JP5626760B2 - 蛍光像取得方法、蛍光像取得プログラム及び蛍光像取得装置 - Google Patents

Description

本発明は蛍光像取得方法、蛍光像取得プログラム及び蛍光像取得装置に関し、例えば加齢黄斑変性症を検査する場合に適用して好適なものである。

加齢黄斑変性症（Age-related Macular Degeneration：ＡＭＤ）は、視力障害及び失明を引き起こす主な原因疾患の一つであり、滲出型と萎縮型に大別される。萎縮型加齢黄斑変性症は黄斑の組織が年齢とともに萎縮していき、長期的に視力低下などを引き起こす疾患である。一方、滲出型加齢黄斑変性症は、黄斑に脈絡膜から新生血管が発生し、該新生血管が脆いために網膜色素上皮層下又は網膜下に出血が生じ、黄斑部の機能障害を引き起こす疾患である。

通常、新陳代謝によって生成される老廃物が網膜及び脈絡膜間にある網膜色素上皮層で消化される。しかしながら加齢と共に網膜色素上皮層の機能が低下すると、老廃物が消化されずにブルッフ膜上に溜まってしまい（ドルーゼン）、その結果として慢性的な炎症を起こす。このとき、炎症部では炎症を鎮めようとして血管の発生を促す因子を放出し、これに伴い脈絡膜から新生血管が発生する。このようにして滲出型加齢黄斑変性症が生じる。

そこで被験者の眼底画像を撮像し、該眼底画像から老廃物などの病変部位を検出するようになされた装置が提案されている（例えば特許文献１参照）。

特開２００８−２９５８０４公報

ところで引用文献１では、眼底画像を取得する装置として眼底カメラのみならず、走査型レーザ検眼鏡なども適応できることが開示されている。走査型レーザ検眼鏡では、光ビームを走査して眼底に照射し、所定部位での反射光や蛍光を撮像素子で受光することにより、眼底画像を取得する。

走査型レーザ検眼鏡で取得された眼底画像は、眼底カメラで取得された画像と比較して精細な蛍光像を得ることができるが、眼底カメラと同じく形態学的な所見に基づいて病変部が検出される。

したがって従来の装置では、取得した眼底画像から病変部位を検出する際、形態学的所見に基づくため、血管新生を認める以前の該病変部位を早期に精度よく発見できないといった問題があった。

本発明は以上の点を考慮してなされたもので、眼底病変部位を早期に精度よく発見し得る蛍光像取得方法、蛍光像取得プログラム及び蛍光像取得装置を提案しようとするものである。

かかる課題を解決するため本発明においては、ターゲットに特異的に結合する蛍光色素を励起させる短パルスの光を眼底に対して照射させる照射ステップと、光が出射された時点を基準として、該基準から所定時間経過後の異なる２つの時刻における蛍光色素の発光の強度を測定し、該異なる２つの時刻における発光の強度の比を検出する検出ステップと、検出ステップによる検出結果を基に、ターゲットに標識した蛍光色素の蛍光像を生成する生成ステップとを有する。

また本発明においては、コンピュータに対して、蛍光色素を励起させる短パルスの光を眼底に対して照射させる照射ステップと、光が出射された時点を基準として、該基準から所定時間経過後の異なる２つの時刻の発光の強度を測定し、該異なる２つの時刻における発光の強度の比を検出する検出ステップと、検出ステップによる検出結果を基に、ターゲットに標識した蛍光色素の蛍光像を生成する生成ステップとを実行させる。

さらに本発明においては、蛍光色素を励起させる短パルスの光を出射する光源と、光源から眼底に対して光を照射させる光源制御部と、光が出射された時点を基準として、該基準から所定時間経過後の異なる２つの時刻の発光の強度を測定し、該異なる２つの時刻における発光の強度の比を検出する検出部と、検出部による検出結果を基に、ターゲットに標識した蛍光色素の蛍光像を生成する生成部とを有する。

これにより、２つの時刻における蛍光の強度に基づいてターゲットに標識した蛍光色素だけの蛍光像を取得することができるので、該ターゲットに標識していない蛍光色素をその像に写すことなく、ターゲットに標識した蛍光色素の蛍光像を精度よく取得することができ、また眼底病変部位に早期に出現する蛋白質をターゲットとして蛍光色素で標識した場合、その蛍光像を得ることで蛋白質を可視化し、形態学所見に加えて物質的根拠を与えることで早期に病変部位を早期に発見させることができる。

本発明においては、蛍光色素が被験者に投与されたことを入力させる入力ステップと、入力ステップにより入力されてから所定時間経過後に、測定を開始させる測定開始ステップと、蛍光色素を励起させる光を眼底に対して照射させる照射ステップと、光により励起された際に発する蛍光色素の発光の強度を測定する測定ステップと、発光の強度に基づいて蛍光像を生成する生成ステップとを有する。

また本発明においては、コンピュータに対して、蛍光色素が被験者に投与されたことを入力させる入力ステップと、入力ステップにより入力されてから所定時間経過後に、測定を開始させる測定開始ステップと、蛍光色素を励起させる光を眼底に対して照射させる照射ステップと、光により励起された際に発する蛍光色素の発光の強度を測定する測定ステップと、発光の強度に基づいて蛍光像を生成する生成ステップとを実行させる。

さらに本発明においては、蛍光色素を励起させる短パルスの光を出射する光源と、蛍光色素が被験者に投与されたことを入力させる入力操作部と、入力操作部を介して入力されてから所定時間経過後に、測定を開始させる測定開始制御部と、蛍光色素を励起させる光を眼底に対して照射させる光源制御部と、光により励起された際に発する蛍光色素の発光の強度を測定する測定部と、発光の強度に基づいて蛍光像を生成する生成部とを有する。

これにより、ターゲットに標識していない蛍光色素が排出され、ターゲットに標識した蛍光色素だけの像を取得することができるので、ターゲットに標識した蛍光色素の蛍光像を精度よく取得することができ、また眼底病変部位に早期に出現する蛋白質をターゲットとして蛍光色素で標識した場合、その蛍光像を得ることで蛋白質を可視化し、形態学所見に加えて物質的根拠を与えることで早期に病変部位を早期に発見させることができる。

以上のように本発明によれば、２つの時刻における蛍光の強度に基づいてターゲットに標識した蛍光色素だけの蛍光像を取得することができるので、該ターゲットに標識していない蛍光色素をその像に写すことなく、ターゲットに標識した蛍光色素の蛍光像を精度よく取得することができ、また眼底病変部位に早期に出現する蛋白質をターゲットとして蛍光色素で標識した場合、その蛍光像を得ることで蛋白質を可視化し、形態学所見に加えて物質的根拠を与えることで早期に病変部位を早期に発見させることができ、かくして眼底の病変部位を早期に精度よく発見し得る蛍光像取得方法、蛍光像取得プログラム及び蛍光像取得装置を実現できる。

またターゲットに標識していない蛍光色素が排出され、ターゲットに標識した蛍光色素だけの像を取得することができるので、ターゲットに標識した蛍光色素の蛍光像を精度よく取得することができ、また眼底病変部位に早期に出現する蛋白質をターゲッットとして蛍光色素で標識した場合、その蛍光像を得ることで蛋白質を可視化し、形態学所見に加えて物質的根拠を与えることで早期に病変部位を早期に発見させることができ、かくして眼底の病変部位を早期に精度よく発見し得る蛍光像取得方法、蛍光像取得プログラム及び蛍光像取得装置を実現できる。

蛍光像取得装置を示す略線図である。 画像化装置の構成を示す略線図である。 蛍光像取得処理を実行するＣＰＵの機能的構成を示す略線図である。 蛍光寿命の変化を示すグラフである。 蛍光像取得処理手順の説明に供するフローチャートである。 他の実施の形態における蛍光像取得処理手順の説明に供するフローチャートである。

以下、発明を実施するための形態について説明する。なお、説明は以下の順序とする。
１．第１の実施の形態
２．他の実施の形態

＜１．実施の形態＞
［１−１．蛍光像取得装置の構成］
図１において、本一実施の形態による蛍光像取得装置１を示す。蛍光像取得装置１は、眼底の黄斑に溜まったドルーゼンの有無を検査する際に用いられる。

具体的に眼底の黄斑は、ドルーゼンが形成される段階でアミロイドβ蛋白が蓄積されることが知られている。このアミロイドβ蛋白は、βシート構造が層状に重なり凝集塊を形成する。（参考文献１、２参照）

参考文献１ Yoshida T, et al, “The potential role of amyloid b in the pathogenesis of age-related macular degeneration”, The Journal of Clinical Investigation, Vol.115, 2005, p.p2793-2800.

参考文献２ Dentchev T, et al, “Amyloid b is found in drusen from some age-related macular degeneration retinas, but not in drusen from normal retinas.”, Molecular Vision, Vol.9, 2003, p.p184-190.

一方、アルツハイマー病の原因とされるアミロイドβ蛋白の有無をＰＥＴ（Positron Emission Tomography）などで検出する際に標識化合物としてＡＯＩ（4,8-Dimethyl-2,3,8,9,10-pentahydro-1,6,11-trioxa-4-azonia-8,13-diazapentacene.tetrafluoroborate）が用いられる。ＡＯＩは、蛍光色素であり、アミロイドβ蛋白にだけ特異的に結合する。なお、ＡＯＩ以外にもアミロイドβ蛋白と特異的に結合し蛍光を発する標識化合物としてＢＦ２２７(2-[2-(2-Dimethylaminothiazol-5-yl)ethenyl]-6[2-(fluoro)ethoxy]benzoxazole)、ＦＳＢ（(trans,trans)-1-fluoro-2,5-bis(3-hydroxycarbonyl-4-hydroxy)styrylbenzene）、ＰＩＢ（2-[4’-(Methylamino)phenyl]-6-hydroxybenzothiazole）などを適応できる。

従って被験者にＡＯＩが投与されると、黄斑にドルーゼンが形成されている場合、該ドルーゼンに含まれるアミロイドβ蛋白にＡＯＩが結合する。

そこで蛍光像取得装置１は、予めＡＯＩを投与した被験者の眼底に該ＡＯＩを励起させるための光を照射して、そのときの眼底の蛍光像を取得することにより、加齢黄斑変性症における初期症状であるドルーゼンの蓄積をより早期に発見し得るようになされている。

蛍光像取得装置１は、信号発生器１１、短パルスレーザ１２、反射ミラー１３、波面補償光学素子１４、反射ミラー１５、ビーム径調整器１６、レーザ走査眼底鏡１７、バンドパスフィルタ１８、集光レンズ１９、受光器２０、信号遅延装置２１及び画像化装置２２により構成される。

画像化装置２２は、信号発生器１１、波面補償光学素子１４、ビーム径調整器１６、レーザ走査眼底鏡１７及び信号遅延装置２１を適宜制御するようになされており、その詳細は後述する。

信号発生器１１は、画像化装置２２からレーザ光の出力命令を受けて、例えば１０[ｐｓ]の短パルスのレーザ光を出力させるための出射信号を短パルスレーザ１２に送出すると共に、信号遅延装置２１に送出する。

短パルスレーザ１２は、波長が６２０[ｎｍ]から1０００[ｎｍ]の範囲で、信号発生器１１から供給された出射信号に基づいてパルス状のレーザ光を出射し得るようになされている。パルス幅は、１０[f sec]から100[p sec]の範囲で任意のものが適応される。

具体的には短パルスレーザ１２から出射されるレーザ光は、波長６３３[ｎｍ]、パルス幅が１０[ｐｓ]程度の場合、出力安定性が±５[％]程度、繰り返し周波数が８０[ＭＨｚ]、平均光出力が２００[ｍＷ]程度となる。出力は眼底に傷害がないエネルギーに調整される。

短パルスレーザ１２から出射されたレーザ光は、反射ミラー１３で反射されて波面補償光学素子１４に入射する。波面補償光学素子１４は、入射されたレーザ光の波面収差を補正すると共に該補正したレーザ光を反射して反射ミラー１５に導く。これにより波面補償光学素子１４は、水晶体１００Ａの個体差により発生する波面収差を補正することができる。

反射ミラー１５で反射されたレーザ光は、ビーム径を調節するためのビーム径調整器１６を透過し、レーザ走査眼底鏡１７に入射する。このビーム径調整器１６は、例えば２つのレンズにより構成されており、一方のレンズを光軸方向に移動させることによりレーザ光のビーム径を調節し得るようになされている。

レーザ走査眼底鏡１７は、ＸＹ平面（眼底１００Ｂにおいて光軸と直交する平面）でレーザ光を走査させるガルバノミラー等でなるＸＹスキャナ１７Ａ、Ｆθレンズ１７Ｂ、ダイクロイックミラー１７Ｃ、収差補正凸レンズ１７Ｄ及び１７Ｅにより構成される。

ビーム径調整器１６によりビーム径が調整されたレーザ光は、ＸＹスキャナ１７Ａで反射されてＦθレンズ１７Ｂを介してダイクロイックミラー１７Ｃを透過した後、収差補正凸レンズ１７Ｄ及び１７Ｅを介して目１００に入射する。

目１００に入射したレーザ光は、該目１００の水晶体１００Ａにより集光されて黄斑を含む眼底１００Ｂに照射される。なお、目１００に入射したレーザ光のエネルギーは、１［ｍＷ］以下が望ましい。

蛍光像取得装置１では、波長６３３［ｎｍ］のレーザ光に励起される蛍光色素であるＡＯＩが眼底１００Ｂに存在する場合、該蛍光像取得装置１から出射されたレーザ光により該ＡＯＩが励起される。

レーザ光によって励起されたＡＯＩは、波長が約６７０［ｎｍ］の蛍光を発する。この発光によって得られる光（以下、これを蛍光光とも呼ぶ）は、水晶体１００Ａ、収差補正凸レンズ１７Ｄ及び１７Ｅを透過してダイクロイックミラー１７Ｃで反射される。

このダイクロイックミラー１７Ｃは、例えば波長が６５０[ｎｍ]以上の光を反射し、それ未満の波長の光を透過するようになされており、短パルスレーザ１２から出射されたレーザ光を透過し、蛍光光を反射する。

ダイクロイックミラー１７Ｃによって反射された蛍光光はバンドパスフィルタ１８を透過し、集光レンズ１９によって集光されて受光器２０に到達する。このバンドパスフィルタ１８は、例えば中心波長が６７０[ｎｍ]で波長域が５０[ｎｍ]の光を透過する。

受光器２０は、例えばＭＣＰ（Multi Channel Plat）でなり、集光レンズ１９により集光された蛍光光を信号遅延装置２１から供給される遅延信号のタイミングに応じて受光し、その結果得られる蛍光光の強度（以下これを蛍光強度とも呼ぶ）を画像化装置２２に出力する。因みに受光器２０は、蛍光強度を例えばＴＣＳＰＣ（Time Correlated Single Photon Counting）法により所定測定回数に対する測定タイミング時の単光子の数に応じて測定する。

信号遅延装置２１は、信号発生器１１から出射信号が供給された時点を基準とし、該基準から所定時間経過後に受光器２０に照射された発光光の蛍光強度を測定させるための遅延信号を該受光器２０に送信する。

画像化装置２２は、ＸＹスキャナ１７Ａによるレーザ光の走査位置と、受光器２０で測定された蛍光強度との関係に基づいて蛍光像を生成し、該蛍光像のデータを記憶部に記憶する。

［１−２．画像化装置の構成］
次に、画像化装置２２の構成について説明する。この画像化装置２２は、図２に示すように、制御を司るＣＰＵ(Central Processing Unit)３１に対して各種ハードウェアを接続することにより構成される。

具体的にはＲＯＭ(Read Only Memory)３２、ＣＰＵ３１のワークメモリとなるＲＡＭ(Random Access Memory)３３、ユーザの操作に応じた命令を入力する操作入力部３４、インターフェイス部３５、表示部３６及び記憶部３７がバス３８を介して接続される。

ＲＯＭ３２には、各種の処理を実行するためのプログラムが格納される。インターフェイス部３５には、信号発生器１１、波面補償光学素子１４、ビーム径調整器１６、ＸＹスキャナ１７Ａ及び信号遅延装置２１などが接続される。

表示部３６には、液晶ディスプレイ、ＥＬ（Electro Luminescence）ディスプレイ又はプラズマディスプレイ等が適用される。また記憶部３７には、ＨＤ（Hard Disc）に代表される磁気ディスクもしくは半導体メモリ又は光ディスク等が適用される。

ＣＰＵ３１は、ＲＯＭ３２に格納される複数のプログラムのうち、操作入力部３４から与えられる命令に対応するプログラムをＲＡＭ３３に展開し、該展開したプログラムに従って、表示部３６及び記憶部３７を適宜制御する。

またＣＰＵ３１は、展開したプログラムに従って、信号発生器１１、波面補償光学素子１４、ビーム径調整器１６、ＸＹスキャナ１７Ａ及び信号遅延装置２１などを適宜制御するようになされている。

［１−３．蛍光像取得処理］
次に、ＡＯＩが投与された被験者の眼底１００Ｂの蛍光像を取得する蛍光像取得処理について説明する。

因みに、蛍光像取得処理を実行する前に、蛍光標識化合物であるＡＯＩを生理食塩水に例えば２[ｍｇ／ｋｇ]で溶解させ、それを例えば静脈注射により被験者に対して投与させる。

そしてＡＯＩが投与された被験者の眼底１００Ｂに該ＡＯＩが到達していることを確認させ、一定時間経過後、蛍光像取得処理を実行し、眼底全体及び黄斑部分の蛍光像を取得する。

ここで、被験者に投与させたＡＯＩは、眼底１００Ｂに到達すると、該眼底１００Ｂの黄斑にアミロイドβ蛋白が蓄積している場合、該アミロイドβ蛋白と結合する。アミロイドβ蛋白と結合したＡＯＩは、運動が制限されることにより蛍光寿命が延びる。

一方、アミロイドβ蛋白に結合しないＡＯＩは、腎臓及び肝臓で代謝され、投与されてから約１２０分後にその殆どが***される。

しかしながら投与から約１２０分後であってもアミロイドβ蛋白に結合していないＡＯＩが完全に黄斑から取り除かれているとは限らない。また被験者の負荷を軽減する目的でレーザ光の強度を低くする必要がある。

従って従来の方法では、蛍光像を取得する際、アミロイドβ蛋白に結合していないＡＯＩが該蛍光像に写ることもあり、またレーザ光の強度が低いためにノイズなどの影響でＳ／Ｎ（Signal/Noise）比も悪い。従って従来の方法では、アミロイドβ蛋白に結合したＡＯＩを蛍光像から区別できなくなってしまう恐れがある。

そこで蛍光像取得装置１は、アミロイドβ蛋白に結合したＡＯＩと結合していないＡＯＩとの蛍光寿命の違いに基づいて蛍光像を取得する。

具体的に蛍光像取得装置１は、ＡＯＩが投与された被験者の眼底１００Ｂに該ＡＯＩが到達していることを確認させてから一定時間（１２０分）経過後、蛍光像取得処理を実行させる。

ＣＰＵ３１は、蛍光像取得処理の実行命令を操作入力部３４から受けた場合、該実行命令に対応するプログラムに従って、図３に示すように駆動制御部４１、光源制御部４２、遅延制御部４３、検出部４４及び画像取得部４５として機能する。

駆動制御部４１は、ＸＹスキャナ１７Ａを駆動させ、所定位置にレーザ光が照射されるように該ＸＹスキャナ１７Ａを移動させる。

光源制御部４２は、短パルスレーザ１２からレーザ光を出射させるための出力信号を信号発生器１１に送出する。信号発生器１１は、出力信号が光源制御部４２から供給されると、短パルスレーザ１２に出射信号を送出して短パルスのレーザ光を出射させると共に、該出射信号を信号遅延装置２１に送出する。

遅延制御部４３は、受光器２０により蛍光強度を測定するタイミングを例えば操作入力部３４からの入力に応じて決定し、そのタイミングを示す信号を信号遅延装置２１に送出する。

信号遅延装置２１は、遅延制御部４３から供給された信号に基づいて、信号発生器１１から出射信号が供給された時点を基準として、該基準から所定時間経過した時刻ｔ１及びｔ２の時点で遅延信号を受光器２０に送出する。受光器２０は、遅延信号が供給されたタイミング、すなわち時刻ｔ１及びｔ２での蛍光強度を測定する。

因みに、時刻ｔ１及びｔ２は、ＡＯＩの蛍光寿命より短い時刻に設定される。また本実施においては、時刻ｔ１は、蛍光強度がピーク値とる時刻に設定されるが、他の時刻でもよい。

続いてＣＰＵ３１は、駆動制御部４１によりレーザ光が照射される位置を変更するように該ＸＹスキャナ１７Ａを移動させ、光源制御部４２及び遅延制御部４３の制御の基にその位置での時刻ｔ１及びｔ２の蛍光強度を測定させる。

このようにしてＣＰＵ３１は、ＸＹスキャナ１７Ａによりレーザ光を所定の撮像範囲で走査させ、それぞれの位置でレーザ光を出射した時点を基準とした時刻ｔ１及びｔ２での蛍光強度を受光器２０により測定させる。

ところで上述したように、アミロイドβ蛋白に結合したＡＯＩと結合していないＡＯＩとの蛍光寿命が異なる。そこで、アミロイドβ蛋白に結合したＡＯＩと結合していないＡＯＩとの蛍光寿命の関係を図４に示す。

図４において時刻ｔ０はレーザ光が出射された時点の時刻を示し、また実線はアミロイドβ蛋白に結合したＡＯＩの蛍光強度を示し、破線はアミロイドβ蛋白に結合していないＡＯＩの蛍光強度を示している。

そして受光器２０により測定される時刻ｔ１での蛍光強度Ｉ１は、励起されたＡＯＩの蛍光強度のピーク値であり、アミロイドβ蛋白に結合したＡＯＩと結合していないＡＯＩとで同一の値を示す。

しかしながら時刻ｔ２での蛍光強度は、蛍光寿命が異なることから、アミロイドβ蛋白に結合したＡＯＩの蛍光強度Ｉ２Ａの方が、アミロイドβ蛋白に結合していないＡＯＩの蛍光強度Ｉ２Ｂよりも大きな値を示す。因みに蛍光強度Ｉ２ＡとＩ２Ｂとを区別しない場合は蛍光強度Ｉ２とも呼ぶ。

そこで検出部４４は、ＸＹスキャナ１７Ａによる全ての走査位置における時刻ｔ１での蛍光強度Ｉ１と時刻ｔ２での蛍光強度Ｉ２との比（Ｉ２／Ｉ１）を算出して閾値と比較する。

閾値は、蛍光強度Ｉ１と蛍光強度Ｉ２Ａとの比（Ｉ２Ａ／Ｉ１）より小さく、かつ該蛍光強度Ｉ１と蛍光強度Ｉ２Ｂとの比（Ｉ２Ｂ／Ｉ１）以上の値に設定される。

検出部４４は、時刻ｔ１での蛍光強度Ｉ１と時刻ｔ２での蛍光強度Ｉ２との比が閾値以上の場合、アミロイドβ蛋白に結合したＡＯＩが発光した蛍光強度であると判断し、その位置をアミロイドβ蛋白と結合したＡＯＩの存在位置として検出する。

画像取得部４５は、閾値との比較結果に基づいて、アミロイドβ蛋白に結合したＡＯＩとして検出された位置をその位置の蛍光強度Ｉ１に応じた輝度値とし、それ以外の位置の輝度値を０（黒）とした蛍光像を生成する。

画像取得部４５は、生成された蛍光像のデータを取得し、記憶部３７に保存する。また画像取得部４５は、操作入力部３４の操作に応じて蛍光像を表示部３６に表示する。

[１−４．蛍光像取得処理手順]
次に、上述した蛍光像取得処理の手順について、図５に示すフローチャートを用いて説明する。

実際上、ＣＰＵ３１は、ルーチンＲＴ１の開始ステップから入って次のステップＳＰ１へ移る。ステップＳＰ１においてＣＰＵ３１は、ＸＹスキャナ１７Ａを駆動させ、所定位置にレーザ光が照射されるように該ＸＹスキャナ１７Ａを移動させ、次のステップＳＰ２に移る。

ステップＳＰ２においてＣＰＵ３１は、出力信号を信号発生器１１に送出し、該信号発生器１１を介して短パルスレーザ１２から短パルスのレーザ光を出射させ、次のステップＳＰ３に移る。

ステップＳＰ３においてＣＰＵ３１は、信号発生器１１から出射信号が供給された時点から所定時間経過した時刻ｔ１及びｔ２に受光器２０により測定された蛍光強度Ｉ１及びＩ２をそれぞれ取得し、次のステップＳＰ４に移る。

ステップＳＰ４においてＣＰＵ３１は、撮像範囲の全ての位置における蛍光強度を取得したか否かを判断し、否定結果が得られると、ステップＳＰ１に戻り、全ての位置における蛍光強度を取得するまで、ステップＳＰ１からＳＰ４を繰り返す。

これに対してステップＳＰ４において肯定結果が得られると、このことは撮像範囲の全ての位置における蛍光強度を取得したことを意味し、ＣＰＵ３１は次のステップＳＰ５に移る。

ステップＳＰ５においてＣＰＵ３１は、時刻ｔ１及びｔ２における蛍光強度Ｉ１及びＩ２の比と閾値を比較することにより、アミロイドβ蛋白に結合したＡＯＩの蛍光強度を検出し、次のステップＳＰ６に移る。

ステップＳＰ６においてＣＰＵ３１は、ステップＳＰ５における検出結果を基に、アミロイドβ蛋白に結合したＡＯＩの蛍光像を生成し、次のステップに移って処理を終了する。

[１−５．動作及び効果]
以上の構成において蛍光像取得装置１は、信号発生器１１を介して短パルスレーザ１２から短パルスのレーザ光を眼底１００Ｂに対して照射させ、該眼底１００Ｂにおけるターゲットとしてのアミロイドβ蛋白に結合した蛍光色素であるＡＯＩを励起させる。

蛍光像取得装置１は、レーザ光が出射された時点を基準にして、該基準から所定時間経過後の異なる２つの時刻ｔ１及びｔ２でのＡＯＩの蛍光強度Ｉ１及びＩ２を受光器２０を介して測定する。

蛍光像取得装置１は、時刻ｔ１及びｔ２での蛍光強度Ｉ１及びＩ２の比を算出し、アミロイドβ蛋白に結合して蛍光寿命が変化したＡＯＩだけを検出し得るように設定された閾値と比較することにより、アミロイドβ蛋白に結合したＡＯＩの蛍光強度を検出する。そして蛍光像取得装置１は、検出結果に基づいて蛍光像を生成するようにした。

これにより蛍光像取得装置１は、黄斑におけるドルーゼンに含まれるアミロイドβ蛋白に結合した蛍光色素（ＡＯＩ）だけが写し出された蛍光像を生成するので、アミロイドβ蛋白の有無を早期に発見することができる。

また蛍光像取得装置１は、時刻ｔ１及びｔ２での蛍光強度Ｉ１及びＩ２の比を用いるので、測定時点の蛍光強度に依存せず、蛍光寿命だけに依存してアミロイドβ蛋白に結合したＡＯＩを検出することができる。

蛍光像取得装置１は、従来の眼底カメラにおけるドルーゼンの観察と比較して、アミロイドβ蛋白に結合した蛍光色素（ＡＯＩ）の蛍光を観察する方が、よりドルーゼンが小さい段階で発見することができるので、より早期に精度よく発見することができる。

また蛍光像取得装置１は、時刻ｔ１及びｔ２での蛍光強度Ｉ１及びＩ２の比を用いてアミロイドβ蛋白に結合した蛍光色素（ＡＯＩ）だけを検出するので、アミロイドβ蛋白に結合せず浮遊している蛍光色素（ＡＯＩ）を蛍光像から除外することができる。

従って蛍光像取得装置１は、アミロイドβ蛋白に結合せず浮遊している蛍光色素（ＡＯＩ）を蛍光像に写し出すことがないので、より正確にアミロイドβ蛋白の有無を発見させることができる。

また蛍光像取得装置１は、被験者に蛍光色素（ＡＯＩ）を投与してから一定時間（１２０分）経過してから蛍光像を撮像しなくても、アミロイドβ蛋白に結合していない蛍光色素（ＡＯＩ）を蛍光像に写し出すことがないので、撮像開始までの待ち時間、すなわち検査時間を短縮することができる。

ところでアミロイドβ蛋白と特異的に結合する蛍光標識化合物は紫外線で励起されるものが多い。しかしながら眼底に紫外線を照射する場合、角膜や水晶体により吸収され、眼底に紫外線が届きにくい。そのため紫外線を用いて蛍光像を取得する場合、該紫外線の光の強度を強くしなくてはならず、被験者の目に負担を与えてしまうことになる。

これに対して蛍光像取得装置１は、波長が例えば６３３［ｎｍ］の赤外線領域のレーザ光を用いるので、弱いエネルギーの光でも眼底１００Ｂにその光が届き、蛍光像を取得することができるので、被験者の目に対する負担を大幅に緩和することができる。

以上の構成によれば、ターゲットであるアミロイドβ蛋白に結合することにより蛍光寿命が変化する蛍光色素を励起させる短パルスのレーザ光を眼底１００Ｂに照射させる。そしてレーザ光を照射した時点を基準として、該基準から所定時間経過後の異なる２つの時刻ｔ１及びｔ２の蛍光強度Ｉ１及びＩ２を測定し、該時刻ｔ１及びｔ２における蛍光強度Ｉ１及びＩ２の比を基にターゲットに結合した蛍光色素の蛍光像を生成する。

これにより蛍光像取得装置１は、黄斑におけるドルーゼンに含まれるアミロイドβ蛋白に結合した蛍光色素（ＡＯＩ）だけを写し出した蛍光像を生成するので、ドルーゼンの有無を早期に精度よく発見することができる。

＜２．他の実施の形態＞
上述した実施の形態においては、時刻ｔ１及びｔ２における蛍光強度の比を算出し、該比が閾値以上であった場合、アミロイドβ蛋白に結合した蛍光色素として検出し、検出結果に基づいて蛍光像を生成するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、レーザ光が出射されてから所定時間経過した時点での蛍光強度に基づいて蛍光像を生成するようにしてもよい。

具体的にＣＰＵ３１は、蛍光像の取得命令を操作入力部３４から受けた場合、該取得命令に対応するプログラムをＲＡＭ３３に展開し、図６に示すフローチャートに従って処理を実行する。なお、この場合、短パルスレーザ１２としてフェムト秒レーザを適応することもできる。

実際上、ＣＰＵ３１は、ルーチンＲＴ２の開始ステップから入って次のステップＳＰ１１へ移る。ステップＳＰ１１においてＣＰＵ３１は、被験者にＰＩＢが投与されたことを例えば操作入力部３４を介して入力させ、次のステップＳＰ１２に移る。なお、ＡＯＩに代えて、ＰＩＢを用いた場合は、具体的には、励起にはフェムト秒レーザを用い、励起波長に８００nmを用い、取得する蛍光波長は４００nmから４５０nmを用いる。

ステップＳＰ１２においてＣＰＵ３１は、ステップＳＰ１１で入力されてから、ＰＩＢが***される所定時間（１２０分）経過したとき、測定開始できることを例えば表示部３６を介してユーザに通知し、次のステップＳＰ１３に移る。

ステップＳＰ１３においてＣＰＵ３１は、ＸＹスキャナ１７Ａを駆動させ、所定位置にレーザ光が照射されるように該ＸＹスキャナ１７Ａを移動させ、次のステップＳＰ１４に移る。

ステップＳＰ１４においてＣＰＵ３１は、出力信号を信号発生器１１に送出し、該信号発生器１１を介して短パルスレーザ１２から短パルスのレーザ光を出射させ、次のステップＳＰ１５に移る。

ステップＳＰ１５においてＣＰＵ３１は、信号発生器１１から出射信号が供給された時点から所定時間経過後に受光器２０により測定された蛍光強度を取得し、次のステップＳＰ１６に移る。

ステップＳＰ１６においてＣＰＵ３１は、撮像範囲の全ての位置における蛍光強度を取得したか否かを判断し、否定結果が得られると、ステップＳＰ１３に戻り、全ての位置における蛍光強度を取得するまで、ステップＳＰ１３からＳＰ１６を繰り返す。

これに対してステップＳＰ１６において肯定結果が得られると、このことは撮像範囲の全ての位置における蛍光強度を取得したことを意味し、ＣＰＵ３１は次のステップＳＰ１７に移る。

ステップＳＰ１７においてＣＰＵ３１は、ＸＹスキャナ１７Ａによるレーザ光の走査位置と、受光器２０で測定された蛍光強度との関係に基づいて蛍光像を生成し、次のステップに移って処理を終了する。

このように蛍光像取得装置１は、レーザ光が出射されてから所定時間経過した時点での蛍光強度に基づいて蛍光像を生成しても、アミロイドβ蛋白に結合したＰＩＢだけの蛍光像を生成するので、より早期に精度よく発見することができる。

上述した実施の形態においては、アミロイドβ蛋白に結合する蛍光色素を用いて、アミロイドβ蛋白の有無を検出するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、蛋白質に特異的に結合し、結合した際に蛍光寿命が変化する蛍光色素を用いて、眼底における他の蛋白質を対象とするようにしてもよい。

上述した実施の形態においては、アミロイドβ蛋白と結合することにより蛍光寿命が変化する蛍光色素を用いるようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、アミロイドβ蛋白と結合することにより波長が変化する蛍光色素を用い、結合した際に発せられる波長の蛍光を撮像することにより蛍光像を生成するようにしてもよい。

さらに上述した実施の形態においては、ＣＰＵ３１がＲＯＭ３２に格納されているプログラムに従い、上述した蛍光像取得処理を行うようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、記憶媒体からインストールしたり、インターネットからダウンロードしたプログラムに従って上述した蛍光像取得処理を行うようにしても良い。またその他種々のルートによってインストールしたプログラムに従って上述した蛍光像取得処理を行うようにしても良い。

さらに上述した実施の形態においては、光源として短パルスレーザ１２、光源制御部として駆動制御部４１、検出部として検出部４４、生成部として画像取得部４５が設けられるようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、その他種々の構成でなる光源、光源制御部、検出部及び生成部を設けるようにしても良い。

本発明は、生物実験又は患者の経過観察などのバイオ産業上において利用可能である。

１……蛍光像取得装置、１１……信号発生器、１２……短パルスレーザ、１３……反射ミラー１５……波面補償光学素子、１５……反射ミラー、１６……ビーム径調整器、１７……レーザ走査眼底鏡、１７Ａ……ＸＹスキャナ、１８……バンドパスフィルタ、１９……集光レンズ、２０……受光器、２１……信号遅延装置、２２……画像化装置、３１……ＣＰＵ、３２……ＲＯＭ、３３……ＲＡＭ、３４……操作入力部、３５……インターフェイス部、３６……表示部、３７……記憶部、３８……バス、４１……駆動制御部、４２……光源制御部、４３……遅延制御部、４４……検出部、４５……画像取得部。

Claims (5)

1. 蛍光色素を励起させる短パルスの光を眼底に対して照射させる照射ステップと、
   上記光が出射された時点を基準として、該基準から所定時間経過後の異なる２つの時刻における上記蛍光色素の発光の強度を測定し、該異なる２つの時刻における発光の強度の比を検出する検出ステップと、
   上記検出ステップによる検出結果を基に、ターゲットに標識した蛍光色素の蛍光像を生成する生成ステップと
   を有する蛍光像取得方法。
2. 上記蛍光色素は、ターゲットに標識すると蛍光寿命が変化する
   請求項１に記載の蛍光像取得方法。
3. 上記照射ステップでは、赤外領域の短パルスの光を眼底に対して照射させる
   請求項１に記載の蛍光像取得方法。
4. コンピュータに対して、
   蛍光色素を励起させる短パルスの光を眼底に対して照射させる照射ステップと、
   上記光が出射された時点を基準として、該基準から所定時間経過後の異なる２つの時刻の発光の強度を測定し、該異なる２つの時刻における発光の強度の比を検出する検出ステップと、
   上記検出ステップによる検出結果を基に、ターゲットに標識した蛍光色素の蛍光像を生成する生成ステップと
   を実行させる蛍光像取得プログラム。
5. 蛍光色素を励起させる短パルスの光を出射する光源と、
   上記光源から眼底に対して上記光を照射させる光源制御部と、
   上記光が出射された時点を基準として、該基準から所定時間経過後の異なる２つの時刻の発光の強度を測定し、該異なる２つの時刻における発光の強度の比を検出する検出部と、
   上記検出部による検出結果を基に、ターゲットに標識した蛍光色素の蛍光像を生成する生成部と
   を有する蛍光像取得装置。

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