノ-２-フェニリンドール（ＤＡＰＩ）；５',５"-ジブロモピロガロール-スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７-ジエチルアミノ-３-(４'-イソチオシアナトフェニル）-４-メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４,４'-ジイソチオシアナトジヒドロスチルベン-２,２'ジスルホン酸；４,４'-ジイソチオシアナトスチルベン-２,２'ジスルホン酸；５-［ジメチルアミノ］ナフタレン-ｌ-スルホニルクロライド（ＤＮＳ、塩化ダンシル）；４-（４'-ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）；４-ジメチルアミノフェニルアゾフェニル-４'-イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよびエオシンイソチオシアネートなどのエオシンおよび誘導体；エリトロシンＢおよびエリトロシンイソチオシアネートなどのエリトロシンおよび誘導体；エチジウム；５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５-（４,６-ジクロロトリアジン-２-イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２'７'-ジメトキシ-４'５'-ジクロロ-６-カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、およびＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）などのフルオレセインおよび誘導体；２′,７′-ジフルオロフルオレセイン（ＯＲＥＧＯＮ ＧＲＥＥＮ^ＴＭ；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアナート；４‐メチルウンベリフェロン；オルト‐クレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリスリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレン酪酸、１−ピレン酪酸スクシンイミジルなどのピレンおよび誘導体；リアクティブレッド４（シバクロン^ＴＭブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６-カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）などのローダミン及び誘導体；リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、ローダミングリーン、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テクサスレッド）、Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチル-６-カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）;テトラメチルローダミン;テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸およびテルビウムキレート誘導体。

他の適切なフルオロフォアは、約６１７ｎｍで放射するチオール反応性ユウロピウムキレート (Heyduk and Heyduk, Analyt. Biochem. 248:216-27, 1997; J. Biol. Chem. 274:3315-22, 1999)、並びにＧＦＰ，Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ.ＴＭ、ジエチルアミノクマリン、フルオレセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレセイン、４，７−ジクロロローダミン及びキサンテン（Ｌｅｅらによる米国特許第５８００９９６号に記載された）及びそれらの誘導体を包含する。当業者に既知である他のフルオロフォア、例えば、Invitrogen Detection Technologies, モレキュラープローブ（Molecular Probes） (ユージーン、オレゴン州)から入手可能なものもまた使用でき、色素のＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ^ＴＭ系（例えば、米国特許第５６９６１５７号、同６１３０１０１号、及び同６６７１６９７９号に記載される）、色素のＢＯＤＩＰＹ系（ジピロメテンボロンジフルオリド色素（dipyrrometheneboron difluoride dyes)、例えば、米国特許第４７７４３３９号、同５１８７２８８号、同５２４８７８２号、同５２７４１１３号、同５３３８８５４号、同５４５１６６３号、及び同５４３３８９６号に記載される）、カスケードブルー（米国特許第５１３２４３２号に記載されるスルホン化ピレンのアミン反応性誘導体）、及びマリーナブルー（米国特許第５８３０９１２号）を包含する。

上記の蛍光色素に加えて、蛍光標識は、半導体ナノ結晶などの蛍光ナノ粒子が可能であり、例えば、ＱＵＡＮＴＵＭ ＤＯＴ^ＴＭ（例えば、QuantumDot Corp, Invitrogen Nanocrystal Technologies、ユージーン、オレゴン州から入手される；米国特許第６８１５０６４号；同６６８２５９６号；及び同６６４９１３８号も参照）。半導体ナノ結晶は、大きさに依存する光学的および／または電気的特性を有する微細な粒子である。半導体ナノ結晶は、一次エネルギー源で照射されている場合、エネルギーの二次電子放出は、半導体ナノ結晶で使用される半導体材料のバンドギャップに対応する周波数で発生する。この放出は、特定の波長または蛍光色の光として検出することができる。異なるスペクトル特性を持つ半導体ナノ結晶は、例えば、米国特許第６６０２６７１号に記載されている。半導体ナノ結晶は、様々な生体分子（ｄＮＴＰ及び／又は核酸を含む）、及び基質に対して、例えば、Bruchez et. al. (1998) Science 281:2013-6, Chan et al. (1998) Science 281;及び米国特許第６２７４３２３号に記載された技術によって結合することができる。

様々な組成物の半導体ナノ結晶の形成は、例えば、米国特許第６９２７０６９号； 同６９１４２５６号；同６８５５２０２号；同６７０９９２９号；同６６８９３３８号；同６５００６２２号；同６３０６７３６号；同６２２５１９８号；同６２０７３９２号；同６１１４０３８号；同６０４８６１６号；同５９９０４７９号；同５６９０８０７号；同５５７１０１８号；同５５０５９２８号；同５２６２３５７号及び米国特許出願公開第２００３／０１６５９５１号並びにＰＣＴ出願公開番号第９９／２６２９９号（１９９９年５月２７日公開）に開示されている。半導体ナノ結晶の別個の集団を、その異なるスペクトル特性に基づいて識別可能であるように生成することができる。例えば、半導体ナノ結晶は、その組成、サイズまたはサイズおよび組成に基づいて異なる色の光を発するように生成することができる。例えば、サイズに基づいて異なる波長（５６５ｎｍ、６５５ｎｍ、７０５ｎｍ、又は８００ｎｍの発光波長）で発光する量子ドットは、本明細書に開示されたプローブにおいて蛍光標識として適しており、インビトロジェンから入手される。

更なるシグナル発生部分は、例えば、放射性同位元素（^３Ｈ、^３５Ｓ及び^３２Ｐなど）、Ｇｄ^３＋などの放射性金属イオン又は常磁性金属イオンのＤＯＴＡ及びＤＰＴＡキレートなどの金属キレート、及びリポソームを包含する。

シグナル発生部分はまた、酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、β-ラクタマーゼを含む。検出可能な標識が酵素を含む場合、色素原、蛍光発生化合物、又は発光性化合物が、酵素と組み合わせて使用することができ、検出可能なシグナルを生成する（多くのそうした化合物が、例えば、インビトジェン社、ユージーン、オレゴン州から市販されている）。発色化合物の特定の例としては、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）、ファーストレッド（ｆａｓｔ ｒｅｄ）、ブロモクロロインドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ファーストレッド、ＡＰオレンジ、ＡＰブルー、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２,２'-アジノ-ジ（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン酸（ＡＢＴＳ）、ｏ−ジアニシジン、４ークロロナフトール（４−ＣＮ）、ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−βーガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ−Ｇａｌ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−βーＤ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルー、及びテトラゾリウムバイオレッドを包含する。

あるいは、酵素は、金属組織学的検出方式で使用することができる。例えば、ＳＩＳＨの方法はハイブリダイズしたゲノムの標的核酸配列の同定及び局在についての金属組織学的検出方式を含む。金属組織学的検出方法は、水溶性金属イオン及び酵素の酸化還元に不活性な基質と組み合わせて、アルカリフォスファターゼ等の酵素を使用することを包含する。基質は酵素により酸化還元活性剤に変換され、その酸化還元活性剤は金属イオンを還元し、それを検出可能な沈殿物を形成させる。（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１００９７６、ＰＣＴ国際公開第２００５／００３７７７及び米国特許出願公開第２００４／０２６５９２２を参照）。金属組織学的検出方法には、オキシドレダクターゼ酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼなど）を、水溶性金属イオン、酸化剤及び還元剤と一緒に使用することを含み、再び検出された沈殿物を形成する。（例えば、米国特許第６６７０１１３を参照）。

幾つかの実施態様において、シグナル生成部分は、蛍光タンパク質である。［０３１９］蛍光タンパク質はまた、可視化を容易にするために、担体として使用することができ、又は担体に結合させることができる。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、もともとはオワンクラゲの発光器官から単離された。キメラＧＦＰ融合は、細胞への遺伝子導入によりインサイツで発現させることができ、適切な標的化シグナルによって、細胞内の特定の部位に局在化させることができる。青、シアン、黄緑色の発光を伴うスペクトルの変異が首尾よくオワンクラゲＧＦＰから生成されるが、何一つ５２９ｎｍより長い発光極大を示すものは無かった。ＧＦＰ様タンパク質が、生物学的用途のために利用可能な色の範囲を著しく拡大した花虫綱（サンゴ動物）から単離されている。配列データベースに寄託された「ＧＦＰ様タンパク質」のファミリーは、現在およそ３０の有意に異なるメンバーを有している。蛍光タンパク質は、発色団の自己触媒的合成によって自発的に蛍光を発することができるタンパク質を指す。赤色波長又は遠赤色波長（赤色蛍光タンパク質又はＲＦＰ）で蛍光を発するタンパク質が知られている。ＲＦＰは、多色標識実験及び蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）実験の両方において、より短い波長で蛍光を発する他の蛍光タンパク質との組み合わせで使用することができる。市販のＲＦＰは、２つの野生型ＧＦＰ様タンパク質に由来する。ＤｓＲｅｄ（ｄｒＦＰ５８３）は、５５８ｎｍと５８３ｎｍで、それぞれ励起極大及び発光極大を持つ。遠赤外蛍光タンパク質は、５７１ｎｍで吸収する色素タンパク質の変異誘発によって生成された。ＨｃＲｅｄ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）は、５８８ｎｍと６１８ｎｍで、それぞれ励起極大及び発光極大を持つ。最長波長（導入されている任意の変異なし）で蛍光を発する蛍光タンパク質は、イソギンチャクＥｎｔａｃｍａｅａ ｑｕａｄｒｉｃｏｌｏｒからクローニングされた、ｅｑＦＰ６１１である。このタンパク質は、５５９ｎｍで吸収し、６１１ｎｍで発光する。

検出プローブは、任意の適切な、既知の核酸合成法により合成することができる。幾つかの実施態様において、検出プローブは、ホスホラミダイトヌクレオシド及び／又はホスホラミダイトヌクレオシドアナログを用いて化学的に合成される。例えば、幾つかの実施態様において、検出プローブは、標準ＲＮＡまたはＤＮＡホスホラミダイトヌクレオシドを用いて合成される。幾つかの実施態様において、検出プローブは、ＬＮＡホスホラミダイト、又はＰＮＡホスホラミダイト単独で、又は標準的なホスホラミダイトヌクレオシドとの組み合わせのいずれかを用いて合成される。幾つかの実施態様において、検出可能な部分は、化学合成中に検出プローブに組み込まれる。例えば、幾つかの実施態様において、ハプテンなどの検出可能な部分は、所望の検出可能部分を含む塩基性ホスホラミダイトに導入される。別の方法は、検出プローブ合成のために用いることができる。例えば、ＬＮＡアナログ又はＬＮＡアナログと標準ヌクレオチドの組み合わせから作られたプライマーは、プローブの残りの転写に使用することができる。その他の例として、検出可能な部分を含むプライマーは、プローブの残りの転写のために利用されている。さらに他の実施態様では、例えば転写又は化学合成によって生成されたプローブのセグメントが、酵素的又は化学的ライゲーションによって連結され得る。

Ｂ．プローブ及びプローブシステムの使用
本発明は、開示されたプローブ及びプローブシステムを使用する方法を提供する。例えば、プローブは標的核酸分子を検出するために使用することができる。一例において、本方法は、サンプル中の核酸分子と標的核酸プローブとのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な条件下で、核酸分子を含むサンプルと開示された標的核酸プローブの一つ以上を接触させることを含む。次いで、検出プローブと標的核酸プローブとの間のハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な条件下で、サンプルを検出プローブと接触させる。検出プローブは、その後、例えば、検出プローブに組み込まれた化合物の結合パートナーを含む化合物をサンプルに接触させることにより、又は直接検出プローブをアッセイすることにより、検出される。

本発明のプローブ及びプローブシステムは、インサイツハイブリダイゼーション手順（例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、発色インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）及び銀インサイツハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ））のような、核酸検出のために使用することができる。相補的な核酸分子間のハイブリダイゼーションは、相補的なヌクレオチド単位間のワトソン−クリック型、フーグスティーン型または逆転フーグスティーン型水素結合を含む水素結合を介して媒介される。例えば、アデニン及びチミンは、水素結合の形成を介して対になる相補的核酸塩基である。本開示のプローブの特定の位置にあるヌクレオチド単位が、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子（例えば、標的核酸配列）の同じ位置にあるヌクレオチド単位と水素結合することが可能である場合、オリゴヌクレオチドは、その位置でお互いに相補的である。プローブ及びＤＮＡ又はＲＮＡは、各分子において十分な数の対応する位置が、互いに水素結合し、検出可能な結合を生成することができるヌクレオチド単位によって占有されている場合、互いに相補的である。プローブは、特異的にハイブリダイズ可能な、標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）と１００％相補的である必要はない。その配列が複雑な混合物中（例えば、全細胞ＤＮＡ又はＲＮＡ）に存在する場合には、プローブが標的核酸配列に結合し、二重鎖を作り、又は標的核酸配列にのみハイブリダイズするか又は実質的にそれのみにハイブリダイズするために、十分な相補性が必要である。

インサイツハイブリダイゼーションは、標的核酸配列（例えば、ゲノムの標的核酸配列）を含むサンプルを、中期または間期の染色体調製物（例えば、スライド上にマウントされた細胞または組織サンプルなど）の関連で、標的核酸配列（例えば、ゲノムの標的核酸配列）に対して特異的にハイブリダイズできるか又は特異的であるプローブ（例えば、上述の標的核酸プローブ）に、接触させることを包含する。スライドは、例えば、パラフィン又は均一なハイブリダイゼーションを妨げる可能性がある他の材料を除去するために、必要に応じて前処理される。染色体サンプルおよびプローブの両方は、二本鎖核酸を変性させるため、例えば加熱により処理される。（適当なハイブリダイゼーション緩衝液中に調製された）プローブとサンプルは、ハイブリダイゼーションが起こることを可能にするため（典型的には平衡に達するまで）の条件下で十分な時間において混ぜ合わされる。染色体の調製物は、過剰な標的核酸プローブを除去するために洗浄され、染色体標的の特異的標識の検出が行われる。本発明のいくつかの実施態様によれば、検出は、標的核酸プローブ二対する検出プローブのハイブリダイゼーションによって促進される。検出プローブは、直接検出又は間接的検出にによって検出することができる。

例えば、幾つかの直接検出の実施態様では、検出プローブは、１つまたはそれ以上の蛍光化合物で標識され、サンプルは蛍光顕微鏡又はイメージングにより解析される。幾つかの間接的な検出の実施態様では、検出プローブは、検出可能な部分（すなわち、蛍光色素又は量子ドット）にコンジュゲートした結合対の第二のメンバー（すなわち、抗ハプテン抗体又はアビジン）を含む化合物とサンプルを接触させることにより検出される、結合対の第一のメンバー（すなわち、ハプテン又はビオチン）を含む検出可能な部分を複数含む。インサイツハイブリダイゼーションの方法の一般的な記述については、例えば米国特許第４８８８２７８号を参照。蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、発色インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）及び銀ハイブリダイゼーションのための多数の手順が、当技術分野で知られている。例えば、ＦＩＳＨを実施するための方法は、米国特許第５４４７８４１号、同５４７２８４２号、同５４２７９３２号、及び例えば、Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83:2934-2938, 1986; Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9138-9142, 1988; 及びLichter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9664-9668, 1988に記載される。ＣＩＳＨは、例えば、Tanner et al., Am. J. Pathol. 157:1467-1472, 2000及び米国特許第６９４２９７０号に記載される。更なる検出方法が、米国特許第６２８０９２９号に与えられている。インサイツハイブリダイゼーションによって、ウイルスを検出するための典型的な手順は、Poddighe et al., J. Clin. Pathol. 49:M340-M344, 1996に見いだすことができる。

多数の試薬および検出方式が、感度、解像度、または他の望ましい特性を向上させるためにＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、及びＳＩＳＨの方法と併せて用いることができる。上で議論したように、ＦＩＳＨを行う際にフルオロフォア（蛍光色素とＱＵＡＮＴＵＭ ＤＯＴＳ^TMを含む）で標識した検出プローブは、直接光学的に検出することができる。あるいは、検出プローブは、ハプテンなどの非蛍光分子（例えば、以下の非限定的な例など：ビオチン、ジゴキシゲニン、ＤＮＰ、およびそれらの様々なオキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ニトロアリル、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ロテノン、クマリン、クマリン系化合物、ポドフィロトキシン、ポドフィロトキシン系化合物、およびそれらの組み合わせ）、リガンド又は他の間接的に検出可能な部分で標識することができる。このような非蛍光分子で標識した検出プローブ（及びそれらが結合する標的核酸配列）は、サンプル（例えば、プローブが結合した細胞又は組織サンプル）を標識検出試薬、例えば、選択されたハプテン又はリガンドに特異的な抗体（又は受容体、又は他の特異的結合パートナー）と接触させることによって検出することができる。検出試薬は、蛍光色素（例えば、ＱＵＡＮＴＵＭ ＤＯＴ^ＴＭ）又は他の間接的に検出可能部分で標識することができ、又は一つ又は複数の更なる特異的結合剤（例えば、二次的又は特異的抗体）と接触することができ、それらは順にフルオロフォアで標識することができる。任意で、検出可能な標識は、抗体、受容体（または他の特異的結合剤）に直接結合される。あるいは、検出可能な標識がリンカー、例えば、ヒドラジドチオールリンカー、ポリエチレングリコールリンカーなど、又は匹敵する反応性を持った他の柔軟な連結部分を介して結合剤に結合される。例えば、抗体、レセプター（又は他の抗リガンド）、アビジン等の特異的結合剤は、ヘテロ二官能性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーなどのヘテロ二官能性アルキレングリコールリンカーを介して、フルオロフォア（又は他の標識）で共有結合性に修飾することができる。ヘテロ二官能性リンカーは、例えば、カルボニル反応性基、アミン反応性基、チオール反応性基及び光反応性基から選択された２つの異なる反応性の基を結合し、その第一番目は標識に結合し、その第２番目は特異的結合剤に結合する。

他の例において、検出プローブ、又は特異的結合剤（抗体、例えば、一次抗体、レセプター又は他の結合剤など）は、蛍光性又は発色性の組成物を、蛍光性、着色された、或いはそうでなければ検出可能なシグナル（例えば、ＳＩＳＨにおける検出可能な金属粒子の蒸着など）へと変換することが可能な酵素を含む。上に示したように、酵素は、関連するプローブ又は検出試薬へリンカーを介して直接または間接的に結合することができる。適切な試薬の例（例えば、結合試薬）及び化学物質（例えば、リンカー及び結合化学物質）は、米国特許出願公開第２００６／０２４６５２４号；同２００６／０２４６５２３号及び米国特許出願第６０／７３９７９４号に記載されている。

標識された検出プローブ及び／又は標識された結合対を適切に選択することにより、多重検出方式を作り出すことができ、１回のアッセイによって（例えば、単一の細胞又は組織サンプルに関して、又は複数の細胞又は組織サンプルに関して）、複数の標的核酸配列（例えば、ゲノムの標的核酸配列）の検出を容易にすることが可能であることが当業者によって理解されるであろう。例えば、第一の標的核酸プローブに対応する第一の検出プローブは、ビオチンなどの第一のハプテンで標識することができ、第二の標的核酸配列に対応する第二の検出プローブは、ＤＮＰなどの第二のハプテンで標識することができる。サンプルをプローブセットへ曝露後、結合したプローブはサンプルを第一の特異的結合剤（この場合は、第一のフルオロフォア、例えば、５８５ｎｍで発光する第一のスペクトル的に異なるＱＵＡＮＴＵＭ ＤＯＴ^ＴＭ）、及び第二の特異的結合剤（この場合、第二のフルオロフォア（例えば、７０５ｎｍで発光する第二のスペクトル的に異なるＱＵＡＮＴＵＭ ＤＯＴ^ＴＭ）で標識された、抗ＤＮＰ抗体又は抗体断片）と接触させることによって検出することができる。更なる一対のプローブ／結合剤が、スペクトル的に異なるフルオロフォアを使用する多重検出方式に加えられる。直接的及び間接的な数多くの変法（一工程、二工程又はそれ以上）が想定されることが可能であり、その全てが本開示によるプローブ及びアッセイに関連して適している。

標準的な蛍光顕微鏡は、量子ドットバイオコンジュゲートなどの蛍光化合物を組み込んだ試薬及びプローブの検出のための安価なツールである。量子ドットコンジュゲートは事実上光に安定しているため、顕微鏡で目的の領域を見つけて、適切にサンプルに焦点を当てるために時間を費やすことができる。量子ドットコンジュゲートは、明るい光に安定した発光が必要とされるときはいつでも有用であり、とりわけ、一つの励起源／フィルターのみがが使用可能で、かつ色の最小限のクロストークが要求される多色用途で特に有用である。

Ｃ．標的
標的核酸分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの任意の選択された核酸であって良い。特定の実施態様では、標的配列は、例えばヒトゲノムなどの真核生物のゲノム由来のゲノム標的配列又はゲノムのサブシーケンスである。幾つかの実施態様において、標的核酸は、細胞質のＲＮＡである。幾つかの実施態様において、標的核酸分子は、病原体、例えばウイルス、細菌、又は例えばウイルスゲノムに由来する細胞内寄生体から選択される。幾つかの実施態様において、標的核酸配列は、真核細胞（例えば、哺乳動物）又はウイルスゲノム配列などのゲノム配列である。固有の非反復ＤＮＡの少なくとも一部分を含有する、本質的に任意のゲノムの標的配列に対応する、標的核酸プローブを作成することができる。例えば、ゲノムの標的配列は、哺乳動物（例えば、ヒト）、真菌又は細胞内寄生体のゲノムなどの真核生物のゲノムの一部であって良い。あるいは、ゲノム標的配列は、ウイルス又は原核生物ゲノム（例えば、細菌ゲノムなど）、又はその一部とすることができる。特定の実施例において、ゲノム標的配列は、感染性の生物（例えば、ウイルス、細菌、真菌）に関連付けられている。

幾つかの実施態様において、標的核酸分子は、疾患に関連した（例えば、相関し、因果的に関与したなどの）配列とすることができる。幾つかの実施態様において、疾患や病気に関連した標的核酸が選択され、ハイブリダイゼーションによる検出を、疾患又は病気に関連する情報（サンプルが得られた患者の診断又は予後情報など）を推測するために用いることができる。所定の実施態様において、選択された標的核酸分子は、腫瘍性疾患（又は癌）に関連付けられた標的核酸分子である。幾つかの実施態様において、ゲノム標的配列は、癌に関連する少なくとも一つの少なくとも１つの遺伝子（例えば、ＨＥＲ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ａｂ１、Ｂｃ１２、Ｂｃ１６、Ｒ１、ｐ５３、ＥＧＦＲ ＴＯＰ２Ａ、ＭＥＴ、又は他の受容体及び／又はシグナル伝達分子をコードする遺伝子等）、又は癌に関連した染色体領域を組み込むことができる。幾つかの実施態様において、標的核酸配列は、癌と相関している染色体の構造異常、例えば、転座、欠失、又は二重化（例えば、遺伝子増幅又はポリソミー）に関連付けることができる。幾つかの実施態様において、標的核酸配列は、少なくともいくつかの腫瘍細胞で二重化又は欠失しているゲノム配列を網羅している。標的核酸配列の大きさは実質的に変えることができ、例えば、少なくとも長さが２０塩基対、少なくとも長さが１００塩基対、少なくとも長さが１０００塩基対、少なくとも全長が５００００塩基対、少なくとも全長が１０００００塩基対、又は少なくとも全長が２５００００塩基対など。

標的核酸配列（例えば、ゲノムの標的配列）は、任意の数の塩基対にまたがることができる。幾つかの実施態様において、標的核酸配列は、少なくとも１０００塩基対に及ぶ。特定の実施例において、標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）は、長さが少なくとも１００００塩基対、少なくとも５００００塩基対、少なくとも１０００００塩基対、少なくとも１５００００塩基対、少なくとも２５００００塩基対、又は少なくとも５０００００塩基対（例えば、１００ｋｂから６００ｋｂ、２００ｋｂから５００ｋｂ、又は３００ｋｂから５００ｋｂ）である。実施例において、標的核酸配列が、真核生物のゲノム（例えば、哺乳動物のゲノム、例えば、ヒトゲノムなど）由来である場合、標的配列は、典型的には、生物のゲノムのごく一部（又は単一染色体の小さな部分）を表している（例えば、生物のゲノムＤＮＡ（又は単一染色体）の２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、又は１％未満）。標的配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）が、感染性生物（ウイルスなど）に由来する幾つかの例では、標的配列は感染性生物のゲノムのより大きな割合（例えば５０％以上）又は実に全てを表わすことができる。

特定の非限定的な例として、腫瘍（例えば、癌）に関連した標的核酸配列（例えば、ゲノムの標的核酸配列）が選択される。多数の染色体異常（転座やその他の再配列、倍加又は欠失を含む）が新生物細胞、特に癌細胞（例えば、Ｂ細胞及びＴ細胞白血病、リンパ腫、乳癌、結腸癌、神経癌等）で同定されている。従って、幾つかの例において、サンプルの細胞の少なくともサブセットにおいて、標的核酸配列（例えば、ゲノムの標的核酸配列）の少なくとも一部が倍加されるか又は削除される。

癌遺伝子が関与する転座は、いくつかのヒト悪性腫瘍について知られている。例えば、染色体１８ｑ１１．２のブレークポイント領域に位置するＳＹＴ遺伝子が関与する染色体再配列は、滑膜肉腫、軟部組織腫瘍に共通している。ｔ（１８ｑ１１．２）転座は、例えば、異なる標識を持つプローブを使用して、同定することができる：第一のプローブは、ＳＹＴ遺伝子から遠位方向に伸びる標的核酸配列から生成される核酸分子を含み、第二のプローブは３’又はＳＹＴ遺伝子の近位に伸びる標的核酸配列から生成される核酸が含まれる。これらの標的核酸配列（例えば、ゲノムの標的核酸配列）が、インサイツハイブリダイゼーションの方法で使用される場合、ＳＹＴ遺伝子領域でｔ（１８ｑ１１．２）を欠く正常細胞は、ＳＹＴの２つのインタクトなコピーを反映する、２つの融合（近接する２つの標識により作成された）シグナルを示す。ｔ（１８ｑ１１．２）を持つ異常な細胞は単一の融合シグナルを示す。

腫瘍性形質転換に関与する遺伝子の倍加の多数の例が観察され、ここで開示されたプローブを使用いるインサイツハイブリダイゼーションにより細胞遺伝学的に検出することができる。一例において、標的核酸配列（例えば、ゲノムの標的核酸配列）は、一以上の悪性腫瘍（例えば、ヒト悪性腫瘍）において倍加された遺伝子（例えば、オンコジーン）を含むように選択される。例えば、ＨＥＲ２は、ｃ−ｅｒｂＢ２又はＨＥＲ２／ｎｅｕとしても知られ、細胞増殖の制御に役割を果たす遺伝子である（代表的なヒトＨＥＲ２ゲノム配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿００００１７、ヌクレオチド３５０９７９１９−３５１３８４４１に与えられる）。その遺伝子はチロシンキナーゼファミリーのメンバーである１８５ｋｄの膜貫通細胞表面レセプターをコードする。ＨＥＲ２は、ヒトの乳癌、卵巣癌、および他の癌で増幅される。従って、ＨＥＲ２遺伝子（あるいはそのＨＥＲ２遺伝子を含む１７番染色体の領域）を、ＨＥＲ２に特異的な結合領域を持つ核酸分子を含むプローブを生成するために、ゲノムの標的核酸配列として使用することができる。

他の実施例において、腫瘍抑制遺伝子であって、悪性腫瘍細胞で欠失した（失われた）標的核酸配列（例えば、ゲノムの標的核酸配列）が選択される。例えば、染色体９ｐ２１に位置するｐ１６領域（Ｄ９Ｓ１７４９、Ｄ９Ｓ１７４７、ｐ１６（ＩＮＫ４Ａ）、ｐ１４（ＡＲＦ）、Ｄ９Ｓ１７４８、ｐ１５（ＩＮＫ４Ｂ）、及びＤ９Ｓ１７５２を含む）が、特定の膀胱癌で欠失しいている。第１染色体短腕の遠位領域を含む染色体欠失（例えば、ＳＨＧＣ５７２４３、ＴＰ７３、ＥＧＦＬ３、ＡＢＬ２、ＡＮＧＰＴＬ１、及びＳＨＧＣ−１３２２を包含する）、及び１９番染色体の動原体周辺領域（例えば、１９ｐ１３−１９ｑ１３）（例えば、ＭＡＮ２Ｂ１、ＺＮＦ４４３、ＺＮＦ４４、ＣＲＸ、ＧＬＴＳＣＲ２、及びＧＬＴＳＣＲ１を包含する）は、中枢神経系の所定の型の固形腫瘍の特徴的な分子構造である。

前述の例は例示の目的のためにのみ提供されており、限定を意図するものではない。腫瘍性形質転換及び／又は増殖と相関する他の多くの細胞遺伝学的異常は、当業者に知られている。標的核酸配列（例えばゲノム標的核酸配列）は、腫瘍性変性と相関し、開示の方法において実用的であり、そのために開示されたプローブを調製することができ、またＥＧＦＲ遺伝子を含有し（７ｐ１２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号＿ＮＣ＿０００００７，ヌクレオチド５５０５４２１９−５５２４２５２５），Ｃ−ＭＹＣ遺伝子（８ｑ２４．２１；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿０００００８，ヌクレオチド１２８８１７４９８−１２８８２２８５６），Ｄ５Ｓ２７１（５ｐ１５．２），リポ蛋白リパーゼ（ＬＰＬ）遺伝子（８ｐ２２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿０００００８，ヌクレオチド１９８４１０５８−１９８６９０４９），ＲＢ１（１３ｑ１４；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿００００１３，ヌクレオチド４７７７５９１２−４７９５４０２３），ｐ５３（１７ｐ１３．１；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿００００１７，相補体，ヌクレオチド７５１２４６４−７５３１６４２）），Ｎ−ＭＹＣ（２ｐ２４；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿０００００２，相補体，ヌクレオチド１５１８３５２３１−１５１８５４６２０），ＣＨＯＰ（１２ｑ１３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿００００１２，相補体，ヌクレオチド５６１９６６３８−５６２００５６７），ＦＵＳ（１６ｐ１１．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿００００１６，ヌクレオチド３１０９８９５４−３１１１０６０１），ＦＫＨＲ（１３ｐ１４；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿００００１３，相補体，ヌクレオチド４００２７８１７−４０１３８７３４）ならびに例えば：ＡＬＫ（２ｐ２３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿０００００２，相補体，ヌクレオチド２９２６９１４４−２９９９７９３６），Ｉｇ重鎖，ＣＣＮＤ１（１１ｑ１３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿００００１１，ヌクレオチド６９１６５０５４．．．６９１７８４２３），ＢＣＬ２（１８ｑ２１．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿００００１８，相補体，ヌクレオチド５８９４１５５９−５９１３７５９３），ＢＣＬ６（３ｑ２７；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿０００００３，相補体，ヌクレオチド１８８９２１８５９−１８８９４６１６９），ＭＡＬＦ１，ＡＰ１（１ｐ３２−ｐ３１；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿０００００１，相補体，ヌクレオチド５９０１９０５１−５９０２２３７３），ＴＯＰ２Ａ（１７ｑ２１−ｑ２２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿００００１７，相補体，ヌクレオチド３５７９８３２１−３５８２７６９５），ＴＭＰＲＳＳ（２１ｑ２２．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿００００２１，相補体，ヌクレオチド４１７５８３５１−４１８０１９４８），ＥＲＧ（２１ｑ２２．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿００００２１，相補体，ヌクレオチド３８６７５６７１−３８９５５４８８）；ＥＴＶ１（７ｐ２１．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿０００００７，相補体，ヌクレオチド１３８９７３７９−１３９９５２８９），ＥＷＳ（２２ｑ１２．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿００００２２，ヌクレオチド２７９９４２７１−２８０２６５０５）；ＦＬＩ１（１１ｑ２４．１−ｑ２４．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿００００１１，ヌクレオチド１２８０６９１９９−１２８１８７５２１），ＰＡＸ３（２ｑ３５−ｑ３７；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ取得番ＮＣ＿０００００２，相補体，ヌクレオチド２２２７７２８５１−２２２８７１９４４），ＰＡＸ７（１ｐ３６．２−ｐ３６．１２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿０００００１，ヌクレオチド１８８３００８７−１８９３５２１９），ＰＴＥＮ（１０ｑ２３．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿００００１０，ヌクレオチド８９６１３１７５−８９７１６３８２），ＡＫＴ２（１９ｑ１３．１−ｑ１３．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿００００１９，相補体，ヌクレオチド４５４３１５５６−４５４８３０３６），ＭＹＣＬ１（１ｐ３４．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿０００００１，相補体，ヌクレオチド４０１３３６８５−４０１４０２７４），ＲＥＬ（２ｐ１３−ｐ１２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿０００００２，ヌクレオチド６０９６２２５６−６１００３６８２）およびＣＳＦ１Ｒ（５ｑ３３−ｑ３５；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ受入番号ＮＣ＿０００００５，相補体，ヌクレオチド１４９４１３０５１−１４９４７３１２８）を含有する。開示された標的核酸プローブ又は方法は、上記の遺伝子の何れかの少なくとも何れか一つ（またはそれ以上、規定通りに）を含む、ヒト染色体のそれぞれの領域を含めることができる。例えば、一部開示されたプローブ又は方法についての標的核酸配列は、合計で少なくとも１０００００塩基対（例えば、少なくとも２５００００塩基対、又は少なくとも５０００００塩基対）又は１０００００塩基対と５０００００塩基対の間の合計において、上記の遺伝子及び十分な付加的な連続ゲノム配列（遺伝子の５’、遺伝子の３’又はその組合わせの何れであろうと）のいずれか１つを含む。

所定の実施態様において、標的核酸分子に対して特異的なプローブが（同じ又は異なるが類似のサンプル中で）染色体特異的（セントロメアなど）プローブなど染色体番号の指標を提供する第二のプローブと組み合わせて、アッセイされる。例えば、少なくともＨＥＲ２遺伝子を含有する第１７染色体の領域に対して特異的なプローブ（ＨＥＲ２プローブ）は、第１７染色体のセントロメア（１７ｐ１１．１−ｑ１１．１）に位置するアルファサテライトＤＮＡにハイブリダイズするＣＥＰ１７プローブと組み合わせて使用することができる。ＣＥＰ １７プローブを包含することで、ＨＥＲ２遺伝子の相対的コピー数が決定されることが可能となる。例えば、正常なサンプルはＨＥＲ２／ＣＥＰ１７の比が２未満であろうが、ＨＥＲ２遺伝子が倍加したサンプルはＨＥＲ２／ＣＥＰ１７の比が２．０以上であろう。同様に、任意の他の選択されたゲノムの標的配列の位置に対応するＣＥＰセントロメアプローブはまた、同一（又は別の）染色体上の一意的な標的に対するプローブと組み合わせて使用することができる。

他の実施例において、標的核酸配列（例えば、ゲノムの標的核酸配列）が、疾患又は病気に関連付けられているウイルス又は他の微生物から選択される。細胞又は組織サンプル中のウイルス又は微生物由来の標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）の検出は、生物の存在を示す。例えばプローブは、発癌性または病原性ウイルス、バクテリアまたは細胞内寄生虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫および他のマラリア原虫種、リーシュマニア（ｓｐ．）、クリプトスポリジウム、赤痢アメーバ及びランブル鞭毛虫、並びに、トキソプラズマ属、アイメリア属、タイレリア属およびバベシア属の種）から選択することができる。

幾つかの実施例において、標的核酸配列（例えばゲノムの標的核酸配列）は、ウイルスゲノムである。例示的なウイルスおよび相当するゲノム配列（ＧＥＮＢＡＮＫ^ＴＭ括弧内に参照配列受入番号記載）は、ヒトアデノウイルスＡ（ＮＣ＿００１４６０），ヒトアデノウイルスＢ（ＮＣ＿００４００１），ヒトアデノウイルスＣ（ＮＣ＿００１４０５），ヒトアデノウイルスＤ（ＮＣ＿００２０６７），ヒトアデノウイルスＥ（ＮＣ＿００３２６６），ヒトアデノウイルスＦ（ＮＣ＿００１４５４），ヒトアストロウイルス（ＮＣ＿００１９４３），ヒトＢＫポリオーマウイルス（Ｖ０１１０９；ＧＩ：６０８５１）ヒトボカウイルス（ＮＣ＿００７４５５），ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＮＣ＿００２６４５），ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＮＣ＿００６５７７），ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＮＣ＿００５８３１），ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＮＣ＿００５１４７），ヒトエンテロウイルスＡ（ＮＣ＿００１６１２），ヒトエンテロウイルスＢ（ＮＣ＿００１４７２），ヒトエンテロウイルスＣ（ＮＣ＿００１４２８），ヒトエンテロウイルスＤ（ＮＣ＿００１４３０），ヒトエリスロウイルスＶ９（ＮＣ＿００４２９５），ヒト泡沫状ウイルス（ＮＣ＿００１７３６），ヒトヘルペスウイルス１（単純ヘルペスウイルス１型）（ＮＣ＿００１８０６），ヒトヘルペスウイルス２（単純ヘルペスウイルス２型）（ＮＣ＿００１７９８），ヒトヘルペスウイルス３（水痘帯状疱疹ウイルス）（ＮＣ＿００１３４８），ヒトヘルペスウイルス４の１型（エプスタインバーウイルス１型）（ＮＣ＿００７６０５），ヒトヘルペスウイルス４の２型（エプスタインバーウイルス２型）（ＮＣ＿００９３３４），ヒトヘルペスウイルス５病原菌ＡＤ１６９（ＮＣ＿００１３４７），ヒトヘルペスウイルス５病原菌Ｍｅｒｌｉｎ Ｓｔｒａｉｎ（ＮＣ＿００６２７３），ヒトヘルペスウイルス６Ａ（ＮＣ＿００１６６４），ヒトヘルペスウイルス６Ｂ（ＮＣ＿０００８９８），ヒトヘルペスウイルス７（ＮＣ＿００１７１６），ヒトヘルペスウイルス８のＭ型（ＮＣ＿００３４０９），ヒトヘルペスウイルス８のＰ型（ＮＣ＿００９３３３），ヒト免疫不全ウイルス１（ＮＣ＿００１８０２），ヒト免疫不全ウイルス１（ＮＣ＿００１７２２），ヒトメタ肺炎ウイルス（ＮＣ＿００４１４８），ヒトパピロマウイルス−１（ＮＣ＿００１３５６），ヒトパピロマウイルス−１８（ＮＣ＿００１３５７），ヒトパピロマウイルス−２（ＮＣ＿００１３５２），ヒトパピロマウイルス５４（ＮＣ＿００１６７６），ヒトパピロマウイルス６１（ＮＣ＿００１６９４），ヒトパピロマウイルス−ｃａｎｄ９０（ＮＣ＿００４１０４），ヒトパピロマウイルスＲＴＲＸ７（ＮＣ＿００４７６１），ヒトパピロマウイルス１０型（ＮＣ＿００１５７６），ヒトパピロマウイルス１０１型（ＮＣ＿００８１８９），ヒトパピロマウイルス１０３型（ＮＣ＿００８１８８），ヒトパピロマウイルス１０７型（ＮＣ＿００９２３９），ヒトパピロマウイルス１６型（ＮＣ＿００１５２６），ヒトパピロマウイルス２４型（ＮＣ＿００１６８３），ヒトパピロマウイルス２６型（ＮＣ＿００１５８３），ヒトパピロマウイルス３２型（ＮＣ＿００１５８６），ヒトパピロマウイルス３４型（ＮＣ＿００１５８７），ヒトパピロマウイルス４型（ＮＣ＿００１４５７），ヒトパピロマウイルス４１型（ＮＣ＿００１３５４），ヒトパピロマウイルス４８型（ＮＣ＿００１６９０），ヒトパピロマウイルス４９型（ＮＣ＿００１５９１），ヒトパピロマウイルス５型（ＮＣ＿００１５３１），ヒトパピロマウイルス５０型（ＮＣ＿００１６９１），ヒトパピロマウイルス５３型（ＮＣ＿００１５９３），ヒトパピロマウイルス６０型（ＮＣ＿００１６９３），ヒトパピロマウイルス６３型（ＮＣ＿００１４５８），ヒトパピロマウイルス６ｂ型（ＮＣ＿００１３５５），ヒトパピロマウイルス７型（ＮＣ＿００１５９５），ヒトパピロマウイルス７１型（ＮＣ＿００２６４４），ヒトパピロマウイルス９型（ＮＣ＿００１５９６），ヒトパピロマウイルス９２型（ＮＣ＿００４５００），ヒトパピロマウイルス９６型（ＮＣ＿００５１３４），ヒトパラインフルエンザウイルス１（ＮＣ＿００３４６１），ヒトパラインフルエンザウイルス２（ＮＣ＿００３４４３），ヒトパラインフルエンザウイルス３（ＮＣ＿００１７９６），ヒトパレコウイルス（ＮＣ＿００１８９７），ヒトパレコウイルス４（ＮＣ＿００７０１８），ヒトパレコウイルスＢ１９（ＮＣ＿０００８８３），呼吸系発疹ウイルス（ＮＣ＿００１７８１），ヒトライノウイルスＡ（ＮＣ＿００１６１７），ヒトライノウイルスＢ（ＮＣ＿００１４９０），ヒトスプマウイルス（ＮＣ＿００１７９５），ヒトＴ−リンパ向性ウイルス１（ＮＣ＿００１４３６），ヒトＴ−リンパ向性ウイルス２（ＮＣ＿００１４８８）を含有する。

特定の例において、標的核酸配列（例えば、ゲノムの標的核酸配列）は、発癌性ウイルス、例えばイプシュタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）またはヒトパピロマウイルス（ＨＰＶ、例えばＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８）に由来する。他の実施例において、標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）は、病原性ウイルス、例えば呼吸器合胞体ウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳウイルス）、アデノウイルス、ポリオーマウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、または単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）に由来する。

Ｄ．キット
幾つかの実施態様において、本発明は、本明細書に開示された少なくとも１つの標的核酸プローブ、及び任意で、少なくとも１つの一次プローブを含むキットを提供する。例えば、ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、及び／又はＳＩＳＨなどのハイブリダイゼーション手順のためのキットは、本明細書に記載される少なくとも一つの標的核酸プローブ、及び任意で、少なくとも一つの一次プローブを含む。幾つかの実施態様において、キットはさらに、少なくとも一つの標的核酸プローブと組み合わせて使用するための１つ以上の検出プローブを含む。幾つかの実施態様において、キットはさらに、一以上の検出プローブと組み合わせて使用するための少なくとも特異的結合剤を含む。従って、キットは、１つ以上の標的核酸プローブ、１つ以上の検出プローブ、及び１つ以上の特異的結合剤を含むことができる。

キットはまた、インサイツハイブリダイゼーションアッセイを実施するための、又はプローブを作成するための一以上の試薬を含み得る。例えば、キットは、一以上のバッファー、標識されたｄＮＴＰ、標識酵素（ポリメラーゼなど）、プライマー、核酸分解酵素フリーの水、及び標識化プローブを作成するためのインストラクションとともに、少なくとも一つの核酸分子（又はそのような分子の集団）を含めることができる。

一実施例において、キットは、バッファー及びインサイツハイブリダイゼーションを行うための他の試薬、例えばパラフィン前処理バッファー、プロテアーゼ、及びプロテアーゼバッファ、プレハイブリダイゼーションバッファー、ハイブリダイゼーションバッファー、洗浄バッファ、対比染色、封入剤、またはそれらの組み合わせなどと一緒に、１つ以上の標的核酸プローブ、１つ以上の検出プローブ及び１つ以上の特異的結合剤を含む。キットには、必要に応じてさらに、ハイブリダイゼーションおよびプローブの信号を評価するための対照のスライドを含めることができる。

Ｅ．自動化
当業者は、ハプテンコンジュゲートを使用するための本明細書に開示される方法の実施態様が自動化することができることを理解するであろう。ベンタナ・メディカル・システムズ社(Ventana Medical Systems, Inc.)は、米国特許第５６５０３２７号、第５６５４２００号、第６２９６８０９号、第６３５２８６１号、第６８２７９０１号及び第６９４３０２９号、及び米国特許出願公開第２００３０２１１６３０号及び第２００４００５２６８５号を含む、自動化された分析を実行するためのシステムおよび方法を開示する数々の米国特許の譲受人であり、それらの各々が参照により本明細書に援用される。高分子ハプテン染色手順の特定の実施態様が、様々な自動化工程を使用して行うことができる。

典型的な作業実施態様に関する更なる詳細は、実施例に記載される。

実施例１
ポリタグプローブを使用する固定組織中のｍＲＮＡの検出
ホルマリン固定パラフィン包埋異種移植組織は、キシレンを使用して脱パラフィン処理し、ホルマリン、酸変性（０．３ＭのＨＣｌ）、クエン酸ナトリウム／Ｔｗｅｅｎ ２０緩衝液及びプロテアーゼによる逐次処理によりハイブリダイゼーション用に調整した。調製後、ポリタグリボプローブ（配列番号：７−１８；１ｕｇ／ｍｌでホルムアミドを含むハイブリダイゼーション緩衝液で希釈）が組織上に沈着され、６５℃で６時間のハイブリダイゼーション前に８０℃で変性させた。非結合及び非特異的に結合したプローブは３回の高ストリンジェンシー洗浄（０．１ｘＳＳＣ、７５℃）で除去した。調製後、ハプテン標識抗ポリタグ検出オリゴヌクレオチド（配列番号：２４；５ｕｇ／ｍｌでホルムアミドを含むハイブリダイゼーション緩衝液で希釈）が組織上に沈着され、３７°Ｃで１時間のハイブリダイゼーション前に６０°Ｃで変性させた。非結合及び非特異的に結合した検出オリゴは２回の低ストリンジェンシー洗浄（２ｘＳＳＣ、３７℃）で除去した。ｍＲＮＡ標的に結合したハプテンはカゼイン（２０ｎＭ）を含む緩衝希釈剤で希釈した量子ドット（インビトロジェン）にコンジュゲートした同族マウス抗ハプテンモノクローナル抗体を用いて検出した。核はＤＡＰＩを用いて対比染色した。スライドはエタノールを増加した洗浄を用いて脱水し、Ｃｙｔｏｓｅａｌ６０封入剤を使用してカバーガラスをかけた。蛍光シグナルは、干渉分光イメージングを用いて捕獲した。図３を参照。

実施例２
スライド・ガラスに固定したＲＮＡのポリタグプローブによる検出
ドットブロット染色。１マイクログラムから１ナノグラムのインビトロで転写されたＲＮＡ標的がＳｐｏｔｔｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩ（Ｇｅｎｏｒａｍａ）に希釈され、１ｕｌがアミノシランコーティングされたマイクロアレイスライド（Ｇｅｎｏｒａｍａ）上に沈着され、乾燥後、ＵＶ光を用いて架橋された。スライドは、カゼインを含む緩衝抗体希釈を用いてブロックし、ポリタグリボプローブ（配列番号：１９−２１；１ｕｇ／ｍｌでホルムアミドを含むハイブリダイゼーション緩衝液で希釈）がスライド上に沈着され、６５℃で６時間のハイブリダイゼーション前に８０℃で変性させた。非結合及び非特異的に結合したプローブは３回の高ストリンジェンシー洗浄（０．１ｘＳＳＣ、７５℃）で除去した。ハプテン標識抗ポリタグ検出オリゴヌクレオチド（配列番号：２７、３０及び［追加ｇｉｎａ配列番号］；５ｕｇ／ｍｌでホルムアミドを含むハイブリダイゼーション緩衝液で希釈）が組織上に沈着され、３７℃で１時間のハイブリダイゼーション前に６０℃で変性させた。非結合及び非特異的に結合した検出オリゴは２回の低ストリンジェンシー洗浄（２ｘＳＳＣ、３７℃）で除去した。ｍＲＮＡ標的に結合したハプテンはカゼイン（２０ｎＭ）を含む緩衝希釈剤で希釈した量子ドット（インビトロジェン）にコンジュゲートした同族マウス抗ハプテンモノクローナル抗体を用いて検出した。スライドはエタノールを増加した洗浄を用いて脱水し、Ｃｙｔｏｓｅａｌ６０封入剤を使用してカバーガラスをかけた。干渉分光イメージングを用いて捕獲したＱｄｏｔシグナルは、別々の検体のチャンネルにデコンボリューションされ、ＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェアを使用して可視化するために重ね合わせた。図２を参照。

実施例３
ポリタグプローブによる固定組織中の核ＤＮＡの検出
第１７染色体セントロメア特異的ポリタグプローブ（配列番号６）は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによる直鎖状プラスミドの転写により生成された。ガラス顕微鏡スライド上の５ｕＭの薄片中のホルマリン固定パラフィン包埋組織は、以下に記載されるようにハイブリダイゼーションと検出工程を受けた。上記のように脱パラフィン後、スライドは９０℃で１２分間クエン酸塩／Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液で処理され、３７度で８分間プロテアーゼで処理した。ホルムアミド含有緩衝液中に処方されたポリタグプローブは、スライドに適用され、その後８分間９２℃に加熱し、二本鎖ＤＮＡ標的を変性させた。８時間のハイブリダイゼーション後、スライドは２×ＳＳＣにより８分間７２℃で二回洗浄した。

同様に処方されたハプテン標識化検出オリゴが追加された（配列番号２４）。５５℃への８分間の加熱後に、ハイブリダイゼーションを１時間３７℃で進行させた。３７℃で２×ＳＳＣで２回洗浄した後に、ハイブリダイズしたプローブをウサギ抗ＤＮＰモノクローナル抗体を用いて検出し、その後洗浄し、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体が適用された。ペルオキシダーゼのシグナルは銀沈着により検出された。図４を参照。

実施例４
標的核酸及び検出プローブセット
標的核酸プローブ（ＲＮＡ）が、プローブ配列をコードするＤＮＡ鋳型からプローブを転写することによって合成した。以下の検出標的配列（ポリタグとも呼ばれる）は、標的プローブ配列（標的ＤＮＡにハイブリダイズする配列）と操作可能に結合して配置され、完全長標的核酸プローブに１０回から４０回反復された。

第１７染色体セントロメアに特異的なＲＮＡ標的核酸プローブ：
アクチンｍＲＮＡに特異的なＲＮＡ標的核酸プローブ：
ここで、ｎ＝５６、すなわちポリタグの５６反復。

ヒト１８リボソームＲＮＡに特異的なＲＮＡ標的核酸プローブ：
ここで、ｎ＝４０、すなわちポリタグの４０反復。

検出オリゴヌクレオチドは、標準的ホスホラミダイト及び製造業者によって提供されるプロトコルを使用してマーメイド・オリゴヌクレオチドシンセサイザー（Ｍｅｒｍａｄｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｅｌｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）で合成した。Ｒで示されるハプテンが、望まれるハプテンを含む脱塩基ホスホラミダイトに導入された。ソフィア（Ｓｏｐｈｉａ）検出プローブが、ＤＮＰ（ジニトロフェノール）で標識され、５８５ｎＭで発光するＱｄｏｔｓに結合した抗ＤＮＰ抗体で使用された。ラクエル（Ｒａｑｕｅｌ）検出プローブが、ＴＳ（チアゾールスルホンアミド）で標識され、６５５ｎＭで発光するＱｄｏｔｓに結合した抗ＴＳ抗体で使用された。Ｑｉｎｇｘｉａ検出プローブが、ＤＣ（ジエチルクマリン）で標識され、６０５ｎＭで発光するＱｄｏｔｓに結合した抗ＤＣ抗体で使用された。エバ（Ｅｖａ）検出プローブが、ＢＦ（ベンゾフラザン）で標識され、５２５ｎＭで発光するＱｄｏｔｓに結合した抗ＢＺ抗体で使用された。

ＬＮＡ又はＰＮＡ検出プローブとの使用に適した短いポリタグ配列：

ハプテン標識化ＬＮＡ検出プローブでの使用に適した配列：

実施例５
一本鎖ＤＮＡポリタグプローブを用いた検出
Ａ）一本鎖ＤＮＡポリタグプローブの構築
この実施例では、細胞又は組織中の核酸標的を検出するためのポリタグシステムのアプリケーションを説明する。固有配列の５つのコピーの直接反復（配列ＫＫ５）が、ヒトゲノムに有意な配列相同性を持たずに化学的に合成された。ポリタグＫＫは、プラスミドベクターｐｕｃ１９にクローニングされ、クローンの配列は配列決定により確認された。ＫＫ５を重複させることによる１０コピーの直接反復型が、標準的な分子生物学的技術を用いて構築された。

ヒトのＰＴＥＮ遺伝子が目的とする遺伝子として選択され、イントロン配列のみが、ＰＣＲプライマーの設計および増幅のために選択された。全ては設計されたプライマー（プライマー配列と対応するＰＣＲアンプリコン配列は以下に一覧される）を持つ約２００塩基対である、３６のＤＮＡ断片が増幅された。リン酸基をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてＤＮＡ断片の５’末端に付加した後、ＤＮＡ断片がアガロースゲルから精製された。ＰＴＥＮ ＰＣＲ断片は、制限酵素ＳｍａＩで直線化したＫＫ５又はＫＫ１０配列とＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結された。一本鎖ＤＮＡ、ＰＴＥＮポロタグプローブは、１）鋳型としての連結産物とともに、ＫＫ配列（ＫＫ５Ｒｐ）に相補的である一つの共通５’リン酸化プライマーを有する（ＰＴＥＮ ＰＣＲ断片を生成するために以前使用された）ＰＴＥＮ特異的順方向プライマーと一緒に連結された、ＫＫ５又はＫＫ１０配列を持つＰＴＥＮ断片のＰＣＲ増幅、２）酵素が好ましくは、５’リン酸基を持つＤＮＡ鎖を分解するゆえの、ＰＴＥＮに対する一本鎖ＤＮＡポリタグプローブを生成したＰＣＲ断片のラムダエキソヌクレアーゼ処理、により作成された。

Ｂ）目的の核酸標的の検出のためのポリタグｓｓＤＮＡプローブの使用の例。
この例において、ＰＴＥＮポリタグｓｓＤＮＡプローブ（プローブ）がパラフィン包埋組織スライド上のヒト細胞由来のその標的を検出するために用いられた：３６のＰＴＥＮ ＰＣＲ断片のうち３０（ＰＴＥＮ ＰＣＲ配列リストの番号１ー３０）がこの例において用いられた。組織は、脱パラフィンされ、水和され、ハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーションは、６時間４５℃で行われ、ブロッキングＤＮＡは使用されなかった。２×ＳＳＣによるポストプローブハイブリダイゼーション洗浄が７２℃で８分間行われ、合計３回繰り返した。ＫＫ検出オリゴハイブリダイゼーション及び洗浄についての手順は、１）５５℃で８分間変性させ；２）４５℃で１時間ハイブリダイゼーションし；３）４５℃で３回、２×ＳＳＣで洗浄する。ＳＩＳＨによるシグナルの検出は公開されている。５つのコピーのポリタグと１０コピーのポリタグプローブは明瞭で強いシグナルを与えた。５つのコピーについての結果は図５ａを、１０コピーについての結果は図５ｂを参照。検出手順は、ベンタナ・メディカル・システムズのＢｅｎｃｈＭａｒｋ ＸＴプラットフォーム上で自動化され、そして、それは手動検出システム並びに、他の半自動または全自動検出システムに普遍的に適応する必要がある。

ポリタグ設計の変形として、３０から８０ヌクレオチド長のユニークなアダプター配列の一コピーが標的核酸（ポリタグ配列とは異なるもの）に結合された；ポリタグ増幅器（ポリタグ＋アダプター配列と相補的なアダプター配列領域）を、次に標的配列にハイブリダイズさせる。具体的には、ハイブリダイゼーションは、標的核酸プローブ上のアダプター配列とポリタグプローブ上のアダプター配列領域との間で起きる。この設計はパラフィン包埋ヒト組織スライド上でＰＴＥＮ遺伝子を検出するために使用された。一本鎖ポリタグ増幅器が構築され、ＰＣＲ増幅によるアダプターがタグ付けされた遺伝子特異的な一本鎖ＤＮＡプローブが構築され、（Ａ）で説明したように、適切なテンプレートとプライマーを用いたラムダエキソヌクレアーゼ処理が続いた。

組織は、脱パラフィンされ、水和され、そしてハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーションは、６時間４５℃で行われ、ブロッキングＤＮＡは使用されなかった。２×ＳＳＣによるポストプローブハイブリダイゼーション洗浄が７２℃で８分間行われ、合計３回繰り返した。ポリタグ増幅器のハイブリダイゼーションおよび洗浄の手順は、プローブに対するものと似ているが、わずか１時間のハイブリダイゼーションの時間である。ＫＫ検出オリゴハイブリダイゼーション及び洗浄についての手順は、１）５５℃で８分間変性させ；２）４５℃で１時間ハイブリダイゼーションし；３）４５℃で３回、２×ＳＳＣで洗浄する。ＳＩＳＨによるシグナルの検出は公開されている。ポリタグプローブ（１０コピー）は明瞭で強いシグナルを与えた。図６を参照。検出手順は、ベンタナ・メディカル・システムズのＢｅｎｃｈＭａｒｋ ＸＴプラットフォーム上で自動化されたが、それは手動検出システム並びに、他の半自動または全自動検出システムに普遍的に適応する必要がある。

Ｃ）核酸配列

上記の明細書に記載されている全ての刊行物および特許は、参照により本明細書に援用される。本発明の記載された方法及びシステムの様々な変更及び変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施態様に関連して説明されてきたが、請求された発明が不当にそのような特定の実施態様に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際に、関連する分野の当業者に明らかである本発明を実施するための記載された方法の様々な変更は、以下の特許請求の範囲内にあるものとする。

Claims (6)

1. 組織サンプル中の第一の細胞の標的核酸配列をインサイツで検出するための方法において、
   前記組織サンプルを、前記第一の細胞の標的核酸配列に相補的な核酸配列と、少なくとも一つの検出プローブ核酸配列に相補的であり、前記標的核酸配列に非相補的である複数の第一の検出標的配列を含む検出標的部分を含む、標的プローブ部分を含む第一の核酸分子と、前記第一の核酸分子の前記検出標的部分が前記細胞の標的核酸配列に直接ハイブリダイズする条件下で接触させ、
   前記第一の核酸分子を、各々が前記第一の核酸分子の前記検出配列に相補的な検出プローブ部分、及び前記検出プローブ部分の５’又は３’の何れかに少なくとも一つの第一の検出可能な部分を含む検出可能な成分部分を含み、ここで、前記少なくとも一つの第一の検出可能な部分が核酸分子に組み込まれている、複数の第二の核酸分子と、前記第二の核酸分子の前記検出プローブ部分が前記第一の核酸分子の前記第一の検出標的配列にハイブリダイズする条件下で接触させ、
   前記少なくとも一つの第一の検出可能な部分を検出すること
   を含む方法。
2. 前記第一の核酸分子の前記標的プローブ部分と、前記標的核酸配列と、前記第二の核酸の前記検出プローブ部分と、前記第一の核酸分子の前記検出標的配列が、摂氏１０度以内の融点を有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記細胞の標的核酸配列が、ゲノムＤＮＡ、核ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ及び細胞質核酸からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
4. 組織サンプルを、第二の細胞の標的核酸配列に相補的な核酸配列と、少なくとも一つの検出プローブ核酸配列に相補的であり、前記標的核酸配列に非相補的である複数の第二の検出標的配列を含む検出標的部分を含む標的プローブ部分を含む第三の核酸分子と、前記第三の核酸分子の前記標的プローブ部分が前記細胞の標的核酸配列に直接ハイブリダイズする条件下で接触させ、
   前記第三の核酸分子を、各々が前記第三の核酸分子の前記検出配列に相補的な検出プローブ部分と、前記検出プローブ部分の５’又は３’の何れかに少なくとも一つの第二の検出可能な部分を含む検出可能な成分部分を含み、ここで、前記少なくとも一つの第二の検出可能な部分が核酸分子に組み込まれている、複数の第四の核酸分子と、前記第四の核酸分子の前記検出プローブ部分が前記第三の核酸分子の前記第二の検出標的配列にハイブリダイズする条件下で接触させ、
   前記少なくとも一つの第二の検出可能な部分を検出すること
   を更に含む請求項１に記載の方法。
5. 前記第一及び第二の細胞の標的核酸配列が同一分子の一部である、請求項４に記載の方法。
6. 前記第一及び第二の検出可能部分が同一である、請求項５に記載の方法。