JP5685764B2 - ミトコンドリア機能向上剤 - Google Patents
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Description
(1) リジン特異的デメチラーゼ-1(LSD1)阻害剤を含む、ミトコンドリア機能向上剤。
(2) リジン特異的デメチラーゼ-1(LSD1)阻害剤が、トラニルシプロミン、又はRNAiによりLSD1又はBHC80又はFAD合成に関わる酵素の発現を抑制できる核酸、FAD合成阻害剤である、(1)に記載のミトコンドリア機能向上剤。
(3) FAD合成に関わる酵素が、リボフラビンキナーゼ(RFK)及び/又はFAD合成酵素(FADS)である、(2)に記載のミトコンドリア機能向上剤。
(4) RNAiによりLSD1の発現を抑制できる核酸が、配列番号29に記載の配列からなるsiRNAと配列番号30に記載の配列からなるsiRNAである、(1)から(3)の何れか1項に記載のミトコンドリア機能向上剤。
(5) リジン特異的デメチラーゼ-1(LSD1)阻害剤を含む、PGC-1α発現誘導剤。
(6) リジン特異的デメチラーゼ-1(LSD1)阻害剤が、トラニルシプロミン、又はRNAiによりLSD1又はBHC80又はFAD合成に関わる酵素(リボフラビンキナーゼ(RFK)、FAD合成酵素(FADS)など)の発現を抑制できる核酸、FAD合成阻害剤である、(5)に記載のPGC-1α発現誘導剤。
(7) FAD合成に関わる酵素が、リボフラビンキナーゼ(RFK)及び/又はFAD合成酵素(FADS)である、(6)に記載のPGC-1α発現誘導剤。
(8) RNAiによりLSD1の発現を抑制できる核酸が、配列番号29に記載の配列からなるsiRNAと配列番号30に記載の配列からなるsiRNAである、(5)から(7)の何れか1項に記載のPGC-1α発現誘導剤。
本発明は、リジン特異的デメチラーゼ-1(LSD1)阻害剤を含む、ミトコンドリア機能向上剤およびPGC-1α発現誘導剤に関する。本発明で言うミトコンドリア機能向上とは、ミトコンドリア量の増大および/またはクエン酸回路、脂肪酸β酸化系、電子伝達系などの活性化のことを言う。
(1)3T3-L1細胞におけるLSD1標的遺伝子のマイクロアレイによる網羅的解析(図1)
RNAimax試薬(Invitrogen)を用いたLSD1又はその共役因子BHC80に対するsiRNAの導入又は10-4 Mのトラニルシプロミン-HCl (TC, Sigma)の添加後に、3T3-L1細胞を分化誘導培地で24時間培養し、RNA分析を行った。脂質生成誘導培地は、0.5μM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン、1μM デキサメタゾン及び5μg/mlインスリンを、10%胎児ウシ血清を含むダルベッコ改変イーグル培地に溶解したものである。全RNAは、RNeasy miniカラム(Qiagen)を用いて抽出した。GeneChip Mouse Genome Array 4302とGeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit (Affymetrix)と組み合わせて用いて、ゲノムワイドの発現解析を行った。
全RNAをTrizol 試薬(Invitrogen)を用いて抽出した。定量的RT-PCRは、Fast SYBR Green System (Applied Biosciences)を用いて行った。PGC-1α等の発現量は、内部対照遺伝子36B4で標準化した。値は、対照siRNAを導入した試料またはビヒクルで処理した試料に対する誘導の倍数として示す。統計学的な有意差について、対照に対して、*p<0.05, **p<0.01で示す(以下、同様)。使用したプライマーは以下の通りである。
PGC-1α/フォワード:5'-AAGTGTGGAACTCTCTGGAACTG-3' (配列番号1)
PGC-1α/リバース:5'-GGGTTATCTTGGTTGGCTTTATG-3' (配列番号2)
PDK4/フォワード:5'-CAAGGAGATCTGAATCTCTA -3' (配列番号3)
PDK4/リバース:5'-GATAATGTTTGAAGGCTGAC-3' (配列番号4)
RIIα/フォワード:5'- AACTGATGAGCAGAGATGCC-3' (配列番号5)
RIIα/リバース:5'- AACATGGCATCCAGAACTTG-3' (配列番号6)
FAT1P/フォワード:5'-CGCCCAGGACTCTGCAAAG-3' (配列番号7)
FATP1/リバース:5'-CACAGAAGTCTGGACTGGGA-3' (配列番号8)
UCP1/フォワード:5'-GGCCCTTGTAAACAACAAAATAC-3' (配列番号9)
UCP1/リバース:5'-GGCAACAAGAGCTGACAGTAAAT-3' (配列番号10)
36B4/フォワード:5'- GCGTCCTGGCATTGTCTGT-3' (配列番号11)
36B4/フォワード:5'-GCAAATGCAGATGGATCAGCC-3' (配列番号12)
LSD1:5'- CACAAGGAAAGCTAGAAGA -3'(配列番号13)
BHC80:5'-GTTCCAGATACAGCCATTG-3'(配列番号14)
RFK:5'-TCTTCCAGCTGATGTGTGT-3'(配列番号15)
FADS:5'-GAGCCCTTGGAGGAATGTC-3'(配列番号16)
コントロールsiRNA
GL3:5'-GATTTCGAGTCGTCTTAAT-3'(配列番号17)
lamin A/C:5'-CTGGACTTCCAGAAGAACA-3'(配列番号18)
LSD1センス:5'-CACAAGGAAAGCUAGAAGA(dT)(dT) -3'(配列番号29)
LSD1アンチセンス:5'-UCUUCUAGCUUUCCUUGUG(dT)(dT) -3'(配列番号30)
BHC80センス:5'-GUUCCAGAUACAGCCAUUG(dT)(dT) -3'(配列番号31)
BHC80アンチセンス:5'-CAAUGGCUGUAUCUGGAAC(dT)(dT) -3'(配列番号32)
RFKセンス:5'-UCUUCCAGCUGAUGUGUCU(dT)(dT)-3'(配列番号33)
RFKアンチセンス:5'-AGACACAUCAGCUGGAAGA(dT)(dT)-3'(配列番号34)
FADSセンス:5'-GAGCCCUUGGAGGAAUGUC(dT)(dT)-3'(配列番号35)
FADSアンチセンス:5'-GACAUUCCUCCAAGGGCUC(dT)(dT)-3'(配列番号36)
GL3センス:5'- GAUUUCGAGUCGUCUUAAU(dT)(dT)-3' (配列番号37)
GL3アンチセンス:5'-AUUAAGACGACUCGAAAUC(dT)(dT)-3' (配列番号38)
lamin A/Cセンス:5'- CUGGACUUCCAGAAGAACA (dT)(dT)-3' (配列番号39)
lamin A/Cアンチセンス:5'-UGUUCUUCUGGAAGUCCAG(dT)(dT)-3' (配列番号40)
3T3-L1細胞のDNA-タンパク質複合体を、1%ホルマリンを用いて架橋し、水槽超音波処理機でクロマチンを断片化した。クロマチン断片は、メチル-H3K4 又はLSD1又はBHC80に対する抗体の存在下において4℃で一晩インキュベートし、プロテインA及びGを結合させたアガロースビーズを用いて回収した。DNAを単離し、以下のプライマーセットを用いてリアルタイムPCRを行った。
領域a: フォワード:5'-GTCTAATTGAGACTGGCTGTG-3' (配列番号19)
領域a: リバース:5'-CAACATGTTGAGCAACTCAGC-3' (配列番号20)
領域b: フォワード: 5'-AAGCTTGACTGGCGTCATTC-3' (配列番号21)
領域b: リバース: 5'- GCTCCGGTCCTGCAATACTC-3' (配列番号22)
領域c: フォワード:5'- TCAAAGATGCCTCCTGTGAC-3' (配列番号23)
領域c: リバース:5'-CAAGGAGAGACCTGCTTGCT-3' (配列番号24)
PDK4:フォワード:5'-CTGGCTAGGAATGCGTGACA -3' (配列番号25)
PDK4:リバース:5'-GATCCCAGGTCGCTAGGACT-3' (配列番号26)
FATP1:フォワード:5'-CGCCCAGGACTCTGCAAAG-3' (配列番号27)
FATP1:リバース:5'-CACAGAAGTCTGGACTGGGA-3' (配列番号28)
mPGC-1αプロモーターを含むルシフェラーゼレポーターベクターであるpGL3-PGC-1α(PGC-1α/Luc)の構築のために、プロモーターの-3627から+80までの3707-bpsの断片を、5’及び3’末端にそれぞれMluI 部位及びXhoI部位を含むプライマーを用いてPCRにより増幅した。ルシフェラーゼアッセイは、Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)を添付のプロトコールに従って用いて行った。pGL3-PGC-1αレポーターベクターを、pRL-TK参照ベクターと一緒に3T3-L1細胞にコトランスフェクションし、TCの存在下又は非存在下において24時間脂肪分化を誘導した後、ルシフェラーゼを測定した。siRNAを適用する場合には、siRNAはレポーターのトランスフェクションの24時間前に導入した。
ミトコンドリア生合成の測定のために、細胞を蛍光色素JC-1 (Molecular Probes)で染色した後、フローサイトメトリーで解析した。JC-1は、ミトコンドリア内膜に結合して緑色の蛍光を発し、膜電位に依存して赤色蛍光の凝集体を形成する。従って、ミトコンドリア量は緑色蛍光を検出することによって評価でき、ミトコンドリア電子伝達の量は赤色蛍光を検出することによって評価できる。3T3-L1 細胞は、10-3 又は10-4 Mのトラニルシプロミンで処理し(図6a)、又はLSD1に対する上記のsiRNAを導入し(図6b)、24時間脂肪分化を誘導した。次いで、細胞を培地中で15分間37℃で5 μg/ml JC-1に接触させ、PBSに懸濁し、FACS解析を行った。緑色蛍光及び赤色蛍光はそれぞれFL1及びFL2セッティングにより検出した。値は、各セッティングにおける平均蛍光強度を示す。
C57B/6Jマウス(7-週齢の雄)に、高脂肪食を6週間与え、10mg/kg体重のトラニルシプロミン又はPBS (n=8)を1日おきに腹腔内に投与した。解剖直前に16時間絶食した後、組織をマウスから単離した。マウスの精巣周囲白色脂肪組織及び肝臓からの全RNAをTrizol 試薬(Invitrogen)を用いて抽出した。発現解析は、上記の通り行った。PGC-1α等の発現量は、内部対照遺伝子36B4に標準化した。値は、PBSで処理した対照マウスに対する誘導の倍数で示す。
C57B/6Jマウス(7-週齢の雄)に、高脂肪食又は通常食を6週間与え、精巣周囲白色脂肪組織をマウスから単離した。細かく切断した組織にアデノウイルスベクターを用いてLSD1 shRNAを導入し、同組織からの全RNAをTrizol 試薬(Invitrogen)を用いて抽出した。発現解析は、上記の通り行った。PGC-1α等の発現量は、内部対照遺伝子36B4に標準化した。値は、コントロールのアデノウイルスを用いた対照組織に対する誘導の倍数で示す。
リボフラビンキナーゼ(RFK)又はFAD合成酵素(FADS)に対するsiRNAを導入した3T3-L1細胞から全RNAをTrizol 試薬(Invitrogen)を用いて抽出した。定量的RT-PCRは、上記の通りに行い、PGC-1α等の発現量は、内部対照遺伝子36B4で標準化した。値は、対照siRNAを導入した試料またはビヒクルで処理した試料に対する誘導の倍数として示す。FADアッセイキット(BioVision)を用いて、FAD合成阻害下による細胞内FAD量を測定した。
RNAimax試薬(Invitrogen)を用いたRFKに対するsiRNAの導入後に、3T3-L1細胞を分化誘導培地で24時間培養し、上記の通りに、RNA分析を行った。GeneChip Mouse Genome Array 4302とGeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit (Affymetrix)と組み合わせて用いて、ゲノムワイドの発現解析を行った。
GAL4結合配列とプロモーターを含むルシフェラーゼレポーターベクターを用いて、上記の通りに、Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)を用いて行った。このレポーターベクターを、GAL4と融合したLSD1(野生型又はFAD結合喪失型)の発現ベクターと一緒に3T3-L1細胞にコトランスフェクションし、ルシフェラーゼを測定した。
C57B/6Jマウス(7-週齢の雄)から、各組織を単離し、全RNAをTrizol 試薬(Invitrogen)を用いて抽出した。LSD1とBHC80の発現量は、内部対照遺伝子36B4に標準化した。値は、白色脂肪組織に対する倍数で示す。WAT(白色脂肪)、BAT(褐色脂肪)、liver(肝臓)、Sk. muscle(骨格筋)、brain(脳)を示す。
トラニルシプロミン又はモノアミン酸化酵素(MAO)阻害剤の添加後に、3T3-L1細胞を分化誘導培地で24時間培養し、RNA分析を行った。発現解析は、上記の通り行った。PGC-1α等の発現量は、内部対照遺伝子36B4に標準化した。値は、ビークルで処理した対照に対する誘導の倍数で示す。Tranylcypromine(TC)、pargyline(parg)、phenelzine(phen)は10-4 M濃度で使用し、clorgyline(clorg)は10-5 M濃度で用いた。
(1)LSD1による脂肪細胞におけるエネルギー代謝の制御.
siRNA又は低分子化合物阻害剤であるトラニルシプロミン(TC)を用いて3T3-L1細胞からLSD1機能を除去した。トラニルシプロミンは、モノアミン酸化酵素A及びB(MAO A 及びB)の阻害剤として最初に同定され、LSD1阻害に特異性が高いことが生化学的に実証されている。これらの条件下で、マイクロアレイによる網羅的な発現解析を行い、分化中の3T3-L1細胞において標的遺伝子を同定した(図1)。LSD1の転写抑制活性と一致して、LSD1ノックダウン(KD)によって、2倍以上に誘導された標的候補は601個であり、それらの多くは共役因子BHC80ノックダウン(KD) 又はトラニルシプロミン処理によっても発現誘導された(図1、上図)。LSD1 KD, BHC80 KD, TCの3つのグループに共通した標的遺伝子には、PGC-1α, ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ4 (PDK4)及びAMP依存性プロテインキナーゼγ2 サブユニットなどのエネルギー消費及びミトコンドリア生合成の鍵調節分子が多数含まれていた(図1、下表)。LSD1又はBHC80のノックダウン(KD)、トラニルシプロミンによるPGC-1α等の遺伝子発現の誘導は、定量的RT-PCRでも確認した(図2)。
PGC-1α遺伝子が、3T3-L1細胞においてLSD1によるH3K4脱メチル化により直接制御されているかどうかを調べた。クロマチン免疫沈降(ChIP)解析により、LSD1をノックダウンした細胞では、PGC-1α遺伝子プロモーターにおけるジメチル化H3K4の量が対照と比較して約2倍に増大することが示された(図3)。ジメチル化H3K4 の増大は、トラニルシプロミン処理下においてPGC-1αプロモーターにおいても検出された(図3)。PDK4などの他のLSD1標的遺伝子のプロモーターにおいても同様の結果であった。標的プロモーターにおけるLSD1の存在を確認するために、このタンパク質のChIP解析を行った(図4)。LSD1は、PGC-1αプロモーターの転写開始部位の近くに位置していた(部位bで示される)。他のLSD1標的遺伝子のプロモーターにおいても同様の結果であった。さらに、PGC-1αプロモーターの下流のルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現は、LSD1のノックダウン又はトラニルシプロミン処理により、活性化(脱抑制)された(図5)。
LSD1阻害条件下での再活性化されたエネルギー消費の細胞学的影響を調べるために、PGC-1αによって活性化されることが知られているミトコンドリア機能の動態を調べた。そのために、ミトコンドリア内膜に結合して緑色蛍光を示し(FL1; ミトコンドリア量)、膜電位に依存して赤色蛍光の凝集物を形成する(FL2; ミチコンドリア活性)蛍光色素であるJC-1を用いて、トラニルシプロミンで処理した細胞を染色した(図6a)。JC-1陽性細胞のフローサイトメトリー解析により、トラニルシプロミンがミトコンドリア量と膜電位の両方に対して刺激効果を示すことが分かった。さらに、LSD1ノックダウンにおいて、同様の結果が得られた(図6b)。これらのデータは、LSD1がH3K4脱メチル化を介してエネルギー消費遺伝子を直接抑制し、ミトコンドリア機能を阻害していることを示している。同時に、LSD1阻害によって、ミトコンドリア機能とエネルギー消費を活性化できることを示している。
LSD1阻害によるミトコンドリア機能の活性化においてトラニルシプロミンが有効であることから、トラニルシプロミンの投与がインビボでエネルギー恒常性に影響するかどうかについて調べた。7週齢のC57B/6Jマウスに高脂肪食を6週間与え、10mg/kg体重のトラニルシプロミン又はPBSを1日おきに投与した。トラニルシプロミンの投与により、マウスの精巣周囲脂肪においてPGC-1αを含むLSD1標的遺伝子の発現は増大した(図7)。肝臓においても同様の結果であった。このデータは、トラニルシプロミンによるLSD1の阻害により、エネルギー消費がインビボで刺激されることを示している。
エネルギー消費向上の意義を調べるために、C57B/6Jマウス(7週齢の雄)に高脂肪食又は通常食を6週間与え、精巣周囲白色脂肪組織を細断してアデノウイルスベクター由来LSD1 shRNAでLSD1阻害を行った。PGC-1α等の発現量は、高脂肪食の条件下では増加するが、他方、通常食の条件下では低下した(図8)。このデータは、LSD1阻害は、エネルギー状態に依存して、ミトコンドリア機能を調節することを示している。すなわち、エネルギー過剰の場合には、LSD1阻害はエネルギー消費を促進し、他方、通常のエネルギー摂取の場合には、LSD1阻害はエネルギー消費を抑制することで、いずれも生体恒常性を維持することが示唆される。
LSD1は、FAD依存性の脱メチル化酵素であることから、細胞内FAD合成経路の機能について検討した。この経路においては、リボフラビンキナーゼ(RFK)とFAD合成酵素(FADS)が鍵酵素として知られている(図9)。これらに対するsiRNAを用いてFAD合成阻害すると、PGC-1α等のLSD1標的遺伝子の発現は活性化された。また、FAD合成阻害時においては、細胞内FAD量は低下していた。このデータは、FAD合成阻害によって、LSD1標的遺伝子を活性化できることを示している。
FADで調節される標的遺伝子を検討するために、LSD1又はRFKのノックダウン(KD)の条件下でマイクロアレイによる網羅的な発現解析を行い、3T3-L1細胞において標的遺伝子を同定した(図10)。LSD1の転写抑制活性と一致して、LSD1標的遺伝子の多くはRFKノックダウンによっても発現誘導された。このことから、LSD1とFAD合成に関わる酵素で発現調節される標的遺伝子は重複することが示された。
LSD1機能のFAD依存性を調べるために、GAL4結合配列とプロモーターを含むルシフェラーゼレポーターベクターを用いて、ルシフェラーゼアッセイを行った(図11)。GAL4と融合したLSD1を発現すると、野生型LSD1は量依存的に転写抑制したが、他方、FAD結合喪失型LSD1は転写抑制能を示さなかった。このデータは、LSD1の転写抑制能は、FAD結合に依存することを示している。
LSD1の生物学的な意義を調べるために、成熟マウスの各組織におけるLSD1とBHC80の発現を検討した(図12)。代謝組織の中では、白色脂肪で高く発現し、褐色脂肪、肝臓、骨格筋でも中等度の発現を認めた。一方、脳組織では極めて高く発現していることからも、各組織のエネルギー代謝においてLSD1が役割を果たすことを示唆している。
トラニルシプロミン及び既存のモノアミン酸化酵素(MAO)がLSD1標的遺伝子に対する影響について検討した(図13)。pargyline(parg)、phenelzine(phen)、clorgyline(clorg)に比較して、トラニルシプロミンがPGC-1αなどのLSD1標的遺伝子の顕著な活性化を示した。トラニルシプロミンがLSD1阻害活性をもち、他のMAO阻害剤ではその活性が低いことから、このデータは、LSD1阻害によるミトコンドリア機能遺伝子の促進を支持するとともに、LSD1阻害とMAO阻害の効果は区別できることを示している。
Claims (4)
- RNAiによりLSD1、BHC80、リボフラビンキナーゼ(RFK)又はFAD合成酵素(FADS)の発現を抑制できる核酸を含む、ミトコンドリア機能向上剤。
- RNAiによりLSD1の発現を抑制できる核酸として、配列番号29に記載の配列からなるsiRNAと配列番号30に記載の配列からなるsiRNAとを含む、請求項1に記載のミトコンドリア機能向上剤。
- RNAiによりLSD1、BHC80、リボフラビンキナーゼ(RFK)又はFAD合成酵素(FADS)の発現を抑制できる核酸を含む、PGC−1α発現誘導剤。
- RNAiによりLSD1の発現を抑制できる核酸として、配列番号29に記載の配列からなるsiRNAと配列番号30に記載の配列からなるsiRNAとを含む、請求項3に記載のPGC−1α発現誘導剤。
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