JP5785378B2 - 組織培養法 - Google Patents
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Description
ヤトロファ属植物の植物細胞として、ヤトロファ・クルカス(Jatropha curcas)の子葉を使用した。種皮を取り除いた種子核を70%濃度のエタノールに10分、続いて15〜30%に希釈したアンチホルミンに5分浸漬して滅菌した後、3%ショ糖を含むMS培地にて発芽させた。
アグロバクテリウム菌の調整:アグロバクテリウム菌は、そのTiプラスミドを無害化したLBA4404株(M. W. Bevan et al. Nucleic Acids Res. 12:8711-8721(1984))を使用した。形質転換の確認のために、市販品として入手可能なβ−グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子をバイナリーベクターに組み込んで作られたプラスミドpBI121を購入して使用し、アグロバクテリウム菌に形質転換した(R. A. Jefferson et al. EMBO J. 6:3901-3907(1987)参照)。前記のβ−グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子を保有するアグロバクテリウム菌LBA4404/pBI121を、マーカーであるカナマイシンを50μg/mlの濃度で含有するL−液体培地にて、30℃で一晩培養した。
引き続いてアグロバクテリウム菌を感染させた子葉片を、MS培地に3mg/LのBAと0.1mg/LのIBA、3%ショ糖及び200μg/mLのCefotaxime、マーカーであるカナマイシンを20μg/mlで添加した固体培地(0.7%の寒天を含む。)に移植した。その後、形成されたカルスを3mg/LのIBAと0.5mg/LのBA、0.7%の寒天、さらに20μg/mlのカナマイシンを含むMS固体培地に移植し、25℃の温度、2,000lux16時間の明時間の環境下で8週間培養し、シュートを形成させた。得られたシュート中に発現したGUS活性を、Kosugiらの方法(Kosugi et al., An improved Assay for beta-Glucuronidase in Transformed Cell: Methanol Almost Completely Suppresses a Putative Endogenous beta- Glucuronidase Activity. Plant Science. 70, 133-140(1990))に従って測定した。また、比較対象として、Sandvortexの替わりに従来法である単純振とう及び超音波処理により細胞に傷害を与え、Sandvoretx法との対比を行った。GUS活性における比較結果を表1及び図1に、カルス形成数及びシュート形成数における比較結果を表2及び図2に示した。これらの結果は3回の繰り返し実験を行った結果を平均したものである。いずれの処理においても標的遺伝子が安定に導入され、導入された遺伝子が発現されていることが確認された。また、20秒程度のSandvortex処理によって従来方法に比べて効率よく形質転換されていることが確認された。このように、Sandvortex法が従来方法である振とう法やSAAT法に比べて有利であることが証明された。もっともSAAT法も振とう法に比べて有利に形質転換できる。
シュート形成のための培地条件の検討を行った。Sandvortex法(15秒間の振動)によって形質転換された細胞から得られたカルスを用いてシュート形成を試みた。植物成長調節物質としてBAとIBAとTDZを用いた。表4に示す組み合わせ及び濃度で2種又は3種の植物成長調節物質をMS培地に添加し、0.7%の寒天を含む固体培地を作製した。25℃の温度、2,000Luxの照明下16時間の明時間の培養条件で6週間培養した。シュート形成した外植体の数を計数し、用いた外植体の数に対してシュート形成された外植体の数の割合(頻度(%))を求めた。その結果を表4及び図3に示した。これらの結果は3回の繰り返し実験の結果を平均したものである。BA(1mg/L)とTDZ(0.5又は1mg/L)とIBA(0.1mg/L)の組み合わせが最も高い頻度でシュートを形成したが、それよりもBA濃度が高いBA(2又は3mg/L)とIBA(0.1mg/L)の組み合わせでもそれとほぼ同じ頻度でシュートを形成し、少ない種類の植物成長調節物質を用いても高い頻度でシュート形成されることが見いだされた。
次にシュート伸長のために、形成されたシュートを植物成長調節物質としてBA(2mg/L)のみを含むMS培地に移植した。0.7%の寒天を含む固体培地を用い、25℃の温度、2,000luxの照明下16時間の明時間の培養条件で6週間培養した。図4にはその伸長経過を示す画像を示した。図4からも理解されるようにBAのみを用いた場合でも良好にシュート伸長が観察された。
引き続いて2〜3cm程度の高さに成長したシュートを、発根のために発根用の培地に移植した。発根用の培地には、植物成長調節物質としてIBA(0.2mg/L)のみを含み、基本培地であるMS培地濃度を半分にした1/2MS培地を用いた。比較としてIBA(0.2mg/L)を含まない1/2MS培地を用いた。図5には移植後2週間経過後のシュート画像を示した。培養条件は前記シュート伸長時と同じである。両培地において発根及びシュート伸長が確認されたが、IBAを含まない培地に比べると、IBAを含む培地の方が良好な発根、シュート伸長が確認された。以上の工程により、ヤトロファ・クルカスの子葉から植物体に再分化・再生させることができた。このように本発明の方法によってアグロバクテリウム菌による感染から約24週間でGUS遺伝子が導入された形質転換体であるヤトロファ属の再生体が得られた。
Claims (7)
- ヤトロファ属植物の子葉細胞を用いた組織培養法であって、
植物成長調節物質として0.05〜0.6mg/LのIBAと1.5〜3.5mg/LのBAのみを含むMS培地でヤトロファ属植物の細胞からシュートを形成させる工程と、
前記形成されたシュートを植物成長調節物質として1.5〜3.5mg/LのBAのみを含むMS培地に移植して伸長させる工程と、
前記伸長させたシュートを植物成長調節物質として0.1〜0.5mg/LのIBAのみを含む1/2MS培地に移植して発根させる工程を有することを特徴とする組織培養法。 - 0.5mg/LのIBAと2mg/L又は3mg/LのBAを含むMS培地でシュートを形成させる工程と、
2mg/LのBAを含むMS培地で形成されたシュートを伸長させる工程と、
0.2mg/LのIBAを含む1/2MS培地で発根させる工程を有することを特徴とする請求項1に記載の組織培養法。 - 前記ヤトロファ属植物の子葉細胞は、子葉片と砂とアグロバクテリウム菌を含む懸濁液にロータリー式振動装置による振動を付与してアグロバクテリウム菌を感染させた細胞であることを特徴とする請求項1又は2に記載の組織培養法。
- 前記砂の粒子径は、50〜70メッシュである請求項3に記載の組織培養法。
- 前記砂は白石英砂である請求項3又は4に記載の組織培養方法。
- 前記ヤトロファ属植物の子葉細胞は、子葉片とアグロバクテリウム菌を含む懸濁液を超音波処理してアグロバクテリウム菌を感染させた細胞であることを特徴とする請求項1又は2に記載の組織培養法。
- ヤトロファ属植物の子葉片と、砂と、外来遺伝子を組み込んだアグロバクテリウム菌とを含む懸濁液に、ロータリー式振動装置による振動を付与してアグロバクテリウム菌を感染させたヤトロファ属植物の形質転換細胞を得る工程;
植物成長調節物質として0.05〜0.6mg/LのIBAと1.5〜3.5mg/LのBAのみを含むMS培地で、前記形質転換された細胞からシュートを形成させる工程と、
前記形成されたシュートを植物成長調節物質として1.5〜3.5mg/LのBAのみを含むMS培地に移植して伸長させる工程と、
前記伸長させたシュートを植物成長調節物質として0.1〜0.5mg/LのIBAのみを含む1/2MS培地に移植して発根させる工程を有することを特徴とする形質転換ヤトロファ属植物を高効率に生産する方法。
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