WO2017130933A1 - 神経変性疾患治療剤 - Google Patents

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WO2017130933A1
WO2017130933A1 PCT/JP2017/002244 JP2017002244W WO2017130933A1 WO 2017130933 A1 WO2017130933 A1 WO 2017130933A1 JP 2017002244 W JP2017002244 W JP 2017002244W WO 2017130933 A1 WO2017130933 A1 WO 2017130933A1
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WO
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therapeutic agent
lsd1
tranylcypromine
preventive
disease
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PCT/JP2017/002244
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English (en)
French (fr)
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秀信 谷原
圭一郎 岩尾
光善 中尾
林　秀樹
信次朗 日野
孝之 堤
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国立大学法人熊本大学
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Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for neurodegenerative diseases, and particularly relates to a therapeutic agent for neuroprotection.
  • Glaucoma is a major cause of blindness in the world. Glaucoma is well known as a major optic neuropathy characterized by retinal ganglion cell (RGC) loss, and RGC death causes visual field impairment. The major risk factor in most cases of visual field progression is elevated intraocular pressure (IOP). However, in normal-tension glaucoma patients, RGC suffers even if the IOP is within the normal range (10-20 mmHg).
  • IOP intraocular pressure
  • Epigenetic mechanisms affect gene expression and its function by DNA methylation, histone modifications, and non-coding RNA without changing the underlying DNA sequence. It is well known that histones are specifically modified by various mechanisms, such as N-terminal acetylation, methylation, phosphorylation, ubiquitination and ADP-ribosylation of histones, and histone modifications are chromatin structures. Is a switch that changes the expression of a downstream “effector” protein, enabling transcriptional activation or repression. Recently, there have been several reports suggesting that multiple epigenetic factors play an important role in RGC survival and the development of glaucoma.
  • HDAC histone deacetylase
  • trichostatin A a major player in histone deacetylation
  • inhibition of retinal HDAC activity by trichostatin A is a representative RGC-specific gene.
  • Can be maintained and cell loss following optic nerve injury can be attenuated (Non-patent Document 1).
  • valproic acid another typical HDAC inhibitor, exhibits a neuroprotective effect, and leads to axonal regeneration after crushing the optic nerve by regulating the activity of the transcription factor CREB (cAMP response element binding protein).
  • Patent Document 3 gene removal of Hdac3 in retinal ganglion cells results in significant improvement in the characteristics of nuclear atrophy and significant suppression of RGC death in the acute phase after optic nerve injury.
  • Lysine-specific demethylase 1 (LSD1) is known as one of the flavin-containing amine oxidase family and is known to suppress transcription by monomethylation of histone H3 and removal of the methyl group from dimethylated lysine 4. ing. LSD1 has already been reported to have effects on cell proliferation, survival promotion, neurite morphogenesis, and neuronal differentiation and development (Non-Patent Document 4; Non-Patent Document 5; Non-Patent Document 6; Non-patent document 7).
  • Non-Patent Document 4 Non-Patent Document 8
  • tranylcypromine an inhibitor of LSD1 regulates the proliferation of neural stem cells in the mouse brain and the development of zebrafish lateral sensation hills.
  • Non-Patent Document 8 Non-Patent Document 8
  • tranylcypromine an inhibitor of LSD1 regulates the proliferation of neural stem cells in the mouse brain and the development of zebrafish lateral sensation hills.
  • tranylcypromine an inhibitor of LSD1
  • Tranylcypromine has been reported to be a powerful dual action agent that inhibits LSD1 and MAO.
  • MAO catalyzes the oxidative deamination of food amines and monoamine neurotransmitters and produces by-products of MAO-related reactions including 3,4-dihydroxyphenylglycolaldehyde (DOPEGAL) or hydrogen peroxide.
  • DOPEGAL 3,4-dihydroxyphenylglycolaldehyde
  • HOPEGAL 3,4-dihydroxyphenylglycolaldehyde
  • These potential neurotoxic metabolites cause neuronal apoptosis and are considered to be one of the causes of neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease and Alzheimer's disease. Therefore, inactivation of MAO is considered one of the excellent strategies for protecting nerve cells not only in vitro but also in vivo.
  • MAO inhibitors including L-deprenyl (Selegiline®) has become a novel pharmacotherapy for human neuropsychiatric disorders such as Parkinson's disease, treatment-resistant depression, anxiety disorders, and Alzheimer's disease. It has been reported.
  • Mitogen-activated protein kinase including ERK1 / 2, JNK and p38 is known as a molecule involved in survival, proliferation and differentiation in neurons and non-neuronal cells (Non-patent document 9; Non-patent document) 10; Non-Patent Document 11).
  • MAPK Mitogen-activated protein kinase
  • NF- ⁇ B activated B cell nuclear factor kappa light chain enhancer
  • the p38 MAPK family consists of four major isoforms, p38 ⁇ , p38 ⁇ , P38 ⁇ and p38 ⁇ , which are encoded by independent genes and functional redundancy among the p38 isoforms as well as isoform-specific functions. It is considered that there may be (Non-Patent Document 13). In central nervous system cells, there are multiple reports that the p38 ⁇ MAPK isoform contributes more significantly to the production and neurotoxicity of stress-induced proinflammatory cytokines than the isoform of p38 ⁇ (Non-Patent Literature). 14; Non-patent document 15; Non-patent document 16). However, the role of other types of p38 isoforms in neurons remained unclear. And it is reported that p38 (alpha) isoform causes the death of a neuron (nonpatent literature 17).
  • An object of the present invention is to provide a therapeutic agent for neurodegenerative diseases. More specifically, an object of the present invention is to provide a neuroprotective therapeutic agent. For example, it aims at providing the new therapeutic agent with respect to the neurodegenerative disease of an eye as one of the neurodegenerative diseases.
  • tranylcypromine an LSD1 inhibitor
  • tranylcypromine exhibits an eye neuroprotective effect, thereby completing the present invention.
  • the molecular target involved in RGC protection mediated by tranylcypromine is p38MAPK ⁇ and / or p38MAPK ⁇ , and completed further invention.
  • the present invention includes the following. [1] A preventive or therapeutic agent for a neurodegenerative disease comprising a substance that inhibits lysine-specific demethylase 1 (LSD1) activity as an active ingredient.
  • LSD1 lysine-specific demethylase 1
  • the substance is the following compound group:
  • a neuroprotective therapeutic agent comprising a substance that inhibits lysine-specific demethylase 1 (LSD1) activity as an active ingredient.
  • An inhibitor of retinal neuronal cell death comprising a substance that inhibits lysine-specific demethylase 1 (LSD1) activity as an active ingredient.
  • the present invention provides new therapeutic agents for neurodegenerative diseases, particularly neuroprotective therapeutic agents.
  • the present invention also provides a novel therapeutic agent for neurodegenerative diseases of the eye as one of neurodegenerative diseases.
  • FIG. 1 shows the decaying effect of tranylcypromine on glutamate neurotoxicity and apoptosis induced by oxidative stress.
  • FIG. 6 shows the result of detecting a fragmented or aggregated nucleus by Hoechst staining 24 hours after glutamic acid (Glu) -induced stress or oxidative (H 2 O 2 ) stress in the presence or absence of tranylcypromine (TC).
  • HBSS Hops Balanced Salt Solution
  • FIGS. A and B show RGC photographic images (upper figure) and fluorescent images (lower figure) after Glu stimulation.
  • FIG. 2 shows the result of confirming the protective effect of RGC from apoptosis by LSD1 inhibition.
  • FIG. A shows the results of Western blot analysis
  • FIG. B shows the results of band density ratios expressed as relative ratios.
  • FIG. C shows the results of confirming the effect of LSD1 siRNA on glutamate (Glu) -loaded apoptosis.
  • HBSS represents the control (Glu ( ⁇ ), S2101 ( ⁇ )), and Control represents only Glu.
  • LSD1 siRNA significantly suppressed apoptosis.
  • FIG. D shows the results of confirming the effect of LSD1 inhibitor S2101 on glutamate (Glu) -induced apoptosis.
  • HBSS represents a control.
  • S2101 shows a significant suppression effect.
  • Data in (C) and (D) represent mean ⁇ standard error.
  • FIG. 3 shows the results of confirming the promotion of p38MAPK ⁇ expression by tranylcypromine (TC) under glutamic acid (Glu) stress.
  • 3A, B and C are the results of Western blot analysis and densitometric evaluation in which phosphorylation of Akt by glutamic acid was confirmed.
  • FIGS. 3D to G show the results of Western blot analysis and densitometry evaluation for confirming the expression and phosphorylation of p38MAPK by glutamic acid and the expression of p38MAPK ⁇ .
  • HBSS represents a control. Glutamic acid had no effect on Akt expression.
  • tranylcypromine had no effect on Akt expression and Akt phosphorylation.
  • glutamic acid did not affect the expression of total p38 MAPK and its phosphorylated state.
  • Tranylcypromine did not affect the expression of total p38 MAPK and its phosphorylation.
  • tranylcypromine significantly promoted the expression of p38MAPK ⁇ .
  • FIG. 4 shows the results of confirming contribution of RGC to survival through p38MAPK ⁇ activity of tranylcypromine. RGC apoptosis was evaluated by changes in nuclear morphology.
  • FIG. 4A shows the result of confirming the effect of Waltmannin.
  • FIG. 5 shows the results of morphological confirmation of retinal protection from NMDA-induced stress by intravitreal administration of tranylcypromine.
  • FIG. 5A is a light microscopic image of a retinal section specimen after treatment with PBS (control) and tranylcypromine in a NMDA stress state.
  • FIG. 6 shows the results of confirming whether or not tranylcypromine suppresses caspase 3 activity in the retina after NMDA-induced damage.
  • FIG. 7 shows the results of confirming the neuroprotective effect of tranylcypromine (TC) against NMDA-induced apoptosis in vivo. Retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGC) with fluorogold was performed.
  • FIG. 7A shows flat mount specimens under four conditions, ie, whether NMDA was administered intravitreally and whether TC was administered.
  • FIGS. 7B and C show the actual number of RGCs (intermediate retina (B), peripheral retina (C)).
  • the TC administration group shows a statistically larger number than the TC non-administration group.
  • LSD1 lysine-specific demethylase 1
  • LSD1 is an important regulator of neuronal survival, and new molecular targets for the treatment of neurodegenerative diseases I found out.
  • the present invention relates to a preventive or therapeutic agent for a neurodegenerative disease comprising a substance that inhibits LSD1 activity as an active ingredient.
  • to inhibit LSD1 activity means to inhibit the enzyme activity of LSD1, which is an enzyme, and to inhibit the expression of LSD1 activity in cells by suppressing the expression of LSD1 itself. It is.
  • the substance that inhibits the enzyme activity of LSD1, which is an enzyme, is not limited to this.
  • tranylcypromine (2-PCPA), 2-PFPA, S2101, S1310, S1401, S1402, S1502, S1601, S1602, S1603, S1603, S1603 , S2101, S2107, S2111 and S2206, and preferred are tranylcypromine and S2101, particularly preferred is tranylcypromine.
  • the structural formulas of these compounds are shown below.
  • the IC 50 for LSD1 inhibition of these compounds is shown in the following table.
  • Tranylcypromine is an LSD1 inhibitor having the following structure, but is a pharmaceutical approved in Europe and the United States as an antidepressant based on monoamine oxidase inhibitory activity.
  • Tranylcypromine has (1R, 2S) tranylcypromine and (1S, 2R) tranylcypromine as optical isomers.
  • any optical isomer may be used as long as it has LSD1 inhibitory activity.
  • a mixture thereof may be used.
  • it may be used in the form of a pharmacologically acceptable salt.
  • S2101 is an LSD1 inhibitor having the following structure.
  • S2101 has an optical isomer, but in the present invention, any optical isomer or a mixture thereof may be used as long as it has LSD1 inhibitory activity.
  • Examples of substances that inhibit the expression of LSD1 activity in cells by suppressing the expression of LSD1 itself include siRNA, shRNA, etc. of LSD1, and these genes are introduced into cells according to conventional methods. By knocking down the LSD1 gene in cells, the expression of LSD1 itself can be suppressed and the expression of LSD1 activity can be inhibited.
  • LSD1-specific siRNA can be designed based on known information and synthesized according to a conventional method, or is commercially available and can be used.
  • the neurodegenerative disease targeted by the prophylactic or therapeutic agent of the present invention is not limited thereto, and examples thereof include optic neurodegenerative diseases, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and multiple sclerosis, and preferably the optic nerve. It is a degenerative disease.
  • the optic neurodegenerative disease targeted by the present invention includes optic neuropathy associated with glaucoma, ischemic optic neuropathy, traumatic optic neuropathy, label hereditary optic neuropathy, and preferably optic neuropathy associated with glaucoma. is there.
  • the target disease of the prophylactic or therapeutic agent of the present invention is particularly preferably a disease based on a disorder of retinal nerve cells, for example, a disease caused by retinal ganglion cell death.
  • the preventive agent or therapeutic agent of the present invention when used for a neurodegenerative disease based on glaucoma, it can be used in combination with other therapeutic agents or treatment methods for glaucoma.
  • a combination therapy with a therapeutic agent for reducing intraocular pressure and a combination therapy with a therapeutic agent for reducing intraocular pressure can be given.
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present invention is a compound
  • the compound can be administered either orally or parenterally.
  • the dosage form include, but are not limited to, tablets, capsules, granules, powders, injections, suspensions, eye drops, eye ointments, sustained-release intraocular implants, and the like. it can. Formulation can be performed using techniques widely used in the field.
  • the target disease is an optic neurodegenerative disease, an intraocular injection or eye drop is preferable.
  • the dose of the compound is appropriately selected depending on the type of disease, the symptom of the administration subject, age, administration method, and the like.
  • the dose of the compound is appropriately selected depending on the type of disease, the symptom of the administration subject, age, administration method, and the like.
  • 0.1 to 5000 mg per day preferably 1 to 2000 mg, more preferably 5 to 1000 mg may be administered in one or several divided doses.
  • a solution of 0.01 to 5%, preferably 0.05 to 1% may be instilled several times per day.
  • a topical ocular injection for example, 0.1 mg to 150 mg, preferably 1 mg to 100 mg, more preferably 10 mg to 50 mg of a drug dissolved in physiological saline is used as a symptom. Accordingly, the injection may be performed intraocularly, preferably intravitreally. In addition, preparation of an injection can be performed based on a conventional method.
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present invention is a gene such as siRNA
  • the gene can be administered by injection.
  • siRNA in the treatment of glaucoma, for example, siRNA can be administered directly or indirectly into the vitreous of the eye.
  • Another preferred embodiment of the present invention is ocular neurodegeneration by preventing and / or restoring loss of retinal ganglion cells (RGC) comprising as an active ingredient a substance that inhibits lysine-specific demethylase 1 (LSD1) activity. It is a preventive and / or therapeutic drug for diseases. Thereby, it is possible to prevent and / or treat an RGC disorder seen in glaucoma patients, for which a sufficient effect cannot be expected with a therapeutic agent or a treatment method aimed at lowering the elevated intraocular pressure.
  • RGC retinal ganglion cells
  • Tranylcypromine is also known as 2-phenylcyclopropylamine. Tranylcypromine was purchased from Sigma-Aldrich. S2101 (LSD1 inhibitor II, also known as 489477) was obtained from Merck Millipore. Two day old Sprague Dawley (SD) rats obtained from Kudo were used for isolation of RGCs. The experimental procedure was performed according to the Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research of Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO). All experimental procedures were approved by the Animal Experiment Committee of Kumamoto University.
  • the cell suspension was first incubated on a panning plate (150 mm Petri dish) coated with goat anti-rabbit IgG.
  • Non-adherent cells were incubated on a second panning plate (100 mm Petri dish) coated with goat anti-mouse IgM ⁇ and mouse anti-Thy1.1 antibody secreted from T11D7e2 cells.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the isolated RGC was added to 1 mM glutamine, 5 ⁇ g / ml insulin, 60 ⁇ g / ml N-acetylcysteine, 62 ng / ml progesterone, 16 ⁇ g / ml putrescine, 40 ng / ml sodium selenite, 0.1 mg / Ml bovine serum albumin, 40 ng / ml triiodothyronine, 0.1 mg / ml transferrin, 1 mM sodium pyruvate, 2% B-27 supplement (# 17504-044, Invitrogen), 10 ⁇ M false Choline, 50 ng / ml brain-derived neurotrophic factor (BDNF) (PeproTech), 50 ng / ml ciliary neurotrophic factor (CNTF) (PeproTech), and 50 ng / ml basic fibroblast growth factor (PeproTech) And suspended in Neurobasal medium containing Culture plates (96 wells
  • Immunoblotting was performed according to the method of Hayashi et al. Proteins were separated by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, transferred to PVDF membrane, and detected with primary and peroxidase-conjugated secondary antibodies. Immunoreactive proteins were visualized with SuperSignal West Pico, Dura or Femoto (Thermo Fisher Scientific).
  • mice anti- ⁇ -actin # A5441, Sigma-Aldrich
  • rabbit anti-LSD1 C69G12
  • rabbit anti-phosphorylated-p38 MAPK Thr180 / Tyr182
  • D3F9 # 4511, Cell Signaling Technology
  • rabbit anti-p38 MAPK # 9212, Cell Signaling Technology
  • rabbit anti-phosphorylated SAPK3 Thr183 + Tyr185
  • rabbit anti-p38 ⁇ MAPK # 2307, Cell Signaling Technology
  • Rabbit anti-phosphorylated Akt Ser473
  • 9271, Cell Signaling Technology rabbit anti-Akt
  • 9272 Cell Signaling Technology
  • rabbit anti-cleaved Caspase3 Asp175)
  • RGC apoptosis of retinal ganglion cells The RGC apoptosis was evaluated as described in Hayashi et al. (2012). Primary RGCs were washed twice with Hanks balanced salt solution (HBSS, Invitrogen) containing 2.4 mM CaCl 2 , 20 mM HEPES (no magnesium) (15 minutes incubation at 37 ° C.). Magnesium was removed from the wash solution to avoid blocking the NMDA receptor. Subsequently, RGCs in HBSS containing 2.4 mM CaCl 2 , 20 mM HEPES (without magnesium), together with 300 ⁇ M glutamate and 10 ⁇ M glycine, which are coactivators of NMDA receptors, at 37 ° C.
  • HBSS Hanks balanced salt solution
  • Invitrogen Hanks balanced salt solution
  • Magnesium was removed from the wash solution to avoid blocking the NMDA receptor.
  • RGCs were cultured at 37 ° C. for 22 hours in the same medium without neurotrophic factors such as forskolin, BDNF, CNTF and bFGF.
  • Apoptosis was also induced by adding a nutrient additive containing “B27 Supplement AO depleted of antioxidant” (Invitrogen) and 50 ⁇ M hydrogen peroxide for 0.5 hours, and the cells were cultured for 24 hours.
  • Tranylcypromine is added simultaneously with the addition of glutamic acid or hydrogen peroxide, while S2101 (# 489477, Merck Millipore), BIRB796 (# S1574, Selleck Chemical), SB203580 (# 199-16551, Wako) induce apoptosis.
  • S2101 # 489477, Merck Millipore
  • BIRB796 # S1574, Selleck Chemical
  • SB203580 # 199-16551, Wako
  • Apoptosis detection using Hoechst 33342 was performed by incubating RGC with 1.0 g / ml Hoechst 33342 for 15 minutes. Fluorescence images were observed using an IX71 fluorescence microscope (Olympus) and 96 well plates were used to obtain at least 6 images / well. Fragmented or reduced nuclei stained with Hoechst dye were counted as apoptotic neurons and round / smooth nuclei were counted as healthy neurons according to Hayashi et al. In order to minimize measurement bias, the software MetaMorph (Molecular Devices) was used to automatically measure over 200 neurons for each condition.
  • siRNA Non-silencing small interfering RNA (siRNA) (1 ⁇ M) (Accell non-targeting siRNA # 1, Thermo Fisher Scientific) or specific siRNA of LSD1 (E-105863-00-0010, Accell) Rat Kdm1a [Gene ID: 500569] siRNA SMARTpool, Thermo Fisher Scientific) was added to the medium according to the manufacturer's instructions and incubated with RGC for 6 days. The knockdown effect by LSD1 siRNA was confirmed using the immunoblotting method.
  • RNA was amplified, labeled and hybridized to Rat GE 4x44K v3 Microarray Kit (Agilent Technologies) according to the manufacturer's instructions. All hybridized microarrays were scanned with an Agilent scanner and all probe signals were calculated using Feature Extraction Software (Agilent Technologies). Using the procedure recommended by Agilent, the raw signal intensity and flag for each probe was calculated from the hybridization intensity and spot information. In order to make a comparison between control and experimental samples to identify up-regulated and down-regulated genes, select a probe with the P flag registered in at least one sample, and use an intensity-based Z-score And the ratio (non-log scale fold change) was calculated from the normalized signal intensity of each probe.
  • a gene having a Z score of 2.0 or less and a ratio of 1.5 times or more was regarded as an up-regulated gene, and a Z score of -2.0 or less and a ratio of 0.66 or less was regarded as a down-regulated gene.
  • the results were “control” vs. “glutamate stimulation” and “glutamate stimulation” vs. “glutamate stimulation + tranylcypromine”.
  • NMDA-induced retinal damage Intravitreal injection of NMDA was performed in the same manner as reported by Inomata (Inomata et al. (2006) Journal of Neurochemistry, 98, 372-385). Briefly, rats were anesthetized by intraperitoneal injection of a 1: 1 mixture of xylazine hydrochloride (4 mg / kg) and ketamine hydrochloride (10 mg / kg). The pupil was dilated with phenylephrine hydrochloride and tropicamide and 20 nanomolar NMDA was injected into the vitreous cavity.
  • Tranylcypromine was injected into SD rats simultaneously with NMDA administration.
  • NMDA was mixed with 500 mM tranylcypromine solution or phosphate buffered saline (PBS) as a control to make the total volume 2.0 ⁇ L, and injected into the vitreous cavity.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Morphological analysis in vivo Morphological analysis for evaluating the protective effect was performed according to a report (Inomata et al., (2003) Brain Research, 991, 163-170). Briefly, 7 days after NMDA injection, the animals were euthanized by carbon dioxide asphyxiation and the eyes were removed. The eyes were fixed with 4% paraformaldehyde overnight at 4 ° C., followed by dehydration and paraffin embedding. A 4 ⁇ m-thick transverse section was prepared from the eye of a rat with an optic disc and stained with hematoxylin and eosin for morphological analysis. The thickness of the inner reticulated layer (IPL) was measured from 1.0 to 1.5 mm from the optic nerve head. Using a microscope BX51 (Olympus), the data of the minimum values of the three sections were averaged to obtain numerical values for each eye.
  • IPL inner reticulated layer
  • rats were deeply anesthetized by intraperitoneal injection of a 1: 1 mixture of xylazine hydrochloride (4 mg / kg) and ketamine hydrochloride (10 mg / kg), then their head hair was shaved and the skin was An incision was made at the midline to expose the skull and sutures (sagittal, coronal and lateral sutures). Both 2 mm diameter craniotomys were performed 0.5 mm on the posterior side of the sagittal and transverse suture lines. The brain material on the upper hill was then carefully removed with a vacuum pump. In each hole on the surface of the upper hill, a small piece of sterile sponge was pre-immersed in 6 ⁇ L of 6% FG solution.
  • the skin wound was then sutured closed. After surgery, the rats were kept warm and recovered themselves. Seven days after NMDA injection, the animals were euthanized and intracardiac perfused with PBS to flush the blood. After PBS irrigation, perfusion was performed with 4% paraformaldehyde. After perfusion fixation, the eyes were removed. The eyes were fixed with 4% paraformaldehyde overnight at 4 ° C.
  • the retina was removed from the sclera and divided into 4 quadrants (excellent, inferior, nasal, and temporal) and mounted on a slide. Each quadrant was subdivided into three regions (center, middle, periphery) that are 1.0, 2.0, and 3.0 mm from the optic nerve transcranial head. A total of 12 fields per retina were analyzed in a masked fashion by counting the number of FG-labeled RGCs using an all-in-one fluorescence microscope BZ-X710 (Keyence).
  • Tranylcypromine has a dual molecular effect of Lsd1 inhibitor and monoamine oxidase (MAO) inhibition.
  • Monoamine oxidase inhibitory activity may be related to anti-apoptotic and neuroprotective activity. Therefore, it was next confirmed whether or not tranylan cypromine exhibits a neuroprotective action through an anti-Lsd1 effect. First, after knocking down LSD1, the survival of neurons was confirmed, and the knockdown effect was verified. Immunoblotting results showed that Lsd1 (Kdm1a) specific siRNA significantly suppressed Lsd1 expression to 30.4 percent compared to non-silencing siRNA controls (FIGS.
  • Example 3 Analysis of target pathway and gene in survival of retinal ganglion cells by administration of tranylcypromine The signal transduction pathway involved in the neuroprotective effect of tranylcypromine was examined.
  • a microarray analysis including changes in 26,930 gene expression was performed. Since LSD1 has been previously reported to suppress gene transcription through the demethylation reaction of lysine 4 of histone H3, the present inventors have amplified expression by tranylcypromine and simultaneously administered glutamate. It was hypothesized that genes with reduced expression are good candidates for identifying gene targets that modulate neuronal viability.
  • KEGG route annotation analysis was performed using Database for annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID). For the functional classification associated with 110 gene candidates, three enriched KEGG pathway terms were significantly detected. These were involved in fcgammaR-mediated phagocytosis, neurotrophin signaling pathway, and purine metabolism (shown in Table 2).
  • Example 4 Enhancement of RGC Survival through p38MAPK ⁇ Activity by Tranylcypromine
  • neurotrophin signaling molecule v-akt mouse thymoma virus oncogene homolog 1 (Akt) and mitogen activation
  • Akt v-akt mouse thymoma virus oncogene homolog 1
  • mitogen activation We focused on protein kinase 12 (P38 MAPK ⁇ ). This is because the PI3K / Akt / mTOR pathway and the MAP kinase pathway were well known as major signaling pathways for cell survival and anti-apoptotic activity.
  • SB203580 is reported to be a specific inhibitor of p38MAPK ⁇ and p38MAPK ⁇ , but not p38MAPK ⁇ or p38MAPK ⁇ . Therefore, these results on pharmacological action indicate that tranylipypromine contributes to RGC survival via p38 MAPK ⁇ activity.
  • Example 5 Confirmation of RGC Survival Promotion by Tranylcypromine In Vivo It was confirmed in vivo whether or not tranylcypromine regulates RGC survival under stress conditions. Materials and methods (7)-(10).
  • an in vivo NMDA-induced retinal injury model was used to evaluate morphological retinal changes after tranylcypromine administration. Intravitreal NMDA significantly reduced IPL thickness compared to PBS control.
  • the retina treated with tranylcypromine and injected with NMDA maintained the IPL thickness at the same level as the control retina. In other words, administration of tranylcypromine was able to completely recover glutamate-induced retinal damage. The results are shown in FIG.
  • NMDA-induced caspase 3 activity after administration of tranylcypromine was measured by Western blot analysis. As confirmed by eyes treated with NMDA and vehicle, cleaved caspase 3 was significantly induced in the retina 18 hours after NMDA injection, but this activity was significantly suppressed in the retina treated with tranylcypromine. It had been. The results are shown in FIG. These results indicate that intravitreal administration of tranylcypromine exerts a neuroprotective effect on the intracellular apoptosis signaling pathway and suppresses retinal morphological changes.
  • tranylcypromine protects RGC from NMDA-induced retinal neurotoxicity.
  • the actual number of RGCs retro-labeled with fluorogold was counted in the retina for each group of sham (control), tranylcypromine treatment, NMDA treatment, and NMDA and tranylcypromine treatment.
  • the number of RGCs in the NMDA administration group 7 days after NMDA intravitreal injection was reduced to 21.4% in the intermediate region of the retina and 23.4% in the peripheral region.
  • the number of RGCs was 48.7% and 50.9%, respectively, in the middle region and the peripheral region, which were significantly increased.
  • the results are shown in FIG. Therefore, intravitreal tranylcypromine treatment enhanced RGC survival after retinal damage due to NMDA neurotoxicity.
  • tranylcypromine not only maintains the thickness of the inner plexiform layer but also reduces RGC loss after NMDA administration, which is an overload on the retina of rats. It was. Thus, tranylcypromine targeting LSD1 activity could enhance the neuroprotective effect in vivo during retinal damage.
  • tranylcypromine a typical LSD1 inhibitor, is prominent in retinal ganglion cells by promoting the expression of neuronal P38 ⁇ isoforms that are considered main players to increase neuronal survival. Shows neuroprotective effect.
  • Topical administration of tranylcypromine also provided neuroprotection for retinal ganglion cells in a rat NMDA-induced excitotoxic stress model. This indicates that treatment of neurodegenerative diseases such as glaucoma is possible by suppressing LSD1.
  • the present invention is useful as a preventive or therapeutic agent for novel neurodegenerative diseases.
  • the present invention is also useful as a new preventive or therapeutic agent for ocular neurodegenerative diseases such as glaucoma.

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Abstract

本発明は、神経変性疾患治療剤を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は神経保護治療剤を提供することを目的とする。例えば、神経変性疾患の一つとして眼の神経変性疾患に対する新たな治療剤を提供することを目的とする。本発明により、リジン特異的デメチラーゼ１（ＬＳＤ１）活性を阻害する物質を有効成分として含む神経変性疾患の予防剤又は治療剤が提供される。本発明によりまた、ＬＳＤ１活性を阻害する物質を有効成分として含む神経保護治療剤が提供される。

Description

神経変性疾患治療剤
　本発明は、神経変性疾患治療剤に関し、特には、神経保護治療剤に関する。
　緑内障は、世界における失明の主な原因である。緑内障は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）損失によって特徴付けられる主要な視神経障害としてよく知られており、ＲＧＣの死は、視野の障害を引き起こす。視野障害進行のほとんどの場合の主要な危険因子は、上昇した眼圧（ＩＯＰ）である。しかし、正常眼圧緑内障患者においては、ＩＯＰが正常範囲内（１０－２０ ｍｍＨｇ）であってもＲＧＣは障害を被る。
　最近の疫学的研究により、特にアジアの人種で、原発性開放隅角緑内障において、正常眼圧緑内障は眼圧上昇を伴う緑内障よりも高頻度に認められることが明らかになった。正常眼圧緑内障の原因は完全には解明されない状態であるが、複数の因子、例えば、視神経における血流低下、遺伝的要素、脳脊髄圧とＩＯＰとの間の拡大したギャップなどがこの疾患における病態生理学的変化に関与している可能性がある。正常眼圧患者を含む緑内障に対する治療は、点眼剤、レーザー治療や手術によるＩＯＰ下降をターゲットにしている。しかし、十分にＩＯＰが下降しても、治療効果は、臨床的にはしばしば限定的であり不充分である。したがって、緑内障治療の新たな戦略、例えば、網膜神経節細胞のための神経保護などの戦略が真に必要とされている。
　エピジェネティックなメカニズムは、ＤＮＡメチル化、ヒストン修飾、及び非コードＲＮＡによって、元となっているＤＮＡ配列の変化なしに、遺伝子発現及びその機能に影響を与える。ヒストンが、種々の機序、例えば、ヒストンのＮ末端のアセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化及びＡＤＰリボシル化により特異的に修飾されることは良く知られており、ヒストン修飾はクロマチン構造を変化させるスイッチであり、下流の「エフェクター」タンパク質の結合プラットフォームを形成して、転写の活性化又は抑制を可能とする。最近、複数のエピジェネティックな要因が、ＲＧＣの生存と緑内障の発症に重要な役割を果たしていることを示唆しているいくつかの報告がなされている。視神経挫滅によるＲＧＣ損傷は、ヒストンの脱アセチル化の主要なプレーヤーであるヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の活性の変化をもたらし、トリコスタチンＡによる網膜ＨＤＡＣ活性の阻害は、代表的なＲＧＣ特異的遺伝子の発現を維持し、視神経損傷に続く細胞の損失を減衰できる（非特許文献１）。また、他の代表的なＨＤＡＣ阻害剤であるバルプロ酸は、神経保護効果を示し、転写因子ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答要素結合タンパク質）の活性を調節することにより視神経挫滅後の軸索再生をもたらす（非特許文献２）。また、網膜神経節細胞でのＨｄａｃ３の遺伝子除去は、視神経損傷後の急性期に核萎縮の特性の大幅な改善とＲＧＣ死の有意な抑制をもたらす（非特許文献３）。
　リジン特異的デメチラーゼ１（ＬＳＤ１）は、フラビン含有アミンオキシダーゼファミリーの一つとして知られており、ヒストンＨ３のモノメチル化及びジメチル化リジン４からメチル基を除去することによって転写を抑制することが知られている。
　ＬＳＤ１は、細胞増殖、生存促進、神経突起の形態形成、及び神経分化と発達への影響を持っていることが既に報告されている（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。さらに、ＬＳＤ１の阻害剤であるトラニルシプロミンは、マウス脳の神経幹細胞の増殖及びゼブラフィッシュ側線感丘の発達を調節していることが報告されている（非特許文献４；非特許文献８）。しかしながら、トラニルシプロミンの哺乳動物の中枢神経細胞(網膜神経細胞を含む)における細胞生存/細胞死の調節に関する作用については報告がない。
　トラニルシプロミンは、ＬＳＤ１及びＭＡＯを阻害する強力なデュアルアクション剤であることが報告されている。ＭＡＯは、食物のアミン、及びモノアミン神経伝達物質の酸化的脱アミノ化を触媒し、３，４－ジヒドロキシフェニルグリコールアルデヒド（ＤＯＰＥＧＡＬ）又は過酸化水素を含むＭＡＯ－関連反応の副産物を生産する。これらの潜在的な神経毒性代謝産物は神経細胞のアポトーシスを引き起こし、パーキンソン病やアルツハイマー病などの神経変性疾患の原因の一つと考えられている。それ故、ＭＡＯの不活性化は、インビトロばかりでなくインビボにおいても、神経細胞を保護するための優れた戦略の一つと考えられている。事実、Ｌ－デプレニル（セレギリン（登録商標））を含むＭＡＯ阻害剤の開発が、パーキンソン病、治療抵抗性うつ病、不安障害、及びアルツハイマー病などのヒト神経精神疾患のための新規な薬物療法として報告されている。
　ＥＲＫ１／２、ＪＮＫ及びｐ３８を含むマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）は、神経細胞及び非神経細胞における、生存、増殖及び分化に関与する分子として知られている（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。最近、虚血／再灌流ラット網膜障害モデルを用いて、ｐ３８ＭＡＰＫの阻害が、活性化Ｂ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー（ＮＦ－κＢ）ｐ６５とのクロストークを介した神経保護の役割を示していることが報告された（非特許文献１２）。ｐ３８ＭＡＰＫファミリーは、４つの主要なアイソフォーム、ｐ３８α、ｐ３８β、Ｐ３８γ及びｐ３８δからなり、それらは独立した遺伝子によってコードされ、アイソフォーム特異的な機能だけでなく、ｐ３８アイソフォームのうちで機能的冗長性があるかもしれないと考えられている（非特許文献１３）。中枢神経系の細胞では、ｐ３８αＭＡＰＫアイソフォームは、ｐ３８βのアイソフォームより、ストレス誘発性の前炎症性サイトカインの産生と神経毒性においてより重要な寄与をしているという複数の報告がある（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。しかし、神経細胞におけるｐ３８アイソフォームの他のタイプの役割は、全く不明のままであった。そして、ｐ３８αアイソフォームはニューロンの死を引き起こすということが報告されている（非特許文献１７）。
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　本発明は、神経変性疾患治療剤を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は神経保護治療剤を提供することを目的とする。例えば、神経変性疾患の一つとして眼の神経変性疾患に対する新たな治療剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究した結果、ＬＳＤ１阻害剤であるトラニルシプロミンが眼の神経保護効果を示すことを見いだし、本発明を完成した。
　本発明者らはさらに、トラニルシプロミンが仲介するＲＧＣ保護に関わる分子標的がｐ３８ＭＡＰＫγ及び／又はｐ３８ＭＡＰＫδであることを見いだしさらなる発明を完成した。
　本発明は、以下のものを含む。
［１］リジン特異的デメチラーゼ１（ＬＳＤ１）活性を阻害する物質を有効成分として含む神経変性疾患の予防剤又は治療剤。
［２］前記神経変性疾患が、視神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、及び多発性硬化症からなる群より選ばれる神経変性疾患である上記［１］に記載の神経変性疾患の予防剤又は治療剤。
［３］前記神経変性疾患が視神経変性疾患である上記［２］に記載の神経変性疾患の予防剤又は治療剤。
［４］前記視神経変性疾患が、緑内障に伴う視神経障害、虚血性視神経症、外傷性視神経症、又は、レーベル遺伝性視神経症である上記［３］に記載の神経変性疾患の予防剤又は治療剤。
［５］前記視神経障害が網膜神経細胞の障害である上記［４］に記載の神経変性疾患の予防剤又は治療剤。
［６］前記物質が、下記の化合物群：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 から選ばれる少なくとも一つの化合物である上記［１］～［５］のいずれか一つに記載の神経変性疾患の予防剤又は治療剤。
［７］前記物質が、トラニルシプロミン又はＳ２１０１である上記［６］に記載の神経変性疾患の予防剤又は治療剤。
［８］前記物質が、ＬＳＤ１のｓｉＲＮＡである上記［１］～［５］のいずれか一つに記載の神経変性疾患の予防剤又は治療剤。
［９］眼局所注入剤である上記［３］～［８］のいずれか一つに記載の神経変性疾患の予防剤又は治療剤。
［１０］点眼剤である、上記［３］～［７］のいずれか一つに記載の神経変性疾患の予防剤又は治療剤。
［１１］リジン特異的デメチラーゼ１（ＬＳＤ１）活性を阻害する物質を有効成分として含む神経保護治療剤。
［１２］網膜神経細胞の保護剤である、上記［１１］に記載の神経保護治療剤。
［１３］リジン特異的デメチラーゼ１（ＬＳＤ１）活性を阻害する物質を有効成分として含む網膜神経細胞死の抑制剤。
　本発明は、新たな神経変性疾患治療剤、特には、神経保護治療剤を提供するものである。本発明はまた、神経変性疾患の一つとして眼の神経変性疾患に対する新たな治療剤を提供するものである。
図１は、グルタミン酸神経毒性及び酸化ストレスによって誘導されるアポトーシスに対するトラニルシプロミンの減衰効果を示している。トラニルシプロミン（ＴＣ）有無の条件での、グルタミン酸（Ｇｌｕ）誘発ストレス又は酸化（Ｈ２Ｏ２）ストレスの２４時間後に、断片化又は凝集した核をヘキスト染色により検出した結果を示している。ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液）は、対照（ストレスなし）を表している。図Ａ及び図Ｂは、Ｇｌｕ刺激後の、ＲＧＣの写真画像（上図）及び蛍光画像（下図）を示している。矢印で示されるように、ＴＣなしでのグルタミン酸刺激に比べて、ＴＣは、グルタミン酸誘発アポトーシスを有意に抑制した。スケールバーは、５０μｍである。図Ｃは、グルタミン酸刺激同様に、ＴＣが、酸化ストレスにおいても有意にＲＧＣ生存を促進した結果である。データは、平均±標準誤差を示している。ターキー・クレーマーテスト（ｎ＝６－９）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。ｎ．ｓ．：有意差なし。 図２は、ＬＳＤ１阻害により、アポトーシスからのＲＧＣの保護効果を確認した結果である。図Ａはウエスタンブロット分析の結果であり、図Ｂはバンドの密度比を相対比で表した結果である。ＬＳＤ１特異的ｓｉＲＮＡは有意にＬＳＤ１の発現を抑制したことが判る。スチューデントのｔ検定の結果である（各群ｎ＝４）。＊＊Ｐ＜０．０１。図Ｃは、ＬＳＤ１ ｓｉＲＮＡによる、グルタミン酸（Ｇｌｕ）負荷アポトーシスに対する効果を確認した結果を示している。ＨＢＳＳは対照（Ｇｌｕ（－），Ｓ２１０１（－））を、ＣｏｎｔｒｏｌはＧｌｕのみを表している。ＬＳＤ１ ｓｉＲＮＡは、有意にアポトーシスを抑制した。図Ｄは、ＬＳＤ１阻害剤Ｓ２１０１によるグルタミン酸（Ｇｌｕ）誘発アポトーシスに対する効果を確認した結果である。ＨＢＳＳは対照を表している。Ｓ２１０１は有意な抑制効果を示している。（Ｃ）及び（Ｄ）のデータは、平均±標準誤差を表す。ターキー・クレーマーの検定の結果である（各群ｎ＝４－６）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 図３は、グルタミン酸（Ｇｌｕ）ストレス下でのトラニルシプロミン（ＴＣ）によるｐ３８ＭＡＰＫγの発現促進を確認した結果である。図３Ａ、Ｂ及びＣは、グルタミン酸によるＡｋｔのリン酸化を確認したウエスタンブロット分析及びデンシトメトリー評価の結果である。図３Ｄ～Ｇは、グルタミン酸によるｐ３８ＭＡＰＫの発現とそのリン酸化、及びｐ３８ＭＡＰＫγの発現を確認したウエスタンブロット分析及びデンシトメトリー評価の結果である。ＨＢＳＳは対照を表している。グルタミン酸は、Ａｋｔの発現には効果がなかった。また、トラニルシプロミンは、Ａｋｔの発現及びＡｋｔのリン酸化に影響がなかった。また、グルタミン酸は全ｐ３８ＭＡＰＫの発現及びそのリン酸化状態に影響を及ぼさなかった。トラニルシプロミンは、全ｐ３８ＭＡＰＫの発現及びそのリン酸化に影響を与えなかった。しかし、トラニルシプロミンは、ｐ３８ＭＡＰＫγの発現を有意に促進した。データは、平均±標準誤差を示している。ターキー・クレーマーテスト（ｎ＝５－７）。＊ｐ＜０．０５。ｎ．ｓ．：有意差なし。 図４は、トラニルシプロミンのｐ３８ＭＡＰＫγ活性を介したＲＧＣの生存への寄与を確認した結果である。ＲＧＣのアポトーシスを核の形態変化により評価した。図４Ａは、ウォルトマニンの効果を確認した結果である。図４Ｂは、ＢＩＲＢ７９６及びＳＢ２０３５８０の効果を確認した結果である。データは、平均±標準誤差を表す。スチューデント検定（各グループ、ｎ＝４）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。ｎ．ｓ．：有意差なし。 図５は、硝子体内へのトラニルシプロミン投与によるＮＭＤＡ誘導ストレスからの網膜保護を形態学的に確認した結果である。図５Ａは、ＰＢＳ処理（対照）及びＮＭＤＡストレス状態におけるトラニルシプロミン処理後の網膜切片標本の光学顕微鏡画像である。ＧＣＬ：神経節細胞層、ＩＰＬ：内網状層、ＩＮＬ：内顆粒層、ＯＮＬ：外顆粒層である。スケールバー＝５０μｍ。図５Ｂは、ＩＰＬ（内網状層）の厚さを示している。データは、平均±標準誤差を示している。ターキー・クレーマーテスト（ｎ＝５－６）。＊＊ｐ＜０．０１。ｎ．ｓ．：有意差なし。 図６は、ＮＭＤＡ誘発性損傷後の網膜におけるカスパーゼ３活性をトラニルシプロミンが抑制するか否かを確認した結果である。図６Ａ及びＢは、トラニルシプロミンによる、切断されたカスパーゼ３のアポトーシスシグナルの有意な阻害効果をウエスタンブロット分析及びデンシトメトリー評価で確認した結果である。データは、平均±標準誤差を示している。ターキー・クレーマーテスト（ｎ＝４）。＊＊ｐ＜０．０１。ｎ．ｓ．：有意差なし。 図７は、インビボでの、ＮＭＤＡ誘導性アポトーシスに対するトラニルシプロミン（ＴＣ）の神経保護効果を確認した結果である。網膜神経節細胞（ＲＧＣ）のフルオロゴールドによる逆行性標識を行った。図７Ａは、ＮＭＤＡの硝子体内投与の有無、及びＴＣの投与の有無の４つの条件でのそれぞれのフラットマウント標本である。ＮＭＤＡ硝子体内への注射後に著しいＲＧＣ喪失が確認でき（ＮＭＤＡ（＋）／ＴＣ（－））、ＲＧＣがトラニルシプロミン処理により保存されていることが示されている（ＮＭＤＡ（＋）／ＴＣ（＋））。スケールバーは、５０μｍである。図７Ｂ及びＣは、実際のＲＧＣの数を示している（中間領域の網膜（Ｂ）、周辺網膜（Ｃ））。ＮＭＤＡ投与の中間領域の網膜（Ｂ）及び周辺網膜（Ｃ）で、ＴＣ投与群はＴＣ非投与群に比べて統計的に大きい数を示している。データは、平均±標準誤差を示している。ターキー・クレーマーテスト（ｎ＝６－９）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。ｎ．ｓ．：有意差なし。
　以下、本発明を、例示的な実施態様を例として、本発明の実施において使用することができる好ましい方法および材料とともに説明する。
　なお、文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。また、本明細書に記載されたものと同等または同様の任意の材料および方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。
　また、本明細書に記載された発明に関連して本明細書中で引用されるすべての刊行物および特許は、例えば、本発明で使用できる方法や材料その他を示すものとして、本明細書の一部を構成するものである。
　ヒストンのアセチル化／脱アセチル化活性とニューロン生存の間の関係は、近年研究されてきた一方で、緑内障などの眼の神経変性疾患におけるヒストンメチル化の役割は解明されないままである。そこで本発明者らは、フラビン依存酸化反応によってＨ３Ｋ４またはＨ３Ｋ９を脱メチル化し、一般に転写抑制を誘導する、リジン特異的デメチラーゼ１（ＬＳＤ１）の機能に注目した。
　そして、本発明者らは、ＲＧＣ死におけるＬＳＤ１活性の重要性を見いだすとともに、ＬＳＤ１阻害剤の一つであるトラニルシプロミンの神経保護効果を見いだした。さらに本発明者らは、トラニルシプロミンが仲介するＲＧＣ保護に関わる分子標的を明らかにし、ＬＳＤ１が神経細胞の生存の重要な調節因子であり、そして神経変性疾患の治療のための新たな分子標的であることを見いだした。
　本発明は、ＬＳＤ１活性を阻害する物質を有効成分として含む神経変性疾患の予防剤又は治療剤に関する。
　本発明において、ＬＳＤ１活性を阻害するとは、酵素であるＬＳＤ１の酵素活性を阻害すること、ＬＳＤ１自体の発現を抑制することにより細胞内でのＬＳＤ１活性の発現を阻害すること、のいずれも含む意味である。
　酵素であるＬＳＤ１の酵素活性を阻害する物質としては、これに限定されないが、例えば、トラニルシプロミン（２－ＰＣＰＡ）、２－ＰＦＰＡ、Ｓ２１０１、Ｓ１３１０、Ｓ１４０１、Ｓ１４０２、Ｓ１５０２、Ｓ１６０１、Ｓ１６０２、Ｓ１６０３、Ｓ２１０１、Ｓ２１０７、Ｓ２１１１、Ｓ２２０６をあげることができ、好ましくはトラニルシプロミン及びＳ２１０１、特に好ましくはトラニルシプロミンである。これらの化合物の構造式を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 　また、これらの化合物のＬＳＤ１阻害のＩＣ50を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　トラニルシプロミンは、下記の構造をもつＬＳＤ１阻害剤であるが、モノアミンオキシダーゼ阻害活性に基づき抗うつ剤として欧米で認可されている医薬品である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 　トラニルシプロミンは、光学異性体として、（１Ｒ，２Ｓ）トラニルシプロミン及び（１Ｓ，２Ｒ）トラニルシプロミンが存在し、本発明においては、ＬＳＤ１阻害活性をもつ限りは、いずれの光学異性体、或いはそれらの混合物であってもよい。また、薬理学的に許容できる塩の形で用いてもよい。
　Ｓ２１０１は、下記の構造をもつＬＳＤ１阻害剤である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　Ｓ２１０１は光学異性体が存在するが、本発明においては、ＬＳＤ１阻害活性をもつ限りは、いずれの光学異性体、或いはそれらの混合物であってもよい。
　ＬＳＤ１自体の発現を抑制することにより細胞内でのＬＳＤ１活性の発現を阻害する物質としては、ＬＳＤ１のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等をあげることができ、常法に従い、それらの遺伝子を細胞内に導入し、細胞のＬＳＤ１遺伝子をノックダウンすることにより、ＬＳＤ１自体の発現を抑制しＬＳＤ１活性の発現を阻害することができる。ＬＳＤ１特異的なｓｉＲＮＡは、公知の情報に基づき設計して常法に従い合成することも可能であり、また、市販されておりそれを用いることもできる。
　本発明の予防剤又は治療剤が対象とする神経変性疾患は、これに限定されないが、例えば、視神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、及び多発性硬化症をあげることができ、好ましくは、視神経変性疾患である。また、本発明が対象とする視神経変性疾患としては、緑内障に伴う視神経障害、虚血性視神経症、外傷性視神経症、レーベル遺伝性視神経症をあげることができ、好ましくは、緑内障に伴う視神経障害である。
　本発明の予防剤又は治療剤の対象疾患としては、特に好ましくは、網膜神経細胞の障害に基づく疾患であり、例えば、網膜神経節細胞死に起因する疾患である。
　また、本発明の予防剤又は治療剤を緑内障に基づく神経変性疾患に用いる場合は、他の緑内障の治療剤や治療方法と併用して用いることもできる。例えば、眼圧下降治療剤との併用、眼圧を下げる治療方法との併用療法をあげることができる。
　本発明の予防剤又は治療剤が化合物である場合、化合物の投与は、経口及び非経口のいずれで行うこともできる。投与剤型としては、これに限定されないが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、注射剤、懸濁剤、点眼剤、眼軟膏剤、徐放性眼内インプラント等をあげあることができる。製剤化は、当該分野において汎用されている技術を用いて行うことができる。対象疾患が視神経変性疾患の場合は、好ましくは眼内注入剤あるいは点眼剤である。
　本発明の予防剤又は治療剤が化合物である場合、化合物の投与量は、疾患の種類、投与対象の症状、年齢、投与方法等により適宜選択される。例えば、これに限定されないが、経口剤であれば、通常、１日当たり０．１～５０００ｍｇ、好ましくは１～２０００ｍｇ、より好ましくは５～１０００ｍｇを、１回又は数回に分けて投与すればよい、点眼剤である場合は、０．０１～５％の、好ましくは０．０５～１％の溶液を、１日当たり、数回、点眼すればよい。眼局所注入（硝子体内注射）剤の場合は、例えば、生理食塩水に溶解させた薬物を、１回当たり、０．１ｍｇ～１５０ｍｇ、好ましくは１ｍｇ～１００ｍｇ、更に好ましくは１０ｍｇ～５０ｍｇを症状に応じて、眼内、好ましくは硝子体内に注射すればよい。なお、注射剤の調製は、常法に基づいて行うことができる。
　本発明の予防剤又は治療剤がｓｉＲＮＡ等の遺伝子である場合は、遺伝子の投与は、注射により行うことができる。例えば、これに限定されないが、緑内障の治療においては、例えばｓｉＲＮＡを、眼の硝子体内に直接又は間接的に投与することにより行うことができる。
　本発明の他の好ましい態様は、リジン特異的デメチラーゼ１（ＬＳＤ１）活性を阻害する物質を有効成分として含む、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の損失を防ぐ及び／又は回復することによる眼の神経変性疾患の予防及び／又は治療薬である。
　これにより、上昇した眼圧を下げることを目的とした治療薬や治療方法では十分な効果が期待できない、緑内障患者において見られるＲＧＣの障害を予防及び／又は治療できる。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
１．材料及び方法
（１）試薬および動物。
　トラニルシプロミンはまた、２-フェニルシクロプロピルアミンとして知られている。トラニルシプロミンは、Sigma-Aldrich社から購入した。Ｓ２１０１（ＬＳＤ１阻害剤ＩＩ、４８９４７７としても知られている）はMerck Milliporeから入手した。九動から入手した、二日齢のスプラーグドーリー（ＳＤ）ラットをＲＧＣの単離のために使用した。実験手順は、 Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO)の Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research に従って行った。全ての実験手順は、熊本大学の動物実験委員会によって承認されたものである。
（２）網膜神経節細胞の初代培養
　初代ＲＧＣは、Barresらの二段階イムノパニング法（Barresら, (1988) Neuron, 1, 791-803）に若干の変更を加えた方法を用いて単離した（Hayashiら, (2007) Journal of neuroscience, 27, 1933-1941.；Hayashiら, (2009) Journal of Biological Chemistry, 284, 29605-29613.；Hayashiら, (2012) Journal of Biological Chemistry, 287, 25395-25406）。簡単に説明すると、網膜をパパイン（１６．５単位／ｍｌ）で消化し、ウサギ抗ラットマクロファージ抗血清（Accurate Chemical）とともに細胞分離した。細胞懸濁液をまず、ヤギ抗ウサギＩｇＧでコーティングされたパンニングプレート（１５０ ｍｍのペトリ皿）上でインキュベートした。非接着細胞は、ヤギ抗マウスＩｇＭμ及びとＴ１１Ｄ７ｅ２細胞から分泌されたマウス抗Ｔｈｙ１．１抗体でコーティングされた第二のパンニングプレート（１００ ｍｍのペトリ皿）上でインキュベートした。プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、付着したＲＧＣを、０．１２５％トリプシンで処理することにより遊離させた。
　単離されたＲＧＣを、１ｍＭのグルタミン、５μｇ／ｍｌのインスリン、６０μｇ／ｍｌのＮ－アセチルシステイン、６２ｎｇ／ｍｌのプロゲステロン、１６μｇ／ｍｌのプトレシン、４０ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム、０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、４０ｎｇ／ｍｌのトリヨードチロニン、０．１ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２％のＢ－２７サプリメント（#17504-044、Invitrogen社）、１０μＭのフォルスコリン、５０ｎｇ／ｍｌの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（PeproTech）、５０ｎｇ／ｍｌの毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）（PeproTech）、及び５０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（PeproTech）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地に懸濁した。培養プレート（９６ウェル）を、ポリ－Ｄ－リジン（Sigma-Aldrich）及びラミニン（Sigma-Aldrich）でコーティングした。ＲＧＣを、５，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播き、実験に供する前、少なくとも１０日間培養した。
（３）免疫ブロッティング
　免疫ブロッティングは、上記Hayashiらの方法に従って行った。タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、一次及びペルオキシダーゼ結合二次抗体で検出した。免疫反応性タンパク質をSuperSignal West Pico, Dura 又は Femoto（Thermo Fisher Scientific）で可視化した。一次抗体は以下のものを使用した：マウス抗βアクチン（#A5441、Sigma-Aldrich)、ウサギ抗ＬＳＤ１（Ｃ６９Ｇ１２）（#2184、Cell Signaling Technology）、ウサギ抗リン酸化－ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）（Ｄ３Ｆ９）（#4511、Cell Signaling Technology）、ウサギ抗ｐ３８ＭＡＰＫ（#9212、Cell Signaling Technology）、ウサギ抗リン酸化ＳＡＰＫ３（Ｔｈｒ１８３＋Ｔｙｒ１８５）（#bs-12001R、Bioss）、ウサギ抗ｐ３８γＭＡＰＫ（#2307、Cell Signaling Technology）、ウサギ抗リン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）（#9271、Cell Signaling Technology）、ウサギ抗Ａｋｔ（#9272、Cell Signaling Technology）、及びウサギ抗切断Ｃａｓｐａｓｅ３（Ａｓｐ１７５）（#9661、Cell Signaling Technology）。
（４）網膜神経節細胞のアポトーシス
　ＲＧＣのアポトーシスの評価は、前述のHayashiら（2012）の記載に従って行った。初代培養ＲＧＣを、２．４ｍＭのＣａＣｌ2、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（マグネシウムなし）を含有するハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、Invitrogen）で２回（３７℃で１５分間のインキュベーション）洗浄した。マグネシウムは、ＮＭＤＡ受容体を遮断することを避けるために、洗浄溶液から除いた。続いて、ＲＧＣは、２．４ｍＭのＣａＣｌ2、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（マグネシウムなし）を含有するＨＢＳＳ中で、ＮＭＤＡ受容体の活性化補助因子である、３００μＭのグルタミン酸及び１０μＭのグリシンとともに、３７℃で２時間培養した。グルタミン酸処理後、ＲＧＣは、フォルスコリン、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ及びｂＦＧＦなどの神経栄養因子なしで、同じ培地中で、３７℃で２２時間培養した。アポトーシスはまた、「B27 Supplement AO depleted of antioxidant」（Invitrogen）を含有する栄養添加剤と５０μＭの過酸化水素を添加し０．５時間おくことにより誘導し、そして、細胞を２４時間培養した。トラニルシプロミンは、グルタミン酸又は過酸化水素の添加と同時に添加し、一方、Ｓ２１０１（#489477、Merck Millipore）、ＢＩＲＢ７９６（#S1574、Selleck Chemical）、ＳＢ２０３５８０（#199-16551、Wako）は、アポトーシス誘導の２４時間前に添加し、処理したＲＧＣをアポトーシス検出のために２４時間インキュベートした。
　ヘキスト３３３４２（同仁化学）を用いたアポトーシスの検出は、ＲＧＣを１５分間、１．０ｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２とインキュベートして行った。蛍光画像は、ＩＸ７１蛍光顕微鏡（オリンパス）を用いて観察し、９６ウェルプレートを使用して、少なくとも６つの画像／ウェルを得た。前述したHayashiら（2007, 2012, 2009）に従い、ヘキスト染料で染色した断片化又は縮小核は、アポトーシスを起こしたニューロンとしてカウントし、丸い／スムーズな核は、健康なニューロンとしてカウントした。測定バイアスを最少化するために、ソフトウェアのMetaMorph（Molecular Devices）を使用して、各条件について２００以上のニューロンを自動計測した。
（５）ＬＳＤ１ ＲＮＡのサイレンシング
　非サイレンシング低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（１μＭ）（Accell non-targeting siRNA#1、Thermo Fisher Scientific）又はＬＳＤ１の特異的ｓｉＲＮＡ（E-105863-00-0010、Accell Rat Kdm1a [Gene ID:500569] siRNA SMARTpool、Thermo Fisher Scientific）を、製造業者の指示に従って培地に添加し、６日間、ＲＧＣとともにインキュベートとした。ＬＳＤ１ ｓｉＲＮＡによるノックダウン効果は、免疫ブロティング法を用いて確認した。
（６）遺伝子発現マイクロアレイ
　製造業者の指示に従って、全ＲＮＡを増幅し、標識し、そしてRat GE 4x44K v3 Microarray Kit（Agilent Technologies）にハイブリダイズさせた。すべてのハイブリダイズしたマイクロアレイは、Agilentスキャナーでスキャンし、すべてのプローブのシグナルは、Feature Extraction Software（Agilent Technologies）を用いて計算した。
　Agilentが推奨する手順を使用して、各プローブの生のシグナル強度とフラグをハイブリダイゼーション強度、及びスポット情報から算出した。対照と実験試料間の比較を行い、アップレギュレートされた遺伝子及びダウンレギュレートされた遺伝子を同定するために、少なくとも１つのサンプル中にＰフラグを登録したプローブを選択し、強度ベースのＺスコア及び各プローブの正規化された信号強度から比（非ログスケールの倍率変化）を計算した。Ｚスコアが２．０以下で比が１．５倍以上をアップレギュレートされた遺伝子、Ｚスコアが－２．０以下で比が０．６６以下をダウンレギュレートされた遺伝子とした。
結果は、「コントロール」対「グルタミン酸刺激」、及び「グルタミン酸刺激」対「グルタミン酸刺激＋トラニルシプロミン」とした。パスウェイの優位な上昇（向上）を決定するために、 Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp)（Huangら,(2009) Nucleic Acids Research, 37, 1-13）及び Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) （Kanehisaら (2000) Nucleic Acids Research, 28, 27-30.）のパスウェイアノテーション解析を行った。
（７）インビボでのＮＭＤＡ誘発網膜損傷
　ＮＭＤＡの硝子体内注射を、Inomata（Inomataら, (2006) Journal of Neurochemistry, 98, 372-385）の報告と同じ様式で行った。簡単に述べると、ラットに、キシラジン塩酸塩（４ｍｇ／ｋｇ）と塩酸ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）の１：１の混合物を腹腔内注射し麻酔した。瞳孔を塩酸フェニレフリン及びトロピカミドの点眼で拡張し、２０ナノモルのＮＭＤＡを硝子体腔に注入した。注射は、マイクロシリンジに接続した３３ゲージ針を用いて顕微鏡下で実施した、針は、角膜輪部の後ろ約１．０ｍｍに挿入した。トラニルシプロミンは、ＮＭＤＡ投与と同時にＳＤラットに注射した。５００ｍＭトラニルシプロミン溶液又はコントロールとしてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に、ＮＭＤＡを混合して総体積を２．０μＬとし、硝子体腔に注入した。
（８）インビボでの形態学的分析
　保護効果を評価するための形態学的分析を報告（Inomataら, (2003) Brain Research, 991, 163-170）に従って行った。簡単に説明すると、ＮＭＤＡ注射の７日後、動物を二酸化炭素窒息により安楽死させ、眼を摘出した。眼は、４℃で一晩、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、次いで、脱水およびパラフィン包埋を行った。視神経乳頭をもったラットの眼から４μｍの厚さの横断切片を作成して、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し、形態学的分析を行った。視神経乳頭から１．０～１．５ｍｍにて、内網状層（ＩＰＬ）の厚さを測定した。顕微鏡ＢＸ５１（オリンパス）を用いて、三つの切片の最小値のデータを平均して、それぞれの眼の数値とした。
（９）インビボでのカスパーゼ３の発現レベル
　切断されたカスパーゼ３の活性は、ウエスタンブロット分析により評価した。簡単に説明すると、ＮＭＤＡ注射の７日後に網膜を取り除き、直ちに、５０ｍＭのトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ、ｐＨ７．０～７．６）、０．１％のデオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ及び１％のトリトンＸ－１００を含有する溶解緩衝液にて、Complete protease inhibitor cocktail（#11836153001、Roche）と共にホモジナイズした。標準的な免疫ブロットを上記（３）のようにして行った。
（１０）生存したＲＧＣの検出のための逆行性ラベリング
　トラニルシプロミンがＲＧＣの生存を制御しているか否かを評価するために、ＮＭＤＡ注射の３日後に、既報（Wangら, (2013) JAMA Ophthalmology, 131, 194-204；Chiuら, (2008) Journal of Visualized Experiments : JoVE.16. doi: 10.3791/819.）と同様の方法で、フルオロゴールド（ＦＧ）でＲＧＣの逆行性標識化を行った。簡単に説明すると、ラットにキシラジン塩酸塩（４ｍｇ／ｋｇ）と塩酸ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）の１：１の混合物を腹腔内注射して深く麻酔した後、その頭の毛を剃って、皮膚を正中線で切開し、頭蓋骨と縫合線（矢状、冠状及び横方向の縫合線）を露出させた。双方の２ｍｍ直径の開頭術を矢状縫合及び横断縫合の線の後側部の０．５ミリメートルに施した。次いで、上丘の上の脳物質を慎重に真空ポンプで除去した。上丘の表面上の各穴にて、滅菌スポンジの小片を６％のＦＧ液６μＬに予備浸漬した。皮膚の傷をその後縫合し閉じた。手術後、ラットを保温し、自身で回復させた。ＮＭＤＡ注射の７日後、動物を安楽死させ、血液をフラッシュするためにＰＢＳで心臓内灌流した。ＰＢＳ洗浄灌漑後に、４％のパラホルムアルデヒドで灌流を行った。灌流固定した後、眼を摘出した。眼は、４℃で一晩、４％のパラホルムアルデヒドで固定した。網膜を強膜から除去し、４象限（優れた、劣った、鼻、及び時間的）に分割し、スライド上にマウントした。各象限は、視神経経頭から１．０、２．０、３．０ｍｍである３つの領域（中心、中間、周辺）に細分した。網膜あたり全部で１２野を、マスクされた様式で、オールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ７１０（Keyence）を用いて、ＦＧ標識したＲＧＣの数をカウントすることによって分析した。
（１１）統計分析
　データは、平均±標準誤差として示す。統計分析は、ターキー・クレイマー検定及びスチューデントのｔ検定により行った。マイクロアレイ実験では、フィッシャーの正確検定（ＥＡＳＥスコアとして変更）を行った。すべてのデータ分析は、ＪＭＰ ver. 8.0 ソフトウエア（SAS Institute Inc.）用いて行い、９５％の信頼水準を有意（ｐ＜０．０５）とみなした。
２．実験結果
（実施例１）トラニルシプロミンの神経保護効果の確認
　グルタミン酸は、主要な興奮性神経伝達物質として作用し、また、脳虚血又は外傷、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病及び緑内障を含む中枢神経系疾患における神経毒として作用する。グルタミン酸は、グリシンの存在下でラットのＲＧＣのアポトーシスを誘導し、そして、ＮＭＤＡ受容体とカスパーゼ依存性アポトーシスを介して神経毒性を誘発する。グルタミン酸誘発ストレスがない場合は、ＲＧＣの９０％以上が生き残った。一方、ヘキスト染色により、２時間グルタミン酸負荷をしたＲＧＣの３２．６パーセントがアポトーシスの形態学的マーカーである収縮または断片化の核を含んでいることが明らかになった。しかし、トラニルシプロミン（添加量：１００μＭ）は、グルタミン酸誘導性神経細胞死からＲＧＣを有意に保護した（図１Ａおよび図１Ｂ）。
　他の仲介機序によって誘発される神経細胞死をトラニルシプロミンによって防ぐことができるかどうかを確認するために、ＲＧＣを、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２、５０μＭ）の酸化ストレスに０．５時間曝した。培地中の抗酸化物質含有量を最少化するために、他の実験で用いられている標準的なＢ２７サプリメントではなく、抗酸化物質を除いたＢ２７サプリメント（#10889、Invitrogen）を用いた。ニューロンの生存は、いずれのＢ２７サプリメント組成を用いた場合でも同様であった（＞９０％）。ＲＧＣを０．５時間Ｈ２Ｏ２に曝露することにより、ＲＧＣの５１．４パーセントは、アポトーシス核を示した。トラニルシプロミン（添加量：１００μＭ）は、神経細胞死を１８．６％にまで著しく減衰した（図１Ｃ）。したがって、トラニルシプロミンは、グルタミン酸の神経毒性によって誘発されるアポトーシスだけではなく、酸化ストレスに起因するアポトーシスからも、ＲＧＣを保護することが示された。
（実施例２）Ｌｓｄ１阻害による、ＲＧＣのアポトーシスからの保護
　トラニルシプロミンは、Ｌｓｄ１阻害剤及びモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）阻害という二重の分子効果を持っている。モノアミンオキシダーゼ阻害活性は、抗アポトーシス及び神経保護活性に関係する可能性がある。そこで、トラニルシプロミンが、抗Ｌｓｄ１効果を介して神経保護作用を示すかどうかを次に確認した。まず、ＬＳＤ１をノックダウンした後、ニューロンの生存を確認し、ノックダウン効果を検証した。免疫ブロッティングの結果は、Ｌｓｄ１（Ｋｄｍ１ａ）特異的ｓｉＲＮＡが、非サイレンシングｓｉＲＮＡコントロールと比較して、Ｌｓｄ１の発現を３０．４パーセントにまで著しく抑制していることを示した（図２Ａおよび図２Ｂ）。続いて、グルタミン酸刺激による神経ストレス後のＬｓｄ１ノックダウンＲＧＣのアポトーシス率を評価した。非サイレンシングｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたコントロールのＲＧＣでは、３０．１％のＲＧＣがグルタミン酸誘導性アポトーシスを受けた。しかしながら、アポトーシスのＲＧＣは、Ｌｓｄ１特異的ｓｉＲＮＡを用いて有意に減少した（図２Ｃ）。同様に、ＬＳＤ１阻害剤であるＳ２１０１は、グルタミン酸誘導性ストレスに対する細胞の生存を促進した（図２Ｄ）。Ｓ２１０１は、トラニルシプロミンと構造的に関連しており、トラニルシプロミンに比べＭＡＯに対して著しく小さい効果にもかかわらず、ＬＳＤ１とより高い強力な親和性を有する。このことから、ＬＳＤ１活性の抑制は、アポトーシスストレスからの神経保護に寄与することがわかった。すなわち、トラニルシプロミンによるＬＳＤ１阻害が、グルタミン酸又は酸化ストレスにより誘導される神経細胞死を抑制できることが確認された。
（実施例３）トラニルシプロミン投与による網膜神経節細胞の生存における標的の経路と遺伝子の解析
　トラニルシプロミンの神経保護効果に関与するシグナル伝達経路を調べた。トラニルシプロミンによるＲＧＣの遺伝子発現の変化を同定するために、２６，９３０の遺伝子発現の変化を含むマイクロアレイ解析を行った。ＬＳＤ１は、ヒストンＨ３のリジン４の脱メチル化反応を介して遺伝子転写を抑制することが既報で示されているので、本発明者らは、トラニルシプロミンによって発現が増幅され、同時にグルタミン酸投与によって発現が減少する遺伝子が、ニューロンの生存能力を調節する遺伝子標的を同定するための優れた候補であるとの仮説を立てた。Ｚスコアと比を用いたマイクロアレイデータから、これらの基準を満たした１１０の遺伝子を見つけた。また、Database for annotation, Visualization and Integrated Discovery（ＤＡＶＩＤ）を用いてＫＥＧＧ経路アノテーション解析を行った。１１０の遺伝子候補に関連付けられた機能分類について、エンリッチされた３つのＫＥＧＧ経路タームが有意に検出された。これらは、ｆｃガンマＲ媒介食作用、ニューロトロフィンシグナル伝達経路、及びプリン代謝に含まれていた（表２に示す）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　発現プロファイルの詳細を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
（実施例４）トラニルシプロミンによるｐ３８ＭＡＰＫγ活性を介してのＲＧＣの生存の強化
　次に、ニューロトロフィンシグナル伝達分子である、ｖ－ａｋｔマウス胸腺腫ウイルス癌遺伝子ホモログ１（Ａｋｔ）及びマイトジェン活性化プロテインキナーゼ１２（Ｐ３８ ＭＡＰＫγ）に注目した。なぜなら、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路及びＭＡＰキナーゼ経路は、細胞の生存及び抗アポトーシス活性のための主要なシグナル伝達経路としてよく知られていたためである。
　ＲＧＣ生存における２つの候補経路の活性の変化を調べた。Ａｋｔ及びｐ３８ＭＡＰＫの発現及びリン酸化状態をウエスタンブロット分析により評価した。Ａｋｔの発現及び活性を確認した結果を図３Ａ－Ｃに示す。グルタミン酸は、Ａｋｔの発現には効果がなかった。また、トラニルシプロミン（ＴＣ）（添加量：１００μＭ）は、Ａｋｔの発現及びＡｋｔのリン酸化に影響がなかった。全Ａｋｔ／βアクチンの比及びリン酸化ａｋｔ／全Ａｋｔの比は、トラニルシプロミンの投与後において、対照とグルタミン酸誘発ストレス条件の両方で変化がなかった。同様にして、全ｐ３８ＭＡＰＫの発現とリン酸化ｐ３８ＭＡＰＫ、及びｐ３８ＭＡＰＫγの発現を確認した。結果を図３Ｄ－Ｇに示す。グルタミン酸は全ｐ３８ＭＡＰＫの発現及びそのリン酸化状態に影響を及ぼさなかった。また、トラニルシプロミン（添加量：１００μＭ）は、全ｐ３８ＭＡＰＫの発現及びそのリン酸化に影響を与えなかった。同様に、全ｐ３８ＭＡＰＫの発現とリン酸化ｐ３８ＭＡＰＫの比は、トラニルシプロミンの添加やグルタミン酸ストレスによって統計的変化を示さなかった。しかしながら、ｐ３８ＭＡＰＫサブタイプの一つであるｐ３８ＭＡＰＫγの発現がグルタミン酸投与により有意に抑制された、そしてグルタミン酸によって誘導されたｐ３８ＭＡＰＫγの抑制は、トラニルシプロミンによって回復された。このことは、トラニルシプロミンによって神経保護効果が、全ｐ３８ＭＡＰＫではなく、ｐ３８ＭＡＰＫγによって深く影響を受けているらしいということを示唆している。
　Ａｋｔではなくｐ３８ＭＡＰＫγがグルタミン酸の過負荷からのＲＧＣ保護に寄与しているか否かを解明するために、以下の阻害剤を用いてＡｋｔ又はｐ３８ＭＡＰＫγを薬理学的に阻害した後の細胞生存率を検討した；ウォルトマニン（Ｗａｒｔｍａｎｎｉｎ）：ホスファチジルイノシトール－３－キナーゼの強力かつ選択的な阻害剤、ＢＩＲＢ７９６及びＳＢ２０３５８０：ｐ３８ＭＡＰＫの特異的阻害剤。ウォルトマニン（添加量：１００ｎＭ）は、グルタミン酸ストレス条件及びトラニルシプロミン投与のグルタミン酸ストレス条件のいずれでも、ＲＧＣの生存に影響を及ぼさなかった。一方、ｐ３８ＭＡＰＫの４つの全てのサブタイプを阻害するＢＩＲＢ７９６（添加量：１０μＭ）は、グルタミン酸誘発のＲＧＣ死からトラニルシプロミンの神経保護効果を明確に打ち消した。ＳＢ２０３５８０による消失効果は明らかでなかった。結果を図４Ａ及び図４Ｂに示す。ＳＢ２０３５８０は、ｐ３８ＭＡＰＫα及びｐ３８ＭＡＰＫβの特異的阻害剤であるが、ｐ３８ＭＡＰＫγ又はｐ３８ＭＡＰＫδは阻害しないと報告されている。したがって、薬理作用に関するこれらの結果は、トラニルシプロミンはｐ３８ＭＡＰＫγ活性を経て、ＲＧＣの生存に寄与していることを示している。
（実施例５）インビボでの、トラニルシプロミンによるＲＧＣの生存促進の確認
　インビボにて、ストレス条件下で、トラニルシプロミンがＲＧＣの生存を調節するかどうかを確認した。材料と方法（７）－（１０）に従って行った。
　まず、インビボＮＭＤＡ誘発網膜障害モデルを用いて、トラニルシプロミン投与後の形態学的な網膜の変化を評価した。硝子体内ＮＭＤＡは、ＰＢＳ対照と比較して有意にＩＰＬの厚さを減少させた。一方、トラニルシプロミン処理をしＮＭＤＡを注射した網膜は、対照の網膜と同じレベルにＩＰＬの厚さを維持した。つまり、トラニルシプロミン投与は、グルタミン酸誘発網膜障害を完全に回復させることができた。結果を図５に示す。
　カスパーゼファミリーの発現レベルは一般的にアポトーシス活性を反映しているので、トラニルシプロミン投与後のＮＭＤＡ誘発性カスパーゼ３活性をウエスタンブロット分析により測定した。ＮＭＤＡ及びビヒクルで処理した眼で確認した結果、切断されたカスパーゼ３が、ＮＭＤＡ注射した１８時間後の網膜で有意に誘導されたが、この活性は、トラニルシプロミンで処置した網膜では有意に抑制されていた。結果を図６に示す。これらの結果は、硝子体内へのトラニルシプロミン投与が、細胞内のアポトーシスシグナル伝達経路に対して神経保護効果を発揮し、網膜の形態学的変化を抑制することを示している。
　次に、トラニルシプロミンが、ＮＭＤＡ誘発網膜神経毒性からＲＧＣをどの程度保護するかをテストした。フルオロゴールドで逆行標識したＲＧＣの実際の数を、偽処理（対照）、トラニルシプロミン処理、ＮＭＤＡ処理、及びＮＭＤＡ及びトラニルシプロミン処理、の各群について、網膜でカウントした。ＮＭＤＡ硝子体内注射後７日目のＮＭＤＡ投与群におけるＲＧＣ数は、網膜の中間領域で２１．４％、周辺領域で２３．４％に減少していた。これとは対照的に、ＮＭＤＡ及びトラニルシプロミン処理群では、ＲＧＣの数は、中間領域と周辺領域で、それぞれ４８．７％と５０．９％であり、有意に増加していた。結果を、図７に示す。従って、硝子体内へのトラニルシプロミン処理は、ＮＭＤＡ神経毒性による網膜の損傷後のＲＧＣの生存を増強した。
　以上の結果より、硝子体内のトラニルシプロミンは、内網状層の厚さを持続するだけでなく、ラットの網膜への過負荷であるＮＭＤＡ投与後のＲＧＣ損失の低減をもたらすことが明らかになった。よって、ＬＳＤ１活性を標的とするトラニルシプロミンは、網膜損傷の間に、インビボにおいて神経保護効果を増強することが可能であろう。
　また、典型的なＬＳＤ１阻害剤であるトラニルシプロミンは、神経細胞の生存率を高めるためにメインプレーヤーと考えられる神経のＰ３８γアイソフォームの発現を促進することにより、網膜神経節細胞に、顕著な神経保護効果を示す。トラニルシプロミンの局所投与はまた、ラットＮＭＤＡ誘発興奮毒性ストレスモデルにおいて網膜神経節細胞のための神経保護をもたらした。このことは、ＬＳＤ１の抑制により、緑内障などの神経変性疾患の治療が可能であることを示している。
　上記の詳細な記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
　本発明は、新規な神経変性疾患の予防剤又は治療剤として有用である。本発明はまた、眼の神経変性疾患、例えば緑内障の新たな予防剤又は治療剤として有用である。

Claims (13)

  1. 　リジン特異的デメチラーゼ１（ＬＳＤ１）活性を阻害する物質を有効成分として含む神経変性疾患の予防剤又は治療剤。
  2. 　前記神経変性疾患が、視神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症からなる群より選ばれる神経変性疾患である請求項１に記載の神経変性疾患の予防剤又は治療剤。
  3. 　前記神経変性疾患が視神経変性疾患である請求項２に記載の神経変性疾患の予防剤又は治療剤。
  4. 　前記視神経変性疾患が、緑内障に伴う視神経障害、虚血性視神経症、外傷性視神経症、又は、レーベル遺伝性視神経症である請求項３に記載の神経変性疾患の予防剤又は治療剤。
  5. 　前記視神経障害が網膜神経細胞の障害である請求項４に記載の神経変性疾患の予防剤又は治療剤。
  6. 　前記物質が、下記の化合物群：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     から選ばれる少なくとも一つの化合物である請求項１～５のいずれか一つに記載の神経変性疾患の予防剤又は治療剤。
  7. 　前記物質が、トラニルシプロミン又はＳ２１０１である請求項６に記載の神経変性疾患の予防剤又は治療剤。
  8. 　前記物質が、ＬＳＤ１のｓｉＲＮＡである請求項１～５のいずれか一つに記載の神経変性疾患の予防剤又は治療剤。
  9. 　眼局所注入剤である請求項３～８のいずれか一つに記載の神経変性疾患の予防剤又は治療剤。
  10. 　点眼剤である、請求項３～７のいずれか一つに記載の神経変性疾患の予防剤又は治療剤。
  11. 　リジン特異的デメチラーゼ１（ＬＳＤ１）活性を阻害する物質を有効成分として含む神経保護治療剤。
  12. 　網膜神経細胞の保護剤である、請求項１１に記載の神経保護治療剤。
  13. 　リジン特異的デメチラーゼ１（ＬＳＤ１）活性を阻害する物質を有効成分として含む網膜神経細胞死の抑制剤。
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