KR20200130174A

KR20200130174A - 미생물 유래 핵산 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20200130174A
Application number: KR1020200054685A
Authority: KR
Inventors: 김연란
Original assignee: 김연란
Priority date: 2019-05-08
Filing date: 2020-05-07
Publication date: 2020-11-18
Also published as: WO2020226460A1

Abstract

본 발명은 미생물 유래 핵산 또는 이의 단편을 유효 성분으로 포함하는 피부 재생 또는 골 재생용 조성물에 관한 것이다. 본 발명자들은 미생물 유래 핵산에 섬유아세포 및 조골아세포에 대한 성장 촉진 효능이 있으며, 골아세포로의 분화를 촉진시키는 효능이 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 미생물 유래 핵산을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부 재생, 상처의 치료 내지 개선과 골 질환의 치료 내지 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

미생물 유래 핵산 및 이의 용도{NUCLEIC ACIDS DERIVED FROM MICROORGANISM AND USE THEREOF}

본 발명은 미생물 유래 핵산 또는 이의 단편을 유효 성분으로 포함하는 조직 재생 효능이 있는 조성물에 관한 것으로, 피부 재생, 상처 치료 또는 골 재생을 위한 약학적 조성물 또는 화장료 조성물에 적용될 수 있다.

피부는 외부를 덮고 있는 기관으로 온도 및 습도변화와 자외선, 공해물질 및 외부환경의 자극으로부터 체내의 기관을 보호해주는 것으로 바깥으로부터 표피, 진피 및 피하지방으로 구성되어 있다. 특히, 피부의 성질을 결정짓는 표피는 외부로부터 직접적이고 잦은 손상을 받으므로 상처회복이 매우 중요하다.

표피의 가장 안쪽에 위치한 기저층의 세포들이 증식과 분열을 거치면서 각질층으로 분화되어 전체적인 이중층 구조를 유지함으로써 피부 표면을 외부의 유해환경으로부터 보호한다. 그러나 피부를 구성하는 가장 바깥부분인 외피세포의 경우, 벗겨져 제거되고, 그 밑에 자라나는 세포들이 그 자리를 대신하는 과정인 세포재생이 끊임없이 반복된다.

또한, 외부에 의한 피부 손상이 일어났을 때 세포재생이 빠르게 일어나 상처 회복이 촉진되어야 하는데, 나이가 듦에 따라 피부손상을 회복시키는 섬유아세포의 증식이 줄어들고 결체 조직인 콜라겐 등의 합성이 줄어들어 재생능력이 저하된다. 이로 인해 세포의 회복이 느려져 상처가 남는 등 미용 및 의학적 문제의 원인이 되고 있다(대한민국 특허 공개공보 제10-2018-0060537호).

따라서, 피부 고유의 기능을 유지시키면서 빠르고 효과적으로 피부의 상처를 치유하고 재생을 촉진시킴으로써 보다 건강하고 아름다운 피부를 유지하기 위한 약물이 개발되고 있는 실정이다.

한편, 최근 의학계에서는 물리적, 화학적 및 화상으로 인한 골조직의 손상이나 염증 또는 종양 등과 같은 질환으로 인한 골조직 결손의 재생이 중요하게 다루어지고 있다. 골조직이 결손된 부위는 외력에 의한 골파절이나 골수염이 쉽게 일어난다. 또한, 피부, 근육, 골조직, 연골조직 및 신경조직 등이 복합으로 손상된 경우, 각 층별로 정상적인 조직 또는 기관으로의 재생이 어려워, 흉터조직으로 대체되면서 운동성 및 기능성의 제약이 수반된다.

종래에는 이러한 문제를 해결하기 위하여 환자 자신의 다른 부위의 골조직을 이식하여 채워 주었으나, 다른 정상부위의 골조직 결손이나 운동성 및 기능성 제약과 같은 부작용이 초래되었다(대한민국 특허 공개공보 제10-2014-0030605호).

이에, 상기와 같은 부작용을 최소화하면서 골 관련 질환을 효율적으로 치료할 수 있는 새로운 약물 개발의 필요성이 대두되고 있다.

대한민국 특허 공개공보 제10-2018-0060537호 대한민국 특허 공개공보 제10-2014-0030605호

본 발명의 목적은 조직 재생에 효과적인 미생물 유래 핵산을 제공하는 것으로, 구체적으로 상기 미생물 유래 핵산에 피부 재생, 상처 치유 및 골 재생 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 측면은, 미생물 유래 핵산 또는 이의 단편을 유효 성분으로 포함하는 조직 세포의 재생을 위한 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은, 미생물 유래 핵산 또는 이의 단편을 유효 성분으로 포함하는 피부 재생 및 상처 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, 미생물 유래 핵산 또는 이의 단편을 유효 성분으로 포함하는 피부 재생 및 상처 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은, 미생물 유래 핵산 또는 이의 단편을 유효 성분으로 포함하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 미생물 유래 핵산 또는 이의 단편을 유효 성분으로 포함하는 조성물은, 섬유아세포의 생장률 및 이동능을 증진시킬 수 있고 조골아세포의 생장과 분화를 촉진시킬 수 있는 효과가 있다. 따라서, 상기 미생물 유래 핵산 또는 이의 단편은 피부 재생 및 상처 치유에 관한 약학적 조성물, 화장료 조성물 또는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 미생물 유래 핵산(LMDNA-1, BSDNA 및 BEDNA)의 단백질 함량을 확인한 것이다.
도 2는 미생물 유래 핵산(LMDNA-2)의 분자량을 아크릴아마이드 겔 전기영동 분석으로 확인한 것이다.
도 3은 미생물 유래 핵산(LMDNA-2)를 초음파 분쇄기로 분쇄한 후 유효 분자량을 아크릴아마이드 겔 전기영동 분석으로 확인한 것이다.
도 4는 대조군(DMSO), 양성대조군(PDRN) 및 실험군(LMDNA-1 및 BSDNA)의 처리에 따른 섬유아세포(L929)의 세포 성장 속도를 확인한 것이다.
도 5는 대조군(TCP), 실험군(LMDNA-1 및 BSDNA) 및 양성대조군(PDRN)의 L929 세포주에 대한 부착 정도를 확인한 것이다.
도 6은 대조군(TCP), 실험군(LMDNA-2) 및 양성대조군(PDRN)의 처리에 따른 L929 세포주의 증식능을 확인한 것이다.
도 7은 대조군(TCP), 실험군(LMDNA-2) 및 양성대조군(PDRN)의 처리에 따른 L929 세포주의 이동능을 확인한 것이다.
도 8은 실험군(LMDNA-2)의 처리에 따른 L929 세포주의 이동능을 확인한 것이다.
도 9는 대조군(TCP), 실험군(LMDNA-1, BSDNA 및 BEDNA) 및 양성대조군(PDRN)의 처리에 따른 조골아세포(MC3T3-E1)의 성장을 확인한 것이다.
도 10은 대조군(TCP), 실험군(LMDNA-1 및 BSDNA) 및 양성대조군(PDRN)의 처리에 따른 조골아세포(MC3T3-E1)에서의 알칼리포스파타제 활성을 확인한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "미생물(Microorganism)"은, 육안의 가시한계를 넘어선 0.1 mm 이하의 크기인 미세한 생물을 의미한다. 미생물은 주로 단일세포 또는 균사로 몸을 이루며, 생물로서 최소 생활단위를 영위한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "핵산(Nucleic acid)"은 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기; 당; 및 인산으로 이루어진 고분자물질이다. 염기, 펜토오스, 인산으로 구성된 뉴클레오티드가 인산디에스테르결합으로 중합되어 긴사슬모양의 분자를 형성하고 있다. 인산은 펜토오스의 5'자리 및 3'자리에서 교대로 결합한다.

상기 핵산은 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA)일 수 있으며, 바람직하게는 폴리디옥시리보뉴클레오타이드(polydeoxyribonucleotide; PDRN)일 수 있다.

상기 폴리디옥시리보뉴클레오타이드는 DNA 복합체, 즉 디옥시뉴클레오타이드(deoxyribonucleotide) 중합체가 포함된 화합물로서 A2 puringergic receptor를 자극하여 특별한 부작용 없이 세포재생에 필요한 활성체로 작용하게 되고, 줄기세포, 섬유아세포, 연골세포 등의 세포 분화를 촉진시키므로 화상이나 만성창상 등에 효과적인 물질이다. 또한, 상기 PDRN은 인체의 유전자와의 높은 유사성으로 안전성이 우수하고, VEGF를 활성화하여 부수적인 항염증, 혈전용해, 성장인자 촉진 작용 등의 효능을 가지는 물질이다. 현재까지 상기 PDRN은 어류의 정자 또는 정소와 같은 동물 조직으로부터 분리 동정하고 있으나, 상기 동물 조직 유래 핵산은 무제한적인 대량 획득이 매우 어렵다는 문제가 있다.

이에, 본 발명자들은 미생물로부터 핵산을 분리 동정하였으며, 상기 핵산이 섬유아세포와 조골아세포의 생장을 촉진하는 데에 매우 뛰어난 효능을 갖는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 상기 미생물 유래 핵산 또는 이의 단편은 종래 시판되는 PDRN에 비하여 조직 재생 효과가 우수할 뿐만 아니라, 대량 생산이 가능한 미생물의 특성에 따라 수득 가능한 핵산의 양을 크게 증가시킬 수 있고, 동물 윤리적인 문제도 해소할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 미생물은 프로바이오틱스일 수 있다. 또한, 상기 프로바이오틱스는 유산균일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "프로바이오틱스(Probiotics)"는, 체내에 들어가서 건강에 좋은 효과를 주는 살아있는 균을 의미한다. 프로바이오틱스는 젖산으로 다른 탄수화물과 설탕으로 전환할 수 있기 때문에 오랫동안 식품산업에서 사용되어 왔다. 프로바이오틱스는 요구르트와 같은 발효 유제품의 신맛을 제공할 뿐만 아니라, 성장을 위해 손상된 조직을 재건하기도 하며 pH를 낮추어 부식방지제로서 작용한다. 프로바이오틱스는 콜레스테롤 및 혈압을 낮출 수 있고, 면역기능 개선, 감염예방, 무기물의 흡수개량, 스트레스로 인한 유해한 세균의 성장 방지, 과민성대장증후군과 결장염 개선 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, 상기 "유산균(Lactic acid bacteria)"은, 당류를 발효하여 에너지를 획득하고 다량의 락트산을 생성하는 세균이다. 이는 농산물이나 식품, 사람이나 동물의 체내 등 자연계에 널리 분포하고 있다. 치즈, 발효유, 김치, 제빵 등의 발효에 많이 이용된다. 일반적으로 유산균을 섭취하면, 장내 미생물들 중 유해균이 억제될 뿐 아니라, 음식물의 소화, 흡수, 분해하는 것을 돕는 유익균이 증가하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 유산균을 섭취하면, 혈중 콜레스테롤 감소, 면역력 증진, 내인성 감염 억제, 간경화 개선, 항암 효과 등의 다양한 효능이 있다는 점이 보고되어 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus sp.) 속, 비피도박테리움(Bifidobacterium sp.) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus sp.) 속, 락토코커스(Lactococcus sp.) 속, 엔테로코커스(Enterococcus sp.) 속, 페디오코커스(Pediococcus sp.) 속, 류코노스톡(Leuconostoc sp.) 속, 비셀라(Weissella sp.) 속, 바실러스 (Bacillus sp.) 속 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 균주일 수 있다. 예를 들어, 류코노스톡(Leuconostoc sp.) 속 또는 바실러스 (Bacillus sp.) 속 균주로부터 유래된 핵산 또는 이의 단편을 포함하는 조성물이 피부 재생 또는 상처 치유하는 효과가 있다.

구체적으로, 상기 조성물은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 균주로부터 유래된 핵산 또는 이의 단편을 유효 성분으로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)"는, 류코노스톡(Leuconostoc)속의 젖산균으로 김치의 발효 초기에 주로 생육한다. 류코노스톡 메센테로이데스는 pH 4.8 이하에서는 생장이 잘 안 되는 균이다. 세포의 크기는 0.9 내지 1.2 ㎛로서 생육 적정 온도는 21 내지 25℃이다. 특히 설탕 용액에서는 덱스트란으로 된 점층으로 싸여 있는 것이 특징이다. 류코노스톡 메센테로이데스는 글루코스, 과당, 갈락토스, 마노스, 자일로스, 아라비노스 및 수크로스 등을 발효하여 젖산을 생성한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilits)"는, 고초균(枯草菌)이라고도 불리며 자연계에 널리 분포하는 비병원성 세균으로, 특히 공기, 마른 풀, 하수, 토양 속에 존재한다. 막대 모양의 간균으로 편모가 있어 활발히 운동하며, 균체의 중앙에 원형 또는 난원형의 아포(芽胞)를 형성한다. 보통의 배양기에서도 잘 발육하며 회백색의 큰 취락을 형성하고 그 주위는 방사상을 이룬다. 아포를 갖고 있어 저항력이 강하고, 균체는 글리코겐을 함유하는 그람양성균이며, 다수의 탄수화물을 분해하여 산을 생성한다.

본 발명의 일 실시예에서는, 배양한 미생물에 프로테이나제 처리 후 원심분리하여 미생물 내 펩타이드 결합을 절단하였고, 아세트산나트륨 및 구아니딘염산염을 처리 후 원심분리하여 본 발명의 미생물 유래 핵산을 수득하였다.

또한, 본 발명의 다른 실시예에서는, 배양한 미생물에 계면활성제를 처리하여 반응시킨 후, 프로테이나제 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)를 처리하였다. 프로테이나제 SDS 처리된 미생물을 원심분리하여 미생물 내 펩타이드 결합을 절단하였고, 소듐 아세테이트 및 에탄올을 첨가한 후 원심분리하여 본 발명의 미생물 유래 핵산을 수득하였다.

상기 미생물 유래 핵산 또는 이의 단편의 길이는 50 bp 내지 10,000 bp, 60 bp 내지 7,500 bp, 70 bp 내지 1,500 bp, 80 bp 내지 1,000 bp, 90 bp 내지 700 bp 또는 100 bp 내지 500 bp일 수 있다. 상기 범위로 핵산 또는 단편의 길이가 구현되는 경우, 이들을 포함하는 조성물의 피부 재생 및 상처 치유 촉진 효능이 가장 우수하게 나타날 수 있다.

또한, 상기 미생물 유래 핵산 또는 이의 단편의 분자량은 30 kDa 내지 7,000 kDa, 35 kDa 내지 5,000 kDa, 40 kDa 내지 1,000 kDa, 45 kDa 내지 700 kDa 또는 55 kDa 내지 350 kDa일 수 있다. 이와 같은 분자량은 미생물 유래 핵산 또는 이의 단편이 상처 치료, 개선 또는 골 질환 치료에 있어 그 효과의 발현 정도와 속효성 측면을 모두 고려하였을 때 최적일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "피부 재생"은, 피부 외부 및 내부 원인에 의한 손상에 대하여 피부 조직이 회복되는 것을 의미하며, "상처(wound)"는, 내재적 및 외부요인에 의해 발생하는 상피조직과 결합조직의 손상을 말하며, 바람직하게는 피부의 손상일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "골 재생"은, 외부의 충격 또는 노화에 의해 손상된 골 조직이 회복되는 것을 의미한다. 골 재생은 골아세포의 분화에 의해 나타날 수 있으며, 상기 골아세포 분화 정도는 표식인자인 알칼리포스파타제(Alkaline Phosphatase, ALP)의 활성을 측정함으로써 확인할 수 있다. 상기 알칼리포스파타제는 뼈에서 가장 많이 발견되며, 골아세포의 세포막과 연결되어 있으며 자라고 있는 뼈의 기질 소체(matrix vesicles)에 많이 존재하는 것으로 알려져 있다.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 내지 90 중량부 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약학적 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 혼합 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강 내 주사, 직장 내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식을 선택할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양할 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다.

또한, 본 발명은 미생물 유래 핵산 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 재생 및 상처 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상처의 치료 방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "투여"는, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, "개체"는, 상처가 날 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 화장료 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제제화될 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 담체 성분을 포함할 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 용매, 용매화제, 유탁화제 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 담체 성분을 포함할 수 있다. 이의 예로는, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄 지방산 에스테르, 및 이의 혼합물 등을 들 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미세결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라가칸트 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 담체 성분을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 미생물 유래 핵산 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 상처 개선용 화장료 조성물을 개체에 도포하는 단계를 포함하는 상처의 개선방법을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은, 미생물 유래 핵산 또는 이의 단편을 유효 성분으로 포함하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 미생물 유래 핵산 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 골 관련 질환의 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골 관련 질환의 치료 방법을 제공한다.

상기 골 관련 질환은 골다공증, 골 성장 장애, 골절, 치주 질환, 파제트병, 골전이암, 류마티스 관절염 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

한편, 상술한 약학적 조성물, 화장료 조성물, 개선 방법 또는 치료 방법에 있어서, 미생물 유래 핵산 또는 이의 단편에 대한 설명은 상기 미생물 유래 핵산 또는 이의 단편을 유효 성분으로 포함하는 조직 세포의 재생을 위한 조성물에 기재된 설명을 참조한다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 미생물 유래 핵산의 제조

실시예 1.1. 류코노스톡 메센테로이데스( Leuconostoc mesenteroides ) 유래 핵산(LMDNA-1)의 제조

류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)를 유산균 배지 MRS에 30℃, 16시간 동안 정치배양한 후, 100 ㎎/㎖의 앰피실린(ampicillin)을 100 ㎕ 첨가하여 3시간 동안 30℃에서 더 배양하였다. 배양액을 10,000 xg에서 10분간 원심분리하여 수득하고, 10 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액을 이용하여 3번 세척하였다.

상기 세척한 세포를 500 ㎕ Lysis buffer(20 mM Tris, 1 M NaCl, 4% Tween 20, 2 mM EDTA, 500 mM NaOH)에 풀어서 혼탁액을 만들어 초음파 분쇄기로 30초씩 3번 파쇄한 후, 프로테이나제 K(Proteinase K)를 0.2 mg/㎖ 농도로 첨가하고 56℃에서 15시간 반응시켰다. 13,000 xg에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 새로운 시험관에 옮기고 1/5 부피의 3 M 아세트산나트륨(sodium acetate, pH 5.2)과 5 M 구아니딘염산염(guanidine-HCl) 혼합액을 첨가하였다. 13,000 xg에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 미리 증류수와 에탄올로 세척하고 말린 silica와 섞어서 10분간 DNA를 흡착시킨 뒤 다시 13,000 xg에서 10 분간 원심분리하고 상등액은 버렸다. 침전물은 1 ㎖ 300 mM 아세트산나트륨으로 1회, 냉장 보관 에탄올로 2회 세척한 후 잔여 에탄올을 공기 중에서 충분하게 건조시켰다. 핵산은 10 mM Tris-HCl(pH 8.5) 완충용액으로 추출한 후, 0.2 ㎛ PVDF filter(Durapore, Millipore)로 여과하여 류코노스톡 메센테로이데스 핵산(LMDNA-1)을 수득하였다.

실시예 1.2. 바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis ) 유래 핵산(BSDNA)의 제조

상기 실시예 1.1.에서 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 대신 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 이용하는 것을 제외하고, 실시예 1.1과 동일한 과정을 반복하여 바실러스 서브틸리스 핵산(BSDNA)을 수득하였다.

실시예 1.3. 바실러스 서브틸리스 유래 세포 외 핵산(BEDNA)의 제조

바실러스 서브틸리스를 24시간 배양한 후, 13,000 xg에서 10분간 원심분리하여 상등액 100 ㎖ 을 취하여 10 ㎖의 3 M 아세트산나트륨(sodium acetate, pH 5.2)을 넣고 완전하게 혼합하였다. 여기에 냉장고에서 차갑게 식힌 100% 에탄올을 250 ㎖ 처리한 다음, 3시간 정도 냉장고에 방치하였다. 13,000 xg 에서 30분간 원심분리한 후, 침전물을 수득한 후, 냉장고에서 차갑게 식힌 70% 에탄올을 넣어 충분하게 섞어 준 다음 13,000 xg에서 10분간 원심분리하여 침전물을 공기 중에서 충분하게 건조시켰다. 그 후 증류수에 녹여 바실러스 서브틸리스 유래 세포 외 핵산(Bacillus subtilis Extracellular DNA) 물질을 수득하였다.

상기 실시예 1.1.에서 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 대신 상기에서 수득한 바실러스 서브틸리스 유래 세포 외 핵산 물질을 이용하는 것을 제외하고, 실시예 1.1과 동일한 과정을 반복하여 바실러스 서브틸리스 유래 세포 외 핵산(BEDNA)을 수득하였다.

실시예 1.4. 류코노스톡 메센테로이데스( Leuconostoc mesenteroides ) 유래 핵산(LMDNA-2)의 제조

류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)를 유산균 배지 MRS 배지에 30℃, 24시간 동안 정치배양하여 Active Seed Culture를 수득한 후, 상기 Active Seed Culture 0.2 ㎖를 200 MRS broth에 재접종하여 OD값이 2.0이 넘어가지 않도록 30℃에서 10시간 내지 12시간 정치배양하여 배양액을 수득하였다.

상기 배양액 200 ㎖에 50 ㎎/㎖의 앰피실린(ampicillin)을 200 ㎕ 첨가하여 30℃에서 1시간 이상 배양하였다. 12,000 xg에서 10분간 원심분리하여 침전물을 수득하고, 10 ㎖ TE(pH 8.0) 완충용액을 이용하여 2번 세척한 후, TES buffer 사용하여 OD 값을 5.0 이하로 조절하면서 37℃에서 가끔씩 흔들어주면서 1시간 반응시켰다. 상기 TES buffer의 조성은 다음과 같다: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 2 mM EDTA, 10 mM NaCl), 750 ㎕ lysozyme 용액(10 ㎎/㎖ in TE, pH 8.0).

반응 후, 10% SDS(Sodium Dodecyl Sulfate) 1.075 ml를 첨가해주고 잘 섞어준 후 65℃에서 20분간 반응시키고, 200 ㎕의 프로테이나제 K(10 ㎎/㎖)을 첨가하여 잘 섞은 후 56℃에서 1시간 내지 3시간 동안 반응시켰다. 다음으로, 실온에서 식힌 후 6,000 rpm x 10분 원심분리하여, 상층액을 새로운 용기로 옮겨 담고 6 ㎖의 3 M cold KOAc을 첨가하여 혼합한 후 20분 동안 아이스 위에 방치하였다. 다음으로, 용액을 21,000 xg에서 20분간 원심분리한 후 상층액을 새로운 용기로 옮겨 담았다. 상층액의 부피로 1/10에 해당하는 3M 소듐 아세테이트(pH 5.2)를 첨가하여 충분히 섞어주고, 다시 부피의 2.5배에 해당하는 100% ice-cold ethanol을 첨가한 후, 1 시간 이상 냉장상태로 방치하여 DNA를 침전시키고, 원심분리기를 사용하여 4℃에서 12,000 rpm x 30분 이상 원심분리하여 DNA 침전물을 수득하였다.

상기 DNA 침전물이 확인되면, 상층액은 버리고 새롭게 조제한 70% ethanol로 침전물을 vortex하지 않고 세척한 후, 공기 중에서 자연 건조시켜 류코노스톡 메센테로이데스 핵산(LMDNA-2)을 수득하였다. 획득된 LMDNA-2는 증류수에 녹여 사용 전까지 -20℃냉동고에 보관하였다.

실험예 1. 미생물 유래 핵산의 특성 확인

실험예 1.1. 미생물 유래 핵산의 농도 및 순도 확인

상기 실시예 1.1. 및 1.3.에서 수득한 미생물 유래 핵산을 적당량의 TE 완충용액에 녹인 후 Nano-drop을 사용하여 핵산을 정량하고 농도 및 순도를 평가하였다(도 1).

도 1을 참조하면, 상기 핵산의 DNA 양은 4450.4 ng/㎕로 측정되었으며, 단백질 함량을 나타내는 280 nm에서의 수치 대비 핵산의 흡광수치로 순도를 표시하는 지수인 260 nm/280 nm의 흡광수치가 2.20으로 측정되었는바, 상기 미생물 유래 핵산의 순도가 높음을 확인하였다.

실험예 1.2. 미생물 유래 핵산의 분자량 확인

상기 실시예 1.4.에서 수득한 미생물 유래 핵산에 DNase I과 RNase A를 처리한 후 아크릴아마이드 겔 전기영동 분석을 활용하여 분자량을 측정하였다(도 2).

도 2를 참조하면, DNase I를 처리한 LMDNA-2에서는 핵산의 분자량이 250 bp 이하로 나타났으나, RNase A를 처리한 LMDNA-2에서는 핵산의 분자량이 10kb 이상으로 나타났다. 이는 LMDNA-2가 10kb 이상의 고분자 genomic DNA임을 시사한다.

실험예 1.3. 미생물 유래 핵산의 유효 효능 분자량 조절

상기 실시예 1.4.에서 수득한 미생물 유래 핵산을 초음파 분쇄기(Sonicator-XL2020, Misonix, USA)로 20% 파워에서 pulse를 10초간 가해주고 10초간 쉬어주기를 반복하여 5분, 10분, 15분 및 20분 동안 파쇄하였고, 이의 유효 효능 분자량을 전기영동(100 V, 40분간)을 진행하여 측정하였다(도 3).

도 3을 참조하면, LMDNA-2를 15분 이상 파쇄시, 분자량이 100 bp 내지 500 bp로 분해됨을 확인하였다.

실험예 2. 미생물 유래 핵산의 상처 치유 효과 확인

실험예 2.1. 미생물 유래 핵산의 섬유아세포 생장 촉진 효과 확인

동물 세포주 L929(murine fibroblast, ATCC CRL-2148)를 활용하여 실시예 1.1. 및 실시예 1.2.를 통해 수득한 미생물 유래 핵산이 섬유아세포의 성장에 미치는 영향을 MTT 포르마잔(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)의 환원 정도를 측정하여 평가하였다.

구체적으로, 배양한 L929 세포를 0.4% trypsin blue를 사용하여 계수한 후, 96 well microtiter　plates에 well 당 배지 총 부피　200 ㎕, 1x10⁵ cells로 분주하였다. 96 well plate 각각의 well에 상기 실시예 1.1. 및 실시예 1.2.에서 수득한 미생물 유래 핵산을 0.1 ㎎/㎖ 첨가 후, 24시간 동안 5%, CO₂/95% 공기 인큐베이터에서 37℃로 3일 또는 6일간 배양하였다. 배양 후, 각 well에 MTT　solution(5.0　mg/㎖,　BBS)을 첨가하고 4시간 더 배양하였다. 배양 후, 나머지 MTT 용액을 덜어내고, 포르마잔 결정(formazan　crystal)을 용해시키기 위해 150 ㎕의 DMSO를 첨가한 후, ELISA plate　reader를 이용하여 490　nm에서의 흡광도를 측정하였다

대조군 및 양성대조군은 각각 시료 대신 DMSO 및 동일한 농도의 시판되는 연어에서 추출한 DNA(PDRN)를 처리하였으며, 모든 실험은 3회 반복(n=3)하여 실시하였다.

세포 생장 속도는 대조군의 흡광도에 대한 시료 처리시 흡광도의 백분율로 나타내었다(도 4).

도 4을 참조하면, 미생물 유래 핵산인 LMDNA-1 및 BSDNA를 처리한 경우, 세포 생장 속도가 양성대조군 대비 각각 약 42.2% 및 약 47.8% 증가하였다.

또한, 현미경으로 핵산의 세포 부착(attachment) 정도를 확인한 결과, 미생물 유래 핵산인 LMDNA-1 및 BSDNA는 양성대조군과 동등한 수준으로 세포에 부착하였다(도 5).

더불어, 배양한 L929 세포에 상기 실시예 1.4.에서 수득한 미생물 유래 핵산 시료를 처리한 후, 세포를 배양시키면서 0시간 대비 3시간, 6시간, 9시간, 12시간 및 24시간 후의 세포의 증식 정도를 측정하였다. 양성대조군은 연어 PDRN(Placentax, Italy)을 동일한 농도로 처리한 것이며, 음성대조군은 아무 시료도 처리하지 않은 것이다(도 6).

도 6을 참조하면, 미생물 유래 핵산인 LMDNA-2를 처리하는 경우, 대조군 및 양성대조군과 비교하여 우수한 수준으로 L929 세포의 증식능이 증가하였다.

실험예 2.2. 미생물 유래 핵산의 섬유아세포 이동 촉진 효과 확인

미생물 유래 핵산이 L929 세포주의 이동 능력에 미치는 영향을 확인하기 위해 Balekar et al. 방법에 따라 수행하였다(Balekar et al., J Ethnopharmacol. 14;141(3):817-24. June, 2012).

구체적으로, 5 Х 10⁵ cells/well의 L929 세포주를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지를 넣은 24-well plate에 seed 접종하여, humidified 5% CO₂, 37℃배양기에서 밤새 배양하였다. 이후, DMEM 배지는 완전히 제거하고 부착된 세포층을 멸균된 yellow pipette tip으로 떼어내어 스크래치를 내었고, 세포 부스러기를 phosphate buffer saline(PBS)으로 세척하여 제거하였다. 이 후, 10 ㎍/㎖의 실시예 1.4.에서 수득한 미생물 유래 핵산 시료를 포함하는 10% FBS DMEM 배지에 스크래치를 낸 세포주를 접종하였다. 세포의 증식 능력을 억제하면서 이동 능력만을 평가하기 위해 10 ㎍/㎖의 미토마이신 C(mitomycin C)를 처리하였다. 세포는 37℃ humidified 5% CO₂ atmosphere 배양기에서 12시간 동안 배양하였다.

10 ㎍/㎖의 상기 실시예 1.4.에서 수득한 미생물 유래 핵산 시료를 포함하는 10% FBS DMEM 배지에 상기 떼어낸 세포를 접종한 시기로부터 0시간, 6시간 및 12시간에 현미경의 내장 카메라(40x magnification)로 촬영하여 이를 도 7에 나타내었다. 이때, 음성대조군(NC)으로는 핵산 시료를 포함하지 않는 10% FBS DMEM 배지를 사용하였고, 양성대조군(PC)은 상기 실시예 1.4.에서 수득한 미생물 유래 핵산 시료 대신 동일한 농도의 시판되는 연어에서 추출한 DNA(PDRN)을 포함하는 10% FBS DMEM 배지를 사용하였다.

도 7을 참조하면, 스크래치를 낸 L929 세포주를 미생물 유래 핵산인 LMDNA-2를 포함하는 배지에서 배양하는 경우, 대조군 및 양성대조군과 비교하여 우수한 수준으로 L929 세포의 이동능이 증가하였다.

또한, 10 ㎍/㎖의 상기 실시예 1.4.에서 수득한 미생물 유래 핵산 시료를 포함하는 10% FBS DMEM 배지에 상기 떼어낸 세포를 접종한 시기로부터 0시간, 3시간, 6시간, 9시간, 12시간 및 24시간에 촬영한 사진을 ImageJ 1.42q imaging software(National Institutes for Health, US)로 분석하였는바, 4시간이 지나면 스크래치가 거의 닫힌 것을 확인할 수 있다(도 8).

세포의 증식 및 이동 능력은 상처 재생 과정에서 중요한 요소에 해당한다. 따라서, 상기 결과는 본 발명에 따른 미생물 유래 핵산이 상처 치료 효과가 우수하다는 점을 시사한다.

실험예 3. 미생물 유래 핵산의 조골아세포 생장 촉진 효과 확인

동물 세포주 MC3T3-E1(Preosteoblast, ATCC CRL-2593)를 활용하여 실시예 1.1. 내지 실시예 1.3.을 통해 수득한 미생물 유래 핵산이 조골아세포의 성장에 미치는 영향을 MTT 포르마잔의 환원 정도를 측정하여 평가하였다.

구체적으로, 배양한 MC3T3-E1 세포를 0.4% trypsin blue를 사용하여 계수한 후, 96 well microtiter　plates에 well 당 배지 총 부피　200 ㎕, 1x10⁵ cells로 분주하였다. 96 well plate 각각의 well에 상기 실시예 1.1 내지 실시예 1.3.에서 수득한 미생물 유래 핵산을 1 ㎍/㎖ 또는 10 ㎍/㎖ 첨가 후, 24시간 동안 5%, CO2/95% 공기 인큐베이터에서 37℃로 2일간 배양하고, 각 well에 MTT　solution(5.0　mg/㎖,　BBS)을 첨가하여 4시간 더 배양하였다. 이후, 나머지 MTT 용액을 덜어내고, 포르마잔 결정(formazan　crystal)을 용해시키기 위해 150 ㎕의 DMSO를 첨가한 후, ELISA plate　reader를 이용하여 490 nm에서의 흡광도를 측정하였다(도 9).

대조군(Tissue Culture Plate, TCP)은 시료를 처리하지 않았고, 양성대조군은 시료 대신 동일한 농도의 시판되는 연어에서 추출한 DNA(PDRN, Mastelli, Italy)를 처리하였다.

도 9를 참조하면, 바실러스 서브틸리스의 세포외 핵산(BEDNA)을 제외한 미생물 유래 핵산의 시료(LMDNA-1 및 BSDNA)를 처리하는 경우, 양성대조군과 비교하여 동등하거나 우수한 조골아세포 생장 촉진 활성을 보였다.

실험예 4. 미생물 유래 핵산의 골아세포 분화 촉진 효과 확인

알칼리포스파타제(Alkaline Phosphatase, ALP)는 골아세포 분화의 표식인자로 널리 알려져 있다. 이에, 상기 실시예 1.1. 및 실시예 1.2.에서 수득한 미생물 유래 핵산이 골아세포의 분화에 미치는 영향을 ALP 활성을 측정하여 평가하였다.

구체적으로, MC3T3-E1 세포를 96-well plate에 15,000 내지 20,000 cells/cm²로 분주하였고, 배지에 10% FBS를 포함하는 DMEM에 접종하였다. 24시간 후 실시예 1.1. 및 실시예 1.2.에서 수득한 미생물 유래 핵산을 각각 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 또는 100 ㎍/㎖를 처리하고 4일 후 PBS로 세척하고 PBS에 녹인 Triton 0.1%(Triton X-100)로 린스하고 나서 -20℃에서 냉동하였다. 100 ㎕ cell lysate를 200 ㎕의 10 mM p-Nitrophenyl Phosphate와 100 ㎕의 1.5 M 2-amino-2-methyl-1-propanol buffer(AMP)와 혼합하였다. 그 후 37℃에서 1시간 반응시켰다. ALP 활성은 Shimazu spectrophotometer를 이용하여 400 nm 에서의 흡광도를 측정하여 평가하였으며, 시간에 따라 변화된 흡광도를 사용된 단백질의 양으로 나누어 보정하였다(도 10).

시료를 처리하지 않은 경우를 대조군(Tissue Culture Plate, TCP)으로 하였고, 양성대조군으로는 시료 대신 동일한 농도의 시판되는 연어에서 추출한 DNA(PDRN)를 처리하였다.

도 10을 참조하면, 미생물 유래 핵산을 처리한 경우, 양성대조군과 동등하거나 우수한 알칼리포스파타제 활성을 보였고, 특히, 1 ㎍/㎖ 및 10 ㎍/㎖의 류코노스톡 메센테로이데스 유래 핵산을 처리한 경우(LMDNA-1), 동일 농도를 PDRN을 처리한 양성대조군과 비교하여 우수한 알칼리포스파타제 활성을 보였다.

Claims

미생물 유래 핵산 또는 이의 단편을 유효 성분으로 포함하는 조직 세포의 재생을 위한 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 미생물 유래 핵산 또는 이의 단편의 혼합물인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 미생물은 프로바이오틱스인, 조성물.
제3항에 있어서,
상기 프로바이오틱스는 유산균인, 조성물.
제4항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus sp.) 속, 비피도박테리움(Bifidobacterium sp.) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus sp.) 속, 락토코커스(Lactococcus sp.) 속, 엔테로코커스(Enterococcus sp.) 속, 페디오코커스(Pediococcus sp.) 속, 류코노스톡(Leuconostoc sp.) 속, 및 비셀라(Weissella sp.) 속, 바실러스 (Bacillus sp.) 속 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 균주인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 미생물은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 핵산 또는 이의 단편의 길이는 50 bp 내지 10,000 bp인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 핵산 또는 이의 단편의 분자량은 30 kDa 내지 7,000 kDa인, 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 피부 재생 및 상처 치료용 약학적 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 피부 재생 및 상처 개선용 화장료 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.