JP5690270B2 - 乳酸菌由来のrnaを有効成分とする組成物 - Google Patents
乳酸菌由来のrnaを有効成分とする組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5690270B2 JP5690270B2 JP2011529940A JP2011529940A JP5690270B2 JP 5690270 B2 JP5690270 B2 JP 5690270B2 JP 2011529940 A JP2011529940 A JP 2011529940A JP 2011529940 A JP2011529940 A JP 2011529940A JP 5690270 B2 JP5690270 B2 JP 5690270B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- rna
- lactic acid
- production
- bar graph
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 126
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 79
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 title claims description 63
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 title claims description 63
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 47
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 title claims description 15
- 108010011429 Interleukin-12 Subunit p40 Proteins 0.000 claims description 50
- 102100039390 Toll-like receptor 7 Human genes 0.000 claims description 43
- 102000014158 Interleukin-12 Subunit p40 Human genes 0.000 claims description 37
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 35
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 34
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 33
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 claims description 17
- 101150053046 MYD88 gene Proteins 0.000 claims description 17
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 claims description 17
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 15
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 15
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 13
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 claims description 13
- 102100032366 C-C motif chemokine 7 Human genes 0.000 claims description 8
- 101000797758 Homo sapiens C-C motif chemokine 7 Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 8
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 8
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 claims description 7
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 claims description 7
- 102100025248 C-X-C motif chemokine 10 Human genes 0.000 claims description 7
- 101000797762 Homo sapiens C-C motif chemokine 5 Proteins 0.000 claims description 7
- 101000897480 Homo sapiens C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000858088 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 10 Proteins 0.000 claims description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 3
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims 1
- 101000669402 Homo sapiens Toll-like receptor 7 Proteins 0.000 claims 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 149
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 106
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 50
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 49
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 49
- 108010060825 Toll-Like Receptor 7 Proteins 0.000 description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 39
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 26
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 26
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 22
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 22
- 230000019734 interleukin-12 production Effects 0.000 description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 18
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 17
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 17
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 17
- 108010060818 Toll-Like Receptor 9 Proteins 0.000 description 15
- 102100033117 Toll-like receptor 9 Human genes 0.000 description 15
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 15
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 14
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 11
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 11
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 10
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 10
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 10
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 10
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 9
- 230000009471 action Effects 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 9
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 8
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 8
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 7
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 7
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 description 6
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 description 6
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 6
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001608472 Bifidobacterium longum Species 0.000 description 5
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 5
- 101000831567 Homo sapiens Toll-like receptor 2 Proteins 0.000 description 5
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 description 5
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 5
- 102100024333 Toll-like receptor 2 Human genes 0.000 description 5
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 229940009291 bifidobacterium longum Drugs 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 4
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 4
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 4
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 4
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 4
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 4
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 4
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 4
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 229940044655 toll-like receptor 9 agonist Drugs 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100032814 ATP-dependent zinc metalloprotease YME1L1 Human genes 0.000 description 3
- 241000186016 Bifidobacterium bifidum Species 0.000 description 3
- 241000186015 Bifidobacterium longum subsp. infantis Species 0.000 description 3
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 3
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 3
- 241000186606 Lactobacillus gasseri Species 0.000 description 3
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 3
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 3
- 241000218588 Lactobacillus rhamnosus Species 0.000 description 3
- 241000194034 Lactococcus lactis subsp. cremoris Species 0.000 description 3
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 3
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 3
- 241000828418 Neomicrococcus lactis Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 101800000795 Proadrenomedullin N-20 terminal peptide Proteins 0.000 description 3
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 3
- 235000014962 Streptococcus cremoris Nutrition 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 3
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 3
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 229940002008 bifidobacterium bifidum Drugs 0.000 description 3
- 229940004120 bifidobacterium infantis Drugs 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 235000015140 cultured milk Nutrition 0.000 description 3
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 3
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 235000021107 fermented food Nutrition 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 210000001986 peyer's patch Anatomy 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 230000034190 positive regulation of NF-kappaB transcription factor activity Effects 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229940044616 toll-like receptor 7 agonist Drugs 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 241000186018 Bifidobacterium adolescentis Species 0.000 description 2
- 241000186012 Bifidobacterium breve Species 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical group C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 102000014154 Interleukin-12 Subunit p35 Human genes 0.000 description 2
- 108010011301 Interleukin-12 Subunit p35 Proteins 0.000 description 2
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 description 2
- 235000013956 Lactobacillus acidophilus Nutrition 0.000 description 2
- 241000192001 Pediococcus Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 RNA Chemical class 0.000 description 2
- 102100032491 Serine protease 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710151387 Serine protease 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 101710119665 Trypsin-1 Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N Zirconium dioxide Chemical compound O=[Zr]=O MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical group O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 2
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 2
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 2
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 2
- 229940039695 lactobacillus acidophilus Drugs 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 2
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 2
- 102000007863 pattern recognition receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010089193 pattern recognition receptors Proteins 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 description 2
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000014452 scavenger receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010078070 scavenger receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 229920001342 Bakelite® Polymers 0.000 description 1
- 108700013048 CCL2 Proteins 0.000 description 1
- 108010008978 Chemokine CXCL10 Proteins 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101100447432 Danio rerio gapdh-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010015719 Exsanguination Diseases 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 101000831496 Homo sapiens Toll-like receptor 3 Proteins 0.000 description 1
- 101150003028 Hprt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000005353 IP-10 production Effects 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000004125 Interleukin-1alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010082786 Interleukin-1alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241000186869 Lactobacillus salivarius Species 0.000 description 1
- 241000192132 Leuconostoc Species 0.000 description 1
- 241000192130 Leuconostoc mesenteroides Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000054812 Microbacterium gubbeenense Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000500340 Pediococcus damnosus Species 0.000 description 1
- QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M Pentobarbital sodium Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)[N-]C1=O QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 102100024324 Toll-like receptor 3 Human genes 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 108091005764 adaptor proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035181 adaptor proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000023385 chemokine (C-C motif) ligand 5 production Effects 0.000 description 1
- 230000014564 chemokine production Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000008821 health effect Effects 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 230000017306 interleukin-6 production Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 238000011430 maximum method Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000023185 monocyte chemotactic protein-1 production Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002275 pentobarbital sodium Drugs 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000021395 porridge Nutrition 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical compound N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 235000011888 snacks Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 238000003211 trypan blue cell staining Methods 0.000 description 1
- 230000006433 tumor necrosis factor production Effects 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0387—Animal model for diseases of the immune system
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
(1)乳酸菌由来の一本鎖RNAを有効成分とする、サイトカイン産生を調整するための組成物である、前記乳酸菌がエンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)である組成物。
(2)IL−12、CCL2、CCL5、CCL7、CXCL10、IL−6、および、IL−1αからなる群から選択される少なくとも一のサイトカインの産生を促進するための組成物である、(1)に記載の組成物。
(3)前記IL−12がIL−12p40である、(2)に記載の組成物。
(4)TNF−αの産生を抑制するための組成物である、(1)に記載の組成物。
(5)TLR7およびMyd88からなる群から選択される少なくとも一の生体分子に依存的なサイトカイン産生を調整するための組成物である、(1)〜(4)のうちのいずれかに記載の組成物。
(6)前記乳酸菌が、エンテロコッカス・フェカリス・EC−12株である、(1)〜(5)のうちのいずれかに記載の組成物。
(7)経口摂取用組成物である、(1)〜(6)のうちのいずれかに記載の組成物。
<マウス由来マクロファージ様細胞J774.1株の維持>
マウス由来マクロファージ様細胞株であるJ774.1細胞株の維持は、5%CO2、37℃の条件下の5%量のウシ胎児血清(fetal calf serum:FCS)、100U/mL ペニシリン、100μg/mL ストレプトマイシンを含むRPMI1640培地(L−グルタミン含有:ナカライテスク株式会社製)中で行った。細胞が80%コンフルエントに達した時点で、2.5g/L トリプシン‐1mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)溶液(ナカライテスク株式会社製)で5分間処理後、セルスクレーパー(IWAKI社製)で細胞を剥離し、継代を行った。
乳酸菌として、殺菌乳酸菌体EC−12(コンビ株式会社製)を、5%FCS RPMI1640培地に10mg/mLとなるように添加し、確実に分散するようULTRASONIC DISRUPTOR(Tomy社製)で出力3、破砕30秒、休止30秒のインターバルを5反復、計2分30秒間氷上で超音波処理した。超音波処理後、5%FCS RPMI1640培地で菌体懸濁液を3段階に連続希釈し(10倍、10倍、5倍)、20μg/mLに調製後、培養に供した。
前記の通りに調製し、80%コンフルエントに達したJ774.1細胞を、0.1M PBS(Phosphate buffered saline)で洗浄した後、2.5g/L トリプシン‐1mM EDTA溶液で5分間処理した。処理後、セルスクレーパーで培養器から細胞を剥がして得られた細胞懸濁液を1,000rpm(170g)、室温で5分間遠心した。集積して得られた細胞を5%FCS RPMI1640培地に再懸濁し、血球計算盤を用いて細胞数を測定して、細胞数を5×105cell/mLに調製した。調製した細胞懸濁液を細胞培養用96ウェルプレート(SUMILON:住友ベークライト株式会社製)に100μL/ウェル(5×104cell)ずつ播種し、細胞が接着するまで5%CO2、37℃の条件下で4時間前培養した。
細胞からの全RNA抽出には、QuickGene RNA cultured cell HC kit S(富士フイルム株式会社製)を用いた。キット添付のLRP溶液(1mLあたり10μLの2−メルカプトエタノール添加済み)を100μL/well添加し、5mmジルコニアビーズ入りのスクリューキャップチューブに移し、FastPrep FP120(フナコシ株式会社製)を用いて、速度4.0、40秒間で細胞破砕を行った。抽出キット添付のSRP溶液を15μL加え、15秒間ボルテックスした後、99.5%エタノールを50μL加え、1分間ボルテックスした。その後の処理は、QuickGene−Mini80を用い、キット添付のプロトコルに準拠した。DNase処理には、RNase free DNase I(Takara社製)を使用し、キット添付のプロトコール通り、オンカラム法にて行った。
抽出したRNAを鋳型として、PrimeScript(TM) RT reagent Kit for Perfect Real Time(Takara社製)を用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した。すなわち、全RNA150ngを鋳型として用い、逆転写プライマーとしてキット添付のOligo dT Primer及びRandom 6 mersを使用し、滅菌水(RNase free)で全量を10μLにし、キット添付の説明書に準拠し、逆転写反応を行い、cDNAを合成した。
合成して得られたcDNAを鋳型として、リアルタイムPCRを用いてIL−12p40遺伝子の発現量を測定した。リアルタイムPCRには、LightCycler(R)480 Real−Time PCR System(Roche Applied Science製)を用いた。反応液の組成は、鋳型cDNA2μL、LightCycler(R)480 Probes Master(Roche Applied Science製)5μL、100nM Universal Probe Library Probe(Roche Applied Science製)、200nMの各プライマーで全量10μLとした。反応は、95℃:5分間の初期変性後、95℃:10秒間、60℃:10秒間、72℃:10秒間のサイクルを50サイクルかけて行った。また、内部補正因子としてグリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素(GAPDH)遺伝子を用いた。プライマーはプローブファインダーソフトウェア(Roche Applied Science製)でデザインした。各プライマーの塩基配列及びUniversal Probe Library Probeナンバーを表1に示す。また、リアルタイムPCRの結果の解析にはLightCycler(R)480 ソフトウェア(Roche Applied Science製)を用い、2nd Derivative Maximum法でThreshold Cycle(Ct)値を算出後、ΔΔCt法による相対定量解析を行った。
20時間培養後の細胞培養上清中のIL−12タンパク質の濃度はMouse Interleukin−12 ELISA Kit(BioSource:Invitrogen社製)を用いて測定した。測定手順はキットのプロトコルに準拠した。
<添加用EC−12の調製>に記載した通りに、5%FCS RPMI1640培地に分散させたEC−12(10mg/mL)を、20units/mLのRNase free DNase I(Takara社製)、又は0.1mg/mLのRNase A(Invitrogen社製)で37℃、30分間処理した。処理後、各ヌクレアーゼ処理後のEC−12を前述の通りに3段階に希釈して、試験例1と同様にしてJ774.1細胞との培養を行った。
TLR7及びTLR9のアンタゴニストとして、ホスホロチオエート化(S化)した合成オリゴヌクレオチド(ODN)を用いた(Barrat,F.J. et al. J.Exp.Med.2005,202(8):1131−9 参照)。すなわち、TLR7のアンタゴニストとしてIRS661、TLR9のアンタゴニストとしてIRS869を使用した。また、TLR7のアゴニストとしてCL097(InvivoGen社製)、TLR9のアゴニストとしてホスホロチオエート化した合成ODNであるISS1018を用いた。各合成ODNの配列は表2に示す。
<EC−12からのRNA抽出>
EC−12からのRNA抽出は、QuickGene RNA tissue kit S II(富士フイルム株式会社製)を用いて行った。すなわち、EC−12 150mgにキット添付のLRT溶液(1mLあたり10μLの2−メルカプトエタノール添加済み)を500μL添加し、0.1mmグラスビーズ入りのスクリューキャップチューブに移し、FastPrep FP120(フナコシ株式会社製)を用いて、速度6.5、90秒間ホモジナイズした。その後の操作は、キットの抽出プロトコルに準拠して行った。また、DNase処理には、RNase free DNase I(Takara社製)を使用し、上記kit S II添付のプロトコル通りオンカラム法にて行った。
EC−12からのDNA抽出は、QuickGene DNA tissue kit S(富士フイルム株式会社製)を用い、QuickGeneのアプリケーションガイドNo.38に準拠して行った。すなわち、EC−12 150mgにキット添付のMDT溶液を250μL添加し、0.1mmグラスビーズ入りのスクリューキャップチューブに移し、FastPrep FP120(フナコシ株式会社製)を用いて、速度6.5、90秒間ホモジナイズした。その後、キット添付のEDT溶液を25μL加え、55℃で60分間のインキュベートを行った。インキュベート後、13,000rpm(12,000g)、室温で10分間遠心し、上清200μLを新しいマイクロチューブに分取し、RNase A(20mg/mL:Invitrogen社製)を60μL加え、室温で2分間インキュベートした。さらに、キット添付のLDT溶液を180μL加え、15秒間ボルテックスした後、70℃で10分間インキュベートし、99.5%エタノールを240μL加え、15秒間ボルテックスした。その後の処理は、QuickGene−Mini80を用い、キット添付のプロトコルに準拠して行った。
J774.1細胞は、遊離のRNAの取り込みが無いものと判断したので、RNAを細胞内に導入するため、リポフェクションを行った。リポフェクションにはFuGENE HD Transfection Reagent(Roche Applied Science製)を用いた。試験例4と同様にしてEC−12から抽出、調製した全RNAを無血清培地(Opti−MEM)で20μg/μLに調製後、FuGENE HD Transfection Reagentを6μL添加し、10分間反応させ、FuGENE/RNA複合体を形成させた。この複合体を細胞数0.5×105cellあたり5μL滴下し、20時間培養した。また、EC−12由来の全RNA(50μg/μL)を0.1mg/mLのRNase A(Invitrogen社製)で処理したものも同様の方法でリポフェクションを行った。さらに、TLR7シグナリングを阻害したJ774.1細胞を試験例3と同様にして調製し、調製して得られた細胞にも同様の方法でリポフェクションを行った。
各菌体(Enterococcus faecalis EC−12株、Enterococcus faecalis(株違い)、Enterococcus faecium、Lactococcus cremoris、Lactococcus lactis、Streptococcus thermophilus、Lactobacillus casei、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus salivarius、Bifidobacterium adolescentis、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium infantis、Bifidobacterium longum)にRNase処理(0.1mg/mlのRNase(Invitrogen社製)で37℃、30分)、又はDNase処理(20units/mlのRNase free DNaseI(TaKaRa社製)で37℃,30分)したものを調製し、実験に供した。
前述の、乳酸菌由来のRNAによるIL−12産生誘導機構を特定するために、Myd88、TLR2、TLR4ノックアウトマウスの脾臓細胞を単離し、表3に示した乳酸菌株(EC−12、Lactobacillus 5株及びEnterococcus 5株)を用いて、評価を行なった。また、TLR7ノックアウトマウスの脾臓細胞を単離し、EC−12を用いて、評価を行なった。
本試験例においては、C57BL/6系統の10週齢の、TLR2−、TLR4−、TLR7−、Myd88−欠損マウス、及び、野生型マウスを用いた。なお、野生型マウスは日本SLC株式会社から購入したマウスを用いた。また、TLR2−、TLR4−、TLR7−、Myd88−欠損マウスは株式会社オリエンタルバイオサービスから得たものを基に、SPF動物施設内(特定の病原微生物の非存在下)で繁殖させたマウスを用いた。そして、これら全てのマウスには、げっ歯類用食(製品名:ラボMRストック、日本農産工業株式会社製)及び水を不断に与えて飼育した。また、これらマウスを用いた実験は、京都府立大学動物実験委員会の実験動物を用いた研究についてのガイドラインに従って行った。
ペントバルビタールナトリウム(シェリング・プラウ株式会社製)30μlを腹腔内に注射することにより、マウスを麻酔し、続いて放血させた。かかるマウスの腹部を切開した後、脾臓を摘出し、氷冷したハンク平衡塩溶液に浸けた。そして、摘出した脾臓から、脾臓細胞を70μmセルストレーナー(BDファルコン社製)を用いて単離した。さらに、単離した脾臓細胞にACK溶解溶液(0.15M NH4Cl、10mM KHCO3、及び0.1mM Na2EDTA、pH7.4)を加え、赤血球を溶解させた。このように処理した脾臓細胞を、滅菌済みリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、細胞培養用培地(10%ウシ胎仔血清(Equitech−Bio社製)、100U/mlペニシリン、及び100μg/mlストレプトマイシン添加RPMI1640)に懸濁した。なお、解析には、遺伝的背景が同一のマウス3匹から単離した脾臓細胞を溜めて用いた。また、コントロールとして、前記ノックアウトマウス以外に野生型マウスからも脾臓細胞を同様に調製した。
生細胞数をトリパンブルー色素排除法によって測定し、前記の通り調製した脾臓細胞を、96穴培養プレート(Orange Scientific社製)の各穴に1×106個(細胞培養用培地100μl)ずつ播種した。そして、100μlの細胞培養用培地に懸濁した20μg(湿重量)の生菌又は加熱殺菌処理した菌を各穴に添加し、脾臓細胞と乳酸菌とを20時間、加湿5%CO2培養器内にて共培養した。なお、乳酸菌と脾臓細胞との共培養は3連穴で行った。
前記培養後、培養上清を回収し、培養上清中のIL−12タンパク質の濃度は、マウスIL−12p70用DuoSet(R) ELISA Development System(R&D Systems社製)を用いて、使用説明書に従って測定した。
ラクトバシルス5株(Lactobacillus acidophilus strain JCM1132, Lactobacillus casei strain JCM1134, Lactobacillus gasseri strain JCM5344, Lactobacillus plantarum strain JCM1149 and Lactobacillus rhamnosus strain ATCC53103)、及び、エンテロコッカス5株(Enterococcus faecium strain JCM8714, Enterococcus faecium strain JCM8727, Enterococcus faecalis strain ATCC14508, Enterococcus faecalis strain ATCC19433 and Enterococcus faecalis strain ATCC23655)は、ATCC(アメリカ培養細胞系統保存機関、American Type Culture Collection)、又はJCM(独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室、the Japan Collection of Microorganisms)から各々得た。また、E.faecalis strain EC−12は、コンビ株式会社が保有しているものを用いた。そして、これらの乳酸菌は、lactobacilli MRS broth(Difco社製)を用いて、37℃で20時間培養した後、滅菌水で洗浄し、次いで9000gで10分間遠心をかけることにより、菌体を回収し、これを生菌として用いた。また、この菌体をサーモアルミバス(Iwaki社製)内にて、95℃で30分間処理することにより、加熱殺菌処理した菌として調製した。
次に、IL−12産生が菌株のRNA含有量に起因している可能性を検証した。すなわち、表4に示した各菌体150mgから試験例4と同様にして処理して抽出した全RNAの量を、吸光度計(製品名:NanoDrop、株式会社エル・エム・エス社製)にて測定した波長260nmにおける吸光度の値を基に算出した。また得られた各全RNAを実施例1と同様にしてリポフェクション法により細胞に導入し、試験例6と同様にしてIL−12p70のタンパク質量を測定した。得られた結果を図10に示す。
次に、EC−12由来のRNAが、IL−12以外のサイトカイン・ケモカインの発現に与える影響を検討した。すなわち、先ず、実施例1と同様にして調製した、EC−12由来の全RNA及びそのRNase処理物をJ774.1細胞にリポフェクション法にて導入して培養した。次に、培養後の細胞から、試験例1と同様にしてRNAを抽出し、リアルタイムPCRによるサイトカイン・ケモカインアレイを用いて、EC−12由来のRNAの有無によって発現量が変化する可能性のある、IL−12を除く15遺伝子を選抜した。具体的には、以下の通りに行った。
先ず、Light Cycler(R)480を用いたリアルタイムPCR法により各試料に含まれるハウスキーピング遺伝子(グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ:GAPDH)の発現量を測定した。また、Gapdhに加え、Hipoxantine−guanine phosphoribosyltransferase(Hprt)とβ−actinも合わせて測定し、ハウスキーピング遺伝子として必要に応じた補正のために用いた。プライマーの設計と使用するプローブの選出を、ロシュ・アプライド・サイエンス社のウェブサイト(https://www.roche−applied−science.com)上にて行った。そして、これらのプライマーを用いた反応は、Light Cycler(R)480 Probe Master(Roche Applied Science)とUniversal Probe Library(ロシュ・アプライド・サイエンス社製)から選抜したTaqmanプローブを用いて行った。具体的には、反応系として、Probe Master 5μl、フォワードとリバースプライマー溶液(10pM)をそれぞれ0.2μl、Universal Probe(10pM)溶液 0.1μl、滅菌蒸留水2.5μlと鋳型cDNA 2μlを加えた合計10μlを用意した。そして、95℃で5分間の初期変性後に、95℃で10秒間、60℃で20秒間の温度サイクルをその反応系に50回かけて増幅曲線を得た。増幅終了後は40℃で30秒間冷却した。Light Cycler480(R) ソフトウェア(ロシュ・アプライド・サイエンス社製)によって得られたCt値をもとに、GAPDHの遺伝子発現量が等しくなるようそれぞれのcDNA溶液を滅菌蒸留水で希釈した。
Claims (7)
- 乳酸菌由来の一本鎖RNAを有効成分とする、サイトカイン産生を調整するための組成物である、前記乳酸菌がエンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)である組成物。
- IL−12、CCL2、CCL5、CCL7、CXCL10、IL−6、および、IL−1αからなる群から選択される少なくとも一のサイトカインの産生を促進するための組成物である、請求項1に記載の組成物。
- 前記IL−12がIL−12p40である、請求項2に記載の組成物。
- TNF−αの産生を抑制するための組成物である、請求項1に記載の組成物。
- TLR7およびMyd88からなる群から選択される少なくとも一の生体分子に依存的なサイトカイン産生を調整するための組成物である、請求項1〜4のうちのいずれか一項に記載の組成物。
- 前記乳酸菌が、エンテロコッカス・フェカリス・EC−12株である、請求項1〜5のうちのいずれか一項に記載の組成物。
- 経口摂取用組成物である、請求項1〜6のうちのいずれか一項に記載の組成物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011529940A JP5690270B2 (ja) | 2009-09-02 | 2010-09-02 | 乳酸菌由来のrnaを有効成分とする組成物 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009202845 | 2009-09-02 | ||
JP2009202845 | 2009-09-02 | ||
PCT/JP2010/065051 WO2011027829A1 (ja) | 2009-09-02 | 2010-09-02 | 乳酸菌由来のrnaを有効成分とする組成物 |
JP2011529940A JP5690270B2 (ja) | 2009-09-02 | 2010-09-02 | 乳酸菌由来のrnaを有効成分とする組成物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2011027829A1 JPWO2011027829A1 (ja) | 2013-02-04 |
JP5690270B2 true JP5690270B2 (ja) | 2015-03-25 |
Family
ID=43649363
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011529940A Active JP5690270B2 (ja) | 2009-09-02 | 2010-09-02 | 乳酸菌由来のrnaを有効成分とする組成物 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8765706B2 (ja) |
JP (1) | JP5690270B2 (ja) |
WO (1) | WO2011027829A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPWO2013069611A1 (ja) * | 2011-11-07 | 2015-04-02 | 京都府公立大学法人 | 免疫調節作用を有するrna |
JP6138570B2 (ja) * | 2013-05-02 | 2017-05-31 | コンビ株式会社 | 免疫調節作用を有するrna |
BR122022016606B1 (pt) | 2013-07-12 | 2023-01-24 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd | Lactobacillus paracasei mortos pelo aquecimento, medicamento, alimento ou bebida, ração, agente promotor da produção de il-12 e uso |
CN105579574B (zh) | 2013-07-12 | 2017-08-25 | 森永乳业株式会社 | 新型乳酸菌、以及含有新型乳酸菌的药品、饮食品和饲料 |
KR20200130174A (ko) * | 2019-05-08 | 2020-11-18 | 김연란 | 미생물 유래 핵산 및 이의 용도 |
WO2023135950A1 (ja) * | 2022-01-11 | 2023-07-20 | 一丸ファルコス株式会社 | プロテオグリカンを含む免疫応答調節剤 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08500846A (ja) * | 1993-03-31 | 1996-01-30 | トロージャン,フェルナン・ナルベ | 抗エイズ免疫調節剤複合体 |
WO2005087241A1 (ja) * | 2004-03-16 | 2005-09-22 | Combi Co. | 家畜・家禽類又は魚介類の感染防除剤 |
WO2009005124A1 (ja) * | 2007-07-04 | 2009-01-08 | Kikkoman Corporation | 乳酸菌由来の2本鎖rna |
WO2009005123A1 (ja) * | 2007-07-03 | 2009-01-08 | Kikkoman Corporation | インターフェロンβ産生促進剤及びその製造法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ID29150A (id) | 1999-01-15 | 2001-08-02 | Entpr Ireland Cs | Penggunaan lactobacillus salivarius |
EP2368431A1 (en) | 2002-04-04 | 2011-09-28 | Coley Pharmaceutical GmbH | Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides |
JP2006223110A (ja) | 2005-02-15 | 2006-08-31 | Tohoku Univ | 免疫賦活剤 |
JP2009102292A (ja) | 2007-04-27 | 2009-05-14 | Chiba Prefecture | ストレス抑制剤 |
-
2010
- 2010-09-02 JP JP2011529940A patent/JP5690270B2/ja active Active
- 2010-09-02 WO PCT/JP2010/065051 patent/WO2011027829A1/ja active Application Filing
- 2010-09-02 US US13/393,060 patent/US8765706B2/en active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08500846A (ja) * | 1993-03-31 | 1996-01-30 | トロージャン,フェルナン・ナルベ | 抗エイズ免疫調節剤複合体 |
WO2005087241A1 (ja) * | 2004-03-16 | 2005-09-22 | Combi Co. | 家畜・家禽類又は魚介類の感染防除剤 |
WO2009005123A1 (ja) * | 2007-07-03 | 2009-01-08 | Kikkoman Corporation | インターフェロンβ産生促進剤及びその製造法 |
WO2009005124A1 (ja) * | 2007-07-04 | 2009-01-08 | Kikkoman Corporation | 乳酸菌由来の2本鎖rna |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20120220760A1 (en) | 2012-08-30 |
WO2011027829A1 (ja) | 2011-03-10 |
JPWO2011027829A1 (ja) | 2013-02-04 |
US8765706B2 (en) | 2014-07-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11944657B2 (en) | Agent for inducing interferon production containing lactic acid bacteria | |
Shida et al. | Peptidoglycan from lactobacilli inhibits interleukin‐12 production by macrophages induced by Lactobacillus casei through Toll‐like receptor 2‐dependent and independent mechanisms | |
JP5690270B2 (ja) | 乳酸菌由来のrnaを有効成分とする組成物 | |
Owen et al. | Microbial activation of gut dendritic cells and the control of mucosal immunity | |
CN108367031A (zh) | 嗜黏蛋白阿克曼氏菌用于治疗炎症病况的用途 | |
JP2016539119A (ja) | 化学療法に対する応答性のマーカーとしての微生物叢組成物、及び癌処置の有効性を改善するための微生物モジュレーター(プレ、プロ又はシンバイオティクス)の使用 | |
TW202014513A (zh) | 包含細菌菌株之組合物 | |
Nerstedt et al. | Administration of Lactobacillus evokes coordinated changes in the intestinal expression profile of genes regulating energy homeostasis and immune phenotype in mice | |
JPWO2008023663A1 (ja) | 抗アレルギー作用を有する菌株並びにその菌体を含有する飲料、食品及び抗アレルギー剤 | |
WO2019104242A1 (en) | Edible plant-derived nanoparticles for regulation of gut microbiota | |
CN102884174A (zh) | 肠道免疫抑制剂的筛选方法 | |
Wang et al. | Effect of Lactobacillus acidophilus KLDS 1.0738 on miRNA expression in in vitro and in vivo models of β-lactoglobulin allergy | |
Tarrah et al. | Lactobacillus paracasei DTA81, a cholesterol‐lowering strain having immunomodulatory activity, reveals gut microbiota regulation capability in BALB/c mice receiving high‐fat diet | |
Dargahi et al. | Immunomodulatory effects of Streptococcus thermophilus on U937 monocyte cell cultures | |
JP6455920B2 (ja) | 微生物又はdnaの免疫賦活活性を予測する方法 | |
TW202038978A (zh) | 包含細菌菌株之組成物 | |
Sławińska et al. | In vitro screening of immunomodulatory properties of synbiotics in chicken DT40 cell line. | |
AU2015268629B2 (en) | Interferon production-inducing agent containing lactic acid bacteria | |
US20240226194A1 (en) | Agent for inducing interferon production containing lactic acid bacteria | |
WO2013069611A1 (ja) | 免疫調節作用を有するrna | |
US12036262B2 (en) | Edible plant-derived nanoparticles for regulation of gut microbiota | |
CN115768894A (zh) | 包含mir-3126的营养组合物 | |
JP2024032856A (ja) | 糖吸収促進用組成物 | |
Tohno et al. | Molecular Immunoassay Systems for Probiotics via Pattern Recognition Receptors | |
Pathmanathan | The impact of commensals predominant in the infant gut on signal cascades in epithelial cells |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130821 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140822 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141020 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150119 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150130 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5690270 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |