JP2012501656A5

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Publication number: JP2012501656A5
Application number: JP2011526268A
Authority: JP
Filing date: 2009-09-08
Publication date: 2013-11-14
Anticipated expiration: 2029-09-08

Description

別の局面において、本発明は、核酸鎖を最初の細胞から２番目の細胞へ、機能依存的な方式で伝達し得る、連続的指向性進化システムのキットおよびシステムを開示する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
核酸の連続的進化方法であって、
進化させる少なくとも１つの機能的核酸鎖を第一の宿主細胞へ導入する工程；
該第一の宿主細胞内で該機能的核酸鎖を複製する工程；
該機能的核酸鎖を変異させる工程；および
少なくとも１つの該変異機能的核酸鎖を第二の宿主細胞へ導入する工程
を含む、方法。
（項目２）
前記宿主細胞が、原核細胞、真核細胞、および細菌細胞からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記機能的核酸鎖は、進化させる遺伝子および増殖コンポーネントをコードする第二の遺伝子を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記増殖コンポーネントは、前記第一の宿主細胞における前記機能的核酸鎖の複製のために必要である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記増殖コンポーネントは、前記第二の宿主細胞への前記機能的核酸鎖の導入のために必要である、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記変異工程は、前記変異核酸鎖の選択された機能についてのスクリーニングをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記スクリーニング工程は、バクテリオファージディスプレイシステム、抗生物質耐性、およびレポーター遺伝子の発現のうちの少なくとも一つを含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記宿主細胞は、
少なくとも一つの増殖シグナルが機能的に無力にされたファージゲノムを含むヘルパープラスミド；および
前記機能的な発現した核酸鎖に反応して１つまたは複数の該無力にされた増殖シグナルを提供することができるアクセサリープラスミド
をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ファージ増殖シグナルは、遺伝子ＩＩタンパク質（ｇ２ｐ）、遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｇ３ｐ）、または遺伝子ＶＩタンパク質（ｇ６ｐ）のうちの少なくとも１つの不活化によって、機能的に無力にされる、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記ファージゲノムは、Ｍ１３ファージゲノム、ｆｄファージゲノム、ｆ１ファージゲノム、ＺＪ／２ファージゲノム、Ｅｃ９ファージゲノム、ＡＥ２ファージゲノム、ＨＲファージゲノム、δＡファージゲノム、およびＩｋｅファージゲノムから成る群から選択される、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記変異機能的核酸鎖を第二の宿主細胞へ導入する工程は、前記第一の宿主細胞を培養する工程をさらに含み、ここで該第一の宿主細胞は、該機能的核酸鎖によってコードされるファージミド核酸分子を糸状ファージ粒子へパッケージングすることができる、項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記変異機能的核酸鎖を第二の宿主細胞へ導入する工程は、前記パッケージングされたファージミド核酸分子を含む前記糸状ファージ粒子を該第二の宿主細胞へと導入し、その結果進化させる該核酸鎖を該第二の宿主細胞へ導入する工程をさらに含み、ここで該第二の宿主細胞は、ヘルパープラスミドおよびアクセサリープラスミドを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記機能的核酸の変異工程が、前記変異機能的核酸鎖によってコードされる進化タンパク質または核酸を発現する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記機能的核酸の変異工程が、変異誘発剤を導入する工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記変異誘発剤が、ヌクレオチドアナログ、ヌクレオシド前駆体、アルキル化剤、架橋剤、遺伝毒性物質、および放射線からなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記変異誘発剤が、化学的変異原である、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記化学的変異原は、３−クロロ−４−（ジクロロメチル）−５−ヒドロキシ−２（５Ｈ）−フラノン（ＭＸ）（ＣＡＳｎｏ．７７４３９−７６−０）、Ｏ，Ｏ−ジメチル−Ｓ−（フタルイミドメチル）ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓ−ｍｅｔ）（ＣＡＳｎｏ．７３２−１１−６）、ホルムアルデヒド（ＣＡＳｎｏ．５０−００−０）、２−（２−フリル）−３−（５−ニトロ−２−フリル）アクリルアミド（ＡＦ−２）（ＣＡＳｎｏ．３６８８−５３−７）、グリオキサール（ＣＡＳｎｏ．１０７−２２−２）、６−メルカプトプリン（ＣＡＳｎｏ．５０−４４−２）、Ｎ−（トリクロロメチルチオ）−４−シクロヘキサン−１，２−ジカルボキシミド（カプタン）（ＣＡＳｎｏ．１３３−０６−２）、２−アミノプリン（ＣＡＳｎｏ．４５２−０６−２）、メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）（ＣＡＳｎｏ．６６−２７−３）、４−ニトロキノリン１−オキシド（４−ＮＱＯ）（ＣＡＳｎｏ．５６−５７−５）、Ｎ４−アミノシチジン（ＣＡＳｎｏ．５７２９４−７４−３）、アジ化ナトリウム（ＣＡＳｎｏ．２６６２８−２２−８）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）（ＣＡＳｎｏ．７５９−７３−９）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＭＮＵ）（ＣＡＳｎｏ．８２０−６０−０）、５−アザシチジン（ＣＡＳｎｏ．３２０−６７−２）、クメンヒドロペルオキシド（ＣＨＰ）（ＣＡＳｎｏ．８０−１５−９）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）（ＣＡＳｎｏ．６２−５０−０）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＥＮＮＧ）（ＣＡＳｎｏ．４２４５−７７−６）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）（ＣＡＳｎｏ．７０−２５−７）、５−ジアゾウラシル（ＣＡＳｎｏ．２４３５−７６−９）、およびｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ＢＨＰ）（ＣＡＳｎｏ．７５−９１−２）からなる群から選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記宿主細胞が、ＳＯＳ変異誘発損傷バイパスタンパク質を誘導的に発現するように改変される、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記ＳＯＳ変異誘発損傷バイパスタンパク質は、ポリメラーゼＶおよび活性化ｒｅｃＡからなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記宿主細胞が、誤りがちのＤＮＡポリメラーゼサブユニットを誘導的に発現することができる変異促進性プラスミドを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記アクセサリープラスミドは、前記ヘルパープラスミドから１つまたは複数の無力になったシグナルを誘導的に発現することができる、項目８に記載の方法。
（項目２２）
前記方法は、前記変異核酸鎖を単離する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記方法は、前記工程を反復する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記宿主細胞は、ある細胞から別の細胞へと核酸を運搬するシステムをさらに含み、該システムは、前記第一の宿主細胞および前記第二の宿主細胞の間の接合伝達（接合）；該第一の宿主細胞が前記機能的核酸を封入し、該第二の宿主細胞への侵入を提供することができる、ウイルス感染；および該裸の核酸鎖が該第二の宿主細胞によって取り込まれる、該第一の細胞からの該機能的核酸の排除、からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記機能的核酸の排除の工程は、分泌または溶解のうちの少なくとも一つを含む、項目２４に記載の方法。

Claims

核酸の連続的進化方法であって、
（ｉ）進化させる遺伝子を含む選択ファージミドを、ラグーンを通して細菌宿主細胞の流れへ導入する工程であって、
ここで、該宿主細胞は、感染性ファージ粒子への該選択ファージミドのパッケージングに必要であるファージ遺伝子を含み、
ここで、ファージ粒子への該選択ファージミドのパッケージングに必要とされる少なくとも１つの遺伝子は、該宿主細胞中の進化される該遺伝子の発現に応答して発現され、そして該ラグーンを介した該宿主細胞の流れの速度は、該ラグーン内での、該ファージミドの複製を許容するが該宿主細胞の複製は許容しない、工程；
（ｉｉ）宿主細胞の該流れ内で該ファージミドを複製および変異させる工程；および
（ｉｉｉ）細胞の該流れから進化される変異遺伝子を含むファージミドを単離する工程
を含む、方法。
前記ファージミドは、ファージ増殖コンポーネントをコードする遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
前記ファージ増殖コンポーネントは、前記ファージミドの複製に必要である、請求項２に記載の方法。
前記増殖コンポーネントは、感染性ファージ粒子への前記ファージミドのパッケージングに必要である、請求項３に記載の方法。
前記方法は、前記進化される遺伝子の選択された機能についてのスクリーニング工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記スクリーニング工程は、ファージディスプレイシステム、抗生物質耐性、およびレポーター遺伝子の発現のうちの少なくとも一つを含む、請求項５に記載の方法。
前記宿主細胞は、
ファージ粒子内への前記選択ファージミドのパッケージングに必要な少なくとも一つの遺伝子が無力にされたファージゲノムを含むヘルパープラスミド；および
前記ヘルパープラスミド内の無効にされたファージ粒子内への前記選択ファージミドのパッケージングに必要な遺伝子を含むアクセサリープラスミドであって、ここで該遺伝子が、前記進化される遺伝子の発現に応答して該アクセサリープラスミドから発現される、アクセサリープラスミド、
を含む、請求項１に記載の方法。
前記ファージは、Ｍ１３ファージ、ｆｄファージ、ｆ１ファージ、ＺＪ／２ファージ、Ｅｃ９ファージ、ＡＥ２ファージ、ＨＲファージ、δＡファージ、およびＩｋｅファージから成る群から選択される、請求項７に記載の方法。
前記進化される遺伝子の発現に応答して発現されるファージ粒子内への前記選択ファージミドのパッケージングに必要な前記遺伝子は、遺伝子ＩＩタンパク質（ｇ２ｐ）、遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｇ３ｐ）、または遺伝子ＶＩタンパク質（ｇ６ｐ）である、請求項８に記載の方法。
前記ファージミドの変異工程が、前記変異されたファージミドによってコードされる進化タンパク質または核酸を発現する工程を含む、請求項１に記載の方法。
前記変異工程が、変異誘発剤を導入する工程を含む、請求項１に記載の方法。
前記変異誘発剤が、化学的変異原、ヌクレオチドアナログ、ヌクレオシド前駆体、アルキル化剤、架橋剤、遺伝毒性物質、および放射線からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
前記化学的変異原は、３−クロロ−４−（ジクロロメチル）−５−ヒドロキシ−２（５Ｈ）−フラノン（ＭＸ）（ＣＡＳｎｏ．７７４３９−７６−０）、Ｏ，Ｏ−ジメチル−Ｓ−（フタルイミドメチル）ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓ−ｍｅｔ）（ＣＡＳｎｏ．７３２−１１−６）、ホルムアルデヒド（ＣＡＳｎｏ．５０−００−０）、２−（２−フリル）−３−（５−ニトロ−２−フリル）アクリルアミド（ＡＦ−２）（ＣＡＳｎｏ．３６８８−５３−７）、グリオキサール（ＣＡＳｎｏ．１０７−２２−２）、６−メルカプトプリン（ＣＡＳｎｏ．５０−４４−２）、Ｎ−（トリクロロメチルチオ）−４−シクロヘキサン−１，２−ジカルボキシミド（カプタン）（ＣＡＳｎｏ．１３３−０６−２）、２−アミノプリン（ＣＡＳｎｏ．４５２−０６−２）、メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）（ＣＡＳｎｏ．６６−２７−３）、４−ニトロキノリン１−オキシド（４−ＮＱＯ）（ＣＡＳｎｏ．５６−５７−５）、Ｎ４−アミノシチジン（ＣＡＳｎｏ．５７２９４−７４−３）、アジ化ナトリウム（ＣＡＳｎｏ．２６６２８−２２−８）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）（ＣＡＳｎｏ．７５９−７３−９）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＭＮＵ）（ＣＡＳｎｏ．８２０−６０−０）、５−アザシチジン（ＣＡＳｎｏ．３２０−６７−２）、クメンヒドロペルオキシド（ＣＨＰ）（ＣＡＳｎｏ．８０−１５−９）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）（ＣＡＳ
ｎｏ．６２−５０−０）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＥＮＮＧ）（ＣＡＳｎｏ．４２４５−７７−６）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）（ＣＡＳｎｏ．７０−２５−７）、５−ジアゾウラシル（ＣＡＳ
ｎｏ．２４３５−７６−９）、およびｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ＢＨＰ）（ＣＡＳｎｏ．７５−９１−２）からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
前記宿主細胞が、ＳＯＳ変異誘発損傷バイパスタンパク質を誘導的に発現するように改変される、および／または、前記宿主細胞が、誤りがちのＤＮＡポリメラーゼサブユニットを誘導的に発現することができる変異促進性プラスミドを含む、請求項１に記載の方法。
前記ＳＯＳ変異誘発損傷バイパスタンパク質は、ポリメラーゼＶおよび活性化ｒｅｃＡからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
前記ヘルパープラスミド中で無力化されるファージ粒子内への前記選択ファージミドのパッケージングに必要な遺伝子は、前記アクセサリープラスミドから誘導的に発現される、請求項１５に記載の方法。
前記１つ以上の無力化されたシグナルが、前記機能的核酸鎖によってコードされる遺伝子産物によって活性化されるプロモーターの制御下で発現される、請求項１６に記載の方法。
前記方法は、変異された核酸鎖を単離する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記方法は、前記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を反復する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記宿主細胞は、ファージ感染を介して、ある細胞から別の細胞へと核酸を運搬するシステムをさらに含む、請求項１に記載の方法。