JP5723774B2 - タンパク質および核酸の連続的指向性進化 - Google Patents
タンパク質および核酸の連続的指向性進化 Download PDFInfo
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Description
本願は、「continuous directed evolution of proteins and nucleic acids」と題された2008年9月5日に出願された米国仮特許出願第61/094,666号の優先権の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
本発明は、国立衛生研究所助成金番号NIH RO1 GM 065400により支援された。政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、核酸およびタンパク質を多様化する方法に関する。具体的には、本発明は核酸およびタンパク質を進化させる連続的な方法を開示する。
タンパク質および核酸は、利用可能な機能性の小さな画分しか用いない。タンパク質および核酸を改変してその機能性を多様化することに現在大きな関心が存在する。分子進化の努力は、開始分子の関連した変異体へのインビトロにおける多様化を含み、それから望ましい分子を選択する。核酸およびタンパク質ライブラリーにおいて多様性を生じるために使用する方法は、ゲノム全体の変異誘発(非特許文献1)、ランダムカセット変異誘発(非特許文献2)、誤りがちのPCR(非特許文献3)、および相同組換えを用いたDNAシャッフリング(非特許文献4)を含む。多様化後、新規または増強された性質を有する分子を選択し得る。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
核酸の連続的進化方法であって、
進化させる少なくとも1つの機能的核酸鎖を第一の宿主細胞へ導入する工程;
該第一の宿主細胞内で該機能的核酸鎖を複製する工程;
該機能的核酸鎖を変異させる工程;および
少なくとも1つの該変異機能的核酸鎖を第二の宿主細胞へ導入する工程
を含む、方法。
(項目2)
前記宿主細胞が、原核細胞、真核細胞、および細菌細胞からなる群から選択される、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記機能的核酸鎖は、進化させる遺伝子および増殖コンポーネントをコードする第二の遺伝子を含む、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記増殖コンポーネントは、前記第一の宿主細胞における前記機能的核酸鎖の複製のために必要である、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記増殖コンポーネントは、前記第二の宿主細胞への前記機能的核酸鎖の導入のために必要である、項目3に記載の方法。
(項目6)
前記変異工程は、前記変異核酸鎖の選択された機能についてのスクリーニングをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記スクリーニング工程は、バクテリオファージディスプレイシステム、抗生物質耐性、およびレポーター遺伝子の発現のうちの少なくとも一つを含む、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記宿主細胞は、
少なくとも一つの増殖シグナルが機能的に無力にされたファージゲノムを含むヘルパープラスミド;および
前記機能的な発現した核酸鎖に反応して1つまたは複数の該無力にされた増殖シグナルを提供することができるアクセサリープラスミド
をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記ファージ増殖シグナルは、遺伝子IIタンパク質(g2p)、遺伝子IIIタンパク質(g3p)、または遺伝子VIタンパク質(g6p)のうちの少なくとも1つの不活化によって、機能的に無力にされる、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記ファージゲノムは、M13ファージゲノム、fdファージゲノム、f1ファージゲノム、ZJ/2ファージゲノム、Ec9ファージゲノム、AE2ファージゲノム、HRファージゲノム、δAファージゲノム、およびIkeファージゲノムから成る群から選択される、項目8に記載の方法。
(項目11)
前記変異機能的核酸鎖を第二の宿主細胞へ導入する工程は、前記第一の宿主細胞を培養する工程をさらに含み、ここで該第一の宿主細胞は、該機能的核酸鎖によってコードされるファージミド核酸分子を糸状ファージ粒子へパッケージングすることができる、項目8に記載の方法。
(項目12)
前記変異機能的核酸鎖を第二の宿主細胞へ導入する工程は、前記パッケージングされたファージミド核酸分子を含む前記糸状ファージ粒子を該第二の宿主細胞へと導入し、その結果進化させる該核酸鎖を該第二の宿主細胞へ導入する工程をさらに含み、ここで該第二の宿主細胞は、ヘルパープラスミドおよびアクセサリープラスミドを含む、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記機能的核酸の変異工程が、前記変異機能的核酸鎖によってコードされる進化タンパク質または核酸を発現する工程をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目14)
前記機能的核酸の変異工程が、変異誘発剤を導入する工程を含む、項目1に記載の方法。
(項目15)
前記変異誘発剤が、ヌクレオチドアナログ、ヌクレオシド前駆体、アルキル化剤、架橋剤、遺伝毒性物質、および放射線からなる群から選択される、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記変異誘発剤が、化学的変異原である、項目14に記載の方法。
(項目17)
前記化学的変異原は、3−クロロ−4−(ジクロロメチル)−5−ヒドロキシ−2(5H)−フラノン(MX)(CAS no.77439−76−0)、O,O−ジメチル−S−(フタルイミドメチル)ホスホロジチオエート(phos−met)(CAS no.732−11−6)、ホルムアルデヒド(CAS no.50−00−0)、2−(2−フリル)−3−(5−ニトロ−2−フリル)アクリルアミド(AF−2)(CAS no.3688−53−7)、グリオキサール(CAS no.107−22−2)、6−メルカプトプリン(CAS no.50−44−2)、N−(トリクロロメチルチオ)−4−シクロヘキサン−1,2−ジカルボキシミド(カプタン)(CAS no.133−06−2)、2−アミノプリン(CAS no.452−06−2)、メチルメタンスルホネート(MMS)(CAS no.66−27−3)、4−ニトロキノリン1−オキシド(4−NQO)(CAS no.56−57−5)、N4−アミノシチジン(CAS no.57294−74−3)、アジ化ナトリウム(CAS no.26628−22−8)、N−エチル−N−ニトロソウレア(ENU)(CAS no.759−73−9)、N−メチル−N−ニトロソウレア(MNU)(CAS no.820−60−0)、5−アザシチジン(CAS no.320−67−2)、クメンヒドロペルオキシド(CHP)(CAS no.80−15−9)、エチルメタンスルホネート(EMS)(CAS no.62−50−0)、N−エチル−N−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(ENNG)(CAS no.4245−77−6)、N−メチル−N−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(MNNG)(CAS no.70−25−7)、5−ジアゾウラシル(CAS no.2435−76−9)、およびt−ブチルヒドロペルオキシド(BHP)(CAS no.75−91−2)からなる群から選択される、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記宿主細胞が、SOS変異誘発損傷バイパスタンパク質を誘導的に発現するように改変される、項目1に記載の方法。
(項目19)
前記SOS変異誘発損傷バイパスタンパク質は、ポリメラーゼVおよび活性化recAからなる群から選択される、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記宿主細胞が、誤りがちのDNAポリメラーゼサブユニットを誘導的に発現することができる変異促進性プラスミドを含む、項目18に記載の方法。
(項目21)
前記アクセサリープラスミドは、前記ヘルパープラスミドから1つまたは複数の無力になったシグナルを誘導的に発現することができる、項目8に記載の方法。
(項目22)
前記方法は、前記変異核酸鎖を単離する工程をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目23)
前記方法は、前記工程を反復する工程をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目24)
前記宿主細胞は、ある細胞から別の細胞へと核酸を運搬するシステムをさらに含み、該システムは、前記第一の宿主細胞および前記第二の宿主細胞の間の接合伝達(接合);該第一の宿主細胞が前記機能的核酸を封入し、該第二の宿主細胞への侵入を提供することができる、ウイルス感染;および該裸の核酸鎖が該第二の宿主細胞によって取り込まれる、該第一の細胞からの該機能的核酸の排除、からなる群から選択される、項目1に記載の方法。
(項目25)
前記機能的核酸の排除の工程は、分泌または溶解のうちの少なくとも一つを含む、項目24に記載の方法。
I.連続的指向性進化のシステムの概説
指向性進化は、タンパク質およびRNAの望ましい性質において顕著な改善をもたらしたが、従来の方法は、試験するライブラリーのサイズおよび選択の回数(number of round)を厳しく制限する。1つの実施態様において、本発明は、機能的タンパク質およびRNAの連続的多様化および選択を可能にするために、バクテリオファージ生活環の進化的潜在力を利用することによって、これらの制限を克服する一般的なシステムを提供する。
ファージディスプレイは、様々なポリペプチドをディスプレイするためにバクテリオファージを利用する。ディスプレイタンパク質を、バクテリオファージコートタンパク質と、共有結合、非共有結合、および非ペプチド結合で連結し得る。例えば米国特許第5,223,409号、Crameriら(1993)Gene 137:69およびWO01/05950を参照のこと。その連結は、コートタンパク質に融合した様々な成分をコードする核酸の翻訳によって起こり得る。その連結は、柔軟なペプチドリンカー、プロテアーゼ部位、またはストップコドンの抑制の結果として組み込まれたアミノ酸を含み得る。
細胞において通常行われるような指向性進化は、(i)関心のある遺伝子を、配列変異体のライブラリーへ多様化すること;(ii)得られた遺伝子ライブラリーをインビボ発現に適当なベクターへサブクローニングすること;(iii)細胞の集団をベクターライブラリーで形質転換すること;(iv)得られた細胞をスクリーニングまたは選択にかけること;(vi)生き残った細胞を回収し、そしてそのベクターを抽出すること;および(vii)これらの生き残った遺伝子を、工程(i)から始まる指向性進化の新しいサイクルにかけること、の段階的な工程を含む。指向性進化のこの形式は、多くの成功した適用を支持したが、その段階的な性質が、いくつかの根本的な制約を課す。
原則的に、段階的な指向性進化が直面する上記の困難に、連続的、自立的な方式で進化分子の変異、選択、および増幅を行うことによって取り組み得る。タンパク質または核酸によって媒介される広い範囲の機能に対して適用し得る、インビボ連続的進化システムの実行は、関心のある遺伝子の多様化が細胞内で起こること、およびより高い適応度の配列が優先的に複製され、そして次世代の細胞へ伝達されることを必要とする。真に連続的な指向性進化システムの開発が直面する上記の困難の多くに、ウイルスの生活環の重要な特徴を利用することによって取り組み得る。本発明のインビボ指向性進化システムは、進化遺伝子の選択、維持、および増殖を行うために細胞を使用する。本発明の1つの局面において、バクテリオファージの生活環を、真に連続的な指向性進化のための枠組みとして使用した。このシステムは、指向性進化が、現在の方法を用いては近づけない、広い範囲の結合および触媒問題を解決することを可能にする。
変異誘発率に関するコントロールは、成功する指向性進化に重要である。高い最初の変異率は、各回において横断する配列スペースの距離を増加させることによって、配列の探索を増強する。しかし、高い変異率はまた、集団の急および狭い適応度ピークからの転落を生じ得る。従って、選択の初期に高い速度で多様化し、そして後に変異誘発を減少させること、または中程度の変異誘発のより長い期間を、集中した変異誘発の短い期間で中断することが有用であり得る。実施例1は、メチルメタンスルホネート(MMS)によって媒介される連続的変異誘発を支持する、セルスタットシステムの能力を実証する。セルスタットシステムを出入りする宿主細胞および化学的変異原の連続流が、変異誘発率のリアルタイムの調整を可能にする。様々な変異原濃度および時点における、選択下にない選択ファージミド中に存在するDNA(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のような)の配列決定によって、化学的変異原濃度および多様化率の間の関係を探索し得る。1時間あたりの変異率対MMS濃度を関係付ける、得られた検量線を使用して、続く実験における変異誘発率を設定し得る。
A.概説
遺伝的にコードされたタンパク質ドメインを用いて、リコンビナーゼ、ヌクレアーゼ、または転写制御因子を、実質的にあらゆる関心のある遺伝子へ標的化する能力は、ゲノミクス、ゲノム操作、および遺伝子治療研究を著しく進歩させる。本発明の前には、この能力は実現しない夢のままであった。単一のジンクフィンガードメインはDNAの3塩基対を認識する。6モジュールのオリゴマーは、18ヌクレオチド配列−ヒトゲノムにおいて唯一の部位を示すのに十分長い配列−を、強力な結合親和性で認識し得る(Kd=約1nMまたはそれより良好)。
全てのリコンビナーゼ酵素が、ジンクフィンガードメインとの融合による標的化に適当なわけではない。例えば、チロシンリコンビナーゼCre、Flp、およびλインテグラーゼ、ならびにΦC31およびより大きなセリンインテグラーゼは、組み込まれた触媒ドメインおよびDNA結合ドメインを有する。結果として、これらのリコンビナーゼについてのDNA特異性は、DNA結合ドメインのジンクフィンガードメインによるモジュラー置換によって変化させることができない。しかし、セリンリコンビナーゼのTn3ファミリーの特異性は、柔軟なリンカーによって別の触媒ドメインに結合したDNA結合ドメインによって決定し得る。この配置は、Tn3リコンビナーゼを、DNA結合ドメインの置換による再標的化のために理想的にする。Tn3リコンビナーゼの近縁、γδは、哺乳類細胞において活性であり、このファミリーはヒトにおける標的化遺伝子治療に有用であり得ることを示唆する。Zif268−Tn3は、ジンクフィンガー標的化リコンビナーゼ酵素として報告され、それに加えてGordleyら(Gordley RMら(2007)、J.Mol.Biol.367:802−813)は、Reczfの指向性進化を記載した。
機能亢進(hyperactive)Hinリコンビナーゼ(H107Y)も、ジンクフィンガーによるDNA結合を用いてDNA配列を標的化するために適当であり得る(図4)。Hinリコンビナーゼは、ジンクフィンガー認識配列を含む部位に、有効に再標的化し得、そして組換えの間に切断される中央のジヌクレオチドのすぐ前にあるプリンに対する優先以外は、配列の必要条件を有さない。本発明の連続的進化システムを使用して、RWWYテトラヌクレオチド(R=AまたはG;W=AまたはT;Y=CまたはT)、約16塩基対ごとに起こるモチーフを含む、あらゆるDNA配列において結合または組換えを触媒し得る、ジンクフィンガーDNA結合ドメインおよびジンクフィンガー標的化リコンビナーゼ酵素の両方を、迅速に生成し得る。
それぞれ異なるDNAトリプレットに結合し得る、異なるジンクフィンガードメインの操作における著しい進歩にも関わらず、現在どのジンクフィンガーモチーフも、CTCまたはTNNトリプレットのいずれも標的化できない。この限界が、多くの関心のある潜在的な配列を標的化することを阻害している。たとえこの問題が克服されたとしても、連鎖状ジンクフィンガーオリゴマーの特異性および有効性は、多くの場合中程度のままである。本発明の連続的進化システムを、高度に特異的および有効なジンクフィンガードメインおよびジンクフィンガー標的化Hinリコンビナーゼを迅速に生成するために適用し得る。
上記で記載された連続的進化システムは、ライブラリーメンバーによる増殖コンポーネントの発現の結果としてのみファージの増殖を可能にするようデザインされる。変異誘発は、セルスタット全体に起こり、そして従ってライブラリーメンバーをコードする遺伝子だけでなく、(i)宿主細胞ゲノム;(ii)アクセサリープラスミド;(iii)ヘルパーファージミド;および(iv)選択ファージミドのライブラリーをコードしない領域にも影響し得る。本発明の連続的進化システムのデザインの特徴は、これらの因子それぞれが、選択ファージミド増殖に影響する能力を最小限にする。
糸状バクテリオファージの生活環(図7)は、一般的な連続的指向性進化システムの理想的な枠組みを表わす。糸状ファージは、その宿主を溶解しない;その代わり、宿主細菌は、宿主細胞の増殖速度の減少という犠牲を払って、連続的にファージを分泌する。感染は、宿主細胞のFピリ線毛およびTolA受容体へ接触するために、ファージ遺伝子IIIタンパク質(g3p)を必要とする。g3pを産生できないファージは、野生型ファージより109倍以上感染性が低い。
Tn3セリンリコンビナーゼファミリーのリコンビナーゼは、天然にダイマーとしてその認識部位に結合し、組換えの間に切断される中央のジヌクレオチドにおいて触媒ドメインがダイマー化する。天然Tn3DNA結合ドメインを、Zif268ジンクフィンガーで置換することは、Zif268が結合する9ヌクレオチドから成る半分の部位、続くTn3認識配列から受け継いだ10ヌクレオチドの領域および中央のジヌクレオチドのリコンビナーゼ認識をもたらす。しかし、中央のジヌクレオチドに隣接する10個の受け継いだ(inherited)ヌクレオチドのうちいくつがTn3活性のために必要なのかは未知である。進化したジンクフィンガードメインによる標的化のために理想的に適したリコンビナーゼ酵素は、中央のジヌクレオチドに隣接するジンクフィンガープログラム配列の他に最小限の配列必要条件を有するべきである。それに加えて、組換えが起こる方向を制御するために、その酵素によって認識される中央のジヌクレオチドは、理想的には非パリンドロームであるべきである(図11)。Tn3リコンビナーゼは天然にはパリンドロームTA中央ジヌクレオチドを認識するが、密接に関連するHinリコンビナーゼは、天然に非パリンドロームAAまたはTT中央ジヌクレオチドに対して作用し、方向特異的組換えを可能にする。指向性進化達成のための開始点としてHinリコンビナーゼの適合性を評価するために、キメラZif268−Hinリコンビナーゼを生成し、そしてZif268認識配列および中央ジヌクレオチドの間の10個のヌクレオチドの中で、そのDNA配列必要条件を特徴付けた。
Claims (20)
- 核酸の連続的進化方法であって、
(i)進化させる遺伝子を含む選択ファージミドを、培養容器を通して細菌宿主細胞の流れへ導入する工程であって、
ここで、該宿主細胞は、
ファージゲノムを含むヘルパープラスミドであって、該ファージゲノム内の少なくとも1つの増殖コンポーネントが機能的に無力化されている、ヘルパープラスミドと、
該選択ファージミドに反応して該無力化された増殖コンポーネントを供給することができるアクセサリープラスミドと
を含み、
そして該培養容器を介した該宿主細胞の流れの速度は、該培養容器内での、該ファージミドの複製を許容するが該宿主細胞の複製は許容しない、工程;
(ii)宿主細胞の該流れ内で該ファージミドを複製および変異させる工程;および
(iii)細胞の該流れから進化される変異遺伝子を含むファージミドを単離する工程
を含む、方法。 - 前記選択ファージミドは、ファージ増殖コンポーネントをコードする遺伝子を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記選択ファージミドに含まれる前記ファージ増殖コンポーネントは、前記ファージミドの複製に必要である、請求項2に記載の方法。
- 前記選択ファージミドに含まれる前記ファージ増殖コンポーネントは、感染性ファージ粒子への前記ファージミドのパッケージングに必要である、請求項3に記載の方法。
- 前記方法は、前記進化される遺伝子の選択された機能についてのスクリーニング工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記スクリーニング工程は、ファージディスプレイシステム、抗生物質耐性、およびレポーター遺伝子の発現のうちの少なくとも一つを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記ヘルパープラスミドと前記アクセサリープラスミドが、単一のプラスミド内で組み合わされる、請求項1に記載の方法。
- 前記ファージは、M13ファージ、fdファージ、f1ファージ、ZJ/2ファージ、Ec9ファージ、AE2ファージ、HRファージ、δAファージ、およびIkeファージから成る群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記増殖コンポーネントは、遺伝子IIタンパク質(g2p)、遺伝子IIIタンパク質(g3p)、または遺伝子VIタンパク質(g6p)の少なくとも1つの不活化によって機能的に無力化されている、請求項1に記載の方法。
- 前記ファージミドの変異工程が、前記変異されたファージミドによってコードされる進化タンパク質または核酸を発現する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記変異工程が、変異誘発剤を導入する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記変異誘発剤が、化学的変異原、ヌクレオチドアナログ、ヌクレオシド前駆体、アルキル化剤、架橋剤、遺伝毒性物質、および放射線からなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記化学的変異原は、3−クロロ−4−(ジクロロメチル)−5−ヒドロキシ−2(5H)−フラノン(MX)(CAS no.77439−76−0)、O,O−ジメチル−S−(フタルイミドメチル)ホスホロジチオエート(phos−met)(CAS no.732−11−6)、ホルムアルデヒド(CAS no.50−00−0)、2−(2−フリル)−3−(5−ニトロ−2−フリル)アクリルアミド(AF−2)(CAS no.3688−53−7)、グリオキサール(CAS no.107−22−2)、6−メルカプトプリン(CAS no.50−44−2)、N−(トリクロロメチルチオ)−4−シクロヘキサン−1,2−ジカルボキシミド(カプタン)(CAS no.133−06−2)、2−アミノプリン(CAS no.452−06−2)、メチルメタンスルホネート(MMS)(CAS no.66−27−3)、4−ニトロキノリン1−オキシド(4−NQO)(CAS no.56−57−5)、N4−アミノシチジン(CAS no.57294−74−3)、アジ化ナトリウム(CAS no.26628−22−8)、N−エチル−N−ニトロソウレア(ENU)(CAS no.759−73−9)、N−メチル−N−ニトロソウレア(MNU)(CAS no.820−60−0)、5−アザシチジン(CAS no.320−67−2)、クメンヒドロペルオキシド(CHP)(CAS no.80−15−9)、エチルメタンスルホネート(EMS)(CAS
no.62−50−0)、N−エチル−N−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(ENNG)(CAS no.4245−77−6)、N−メチル−N−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(MNNG)(CAS no.70−25−7)、5−ジアゾウラシル(CAS no.2435−76−9)、およびt−ブチルヒドロペルオキシド(BHP)(CAS no.75−91−2)からなる群から選択される、請求項12に記載の方法。 - 前記宿主細胞が、SOS変異誘発損傷バイパスタンパク質を誘導的に発現するように改変される、および/または、前記宿主細胞が、誤りがちのDNAポリメラーゼサブユニットを誘導的に発現することができる変異促進性プラスミドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記SOS変異誘発損傷バイパスタンパク質は、ポリメラーゼVおよび活性化recAからなる群から選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記ヘルパープラスミド中で無力化される増殖コンポーネントは、前記アクセサリープラスミドから誘導的に発現される、請求項15に記載の方法。
- 前記増殖コンポーネントが、前記選択ファージミドによってコードされる遺伝子産物によって活性化されるプロモーターの制御下で発現される、請求項16に記載の方法。
- 前記方法は、変異された核酸鎖を単離する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記方法は、前記工程(i)〜(iii)を反復する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記宿主細胞は、ファージ感染を介して、ある細胞から別の細胞へと核酸を運搬するシステムをさらに含む、請求項1に記載の方法。
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