JP5662593B2 - 組織試料固定のための方法 - Google Patents
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Description
[0002]ホルマリンは、半世紀に渡って、組織学的分野で用いられてきている。室温で用いた場合、ホルマリンは組織切片内に拡散し、そしてタンパク質および核酸を架橋して、それによって代謝を停止させ、生体分子を保持し、そしてパラフィン蝋浸潤のため組織を準備する。実際には、ホルマリン固定は主に、室温またはそれより高い温度で行われる。おそらく架橋速度が増加するであろうため、いくつかのグループは、わずかに上昇した温度で固定を行う。熱が架橋速度を増加させるのと同様に、冷たいホルマリンは架橋速度を有意に減少させる。このため、組織学者らは、典型的には、組織固定を室温またはそれより高い温度で行う。いくつかのグループは、冷たいホルムアルデヒドを使用してきているが、特殊な状況においてのみであり、そして組織を固定するためではない。例えば、あるグループは、脂肪滴または他の特別な状況を調べるために冷たいホルマリンを用いる。
[0009]本発明は、組織を固定するための方法に関する。典型的な態様において、方法は、組織形態、タンパク質構造および/または翻訳後修飾シグナルを保持する優れた品質を提供する。
[0021]要約すると、本方法は、当該技術分野に存在する方法に勝る、少なくとも3つの改善点を提供する。第一に、ホルマリンが低温環境において組織切片内に浸透することを可能にすることによって、酵素活性を有意に減少させることが可能である。第二に、組織試料温度を迅速に上昇させることによって、架橋動力学を増加させることにより、細胞構成要素は、室温で観察されるであろうよりもより迅速にその場所に「ロック」される。この組み合わせによって、この技術は存在する方法よりも優れたものとなり、そして初めて、FFPE組織において、修飾状態を保持することが可能になる。第三に、これは、非常に多様な修飾状態および酵素に適用可能であると考えられる一般的な方法に相当する。他の方法は、特定のセットの修飾酵素をターゲットとする一方、この方法は、迅速にすべての修飾酵素を無効にし、そしてしたがって、代表的な室温法よりもはるかに優れた一般的な細胞状態を保持する。本発明は、生体分子の特定のセットまたは特定の翻訳後修飾を含有する生体分子に限定されないため、この方法は、任意の生体分子または修飾状態の保持のための一般的な方法に相当すると考えられる。したがって、本発明は、高品質の多量の生体分子および特定の翻訳後修飾を含有する生体分子を保持可能である。
[0045]別に記載しない限り、技術用語は慣用的用法にしたがって用いられる。分子生物学における共通の用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes VII, Oxford University Press刊行, 2000(ISBN 019879276X); Kendrewら(監修), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Publishers刊行, 1994(ISBN 0632021829);およびRobert A. Meyers(監修), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, Wiley, John & Sons, Inc.刊行, 1995(ISBN 0471186341);および他の類似の参考文献に見られうる。
[0048]H&E:ヘマトキシリンおよびエオジン染色。
[0050]ISH:in situハイブリダイゼーション。
[0051]NBF:中和緩衝ホルマリン溶液。
[0054]動物:生存多細胞脊椎動物生物、例えば哺乳動物および鳥類を含むカテゴリー。用語、哺乳動物には、ヒトおよび非ヒト哺乳動物両方が含まれる。同様に、用語「被験体」には、ヒトおよび獣医学的被験体、例えばヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれる。
[0065]哺乳動物:この用語には、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方が含まれる。同様に、用語「被験体」には、ヒトおよび獣医学的被験体の両方が含まれる。
[0067]モノクローナル抗体:Bリンパ球の単一クローンによって、または単一抗体の軽鎖および重鎖遺伝子がトランスフェクションされている細胞によって産生される抗体。モノクローナル抗体は、当業者に知られる方法によって、例えば骨髄細胞と免疫脾臓細胞の融合から、ハイブリッド抗体形成細胞を作製することによって、産生される。モノクローナル抗体には、ヒト化モノクローナル抗体が含まれる。
[0073]タンパク質:アミノ酸で構成される分子、特にポリペプチド。
[0076]翻訳後修飾シグナルの保持は、本明細書開示の方法を用いることによって達成可能である。該方法は、組織試料中のタンパク質の翻訳後修飾シグナルを有意に、例えば翻訳後修飾シグナルの少なくとも50%、70%、90%または99%を保持することによって、保持する。例示的な態様において、翻訳後修飾シグナルによるpAKTの免疫組織化学シグナルを、翻訳後修飾シグナルの保持を示す指標として用いる。
[0079]プロテアーゼは、触媒活性部位および作用条件の特性にしたがって、4つの主な群に分けられる:セリンプロテイナーゼ、システイン(チオール)プロテイナーゼ、アスパラギン酸プロテイナーゼ、およびメタロプロテイナーゼ。特定の基へのプロテアーゼの付着は、触媒部位の構造およびその活性に必須のアミノ酸(構成要素の1つとして)に依存する。
[0083]固定は、続く検査のため、生物学的試料(組織または細胞)を保持する。組織試料を固定するには3つの主な方法がある。熱固定は、細胞タンパク質の活性を無効にし、そしてそれによって細胞代謝を停止するのに十分な熱に、十分な期間、試料を曝露することを伴う。熱固定は,一般的に、細胞形態を保持するが、タンパク質構造を保持しない。
[0087]組織固定動力学が、ホルマリンの温度を上昇させることによって増加可能であることが周知である。しかし、本発明者らが行った最初の研究によって、加熱したホルマリン固定剤に組織試料を直接入れると、ホルマリンが組織中心に浸透するよりはるかに前に、組織外部の架橋が引き起こされることが示された。上昇した温度では、ホルマリンは、架橋動力学よりもゆっくりと、密な組織内に拡散する。この場合、中心の生体分子は、いかなる有意な架橋も伴わずに加熱され、そしてしたがって、これらの分子は分解および損傷により感受性である。
[0091]IV.プロセス工程
[0092]本発明の特定の開示される態様は、多工程、典型的には二工程の、組織試料にアルデヒド固定剤、例えばホルマリンおよび/またはグルタルアルデヒドを注入する/拡散させるための組織固定プロセスに関する。第一の工程中、固定剤が実質的に試料の全横断面全体に拡散することを可能にする条件下で、組織試料を固定剤溶液で処理する。実質的に完全な組織注入/拡散を達成する第一の期間、そして第一の温度で、固定剤組成物を用いて、この第一の工程を行う。第二の工程は、組織試料を第二のより高い温度で固定剤組成物に供して、組織特性、例えば抗原性および形態を損なうことなく、可能な限り迅速な速度で架橋が起こるのを可能にする。これらのプロセシング工程各々を、以下により詳細に論じる。
[0100]プロセスの第一の工程は、組織試料を、実質的に試料の全横断面全体に組成物が実質的に完全に拡散することを可能にするのに有効な条件下で、組織試料を固定剤組成物に供することである。第一の工程に関する有効な温度範囲は、−20℃より高く、少なくとも15℃まで、好ましくは0℃より高く、それより高い温度、より典型的には約10℃まで、そしてさらにより典型的には約3℃〜約5℃である。作業態様に関して、温度は典型的には約4℃であった。
[0105]図1A〜1D(サイクリンD1)および2A〜2D(bcl−2)は、一連の対照スライド由来であり、ここで組織試料を、それぞれ、0、2、4および24時間、室温のホルマリンに浸漬した。産業標準は、少なくとも6時間、そしてより典型的には少なくとも8時間、最大72時間の室温ホルマリン中の固定時間を必要とする。図1A〜1Cによって提供される対照画像は、組織試料の過少固定、すなわち0、2および4時間のプロセシング時間が、サイクリンD1免疫組織化学染色プロトコルを用いると、よく染色されないことを例示する。対照スライド2A〜2Cは、組織試料の過少固定、すなわち0、2および4時間のプロセシング時間が、bcl−2免疫組織化学染色プロトコルを用いると、よく染色されないことを例示する。しかし、既知の標準に基づいて期待されるように、固定時間を24時間に増加させると、図1Dおよび2Dは、許容可能に染色された組織試料を提供する。
[0123]本発明を、伝統的な組織化学、ならびに免疫組織化学およびin situハイブリダイゼーションの技術分野で知られる任意の染色系およびプロトコルとともに用いてもよい。本発明はまた、多様な自動化染色系、例えば、Benchmark XT、Benchmark Ultra、およびDiscovery自動化プラットホームを含む、Ventana Medical Systems, Inc.、アリゾナ州ツーソンによって市販されているものとともに使用可能である。例示的な系は、米国特許第6,352,861号、米国特許第5,654,200号、米国特許第6,582,962号、米国特許第6,296,809号、および米国特許第5,595,707号に開示される。
[0131]本実施例は、30℃、40℃、50℃および60℃で固定したマウス腎臓試料に関する固定時間経過に関し、そしてヒト組織試料で得られた先の結果を確認する。Ventana Medical Systems, Inc.のBMAC部門から新鮮なマウス腎臓を得た。
[0135]本実施例は、50℃、60℃、70℃、80℃および90℃の長期ホルマリン熱浸漬に関し、形態または抗原性が損なわれるまでに、どれだけの熱を適用可能であるかを決定する。ホルマリン浸漬を伴って実施例1を反復するが、ヒト扁桃腺片を50℃、60℃、70℃、80℃および90℃に加熱した10%NBFに浸した。以下に例示するように、多様な時点を試した。
[0137]上記温度に加熱した20mlの10%NBFに組織試料を浸漬した。適切な時間の後、片をプロセシングカセットに取り除き、そして70%エタノール中で保存した。すべての時点の後、組織を標準組織プロセッサー中で一晩プロセシングした。組織を中央でスライスし、そして切断側を下にして包埋した(中央を曝露するように組織をスライスした)。
実施例3
[0142]本実施例は、ヒト扁桃腺片を52℃ホルマリンに浸漬する前に、10%NBFに60分間、前浸漬した場合の前浸漬実験に関する。原理は、ホルマリンが最初の1時間に組織に浸透するが、それほど多くの架橋が起こらないというものであった。次いで、温度を上昇させることによって、架橋反応を増加させることも可能であった。
実施例4
[0146]本実施例は、実施例3に類似の前浸漬に関し、そしてCHTNから得たヒト扁桃腺組織に対して行われた。調べている異なる扁桃腺切片の性質が異なるため、この実験を多数回行った。扁桃腺片を異なる方式でホルマリンに浸漬した。第一に、片を50℃または60℃のいずれかに加熱したホルマリンに、10、30および60分間浸漬した。第二の様式は、加熱工程プロセシング工程前に、まず、4℃のホルマリン中に片を60〜120分間「前浸漬」することであった。
[0148]一般的に、前浸漬されておらず、単に50℃および60℃のホルマリンに供されたスライドは、組織中心で不完全な固定を示した。60分間の浸漬は、完全に近いが本当に完全ではなかった。4℃で1または2時間、前浸漬され、次いで熱プロファイルに供された片は、特に2時間の前浸漬でより優れており、これがこれらの試験の好ましい条件であった。
[0149]本実施例は、前浸漬実施例3に関する。実施例4からの結果は、加熱浸漬前のホルマリンでの前浸漬が好ましいことを示した。ヒト扁桃腺を用いて、そしてより小規模で、より焦点を絞った実験を行うことによって、実施例4の結果を拡張した。この実験のため、120分間、4℃のホルマリン前浸漬を、55℃のホルマリン架橋プロセシング工程とともに用いた。
[0152]本実施例は、多様な温度での前浸漬が組織形態にどのような影響を有するかを決定するための、4℃、12℃および22℃の前浸漬に関する。加熱したホルマリン固定の前に、未固定組織試料を、1または2時間いずれかの間、4℃、12℃および22℃のホルマリン内に入れた。
[0157]本実施例は、前浸漬するが、組織試料を55℃で、マイクロ波組織プロセッサー中で固定し、この容器が、20mlコニカル試験管とは対照的な大きいホルマリン容器(ほぼ1リットル)を有するものに関する。より大きな体積のホルマリンは、より小さい体積のものと同じほど大きくは温度を減少させなかった。これは、4℃からより高い温度の液体に片を移す際には重要でありうる。
実施例8
[0162]本実施例は、マウス腎臓に対して前浸漬プロトコルを用いることに関する。マウス腎臓を中央で切り下ろし、そして実施例6におけるのと同一の実験を行った。
実施例9
[0164]本実施例は、組織に対する有害な影響が観察されるまでに、ホルマリンがどのくらい熱くてもよいかの限界を探究するため、前浸漬を伴うまたは伴わない、40℃、55℃、65℃および75℃での固定に関する。組織切片を、4℃ホルマリン中のあらかじめの前浸漬を伴い、そして伴わず、40℃、55℃、65℃および75℃でプロセシングした。
[0166]本実施例は、実施例9に非常によく似た方式で、前浸漬を伴うまたは伴わない、40℃、55℃および70℃での固定に関する。相違点は、正確な加熱ホルマリン温度であり、そして加熱浸漬時間を延長したことのみである。
[0168]本実施例は、前浸漬時間を1〜3時間で変化させて、組織形態および抗原性の関数として、前浸漬時間を調べることに関する。未固定ヒト扁桃腺試料を1〜3時間の間、4℃のホルマリンに前浸漬した。以下に示すように、試料を45℃のホルマリン中で固定した:
[0170]本実施例は、前浸漬時間が4時間まで変化しており、そして加熱ホルマリン浸漬が4時間まで延長されていることを除き、実施例12に用いたのと実質的に同じパラメーターで、前浸漬時間を1〜4時間で変化させることに関する。
実施例13
[0173]本実施例は、基本的に用いる扁桃腺切片サイズを増加させるための実施例13の繰り返しとして、前浸漬時間を1〜4時間で変化させることに関する。
[0175]本実施例は、NBFおよびエタノールの後のキシレン浸漬時間を分析することに関する。
[0177]本実施例は、Calu−3異種移植片に対するpAKTに関する染色を論じる。本実施例において、新鮮に採取したCalu−3異種移植片腫瘍を2つのほぼ等しい部分にスライスし、そしてRTで10%NBF(ホルマリン)または4℃で10%NBFのいずれかで処理した。RTホルマリンで処理する腫瘍試料を腫瘍除去の5分間以内に溶液内に直接入れた。次いで、試料を水浸0、2、4または24時間後の時間間隔で、ホルマリンから取り除いた。1つの腫瘍試料を直接、4℃のホルマリンに2時間入れ、そして次いで、45℃のホルマリンにさらに2時間移した。一晩プログラムに設定した自動化組織プロセッサー中でさらにプロセシングするまで、すべての試料を、保持貯蔵所としての70%エタノール内に入れた。顕微鏡切片作製法のため、すべての試料をパラフィン蝋内に包埋した。自動化スライド染色装置(VENTANA Discovery XT装置、Ventana Medical Systems, Inc.)上で、pAKTエピトープを認識する抗体(Cell Signaling Technologies、カタログ番号4060)でスライドを染色した。図11A〜Eに示すように、標準RTホルマリンプロセスよりも、本実施例の二重温度固定(2+2)プロトコルで有意により多いpAKTが保持された(24時間を2+2パネルと比較されたい)。
[0178]本実施例は、ホスファターゼ処理およびCalu−3異種移植片に対するpAKTに関する染色を記載する。
[0180]本実施例は、非浸潤性乳管癌(DCIS)を有するヒト***に対するpAKTに関する染色を記載する。本実施例において、ヒト***の試料を採取し、そしておよそ4mm片にスライスし、そしてRTで10%NBF(ホルマリン)または4℃で10%NBFのいずれかで処理した。RTホルマリンで処理する腫瘍試料を溶液内に直接入れた。次いで、試料を水浸0、2、4または24時間後の時間間隔で、ホルマリンから取り除いた。1つの腫瘍試料を直接、4℃のホルマリンに2時間入れ、そして次いで、45℃のホルマリンにさらに2時間移した。一晩プログラムに設定した自動化組織プロセッサー中でさらにプロセシングするまで、すべての試料を、保持貯蔵所としての70%エタノール内に入れた。顕微鏡切片作製法のため、すべての試料をパラフィン蝋内に包埋した。自動化スライド染色装置(VENTANA Discovery XT装置)上で、pAKTエピトープを認識する抗体(Cell Signaling Technologies、カタログ番号4060)でスライドを染色した。図13AおよびBに示すように、標準RTホルマリンプロセスよりも、本発明の二重温度固定(2+2)プロトコルで有意により多いpAKTが保持される(24時間を2+2パネルと比較されたい)。さらに、染色は、本発明の二重温度固定プロトコルによって固定された試料において、膜に対してはるかにより特異的であるようである。
[0181]本実施例は、Calu−3異種移植片上のpAKTの熱分解を記載する:本実施例において、新鮮に採取したCalu−3異種移植片腫瘍を2つのほぼ等しい部分にスライスし、そしてRTで10%NBF(ホルマリン)または45℃で10%NBF、または2つの異なる温度で10%NBFのいずれかで処理した。RTホルマリンで処理する腫瘍試料を腫瘍除去の5分間以内に溶液内に直接入れた。次いで、試料を水浸0または24時間後の時間間隔で、ホルマリンから取り除いた。1つの腫瘍試料を直接、45℃のホルマリンに3.5時間入れた。別の腫瘍試料を4℃のホルマリンに2時間入れ、そして次いで、45℃のホルマリンにさらに2時間移した。一晩プログラムに設定した自動化組織プロセッサー中でさらにプロセシングするまで、すべての試料を、保持貯蔵所としての70%エタノール内に入れた。顕微鏡切片作製法のため、すべての試料をパラフィン蝋内に包埋した。自動化スライド染色装置(VENTANA Discovery XT装置)上で、pAKTエピトープを認識する抗体(Cell Signaling Technologies、カタログ番号4060)でスライドを染色した。図14A〜Dに示すように、標準RTホルマリンプロセスよりも、本発明の二重温度固定プロトコルによって固定された(2+3.5)試料において、有意により多いpAKTが保持された(24時間を2+3.5パネルと比較されたい)。第一の冷たい浸漬なしに、加熱したホルマリンに直接入れた腫瘍試料(0+3.5パネル)では、pAKTでの染色が保持されなかったため、4℃での第一の温度の浸漬は、ホスホマーカーを保持するのに必要である。Aperioスライドスキャナを用いて、定量的目的のため、スライドをスキャンした(下部写真)。図14Eに示すように、陽性(茶色)または陰性(青色)を示す2群にピクセルをビン化した。陽性ピクセルの割合をグラフに報告する。
[0182]本実施例は、除去後、pAKT染色が迅速に減少することを記載する。本実施例において、新鮮に採取したCalu−3異種移植片腫瘍を2つのほぼ等しい部分にスライスし、生理食塩水に浸漬したガーゼ中に包み、そして0、10、30、60、120または240分間、湿った氷上に置いた。次いで、各試料を4℃のホルマリンに2時間入れ、そして次いで、45℃のホルマリンにさらに2時間移した。一晩プログラムに設定した自動化組織プロセッサー中でさらにプロセシングするまで、すべての試料を、保持貯蔵所としての70%エタノール内に入れた。顕微鏡切片作製法のため、すべての試料をパラフィン蝋内に包埋した。自動化スライド染色装置(VENTANA Discovery XT装置)上で、pAKTエピトープを認識する抗体(Cell Signaling Technologies、カタログ番号4060)でスライドを染色した。図15A〜Fに示すように、pAKTシグナルは、湿った氷上で4℃に冷却した際であっても、除去後30分間(図15B)で有意に減少した。
[0183]本実施例は、ヒト結腸癌に対するホスホマーカーに関する染色を記載する。
[0184]本実施例において、ヒト結腸の試料を採取し、そして患者からの除去の3〜7分以内にプロセシングした。試料をおよそ4mmの片にスライスし、そして3つの異なるプロトコルで処理した。プロトコル1では、試料を直接、4℃のホルマリン内に2時間入れ、そして次いで45℃のホルマリンにさらに2時間移した。プロトコル2では、試料を水浸後24時間、室温のホルマリン内に入れた。プロトコル3では、試料は、室温のホルマリンに24時間入れられる前に、意図的な虚血を1時間受けた。一晩プログラムに設定した自動化組織プロセッサー中でさらにプロセシングするまで、すべての試料を、保持貯蔵所としての70%エタノール内に入れた。顕微鏡切片作製法のため、すべての試料をパラフィン蝋内に包埋した。自動化スライド染色装置(VENTANA Discovery XT装置)上で、pAKTエピトープを認識する抗体(Cell Signaling Technologies、カタログ番号4060)またはpPRAS40エピトープを認識する抗体(Cell Signaling Technologies、カタログ番号)で試料を染色した。図16A〜Iに示すように、標準的RTホルマリンプロセスよりも本発明の二重温度固定(2+2)プロトコルにおいて、有意により多くのホスホマーカーが保持された(24時間を2+2パネルと比較されたい)。さらに、意図的な虚血を経た試料は、本発明の二重温度固定プロトコルによって固定された試料、または24時間固定プロトコルによって固定された試料のいずれよりも、有意により少ないホスホマーカー保持を有した。組織形態の比較のため、試料をまた、ヘマトキシリンおよびエオジンでも染色した(上部パネル)。Aperioスライドスキャナを用いて、定量的目的のため、スライドをスキャンした(下部写真)。陽性(茶色)または陰性(青色)を示す2群にピクセルをビン化した。陽性ピクセルの割合をグラフ中に報告する。
[0185]本実施例は、本発明の二重温度固定プロトコルおよび標準プロトコル(24時間)にしたがって固定された試料におけるmiRNAレベルの分析に関する。miRNAは短い(21〜25)ヌクレオチドであり、mRNA転写物の転写後修飾剤として作用し、翻訳を防止することによって、遺伝子発現に影響を及ぼす。
[0187]本実施例は、ヒト非浸潤性乳管癌(DCIS)におけるDNAの保持に関する。
[0188] 本実施例において、HER2 二重ISH DNAプローブカクテル染色体17/HER2(DDISH;Ventana Medical Systems, Inc. カタログ番号780−4422)を乳癌試料において用いて、本発明の二重温度固定プロトコルで2つの異なるDNAターゲットの単一および多数コピーを検出する能力に関して試験した。非浸潤性乳管癌(DCIS)を含有する***組織試料は、標準的24時間室温ホルマリン浸漬によって固定されたものとの比較において、本発明の二重温度固定プロトコル(2時間の4℃で10%NBF、その後、2時間の45℃で10%NBF)にしたがって保持された。VENTANA Discovery XT自動化組織染色装置(カタログ番号786−089)上での染色後、ホルマリン固定パラフィン包埋したスライド中で、2色発色性in situハイブリダイゼーション(ISH)を用いて、HER2および染色体17プローブを検出した。次いで、染色体17に対するHER2遺伝子の比を計算することによって、HER2遺伝子状態を数値化した。図18AおよびBに示すように、HER2遺伝子の単一および多数のコピーが検出され、どちらの試料に関しても、試験は成功であった(黒いシグナル)。さらに、染色体17の中心体もまた、成功裡に検出された(赤いシグナル;例示的なシグナルを矢印によって示す)。これは、本発明の二重温度固定プロトコルが、組織中の核酸DNAを保持し、そして商業的に入手可能なプローブによって検出可能であることを例示する。
[0189]本実施例は、ヒト結腸癌に対するHif1αに関する染色を記載する。
[0190]本実施例において、ヒト結腸の試料を採取し、そして患者からの除去の3〜7分以内にプロセシングした。試料をおよそ4mmの片にスライスし、そして3つの異なるプロトコルで処理した。プロトコル1では、試料を直接、4℃のホルマリン内に2時間入れ、そして次いで45℃のホルマリンにさらに2時間移した(A)。プロトコル2では、試料を水浸後24時間、室温のホルマリン内に入れた(B)。プロトコル3では、試料は、室温のホルマリンに24時間入れられる前に、意図的な虚血を1時間受けた(C)。一晩プログラムに設定した自動化組織プロセッサー中でさらにプロセシングするまで、すべての試料を、保持貯蔵所としての70%エタノール内に入れた。顕微鏡切片作製法のため、すべての試料をパラフィン蝋内に包埋した。自動化スライド染色装置(VENTANA Discovery XT装置)上で、Hif1αエピトープを認識する抗体(ABCam、カタログ番号Ab51608)でスライドを染色した。図19A、BおよびCに示すように、標準的RTホルマリンプロセスよりも本発明の二重温度固定(2+2)プロトコルにおいて、有意により多くのHif1αが保持された(24時間を2+2パネルと比較されたい)。さらに、意図的な虚血を経た試料は、本発明の二重温度固定プロトコル(2+2)または24時間の試料のいずれよりも、有意により少ないHif1α保持を有した。
Claims (15)
- 組織試料を固定するための方法であって:
a)第一の温度で、そして第一の期間、第一のアルデヒド溶液と組織試料を接触させ;
b)a)において得られた組織試料の温度を、迅速に第二の温度に上昇させ;
c)第二の温度で第二の期間、前記組織試料をインキュベートする;
ここで前記の第一の温度が−20℃〜15℃であり、前記の第二の温度が22℃〜少なくとも50℃であり;そして第一の期間が15分間から最大4時間の範囲であり、第二の期間が15分間より長く最大少なくとも5時間の範囲である、
を含む、前記方法。 - 前記a)において得られた組織試料の前記温度が、組織試料を前記の第二の温度に加熱することによって上昇する、請求項1記載の方法。
- 前記a)において得られた組織試料の前記温度が、マイクロ波加熱を用いることにより上昇する、請求項2記載の方法。
- 前記a)において得られた組織試料の前記温度が、前記組織試料を前記の第二の温度で第二のアルデヒド溶液内に浸すことによって上昇する、請求項1記載の方法。
- 第一の温度が0℃〜15℃である、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 第一の温度が3℃〜5℃である、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記第一の期間が1時間〜2時間の範囲である、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記第二の温度が35℃〜45℃である、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記第二の期間が2時間〜3時間である、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記第二のアルデヒド溶液が前記第一のアルデヒド溶液と同じであるか、または前記第二のアルデヒド溶液が前記第一のアルデヒド溶液と異なる、請求項4記載の方法。
- 前記アルデヒド溶液中のアルデヒドが低次アルキルアルデヒドであり、前記アルデヒドが、ホルマリン、グルタルアルデヒド、およびその組み合わせより選択されてもよい、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 前記第1のアルデヒド溶液がホルマリン溶液であり、そして前記第1の温度が0℃より高く〜5℃であり、そして、前記第2の期間が1時間〜4時間の範囲である、請求項2または3記載の方法。
- 前記第1及び第2のアルデヒド溶液がホルマリン溶液であり、そして前記第1の温度が0℃より高く〜5℃であり、そして、前記第2の期間が1時間〜4時間の範囲である、請求項4記載の方法。
- 前記組織試料がFFPE組織試料である、請求項1記載の方法。
- 自動検出系において、固定組織試料を検出する工程をさらに含む、請求項1〜14のいずれかに記載の方法。
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