JP5726305B2 - 肝ガン治療のための方法及び組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、米国特許法第119条(e)に基づいて、2010年7月26日に出願された仮出願番号第61/367,851号、及び2011年4月15日に出願された仮出願番号第61/476,204号利益を主張し、これらのすべての内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、電子出願によりASCII形式で提出された配列表を含む。2011年7月14日に作成された前記ASCIIコピーは、BR(005WO).txtと名付けられ、79,913バイトのサイズである。
本開示は、とりわけ、プロガストリンに対して特異的な抗体を含む組成物を被験体に投与することによって、肝ガンを有するか、又は肝ガンの再発のリスクがある被験体を処置する方法に関する。
肝ガンは、世界で5番目に多いガンであり、ガンに関連した死亡の3番目に多い原因である。Llovet et al., 2003, "Hepatocellular carcinoma," Lancet 362:1907-17。肝ガンの最も多い形態は、HCCとしても公知の肝細胞ガンであり、他の基礎肝臓損傷、典型的には肝炎又は肝硬変に関連して発症することが多い。Thorgeirsson et al., 2002, "Molecular pathogenesis of human hepatocellular carcinoma," Nature Genetics 31:339-346。あまり多くないが、他の形態の肝ガンは、肝芽腫及び胆管ガンを含む。
ガストリンは、胃酸の分泌を刺激する消化管ペプチドホルモンである。成体哺乳動物では、それは、特に胃前庭部、そしてある程度は上部小腸及び膵臓におけるG細胞によって産生される。図1を参照すると、ガストリン遺伝子は、シグナル配列(下線部)を含む101アミノ酸のポリペプチド(プレプロガストリンと称される)に翻訳され、これが切断されて、プロガストリン(PG)(80アミノ酸残基のポリペプチド)が生じる。3つの形態G34、G17及びG14(図示せず)で主に見られるガストリンは、プロガストリンプロセシングから生じる。
7.1.肝ガン
肝ガンは、肝細胞ガン(HCC)、胆管ガン及び肝芽腫を含む。ほとんどの肝ガンはHCCであり、肝炎、肝硬変、及び/又はアフラトキシンB1中毒を含む他の基礎肝臓病変(これは、肝臓の炎症及び慢性傷害並びに肝細胞の再生を引き起こす)に罹患している個体において生じることが多い。現在、肝ガンの診断は、超音波検査、細針生検、及び特定のマーカータンパク質(例えば、αフェトプロテインを含む)の血中レベルの検出の組み合わせに基づいている。HCCは、腫瘍のサイズ、数及び形態(例えば、カプセル化又は浸潤性)、並びに肝機能に基づいて、早期、中間、進行、及び末期のガンに分類され得る。
再発は、肝ガンにおいて特に問題である。ガンの再発は、一般的には、処置後、及び早期ガンが検出され得ない期間後に、ガンが戻ってくることとして理解されている。肝ガンの高再発率に関して、外科手術中にすべてのガン細胞を除去することの失敗、経皮的アブレーション中の器具によるガン細胞の拡散、及び化学療法剤に対する抵抗性を含む様々な説明がなされている。再発を減少させるか、又は排除する肝ガン治療のニーズがある。
固形腫瘍は、必ずしも均質な組織ではない。むしろ、いくつかの腫瘍は、異なる表現型特性及び機能特性を有する複数の異常な細胞型を含む。この点において、このような腫瘍は、異常な臓器と類似している。固形腫瘍を含む細胞は、同じホストにおける新たな部位に移植されたか、又は同じ若しくは異なる種の新たなホストに移植された場合に、それらが新たな腫瘍の形成をイニシエーションできるその程度の点で異なる。この特性を有する細胞は、腫瘍又はガンイニシエーティング細胞、あるいは腫瘍又はガンの幹細胞として公知である。例えば、Chiba et al., 2009, "Cancer stem cells in hepatocellular carcinoma: Recent progress and perspective," Cancer Letters 286:145-153を参照のこと。このような細胞は、非選択プールの肝ガン細胞が免疫不全マウスにおいて腫瘍を形成するのに必要な数よりもずっと少ない数が免疫不全マウスに移植された場合に、腫瘍を形成する(「サイドポピュレーション」肝ガン細胞1000個に対して、非選別肝ガン細胞100万個)。Chiba et al(前掲)を参照のこと。
ガン幹細胞の特性を有し、放射線及び/又は化学療法剤に対する耐性の増大を示す腫瘍細胞が同定された。Eyler, C.E., et al., 2008, J. Clin. Oncol., 26:2839-2845。放射線及び化学療法に対するガン幹細胞の耐性の増大は、このような治療の効果を減少させるだけでなく、腫瘍がもはや検出不可能になり、治療が成功した後であっても、このような細胞が生き残ることも可能にし得る。このような患者において、処置は、最初は有効であり、診断スキャンにおける腫瘍の縮小又は消失を引き起こすが、腫瘍は、処置中断後しばらくして再発する。そして、これにより、以前に肝ガンの処置を受けた個体における再発の現象を説明できる。Eyler(前掲)。従って、以前に肝ガンの処置を受けた被験体であって、肝ガンの兆候が存在しない被験体における肝ガン幹細胞の成長を阻害するか、又はそれを殺傷することにより、再発を予防し得る。
以下の実施例に示されるように、肝ガン腫瘍及びHCC細胞株は、プロガストリンをコードするガストリン遺伝子(GAST)の発現の増加を示す。この発現は、2つの異なる肝ガン細胞株の「サイドポピュレーション」細胞(これは、肝ガン幹細胞の特徴を持つ)においてさらにより上昇している。いかなる作用理論に拘束されることも意図しないが、初期又は再発性の肝ガンを処置する方法の1つは、肝ガン幹細胞の成長を阻害する薬剤、好ましくは、腫瘍をイニシエーションする細胞の腫瘍形成能力を阻害する薬剤を投与することであると考えられる。
本開示は、治療効果を有する抗プロガストリン(「抗PG」)抗体の有効量を投与することによって、被験体における肝ガンを処置する方法を提供する。本開示の肝ガンを処置する方法は、以下のセクション7.11に詳細に記載されるPGを中和できる1つ以上の抗PG抗体を、肝ガンを有する個体に投与することによって達成される。本開示の方法において、ポリクローナル及びモノクローナル(例えば、キメラ、ヒト化、完全ヒト、全長、Fab、一本鎖)抗PG抗体を含む、PGを中和するあらゆる抗体を使用し得るが、これらに限定されない。適切な抗PG抗体は、in vitroで肝ガン細胞の成長を阻害できる。いくつかの実施態様では、抗PG抗体は、腫瘍をイニシエーションする特性を有する肝ガン細胞(肝ガン幹細胞、CD133、CD44、及びCD90からなる群より選択される1つ以上の細胞表面マーカーを持つ肝ガン細胞、及びHoechst33342色素を排出できる肝ガン細胞を含む)による低接着培養条件下におけるスフェロイド成長を阻害できる。
別の態様では、本開示は、肝ガンの再発を予防する方法であって、有効量の抗PG抗体を、予防を必要とする被験体に投与することを含む、方法を提供する。本開示の肝ガンの再発を予防する方法は、以下のセクション7.11に詳細に記載されるPGを中和できる1つ以上の抗PG抗体を、肝ガンの再発のリスクがある個体に投与することによって達成される。
本開示の方法において有用な抗PG抗体は、組成物中に製剤化し得る。場合により、組成物は、上記第2の薬剤などの1つ以上のさらなる薬剤を含み得る。組成物は、通常、医薬組成物(これは、滅菌されており、通常、薬学的に許容しうる担体を含むであろう)の一部として供給されるであろう。この医薬組成物は、(それを個体に投与する所望の方法に応じた)任意の適切な形態であり得る。
本開示の抗PG抗体又はその組成物は、一般的には、所望の結果を達成するのに有効な量(例えば、肝ガンを有する被験体における肝ガンを処置するのに有効な量、又は肝ガンの再発のリスクがある被験体における再発を予防するのに有効な量)で使用するであろう。有効量は、治療効果をもたらす量である。
本開示は、抗PG抗体による処置を受けている被験体をモニタリングして、処置が有効であるか否かを決定する方法も提供する。PGのレベルは、抗PG処置を受けている患者において測定し、測定されたレベルがベースラインPGレベルを超えるか、又はそれ未満であるかに基づいて、処置が有効であるか否かの指標として使用し得る。例えば、2010年1月8日に出願された「PROGASTRIN AND LIVER PATHOLOGIES」と題される米国仮特許出願第61/293,557号及び2011年1月4日に出願された「PROGASTRIN AND LIVER PATHOLOGIES」と題される米国特許出願第12/984,507号(それぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれる)を参照のこと。医療供給業者は、この情報を使用して、抗PG抗体の投与を継続するか、又は処置を改変するかを決定し得る。これらの方法を使用して、上記のように単独で使用されるか、又は他の処置と併用される抗PG処置をモニタリングし得る。
本明細書において開示される方法において有用な抗体は、ガストリン遺伝子の他の産物よりもヒトプロガストリンに特異的に結合するものである。図1を参照すると、ガストリン遺伝子は、シグナル配列(下線部)を含む101アミノ酸のポリペプチド(プレプロガストリンと称される)に翻訳され、これが切断されて、プロガストリン(80アミノ酸のポリペプチド)が生じる。次いで、プロガストリンは切断されて、配列においてプロガストリンの残基38〜71に対応する34アミノ酸の産物が生じ、次いで、これがそのカルボキシ末端においてグリシン残基で延長され、グリシン延長G34(「G34−Gly」)が生じる。この切断の副産物は、配列においてプロガストリンの残基75〜80に対応する6アミノ酸のペプチド(C末端隣接ペプチド、又はCTFPと称される)である。次いで、G34−Glyはさらに切断されて、配列においてプロガストリンの残基55〜71に対応し、G17−Glyと称される17残基のポリペプチドが生じる。G34−Gly及びG17−GlyのC末端グリシンを除去し、その後、C末端をアミド化することにより、G34及びG17がそれぞれ生じ、これらは両方ともC末端がアミド化されている。
(a)配列においてMAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19又はMAb20のVLCDRに対応するVLCDRと、配列においてMAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19又はMAb20のVHCDRに対応するVHCDRとを有する抗体;
(b)配列においてMAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19又はMAb20のVL及びVHCDRに対応するVLCDR及びVHCDRを有する抗体;
(c)抗体であって:
(i)VLCDR1が、QSIVHSNGNTY(「VLCDR1.3」;配列番号4)、QSLVHSSGVTY(「VLCDR1.4」;配列番号10)、QSLLDSDGKTY(「VLCDR1.16」;配列番号50)、及びSQHRTYT(「VLCDR1.19」;配列番号51)から選択され;
(ii)VLCDR2が、KVS(「VLCDR2.3」又は「VLCDR2.4」;配列番号5)、LVS(「VLCDR2.16」;配列番号53)、及びVKKDGSH(「VLCDR2.19」;配列番号54)から選択され;
(iii)VLCDR3が、FQGSHVPFT(「VLCDR3.3」;配列番号6)、SQSTHVPPT(「VLCDR3.4」;配列番号11)、WQGTHSPYT(「VLCDR3.16」;配列番号57)、及びGVGDAIKGQSVFV(「VLCDR3.19」;配列番号58)から選択され;
(iv)VHCDR1が、GYIFTSYW(「VHCDR1.3」;配列番号1)、GYTFSSSW(「VHCDR1.4」;配列番号7)、GYTFTSYY(「VHCDR1.16」;配列番号39)、及びGYSITSDYA(「VHCDR1.19」;配列番号40)から選択され;
(v)VHCDR2が、FYPGNSDS(「VHCDR2.3」;配列番号2)、FLPGSGST(「VHCDR2.4」;配列番号8)、INPSNGGT(「VHCDR2.16」;配列番号43)、及びISFSGYT(「VHCDR2.19」;配列番号44)から選択され;並びに
(vi)VHCDR3が、TRRDSPQY(「VHCDR3.3」;配列番号3)、ATDGNYDWFAY(「VHCDR3.4」配列番号9)、TRGGYYPFDY(「VHCDR3.16」;配列番号47)、及びAREVNYGDSYHFDY(「VHCDR3.19」;配列番号48)から選択される、抗体;
(d)配列においてMAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19又はMAb20のVLに対応するVLと、配列においてMAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19又はMAb20のVHに対応するVHとを有する抗体;並びに
(e)配列においてMAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19又はMAb20のVL及びVHに対応するVL及びVHを有する抗体。
(a)配列においてMAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22又はMAb23のVLCDRに対応するVLCDRと、配列においてMAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22又はMAb23のVHCDRに対応するVHCDRとを有する抗体;
(b)配列においてMAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22又はMAb23のVL及びVHCDRに対応するVLCDR及びVHCDRを有する抗体;
(c)抗体であって:
(i)VLCDR1が、KSLRHTKGITF(「VLCDR1.8」;配列番号49)及びQSLLDSDGKTY(「VLCDR1.13」;配列番号50)から選択され;
(ii)VLCDR2が、QMS(「VLCDR2.8」;配列番号52)及びLVS(「VLCDR2.13」;配列番号53)から選択され;
(iii)VLCDR3が、AQNLELPLT(「VLCDR3.8」;配列番号55)及びWQGTHFPQT(「VLCDR3.13」;配列番号56)から選択され;
(iv)VHCDR1が、GFTFTTYA(「VHCDR1.8」;配列番号37)及びGFIFSSYG(「VHCDR1.13」;配列番号38)から選択され;
(v)VHCDR2が、ISSGGTYT(「VHCDR2.8」;配列番号41)及びINTFGDRT(「VHCDR2.13」;配列番号42)から選択され;並びに
(vi)VHCDR3が、ATQGNYSLDF(「VHCDR3.8」;配列番号45)及びARGTGTY(「VHCDR3.13」;配列番号46)から選択される、抗体;
(d)配列においてMAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22又はMAb23のVLに対応するVLと、配列においてMAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22又はMAb23のVHに対応するVHとを有する抗体;並びに
(e)配列においてMAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22又はMAb23のVL及びVHに対応するVL及びVHに配列において対応するVL及びVHを有する抗体。
(a)本明細書において開示される任意の3つのVLCDR及び任意の3つのVHCDR;
(b)配列番号21に対応するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号22に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(c)配列番号23に対応するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号24に対応するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(d)配列番号75、77、及び79からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号76及び78からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(e)配列番号80及び82からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号81及び83からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(f)配列番号84、86、及び88からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号85、87、及び89からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;並びに
(g)配列番号90、92、及び94からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号91、93、及び95からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
本明細書において記載される方法において有用な抗PG抗体は、周知の標準方法を使用して得ることができる。本明細書において記載される方法において有用な抗PG抗体を発現させるために、軽鎖及び重鎖の、部分又は全長をコードするDNAを、遺伝子が転写及び翻訳コントロール配列に機能的に連結されるように発現ベクターに挿入する。この文脈において、「機能的に連結される」という用語は、ベクター内の転写及び翻訳コントロール配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳をレギュレーションする所望の機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターにライゲーションされることを意味すると意図される。発現ベクター及び発現コントロール配列は、使用される発現ホスト細胞と適合するように選択する。抗体の軽鎖遺伝子及び抗体の重鎖遺伝子を別々のベクターに挿入し得るか、又はより典型的には、両遺伝子を同じ発現ベクターに挿入する。
以下の実施例は例示的なものであり、限定的なものであることを意図しない。
以下のアッセイを使用して、血漿中及び/又は血清中PGレベルを便利に測定できる。96ウェルマイクロタイタープレートを、0.5〜10μg/mLのC末端抗hPG抗体(例えば、本明細書において記載されるウサギC末端抗hPGポリクローナル抗体、又はC末端抗hPG抗体)でコーティングし、次いで、一晩インキュベーションする。次いで、プレートをPBS−Tween(0.05%)中で3回洗浄し、PBS−Tween(0.05%)に溶解させた2%(w/v)スキムミルクでブロッキングする。別に、試験サンプル、コントロールサンプル(ブランク又はPGネガティブ血漿若しくは血清サンプル)、及び約5pM(0.5x10−11M)〜約0.1nM(1x10−10M)のhPG参照標準(PGネガティブ血漿又は血清中で希釈した凍結乾燥hPG)を、適切な希釈剤(例えば、PBS−Tween(0.05%))で調製する。コーティングしたプレート上で、サンプルを37℃で2〜4時間、あるいは21℃で12〜16時間インキュベーションする。インキュベーション後、プレートをPBS−Tween(0.05%)で3回洗浄し、0.001〜0.1μg/mLのN末端抗hPG抗体(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)(Nakane et al., 1974, J. Histochem. Cytochem. 22(12):1084-1091を参照のこと)にカップリングした本明細書において記載されるポリクローナルN末端抗hPG抗体又はN末端モノクローナル抗hPG抗体)と共に、21℃で30分間インキュベーションする。次いで、プレートをPBS−Tween(0.05%)中で3回洗浄し、HRP基質を21℃で15分間添加する。100μLの0.5M硫酸を添加することによって反応を停止させ、405nmで光学密度測定を行う。hPG参照標準に由来する測定結果から作成した標準曲線との比較によって、試験サンプルのhPGレベルを決定する。
以下のように、ELISAアッセイを使用して、抗hPG抗体の特異性を便利に決定できる。96ウェルプレートを、適切な濃度の試験ポリペプチド(例えば、25及び50ngのリコンビナントヒトPG、並びに50及び250ngのCTFP又はガストリンに由来する他の遺伝子産物)と共に、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中、4℃で一晩インキュベーションし、その後、ウェルを洗浄液(PBS及び0.1%Tween−20)で3回洗浄し、次いで、1ウェルあたり100μLのブロッキング溶液(PBS、0.1%Tween−20、0.1%ウシ血清アルブミン又はカゼイン加水分解物)と共に、22℃で2時間インキュベーションする。ブロッキング後、ウェルを3回洗浄し、アッセイするべき抗体(試験抗体)を添加する。PBS及び0.1%Tween−20に溶解させた100μLの試験抗体(0.3〜1ng/mL)を各ウェルに添加する。次いで、プレートを22℃で2時間インキュベーションし、その後、二次抗体(西洋ワサビペルオキシダーゼにカップリングしたヤギ抗マウスIgG(Fc)抗体)を含むブロッキング溶液による洗浄工程(3X100μLの上記洗浄液)後に、試験抗体溶液を廃棄し、交換する。二次抗体と共に1時間インキュベーションした後、100μLの基質溶液(例えば、製造業者の指示に従って調製した、Sigma-Aldrich Co.から入手可能なFast OPD、又はO−フェニレンジアミン二塩酸塩)を各ウェルに添加し、暗所、22℃で20分間インキュベーションする。50μLの4N硫酸を添加することによって反応を停止させ、492nmの光学密度(O.D.)を測定することによって、触媒された基質の量を決定する。基質変換は、抗原に結合した一次(試験)抗体の量に比例する。二重測定で実験を行い、ODの測定結果を、抗原濃度の関数としてプロットする。測定したO.D.がhPGに関して0.2〜1.5であり、CTFP、又はガストリン遺伝子に由来する他のペプチドのいずれかを用いるバックグラウンド(バックグラウンドは、PBSのみを含むコントロールウェルからの平均シグナルである)を超える統計的に有意なシグナルがない場合、試験抗体を、PGに対して特異的であるとスコア化する。
特定の抗hPG抗体が中和性であるか否かをアッセイするための具体的な試験を、以下のように実施できる。Huh7肝細胞ガン細胞を、無血清M11培地における超低接着24ウェルプレート(細胞500個/ウェル)に播種する。細胞を37℃で成長させ、約5μg/mLの抗体濃度の試験抗hPG抗体又はコントロールの非特異的モノクローナル抗体で、1日2回、7日間処置する。実験終了時に、顕微鏡写真を撮影し、1ウェルあたりのスフィア数をカウントし、中央値及びパーセンタイル分布を計算する。1つの抗hPG抗体を試験する場合は対応のないt検定、又は複数の抗体を試験する場合はBonferroni事後検定を用いる一元ANOVAを使用して(差は、p<0.05の場合に有意であると考える)、低接着培養条件下でHuh7細胞によって形成されたスフェロイド数が、コントロール抗体で処置した細胞と比較して、少なくとも20%の統計的に有意な減少を示す場合、試験抗体を、アッセイにおいて中和性であると定義する。
Nahshol et al., 2008, Analytical Biochemistry 383:52-60(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に従って、Proteon Technique (BioRad)を使用して、抗hPG抗体の親和性定数を測定できる。つまり、マウス抗PG抗体の場合、最初に、抗マウスIgG抗体(50μg/ml)を、センサーチップ上にコーティングし、抗体の注射後にチップによって検出されたシグナルが、10,000〜11,500反応単位(RU)に収まることを確認する。次いで、関心対象のマウス抗hPG抗体(試験抗体)を注射(30μg/mlの典型的な濃度で)する。試験抗体が特異的に結合する場合、少なくとも500RUのさらなるシグナルが観察されるであろう。次いで、様々な濃度のhPG(例えば、200nM、100nM、50nM、25nM、及び12.5nM)を注射し、結合のレベルを検出することによって、試験抗体とhPGとの間の結合の経時変化を得る。典型的には、単一の実験において複数の抗体を並行して試験するのに、いくつかのチャンネルが利用可能であり、単一の試験抗体の結合を異なる濃度のhPGで並行してアッセイすることを可能にする。hPGに対して特異的ではないマウスモノクローナル抗体を、非特異的結合のコントロールとして1つのチャンネルに注射するべきであり、希釈バッファーを、バックグラウンドシグナルのベースラインとして別のチャンネルに単独で注射するべきである。一般的には、非特異的マウス抗体を注射したチャンネルにおいて結合は検出できない。この設定(これは、hPGによって捕捉されたモノクローナル抗体の飽和をもたらす可能性がある)で高レベルの結合を示す抗体を、より低いhPG濃度(50nM、25nM、12.5nM、6.25nM及び3.125nM)に対して試験して、より正確な測定をできる。
関心対象の抗体(試験抗体)が、hPGへの結合に関してビオチン化参照抗hPG抗体と競合するか否かを評価するための具体的なアッセイを、以下のように実施できる。1〜10μg/mlの範囲内で選択される濃度の捕捉抗hPG抗体(ビオチン化参照抗hPG抗体によって認識されるエピトープと異なるhPGのN又はC末端領域を認識するポリクローナル又はモノクローナル抗体)により、96ウェルプレートを4℃で一晩コーティングする(0.1〜1μg/ウェル)。ブロッキングバッファー(PBSに溶解させた0.1%Tween−20、0.1%BSA)により22℃で2時間ブロッキングした後、リコンビナントhPGを10pM〜1nM(10〜1000pg/ウェル)の濃度範囲で添加し、22℃で2時間インキュベーションする。その後、ビオチン化参照抗hPG抗体(又は、ビオチン化参照抗hPG抗体を含む混合物)を、漸増濃度の非ラベル化試験抗体と共に添加し、22℃で1時間インキュベーションする。洗浄して未結合の抗体を除去した後、この混合物を50ng/mlのストレプトアビジン−HRPと共に22℃で1時間インキュベーションすることによって、結合したラベル化参照抗hPG抗体の検出を実施し、続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ用の化学発光基質と共に22℃で5分間インキュベーションし、次いで、照度計で相対発光量(RLU)を定量化する。アッセイは二重測定で実施する。
Ki=IC50/[1+(参照抗hPGAb濃度/KD 参照抗hPGAb)]
(式中、「IC50」は、参照抗体の結合の50%減少をもたらす試験抗体の濃度であり、KD 参照抗hPGAbは、参照抗hPG抗体の解離定数(すなわち、hPGに対するその親和性の程度)である)。参照抗hPG抗体と競合する有用な試験抗体(例えば、本明細書において記載される抗hPG抗体の1つ)は、典型的には、本明細書において記載されるアッセイ条件下で、10pM〜100nMの範囲のKiを有するであろう。
本実施例は、肝細胞ガン(HCC)を有する患者に由来する肝腫瘍サンプルが、正常組織と比較して、高レベルのGAST遺伝子を発現するという観察結果を記載する。
原発性肝腫瘍及び正常コントロール組織を、14人の患者から外科的に切除した。腫瘍及び健常肝組織サンプルの両方からRNAを調製し、Agilent Bioanalyserを使用してmRNAの完全性をコントロールした。定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によって、GAST mRNA発現を測定し、HPRT mRNA発現で標準化した。RT−PCRのために、FastRNA Pro Green Kit (MP BioMed)を使用して、製造業者のプロトコールに従って、HCCサンプルから全RNAを抽出した。ランダムプライマー(R&D Systems)の存在下で、Superscript II RT (Invitrogen)を使用して、RNAを逆転写した。Quantifast SYBR Green PCR kit (Qiagen)及びEppendorf Mastercycler ep realplex (Eppendorf)を使用して、リアルタイムRT−PCRを実施した。GAST及びHPRT遺伝子増幅用のプライマーを、Sigma Life Scienceから入手した。以下の条件を使用して、3つのウェルで各PCR増幅を実施した:95℃5分、続いて2つの温度サイクルを合計45サイクル(95℃10秒及び60℃30秒)。
図4に示されるように、肝ガンを有する患者14人中10人において、GAST mRNA発現は、正常肝組織と比較して、HCC腫瘍サンプルにおいて上昇していた。GAST mRNA発現が上昇していたサンプルでは、発現は、正常組織と比較して、2〜2800倍高い範囲に及んだ。
本実施例は、低接着培養条件下で成長させた肝ガン細胞株が、結腸直腸ガン細胞株と比較して、高レベルのGAST遺伝子を発現するという観察結果を記載する。
2つの肝細胞ガン細胞株Huh7及びPLC/PRF/5、肝芽腫細胞株Huh6、並びに結腸直腸ガン細胞株SW480をそれぞれ、M11培地の超低接着フラスコに播種し、スフィア形成が達成されるまで成長させた。次いで、RNA抽出のために、スフィアをプロセシングした。QIAGEN Rneasy Mini-kitを使用して、製造業者のプロトコールに従って全RNAを抽出した点を除いて、実施例1に記載されるように、RT−PCRを実施した。次いで、肝ガン細胞株に由来するGAST mRNA発現レベルを、SW480細胞における発現(これは、ポジティブコントロールとして働いた)に対して標準化した。
図5A〜5Bに示されるように、試験したすべての肝細胞株(Huh6、Huh7及びPLC/PRF/5)は、低接着培養条件下で成長させた場合、結腸直腸腫瘍細胞株SW480と比較して、高レベルのGAST mRNAを発現していた。SW480細胞におけるガストリン遺伝子発現レベルと比較して、結果を表す。
本実施例は、2つの肝ガン細胞株Huh6及びHuh7に由来する色素排除「サイドポピュレーション」細胞が、低接着培養条件下で成長させたこのような細胞の一般集団(すなわち、サイドポピュレーション及び非サイドポピュレーション)と比較して、高レベルのGAST mRNAを発現するという観察結果を記載する。
FACSを使用して、Huh6及びHuh7肝ガン細胞株に由来する色素排除「サイドポピュレーション」細胞を、このような細胞の一般集団から単離した。具体的には、トリプシン及びEDTAによる処理によって、細胞を分離した。次いで、細胞を、1mlの染色培地(DMEM、2%ウシ胎仔血清、2mMEDTA)中、37℃で、10分間インキュベーションした。1μlの50mMベラパミル溶液(最終濃度50μM)を、ネイティブコントロールサンプルに添加した。次いで、コントロール及び試験サンプルを、37℃で10分間インキュベーションした。次いで、色素溶液を試験サンプル(2.5μlの2mg/mlHoechst33342;5μg/mlの最終色素濃度)に添加し、続いて、穏やかに混合した。次いで、すべてのサンプルを、一定に穏やかに混合しながら、37℃で50分間インキュベーションした。氷上で5〜10分間インキュベーションした後、次いで、サンプルを1000rpmで5分間遠心分離した。次いで、細胞ペレットを、M11培地において、25μg/mlヨウ化プロピジウム溶液の1:40希釈液1ml中に再懸濁した。5mlチューブ中で、篩に通してろ過することによって、凝集した細胞を除去した。次いで、450nm及び488nmのシグナル検出でFACSAria cytometerを使用してサイトメトリーを実施するまで、サンプルを氷上で保管した。次いで、実施例6及び7のように、RNAを精製し、GAST mRNA発現レベルを定量化し、次いで、低接着培養条件下でスフェロイドとして成長させたHuh6及びHuh7細胞、並びにSW480結腸直腸ガン細胞に由来するGAST遺伝子発現レベルに対して比較した。次いで、肝ガン細胞株に由来するGAST mRNA発現レベルを、SW480細胞における発現(これは、ポジティブコントロールとして働いた)に対して標準化した。
図6に示されるように、Huh6及びHuh7細胞の色素排除「サイドポピュレーション」は、低接着培養条件下でスフェロイドとして成長させたこのような細胞の一般集団と比較して、高レベルのGAST mRNAを発現していた(それぞれ図6A及び6B)。Huh7細胞のサイドポピュレーションは、Huh6細胞のサイドポピュレーションと比較して、より多くのガストリンmRNAを発現していた。SW480細胞におけるGAST遺伝子発現レベルと比較して、結果を表す。
本実施例は、低接着培養条件下におけるPLC/PRL/5肝ガン細胞のスフェロイド成長に対する、抗hPGモノクローナル抗体による処置の効果を示す。
PLC/PRL/5肝細胞ガン細胞を、無血清M11培地(20ng/mlEGF、10ng/mlFGF、20μg/mlインスリン、N2サプリメント、2μg/mlシプロフロキサシン、5μg/mlゲンタマイシン及び3μg/mlグルコースを含むDMEM/F12)における超低接着24ウェルプレート(細胞220個/ウェル)に播種した。コントロール又は抗hPGMAb3モノクローナル抗体(1μg/ml)を毎日添加して、細胞を37℃で10日間成長させた。実験終了時に、顕微鏡写真を撮影し、1ウェルあたりのスフィア数をカウントし、平均及び標準偏差を計算した。
図7に示されるように、抗hPGモノクローナル抗体によるPLC/PRL/5細胞の処置は、コントロールモノクローナル抗体と比較して、低接着培養条件下における成長中に形成したスフェロイド数を大幅に減少させた。
本実施例は、低接着培養条件下におけるHuh6肝ガン細胞の色素排除サイドポピュレーションのスフェロイド成長に対する、抗hPGポリクローナル抗体による処置の効果を示す。
上記のように、Huh6細胞の色素排除サイドポピュレーション細胞を単離した。次いで、サイドポピュレーション細胞を、M11培地における超低接着96ウェルプレート(細胞200個/ウェル)に播種し、コントロール又は抗プロガストリンポリクローナル抗体(1μg/ml)、5nMドキソルビシン(特定の肝ガン治療において使用される化学療法剤)、又はDMSO(ドキソルビシンのビヒクル)の存在下、37℃で13日間成長させた(条件あたり15ウェル)。M11培地の組成は、以下の通りであった:DMEM/F12-Glutamax (カタログ#31331 Invitrogen);20ng/mlEGF(R&D systems);10ng/mlFGF(R&D systems);20μg/mlインスリン(Sigma);N2サプリメントの1/100希釈物(カタログ#P1510, Gibco);2μg/mlシプロフロキサシン、5μg/mlゲンタマイシン及び3μg/mlグルコース。実験終了時に、顕微鏡写真を撮影し、1ウェルあたりのスフィア数をカウントし、平均及び標準偏差を計算した。
図8に示されるように、抗hPGポリクローナル抗体による、Huh6細胞株から精製したサイドポピュレーション細胞の処置は、コントロール抗体、ドキソルビシン及びDMSOコントロールと比較して、低接着培養条件下における成長中に形成したスフェロイド数を大幅に減少させた。
本実施例は、低接着培養条件下におけるHuh7肝ガン細胞の色素排除サイドポピュレーションのスフェロイド成長に対する、抗hPGポリクローナル抗体による処置の効果を示す。
実施例8に記載されるように、Huh7細胞の色素排除サイドポピュレーション細胞を単離した。次いで、サイドポピュレーション細胞を、M11培地における超低接着96ウェルプレート(細胞200個/ウェル)に播種し、コントロール又は抗プロガストリンポリクローナル抗体(1μg/ml)、5nMドキソルビシン(特定の肝ガン治療において使用される化学療法剤)、又はDMSO(ドキソルビシンのビヒクル)の存在下、37℃で9日間成長させた(条件あたり15ウェル)。M11培地の組成は、以下の通りであった:DMEM/F12-Glutamax (カタログ#31331 Invitrogen);20ng/mlEGF(R&D systems);10ng/mlFGF(R&D systems);20μg/mlインスリン(Sigma);N2サプリメントの1/100希釈物(カタログ#P1510, Gibco);2μg/mlシプロフロキサシン、5μg/mlゲンタマイシン及び3μg/mlグルコース。実験終了時に、顕微鏡写真を撮影し、1ウェルあたりのスフィア数をカウントし、平均及び標準偏差を計算した。
図9に示されるように、抗hPGポリクローナル抗体による、Huh7細胞株から精製したサイドポピュレーション細胞の処置は、コントロール抗体及びDMSOコントロールと比較して、低接着培養条件下における成長中に形成したスフェロイド数を大幅に減少させた。ドキソルビシンも、培養液中で形成したスフェロイド数を減少させることが分かった。
本実施例は、低接着成長条件下におけるHuh6のスフェロイド成長に対する、抗hPGモノクローナル抗体の効果を示す。
Huh−6肝芽腫細胞を、無血清M11培地(20ng/mlEGF、10ng/mlFGF、20μg/mlインスリン、N2サプリメント、2μg/mlシプロフロキサシン、5μg/mlゲンタマイシン及び3μg/mlグルコースを含むDMEM/F12)における超低接着96ウェルプレート(細胞85個/ウェル)に播種した。細胞を、ビヒクル(PBS、コントロール)又は抗hPGMAb13若しくはMAb19モノクローナル抗体(3μg/ml)により37℃で毎日2回、7日間処置した。実験終了時に、顕微鏡写真を撮影し、1ウェルあたりのスフェロイド数をカウントし、中央値及びパーセンタイル分布を計算し、グラフ化した。
図10に示されるように、抗hPGモノクローナル抗体によるHuh6細胞の処置は、未処置コントロール細胞と比較して、低接着培養条件下における成長中に形成したスフェロイド数を大幅に減少させた。
本実施例は、Huh6肝芽腫細胞が低接着培養条件下でスフェロイドとしてその後成長する能力に対する、抗hPGモノクローナル抗体による前処置の阻害効果を実証する。
最初に、Huh6肝芽腫細胞100,000個/ウェルを、10%FCS含有DMEMにおける6ウェルプレートに播種し、一晩血清飢餓させ、10μg/mL抗プロガストリンモノクローナル抗体MAb8若しくはMAb13又はコントロールモノクローナル抗体(PCX63Ag8, ATCC, Ref TIB-9)の存在下、DMEM中で48時間成長させた。処置終了時に、各処置グループに関して、細胞500個/ウェルを、bFGF及びEGFを含む無血清M11培地500μlにおける超低接着24ウェルプレートのウェル8個にプレートし、処置せずにさらに5日間成長させた。この期間の終了時に、写真を撮影し、1ウェルあたりのスフィア数をカウントし、スフィア表面を測定した。5日間の「ウォッシュアウト」期間(この期間に、すべてのオリジナル処置条件からのHuh−6細胞を同じM11培地中で成長させた)の終了時に、写真を撮影した。その後、すべてのウェルの正体を知らない操作者が、スフィアをカウントした。
図11に示されるように、プロガストリンに対するモノクローナル抗体による48時間前処置によって、Huh6肝芽腫細胞が低接着プレートでスフェロイドとして成長する能力は、有意に減少した。
本実施例は、低接着培養条件におけるHuh7細胞のスフェロイド形成に対する、抗hPGモノクローナル抗体の効果を示す。
第1の実験では、Huh7肝細胞ガン細胞を、無血清M11培地(20ng/mlEGF、10ng/mlFGF、20μg/mlインスリン、N2サプリメント、2μg/mlシプロフロキサシン、5μg/mlゲンタマイシン及び3μg/mlグルコースを含むDMEM/F12)における超低接着24ウェルプレート(細胞500個/ウェル)に播種した。細胞を、ビヒクル(PBS、コントロール)又は3μg/ml抗hPGMAb13モノクローナル抗体(抗hPGMAb13)により37℃で毎日2回、7日間処置した。実験終了時に、顕微鏡写真を撮影し、1ウェルあたりのスフィア数をカウントし、中央値及びパーセンタイル分布を計算した。
第1の実験では、図12Aに示されるように、抗hPGモノクローナル抗体MAb13によるHuh7細胞の処置は、未処置コントロール細胞と比較して、低接着培養条件下における成長中に形成したスフェロイド数を大幅に減少させた。
本実施例は、Huh7肝細胞ガン細胞が低接着培養条件下でスフェロイドを形成する能力に対する、抗プロガストリンモノクローナル抗体による前処置の阻害効果を示す。
第1の実験では、最初に、Huh7肝細胞ガン細胞75,000個/ウェルを、10%FCS含有MEMαにおける6ウェルプレートに播種し、一晩血清飢餓させ、10μg/mL抗プロガストリンモノクローナル抗体MAb8又はコントロールモノクローナル抗体(P3X63Ag8, ATCC, Ref TIB-9)の存在下、MEMα+0.5%パネキシンH中で60時間成長させた。処置終了時に、各処置グループに関して、細胞500個/ウェルを、bFGF及びEGFを含む無血清M11培地500μlにおける超低接着24ウェルプレートのウェル8個にプレートし、処置せずにさらに5日間成長させた。この期間の終了時に、写真を撮影し、1ウェルあたりのスフィア数をカウントし、スフィア表面を測定した。5日間の「ウォッシュアウト」期間(この期間に、すべてのオリジナル処置条件からのHuh−7細胞を同じM11培地中で成長させた)の終了時に、写真を撮影した。その後、すべてのウェルの正体を知らない操作者が、スフェロイドをカウントした。
結果を図13A〜Bに示す。図13Aに示されるように、抗hPGMAb8による48時間前処置によって、Huh7細胞が低接着プレートでスフェロイドとして成長する能力は、有意に減少した。図13Bに示されるように、抗hPGMAb16による48時間前処置によって、Huh7細胞が低接着プレートでスフェロイドとして成長する能力は、有意に減少した。
本実施例は、低接着培養条件下におけるHuh7肝ガン細胞株に由来する色素排除「サイドポピュレーション」細胞のスフェロイド成長に対する、抗hPGモノクローナル抗体による処置の効果を示す。
実施例8に記載されるように、Huh7細胞の色素排除サイドポピュレーション細胞を単離した。次いで、サイドポピュレーション細胞を、M11培地における超低接着24ウェルプレート(細胞1000個/ウェル)に播種し、コントロール培地又は抗プロガストリンモノクローナル抗体MAb8若しくはMAb13(6μg/ml)の存在下、37℃で7日間成長させた(条件あたり8ウェル)。M11培地の組成は、以下の通りであった:DMEM/F12-Glutamax (カタログ#31331 Invitrogen);20ng/mlEGF(R&D systems);10ng/mlFGF(R&D systems);20μg/mlインスリン(Sigma);N2サプリメントの1/100希釈物(カタログ#P1510, Gibco);2μg/mlシプロフロキサシン、5μg/mlゲンタマイシン及び3μg/mlグルコース。実験終了時に、顕微鏡写真を撮影し、1ウェルあたりのスフィア数をカウントし、平均及び標準偏差を計算した。
図14に示されるように、抗hPGモノクローナル抗体による、Huh7細胞株から精製したサイドポピュレーション細胞の処置は、コントロール培地中で成長させた細胞と比較して、低接着培養条件下における成長中に形成したスフェロイド数を大幅に減少させた。
本実施例は、低接着培養条件下におけるPLC/PRL/5細胞のスフェロイド形成に対する、抗hPGモノクローナル抗体の効果を示す。
一方の実験では、PLC/PRL/5肝細胞ガン細胞を、無血清M11培地(20ng/mlEGF、10ng/mlFGF、20μg/mlインスリン、N2サプリメント、2μg/mlシプロフロキサシン、5μg/mlゲンタマイシン及び3μg/mlグルコースを含むDMEM/F12)における超低接着96ウェルプレート(細胞35個/ウェル)に播種した。細胞を、コントロールモノクローナル抗体(コントロールMAb、P3X63Ag8, ATCC, Ref TIB-9)又は抗hPGMAb19モノクローナル抗体のいずれか(3μg/ml)により37℃で毎日2回、8日間処置した。実験終了時に、顕微鏡写真を撮影し、1ウェルあたりのスフィア数をカウントし、中央値及びパーセンタイル分布を計算した。
結果を図15A〜Cに示す。図15Aに示されるように、抗hPGMAb19による処置は、コントロールMAbで処置した細胞と比較して、低接着培養条件下における成長中にPLC/PRL/5細胞によって形成されたスフェロイド数を有意に減少させた。図15Bに示されるように、抗hPGMAb13による処置は、コントロールMAbで処置した細胞と比較して、低接着培養条件下においてPLC/PRL/5細胞によって形成されたスフェロイド数を有意に減少させた。図15Cに示されるように、抗hPGMAb8又はMAb13による処置は、コントロールMAbで処置した細胞と比較して、低接着培養条件下においてPLC/PRL/5細胞によって形成されたスフェロイド数を有意に減少させた。
本実施例は、肝細胞ガン細胞が低接着培養条件下でスフェロイドを形成する能力に対する、抗hPGモノクローナル抗体前処置の阻害効果を示す。
最初に、PLC/PRL/5肝細胞ガン細胞50,000個/ウェルを、10%FCS含有EMEMにおける6ウェルプレートに播種し、一晩血清飢餓させ、10μg/mL抗hPGMAb8、抗hPGMAb16又はコントロールモノクローナル抗体(コントロールMAb、P3X63Ag8, ATCC, Ref TIB-9)の存在下、EMEM+0.5%パネキシンH中で72時間成長させた。処置終了時に、各処置グループに関して、細胞200個/ウェルを、bFGF及びEGFを含む無血清M11培地500μlにおける超低接着24ウェルプレートのウェル8個にプレートし、処置せずにさらに5日間成長させた。この期間の終了時に、写真を撮影し、1ウェルあたりのスフィア数をカウントし、スフィア表面を測定した。5日間の「ウォッシュアウト」期間(この期間に、すべてのオリジナル処置条件からのPLC/PRL/5細胞を同じM11培地中で成長させた)の終了時に、写真を撮影した。その後、すべてのウェルの正体を知らない操作者が、スフェロイドをカウントした。
図16に示されるように、プロガストリンに対する2つの異なるモノクローナル抗体による72時間前処置によって、PLC/PRL/5肝細胞ガン細胞が低接着プレートでスフェロイドを形成する能力は、コントロールMAbと比較して有意に減少した。
本実施例は、PLC/PRL/5肝ガン細胞から単離した色素排除「サイドポピュレーション」細胞による低接着培養条件下におけるスフェロイド形成に対する、抗hPGモノクローナル抗体の効果を示す。
実施例8に記載されるように、PLC/PRL/5細胞の色素排除サイドポピュレーション細胞を単離した。次いで、サイドポピュレーション細胞を、M11培地における超低接着24ウェルプレート(細胞400個/ウェル)に播種し、コントロール培地又は抗プロガストリンモノクローナル抗体MAb13(6μg/ml)若しくはMAb16(10μg/ml)の存在下、37℃で7日間成長させた(条件あたり6ウェル)。M11培地の組成は、以下の通りであった:DMEM/F12-Glutamax (カタログ#31331 Invitrogen);20ng/mlEGF(R&D systems);10ng/mlFGF(R&D systems);20μg/mlインスリン(Sigma);N2サプリメントの1/100希釈物(カタログ#P1510, Gibco);2μg/mlシプロフロキサシン、5μg/mlゲンタマイシン及び3μg/mlグルコース。実験終了時に、顕微鏡写真を撮影し、1ウェルあたりのスフィア数をカウントし、平均及び標準偏差を計算した。
図17に示されるように、抗hPGモノクローナル抗体による、PLC/PRL/5細胞株から単離した「サイドポピュレーション」細胞の処置は、単独培地中で成長させた細胞と比較して、低接着培養条件下で形成されたスフェロイド数を大幅に減少させた。
Claims (14)
- 肝ガンを処置または肝ガンの再発を予防する方法における使用のための医薬を製造するための、抗ヒトプロガストリンモノクローナル抗体の使用。
- 抗ヒトプロガストリンモノクローナル抗体が、ヒト化モノクローナル抗体である、請求項1記載の使用。
- 抗hPGモノクローナル抗体が、N末端抗hPGモノクローナル抗体である、請求項1記載の使用。
- N末端抗hPGモノクローナル抗体が、DAPLG(配列番号28)、PDAPLG(配列番号29)、PRSQQPD(配列番号30)、WKPRSQQPD(配列番号31)及びWKPRSQQPDAPLG(配列番号32)からなる群より選択される配列を含むエピトープに結合する、請求項3記載の使用。
- N末端抗hPGモノクローナル抗体が、配列SWKPRSQQPDAPLG(配列番号25)を有するペプチドを含む免疫原に対して作られる、請求項3記載の使用。
- N末端抗hPGモノクローナル抗体が、
(a)重鎖可変領域中のCDR1がVHCDR1.3(配列番号1)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVHCDR2.3(配列番号2)のアミノ酸配列を含み、CDR3がVHCDR3.3(配列番号3)のアミノ酸配列を含む、該重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域中のCDR1がVLCDR1.3(配列番号4)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVLCDR2.3(配列番号5)のアミノ酸配列を含み、CDR3がVLCDR3.3(配列番号6)のアミノ酸配列を含む、該軽鎖可変領域;
(b)重鎖可変領域中のCDR1がVHCDR1.4(配列番号7)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVHCDR2.4(配列番号8)のアミノ酸配列を含み、CDR3がVHCDR3.4(配列番号9)のアミノ酸配列を含む、該重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域中のCDR1がVLCDR1.4(配列番号10)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVLCDR2.4(配列番号5)のアミノ酸配列を含み、CDR3がVLCDR3.4(配列番号11)のアミノ酸配列を含む、該軽鎖可変領域;
(c)重鎖可変領域中のCDR1がVHCDR1.16(配列番号39)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVHCDR2.16(配列番号43)のアミノ酸配列を含み、CDR3がVHCDR3.16(配列番号47)のアミノ酸配列を含む、該重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域中のCDR1がVLCDR1.16(配列番号50)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVLCDR2.16(配列番号53)のアミノ酸配列を含み、CDR3がVLCDR3.16(配列番号57)のアミノ酸配列を含む、該軽鎖可変領域;
又は
(d)重鎖可変領域中のCDR1がVHCDR1.19(配列番号40)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVHCDR2.19(配列番号44)のアミノ酸配列を含み、CDR3がVHCDR3.19(配列番号48)のアミノ酸配列を含む、該重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域中のCDR1がVLCDR1.19(配列番号51)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVLCDR2.19(配列番号54)のアミノ酸配列を含み、CDR3がVLCDR3.19(配列番号58)のアミノ酸配列を含む、該軽鎖可変領域;
を含む、請求項3記載の使用。 - 抗hPGモノクローナル抗体が、hPGへの結合に関して、
(a)配列番号12の重鎖可変ドメイン配列と、配列番号13の軽鎖可変ドメイン配列とを含むモノクローナル抗体;
(b)配列番号14の重鎖可変ドメイン配列と、配列番号15の軽鎖可変ドメイン配列とを含むモノクローナル抗体;
(c)配列番号61の重鎖可変ドメイン配列と、配列番号65の軽鎖可変ドメイン配列とを含むモノクローナル抗体;及び
(d)配列番号62の重鎖可変ドメイン配列と、配列番号66の軽鎖可変ドメイン配列とを含むモノクローナル抗体;
からなる群より選択される参照抗体と競合する、請求項3記載の使用。 - 抗hPGモノクローナル抗体が、C末端抗hPGモノクローナル抗体である、請求項1記載の使用。
- C末端抗hPGモノクローナル抗体が、FGRR(配列番号33)、MDFGR(配列番号34)及びGWMDFGRR(配列番号36)からなる群より選択される配列を含むエピトープに結合する、請求項8記載の使用。
- C末端抗hPGモノクローナル抗体が、配列QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN(配列番号27)を有するペプチドを含む免疫原に対して作られる、請求項8記載の使用。
- C末端抗hPGモノクローナル抗体が、
(e)重鎖可変領域中のCDR1がVHCDR1.8(配列番号37)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVHCDR2.8(配列番号41)のアミノ酸配列を含み、CDR3がVHCDR3.8(配列番号45)のアミノ酸配列を含む、該重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域中のCDR1がVLCDR1.8(配列番号49)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVLCDR2.8(配列番号52)のアミノ酸配列を含み、CDR3がVLCDR3.8(配列番号55)のアミノ酸配列を含む、該軽鎖可変領域;
(f)重鎖可変領域中のCDR1がVHCDR1.13(配列番号38)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVHCDR2.13(配列番号42)のアミノ酸配列を含み、CDR3がVHCDR3.13(配列番号46)のアミノ酸配列を含む、該重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域中のCDR1がVLCDR1.13(配列番号50)のアミノ酸配列を含み、CDR2がVLCDR2.13(配列番号53)のアミノ酸配列を含み、CDR3がVLCDR3.13(配列番号56)のアミノ酸配列を含む、該軽鎖可変領域;
を含む、請求項8記載の使用。 - C末端抗hPGモノクローナル抗体が、hPGへの結合に関して、
(g)配列番号59の重鎖可変ドメイン配列と、配列番号63の軽鎖可変ドメイン配列とを含むモノクローナル抗体;及び
(h)配列番号60の重鎖可変ドメイン配列と、配列番号64の軽鎖可変ドメイン配列とを含むモノクローナル抗体;
からなる群より選択される参照抗体と競合する、請求項8記載の使用。 - 抗プロガストリン抗体が、外科的切除、化学療法または放射線療法に対して補助的に投与される、請求項1記載の使用。
- 被験体における肝ガンの再発を予防するための医薬の製造のための抗hPGモノクローナル抗体の使用であって、
前記被験者が肝ガンの治療を受けており、約500pM以上の血清中プロガストリンレベルと測定されている、使用。
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