JP2022553737A - ポリヌクレオチド連結バイオコンジュゲートならびにその作製方法および使用方法 - Google Patents
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Abstract
本明細書に提供されるのは、核酸リンカーを介してコンジュゲート成分に連結された抗体またはビーズなどの基質を含むポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートである。そのようなバイオコンジュゲートを作製および使用する方法も提供される。バイオコンジュゲートを作成するためのコンジュゲーション方法は安定しており、化学的に過酷ではなく、コンジュゲーション後の精製が必要とされ得ないほど十分に効率的である。さらに、本開示は、コンジュゲーション対ごとに多くの固有のリンカーの必要性を排除することによって、製品ラインに関連するロジスティックオーバーヘッドの低減を提供する。【選択図】図1
Description
分子を抗体などのタンパク質にコンジュゲートさせるために使用される現在の化学は、化学的に過酷であり、抗体および/または抗体にコンジュゲートされる分子の生物学的活性を変えることにおいて本来備え持つ危険性を伴う。さらに、蛍光色素コンジュゲート化抗体を用いると、使用される化学物質は各抗体上に蛍光色素分子の分布を生成する。例えば、NHS-エステルコンジュゲーション化学物質と最先端のポリマー色素を使用すると、最終的にポアソン分布で各抗体にコンジュゲートされた、2~10個の色素分子の分布がもたらされる。これにより、測定値の根本的な変動性(したがって、ノイズ)が増大し、そのような色素コンジュゲート化抗体を使用して生体分子を定量化する能力も損なわれる。これらのコンジュゲーション化学物質はまた、非効率的であり、過剰な色素を必要とし、これはコストに影響を与えるだけでなく、最終製品中に遊離した非結合色素が含まれるリスクを高める。表1は、分子を抗体に付着させるために使用されるいくつかの現在の技術を示す。
さらに、関連する潜在的な過酷な化学作用および現在利用可能な色素の固有の「粘着性」のために、コンジュゲーション後の色素の精製は、生体分子コンジュゲートの現在の製造において必要なステップである。
本明細書には、核酸リンカーを介してコンジュゲート成分に連結された結合分子を含むポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲートが提供される。
本明細書には、核酸リンカーを介してコンジュゲート成分に連結されたビーズを含むポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲートも提供される。
提供されるのは、本開示のポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲートまたは本開示のポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲートを生成する方法であって、(i)少なくとも部分的に一本鎖核酸リンカーを含むポリヌクレオチド修飾基質を、少なくとも部分的に一本鎖核酸リンカーを含むポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触させることであって、基質が結合分子またはビーズであり、基質の一本鎖リンカー配列の少なくとも一部分がコンジュゲート成分の一本鎖リンカー配列の一部分に相補的であり、接触するときに、基質の核酸リンカーおよびコンジュゲート成分の核酸リンカーがアニールして、基質をコンジュゲート成分に連結する少なくとも部分的に二本鎖のリンカーを形成する、接触させること、(ii)基質をコンジュゲート成分と接触させることであって、基質が結合分子またはビーズである、接触させること、核酸リンカーを基質に付着させること、および、同じ核酸リンカーをコンジュゲート成分に付着させて、ポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲートを形成すること、(iii)核酸リンカーを含むポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分を基質と接触させることであって、基質が結合分子またはビーズである、接触させること、および、ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分の核酸リンカーを基質に付着させて、ポリヌクレオチド修飾結合分子またはビーズバイオコンジュゲートを形成すること、(iv)核酸リンカーを含むポリヌクレオチド修飾基質をコンジュゲート成分と接触させることであって、基質が結合分子またはビーズである、接触させること、および、ポリヌクレオチド修飾基質の核酸リンカーをコンジュゲート成分に付着させて、ポリヌクレオチド修飾結合分子またはビーズバイオコンジュゲートを形成すること、あるいは(v)(i)少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを含むポリヌクレオチド修飾基質であって、基質が結合分子またはビーズである、ポリヌクレオチド修飾基質と、(ii)少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを含むポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と、(iii)(i)または(ii)の核酸リンカーではない、さらなる核酸リンカーセグメントと、を接触させることであって、基質の一本鎖リンカー配列の少なくとも一部分は、さらなる核酸リンカーセグメント(iii)の一本鎖部分に相補的であり、かつ/または、コンジュゲート成分の一本鎖リンカー配列の少なくとも一部分は、さらなる核酸リンカーセグメント(iii)の一本鎖部分に相補的であり、接触するとき、基質の核酸リンカー、コンジュゲート成分の核酸リンカー、およびさらなる核酸リンカーセグメントがアニールして、基質をコンジュゲート成分に連結する少なくとも部分的に二本鎖のリンカーを形成する、接触させること、を含む、方法である。
本明細書に提供されるのは、検出のための標識結合分子を生成する高率の方法であって、同じ結合分子の別個の結合分子の分子が異なるコンジュゲート成分で標識され、方法が、(a)少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを同じ結合分子の少なくとも2つの別個の結合分子の分子に付着させて、複数のポリヌクレオチド修飾結合分子の分子を生成することと、(b)複数の少なくとも1つのポリヌクレオチド修飾結合分子の分子を、少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを含む第1のポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触させ、複数の少なくとも1つの異なるポリヌクレオチド修飾結合分子の分子を、少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを含む第2のポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触させることであって、第1および第2のポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分が検出標識を含み、少なくともそれらの検出標識が異なる、接触させることと、を含み、結合分子の分子の核酸リンカーの一本鎖配列の少なくとも一部分は、第1および/または第2のコンジュゲート成分の核酸リンカーの一本鎖配列に相補的であり、接触するとき、核酸リンカーがアニールして、結合分子の分子をコンジュゲート成分に連結する二本鎖リンカーを形成する、方法である。
本明細書に提供されるのは、検出のための標識結合分子を生成する高率の方法であって、異なる結合分子が同じコンジュゲート成分で標識され、方法が、(a)少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを少なくとも2つの異なる結合分子に付着させて、少なくとも2つの異なるポリヌクレオチド修飾結合分子を生成することと、(b)少なくとも2つの異なるポリヌクレオチド修飾結合分子を、検出標識を含み、少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを含むポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触させることと、を含み、結合分子の核酸リンカーの一本鎖配列の少なくとも一部分は、コンジュゲート成分の核酸リンカーの一本鎖配列に相補的であり、接触するときに、核酸リンカーがアニールして、結合分子をコンジュゲート成分に連結する二重鎖リンカーを形成する、方法である。
本明細書に提供されるのは、組成物であって、(i)(a)少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを含む基質であって、基質が結合分子またはビーズである、基質、および(i)(b)少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを含むコンジュゲート成分であって、基質の核酸リンカーの一本鎖配列の少なくとも十分な部分は、リンカーがアニールし、基質をコンジュゲート成分に連結する少なくとも部分的に二本鎖のリンカーを形成することを可能にするために、コンジュゲート成分の核酸リンカーの一本鎖配列の一部分に相補的である、コンジュゲート成分、(ii)(a)核酸リンカーを含む基質であって、基質が、結合分子またはビーズである、基質、および(ii)(b)核酸リンカーに付着して、基質をコンジュゲート成分に連結することができるコンジュゲート成分、(iii)(a)核酸リンカーを含むコンジュゲート成分、(iii)(b)核酸リンカーに付着して、コンジュゲート成分を基質に連結することができる基質、(iv)(a)核酸リンカーに付着することができる基質であって、基質が、結合分子またはビーズであり、コンジュゲート成分は核酸リンカーに付着することができる、基質、および(iv)(b)核酸リンカーであって、核酸リンカーが、一本鎖であるか、二本鎖セグメントを含むか、または核酸リンカーが全体的に二本鎖である、核酸リンカー、あるいは(v)(a)少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを含む基質であって、基質が結合分子またはビーズである、基質、(v)(b)少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを含むコンジュゲート成分、および(v)(c)さらなる核酸リンカーセグメント、を含み、(v)(a)、(v)(b)、および(v)(c)がアニールして、(v)(a)、(v)(b)、および(v)(c)を含み、かつ(v)(a)を(v)(b)に連結する少なくとも部分的に二本鎖の核酸リンカーを形成することができる、組成物である。
本明細書に提供されるのは、細胞、組織、および/または器官を標識する方法であって、方法が、細胞、組織、および/または器官を、ポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲートと接触させることを含み、バイオコンジュゲートの結合分子部分が、細胞、組織、および/または器官の抗原、エピトープ、および/またはハプテンに結合し、バイオコンジュゲートのコンジュゲート成分部分が、検出可能な標識を含む、方法である。
本明細書に提供されるのは、標識された細胞、組織、および/または器官からのシグナルを定量的に測定する方法であって、方法が、細胞、組織、および/または器官を、本開示のポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲートと接触させることであって、バイオコンジュゲートの結合分子部分が、細胞、組織、および/または器官の抗原、エピトープ、および/またはハプテンに結合し、バイオコンジュゲートのコンジュゲート成分部分が、検出可能な標識を含む、接触させることと、ポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲートの存在を測定することであって、結合分子のDoLが既知であり、したがって、定量的測定を行うことが可能である、方法である。
本明細書に提供されるのは、本開示のポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲートを生成し、本開示のポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲートを生成し、本開示の組成物を生成し、または本開示の方法のいずれかを実行するために必要な1つ以上の成分を含むキットである。
定義.
「a」または「an」エンティティという用語は、そのエンティティの1つ以上を指すことに留意されたく、例えば、「リンカー(a linker)」は、1つ以上のリンカーを表すと理解される。したがって、「a」(または「an」)、「1つ以上」、および「少なくとも1つ」という用語は、本明細書では交換可能に使用され得る。
「a」または「an」エンティティという用語は、そのエンティティの1つ以上を指すことに留意されたく、例えば、「リンカー(a linker)」は、1つ以上のリンカーを表すと理解される。したがって、「a」(または「an」)、「1つ以上」、および「少なくとも1つ」という用語は、本明細書では交換可能に使用され得る。
さらに、本明細書で使用される「および/または」は、他を有するまたは有しない特定の特徴または構成要素の各々の特定の開示として解釈されるべきである。したがって、本明細書の「Aおよび/またはB」などの句で使用される用語は「および/また」は、「AおよびB」、「AまたはB」、「A」(単独)、および「B」(単独)を含むことが意図される。同様に、「A、B、および/またはC」などの句で使用される「および/または」という用語は、以下の実施形態の各々を包含することを意図する:A、B、およびC;A、BまたはC;AまたはC;AまたはB;BまたはC;AおよびC;AおよびB;BおよびC;A(単独);B(単独);ならびにC(単独)。
態様が「含む(comprising)」または「含む(comprises)」という言葉で本明細書に記載される場合は常に、「からなる(consisting of)」、「からなる(consists of)」、「本質的にからなる(consisting essentially of)」、および/または「本質的にからなる(consists essentially of)」に関して記載される類似の態様も提供されることが理解される。
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が関連する当業者が一般的に理解しているのと同じ意味を有する。
数値範囲には、範囲を定義する数が含まれる。「およびその間の任意の範囲」などによって明示的に特定されない場合でも、値のリスト、例えば、1、2、3、または4が列挙される箇所では、特に明記しない限り、本開示は、具体的に、エンドポイント、例えば、1~3、1~4、2~3、2~4などを含む、値の間の任意の範囲を含む。
本明細書で提供される見出しは、単に参照を容易にするためのものであり、本開示の様々な態様または態様の制限ではなく、それらは、本明細書を全体として参照することによって有することができる。
本明細書で使用される場合、「リンカー」は、分子の他の構成要素を一緒に連結することを目的とするコンジュゲート分子の構成要素であり、またはコンジュゲート分子の他の構成要素が互いに連結されない場合には、構成要素の部分は別の構成要素に結合する目的のために存在するが、そうでなければ必ずしも存在するとは限らない。例えば、抗体は通常または必ずしもそれに付着したポリヌクレオチドを有しないが、本開示の目的のために、ポリヌクレオチドを抗体に付着させて抗体を別の分子に連結するリンカーを形成して、ポリヌクレオチド修飾抗体バイオコンジュゲートを形成することができる。
本明細書で使用される場合、「天然に存在しない」物質、組成物、エンティティ、および/または物質、組成物、もしくはエンティティの任意の組み合わせという、またはそれらの文法的異表記の用語は、当業者が「天然に存在する」として十分に理解している、または裁判官または行政機関または司法機関によって「天然に存在する」として判断または解釈されたときはいつでも存在する可能性がある、物質、組成物、エンティティ、および/または物質、組成物、または実体の任意の組み合わせの形態を、明示的に除外するが、それらのみを除外する条件付き用語である。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、単一の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含するように意図され、アミド結合(ペプチド結合としても知られる)によって直線的に連結されたモノマー(アミノ酸)から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、2つ以上のアミノ酸の任意の鎖または複数の鎖を指し、生成物の特定の長さを指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または2つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語の代わりに、またはこれらの用語のいずれかと交換可能に使用され得る。「ポリペプチド」という用語はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護/保護基による誘導体化、タンパク質分解的切断、または非標準アミノ酸による修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの発現後修飾の生成物を指すことが意図される。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来するか、または組換え技術によって産生され得るが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるとは限らない。それは、化学合成を含むあらゆる様式で生成され得る。
本明細書で使用される「タンパク質」は、単一のポリペプチド、すなわち、上記で定義された単一のアミノ酸鎖を指し得るが、例えば、ジスルフィド結合、水素結合、または疎水性相互作用によって結合されて、多量体タンパク質を生成する2つ以上のポリペプチドを指し得る。
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、変異体、もしくは誘導体は、その自然環境に存在しないポリペプチドが意図される。特定のレベルの精製は必要ない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然または自然環境から除去され得る。宿主細胞で発現される組換え産生ポリペプチドおよびタンパク質は、任意の好適な技術によって分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製された組換えポリペプチドと同様に、本明細書に開示されるように単離されたと見なされる。
本明細書で使用される場合、「天然に存在しない」ポリペプチドという、またはその任意の文法的異表記の用語は、当業者が「天然に存在する」として十分に理解している、または裁判官または行政機関または司法機関によって「天然に存在する」として判断または解釈されたときはいつでも存在する、ポリペプチドの形態を、明示的に除外するが、それらのみを除外する条件付き用語である。
本明細書に開示される他のポリペプチドは、前述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、または変異体、およびそれらの任意の組み合わせである。本明細書に開示されるポリペプチドサブユニットまたは多量体タンパク質を指す場合の「断片」、「変異体」、「誘導体」および「類似体」という用語は、完全なポリペプチドまたはタンパク質の活性の少なくとも一部を保持するが、構造的に異なる、任意のポリペプチドまたはタンパク質を含み得る。ポリペプチドの断片には、例えば、タンパク質分解断片、ならびに欠失断片が含まれる。変異体には、上記のような断片、およびアミノ酸置換、欠失、または挿入のために改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。変異体は自発的に発生し得、または意図的に構築され得る。意図的に構築された変異体は、当該技術分野で知られている突然変異誘発技術を使用して生成され得る。変異体ポリペプチドは、同類または非同類アミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。誘導体は、天然のポリペプチドには見られない追加の特徴を示すように改変されているポリペプチドである。例としては、融合タンパク質が含まれる。誘導体ポリペプチドはまた、本明細書では「ポリペプチド類似体」と呼ばれ得る。本明細書で使用される場合、「誘導体」は、官能性側基の反応によって化学的に誘導体化された1つ以上のアミノ酸を有する対象のポリペプチドを指し得る。「誘導体」として挙げられるのは、20個の標準アミノ酸の1つ以上の標準または合成アミノ酸誘導体を含むペプチドである。例えば、4-ヒドロキシプロリンがプロリンに対して置換され得、5-ヒドロキシリシンがリシンに対して置換され得、3-メチルヒスチジンがヒスチジンに対して置換され得、ホモセリンがセリンに対して置換され得、オルニチンがリジンに対して置換され得る。
本明細書で使用される場合、「結合分子」という用語は、その最も広い意味で、別の標的分子、部分、または抗原に特異的に結合する分子を指す。結合分子には、抗体などの抗原決定基に特異的に結合し得る分子が含まれ、および受容体リガンド(例えば、ガストリン放出ペプチド(GRP)およびガストリン放出ペプチド受容体(GRPR))などの受容体に結合し得る分子も含まれる。したがって、結合分子の代表的な例としては、ペプチド、組換え、天然、または操作された受容体/リガンドタンパク質、アプタマー、テトラマー(T細胞受容体を検出するために使用されるペプチドを有する折り畳まれたMHCタンパク質)、非抗体タンパク質または抗体模倣物、例えば、アフィリンが挙げられる。アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ファイノマー、クニッツドメインペプチド、nanoCLAMP、設計アンキリンリピートタンパク質(DARPin)、モノボディ、ナノボディ、アンチカリン、アフィボディ、およびSOMAmer(さらなる例は、Global Bioanalysis Consortium(GBC)およびEuropean Medicines Agency「重要な試薬を分析物特異的または結合試薬、具体的には抗体、ペプチド、操作されたタンパク質、抗体、タンパク質およびペプチドコンジュゲート、試薬、アプタマーおよび陽性および陰性コントロールを含む抗薬物抗体(ADA)試薬(King et al.2014))が挙げられる。
本明細書に開示されるのは、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を含む特定の結合分子である。天然に存在する抗体などのフルサイズ抗体を特に指す場合を除き、「結合分子」という用語は、二重特異性抗体(例えば、第1のエピトープに結合する第1の結合ドメイン、および第2のエピトープに結合する第2の結合ドメインを含む)を含むフルサイズの抗体、ならびにそのような抗体の抗原結合断片、変異体、類似体、または誘導体、例えば、天然に存在する抗体または免疫グロブリン分子、または操作された抗体分子または抗体分子と同様の様式で抗原に結合する断片を包含する。
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書では交換可能に使用され得る。脊椎動物のシステムにおける基本的な免疫グロブリンの構造は、比較的よく理解されている。例えば、Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbour Laboratory Press,2nd ed.1988)を参照されたい。抗体またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体として、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Fab、Fab’およびF(ab’)2、Fd、Fvs、一本鎖Fv(scFv)、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、VLまたはVHドメインのいずれかを含む断片、Fab発現ライブラリによって生成された断片が挙げられるが、これらに限定されない。ScFv分子は、当該技術分野で知られており、例えば、米国特許第5,892,019号に記載されている。本開示に含まれる免疫グロブリンまたは抗体分子は、任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)または免疫グロブリン分子のサブクラスであり得る。
本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、免疫反応性領域または部位が第1の種から得られるかまたはそれに由来し、定常領域(無傷、部分的であり得るまたは修飾され得る)が第2の種から得られる任意の抗体を意味すると解釈される。いくつかの実施形態において、標的結合領域または部位は、非ヒト供給源(例えば、マウスまたは霊長類)に由来し、定常領域はヒトである。
本明細書で使用される「二重特異性抗体」という用語は、単一の抗体分子内に2つの異なる抗原に対する結合部位を有する抗体を指す。標準的な抗体構造に加えて他の分子が2つの結合特異性で構築され得ることが理解されるであろう。さらに、二重特異性抗体による抗原結合は同時または連続的であり得ることが理解されであろう。トリオーマおよびハイブリッドハイブリドーマは、二重特異性抗体を分泌することができる細胞株の2つの例である。二重特異性抗体はまた、組換え手段によって構築され得る。(Strohlein and Heiss,Future Oncol.6:1387-94(2010);Mabry and Snavely,IDrugs.13:543-9(2010))。二重特異性抗体はまた、二重特異性抗体であり得る。
本明細書で使用される場合、「操作された抗体」という用語は、重鎖および軽鎖のいずれかまたは両方の可変ドメインが、既知の特異性の抗体からの1つ以上のCDRの少なくとも部分的な置換によって、および部分的フレームワーク領域置換および連続した変更によって改変された抗体を指す。CDRは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスまたはさらなるサブクラスの抗体に由来し得るが、CDRは、異なるクラスの抗体、例えば、異なる種由来の抗体に由来することが想定される。既知の特異性の非ヒト抗体由来の1つ以上の「ドナー」CDRがヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域にグラフトされる操作された抗体は、本明細書では「ヒト化抗体」と呼ばれる。場合によっては、ある可変ドメインの抗原結合能力を別の可変ドメインに移すために、すべてのCDRがドナー可変領域由来の完全なCDRに置き換えられるわけではなく、代わりに、標的結合部位の活性を維持する最小限のアミノ酸が移される。例えば、米国特許第5,585,089号、同第5,693,761号、同第5,693,762号、および同第6,180,370号に記載される説明を考慮すると、それは、日常的な実験を実施するか、または試行錯誤して、機能的に操作されるまたはヒト化された抗体取得するかのいずれかにより、当業者の能力の範囲内に十分入るであろう。
「ポリヌクレオチド」という用語は、単一の核酸、ならびに、例えば、合成塩基を含むようなDNAまたはRNAまたはその類似体を指す「核酸」を有する複数の核酸を包含することが意図される。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたは核酸は、DNAである。他の実施形態では、ポリヌクレオチドはRNAであり得る。核酸またはポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合または非従来の結合(例えば、ペプチド核酸(PNA)に見られるようなアミド結合)を含み得る。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドとは、単離された核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)またはプラスミドDNA(pDNA)などの自然環境から除去されたDNAまたはRNAであることが意図される。例えば、ベクターに含まれるポリペプチドサブユニットをコードする組換えポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるように単離されたと見なされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞で維持される組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の精製された(部分的または実質的に)ポリヌクレオチドが含まれる。単離されたRNA分子には、ポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロRNA転写物が含まれる。単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成的に生成されたそのような分子をさらに含む。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節要素であり得るか、またはそれらを含み得る。
本明細書で使用される場合、「天然に存在しない」ポリヌクレオチド、またはその任意の文法的異表記は、当業者が「天然に存在する」として十分に理解している、または裁判官または行政機関または司法機関によって「天然に存在する」として判断または解釈されたときはいつでも存在する、ポリヌクレオチドの形態を、明示的に除外するが、それらのみを除外する条件付き用語である。
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、または「の治療」という用語(例えば、「対象を治療する」という句において)は、対象がより長い生存率または軽減した不快感を有する程度まで、疾患の病状の可能性を低減し、疾患の症状の発生を低減することを指す。例えば、治療は、対象に投与されたときの、疾患の症状、徴候、または原因を軽減するための治療の能力を指し得る。治療はまた、少なくとも1つの臨床症状および/または状態の進行の阻害または遅延、および/または疾患または病気の発症の予防または遅延を軽減または減少させることを指す。
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後、または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象としてはト、飼育動物、家畜、スポーツ動物、および動物園の動物が含まれ、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、ラクダ、クマなどが含まれる。哺乳動物対象には、ゾウ、キリン、シカ、カンガルー、大型ネコ科動物などの野生動物も含まれる。
「医薬組成物」という用語は、有効成分の生物学的活性が効果的であることを可能にするような形態にあり、組成物が投与される対象に対して容認できないほど毒性を有する追加の成分を含まない調製物を指す。そのような組成物は無菌であり得る。
本明細書に開示される試薬の「有効量」は、具体的に記載された目的を実施するのに十分な量である。「有効量」は、記載された目的に関連して、経験的にかつ規則的な様式で決定され得る。
本明細書で使用される場合、「バイオコンジュゲート」という用語は、生物学的リンカー(すなわち、核酸リンカー)の使用を呼び起こし、基質分子および/またはコンジュゲート成分の生物学的または合成的起源に関係なく、核酸リンカーを介してコンジュゲート成分(本明細書の他の場所に開示される)に連結された基質分子(例えば、結合分子または本明細書の他の場所に記載されるビーズ)を指す。
本明細書で使用される場合、「ビーズ」という用語は「ポリスチレンミクロスフェア」を指し、これらの用語は全体を通して交換可能に使用される。特定の実施形態では、標識(例えば、PHITONS)は、ドーパントを用いてポリマーミクロスフェアを形成することによってビーズ内に内在化させることができる。
本明細書で使用される場合、「PHITON」は、ノースカロライナ州ダーラムのPhitonex、Inc.によって製造されたオリゴヌクレオチドベースのナノ粒子である。
本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、「相補的塩基対形成」は、A/T、A/U、またはC/G塩基対形成、ならびに合成または非標準ヌクレオチドの対応する対形成、例えば、イソシトシン/イソグアニン(isoC/isoG)を指す。チミジン(T)が核酸における塩基として指定される限り、本開示を単純化する目的で、別段の指定がない限り、ウラシル(U)は、核酸がRNAである場合に意図されることが理解される。
特定の文脈で別段の指定がない限り、「コンジュゲート」および「連結」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、頭字語「SKU」は「在庫管理単位」を指す。
本明細書で使用される場合、「少なくとも部分的に一本鎖の」核酸などは、全体的に一本鎖であり得るか、または一本鎖部分および二本鎖部分の両方を含み得るが、全体的に二本鎖ではない。「少なくとも部分的に二本鎖」、「二本鎖セグメントを含む」などである核酸は、全体的に二本鎖であり得るか、または一本鎖部分および二本鎖部分の両方を含み得るが、全体的に一本鎖ではない。当業者は、ある要素(基質またはコンジュゲート成分など)の核酸リンカーが別の要素の核酸リンカーとハイブリダイズするように意図される場合、一本鎖部分または各リンカーがハイブリダイゼーションを可能にするための長さおよび連続性において十分であることを認識するであろう。
概要.
本明細書で提供されるのは、安定しており、化学的に過酷でなく、特定の実施形態での精製を妨げるのに十分効率的である、本明細書の他の場所に記載されるようなバイオコンジュゲートを作成するための方法である。特定の実施形態において、方法は、いずれの生物学的に不適合な試薬、生理学的条件外のpH変化、高温、または高塩濃度も含まない。さらに(以下の実施例2に示されるように)、特定の実施形態では、リンカーの高い熱力学的安定性のために、溶液中での種の交換はない。この方法はまた、製造のために迅速かつスケーラブルであり、様々な分子を互いに対形成しおよび連結するために使用され得る。
本明細書で提供されるのは、安定しており、化学的に過酷でなく、特定の実施形態での精製を妨げるのに十分効率的である、本明細書の他の場所に記載されるようなバイオコンジュゲートを作成するための方法である。特定の実施形態において、方法は、いずれの生物学的に不適合な試薬、生理学的条件外のpH変化、高温、または高塩濃度も含まない。さらに(以下の実施例2に示されるように)、特定の実施形態では、リンカーの高い熱力学的安定性のために、溶液中での種の交換はない。この方法はまた、製造のために迅速かつスケーラブルであり、様々な分子を互いに対形成しおよび連結するために使用され得る。
本開示の1つの重要な側面には、コンジュゲート-抗体対ごとに多くの固有のリンカーの必要性を排除することによって、製品ラインに関連するロジスティックオーバーヘッドを低減することが含まれる。これは、製造規模に劇的な効果を有し(例えば、ポリヌクレオチドにより色素あたり1SKUのみを有することにより)、これらの色素を抗体に迅速にコンジュゲートさせ得る(相補的ポリヌクレオチドにより抗体あたり1SKU)。例えば、PHITON抗体バイオコンジュゲートのライブラリを作成する場合、各PHITON抗体バイオコンジュゲートに固有の相補的ポリヌクレオチドのセットを必要とせずに、すべてのPHITONを同じポリヌクレオチドで修飾し、すべての抗体を同じ相補的ポリヌクレオチドで修飾し得る。
本明細書で提供されるのは、例えば、オリゴヌクレオチドベースの蛍光標識(例えば、PHITON)を抗体(または他の分子)にコンジュゲートさせるためのキットである。
特定の実施形態は、核酸リンカーを介してコンジュゲート成分に連結された基質を含むポリヌクレオチド修飾基質バイオコンジュゲート(ポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートとも呼ばれる)に引き寄せられ、核酸リンカーについては以下に詳細に記載される。特定の実施形態において、基質は結合分子である。特定の実施形態において、基板はビーズ(ポリスチレンミクロスフェアともいう)である。
「ポリヌクレオチド修飾結合分子」とは、核酸/ポリヌクレオチドが付着した結合分子を意味する。限定的ではないが、当業者は、NHSエステル、マレイミド、およびタンパク質/抗体などの他の分子に核酸を付着させるために、すなわち、本開示のポリヌクレオチド修飾結合分子を作製するために、使用され得る「クリック」などの多くのコンジュゲーション化学に精通しているであろう。したがって、「ポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲート」は、コンジュゲート成分に連結されたポリヌクレオチド修飾結合分子である。
「ポリヌクレオチド修飾ビーズ」とは、核酸/ポリヌクレオチドが付着したビーズを意味する。限定的ではないが、当業者は、例えば、抗体-ポリヌクレオチド結合について記載されたのと同じ化学を使用して、ポリヌクレオチドを付加するためにビーズの表面を機能化することに精通しているであろう。したがって、「ポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲート」は、コンジュゲート成分に連結されたポリヌクレオチド修飾ビーズである。特定の実施形態において、核酸は、一本鎖であり、その5’末端でビーズに付着している。特定の実施形態において、核酸は、一本鎖であり、その3’末端でビーズに付着している。
当業者は、核酸分子が一本鎖、二本鎖であり得る、または一本鎖および二本鎖セグメントの両方を含み得ることを理解するであろう。さらに、核酸分子はまた、三本鎖およびあまり組織化されていない形態を含み得る。特定の実施形態において、核酸リンカーは、一本鎖セグメントを含むか、またはそれからなる。特定の実施形態において、核酸リンカーは、二本鎖セグメントを含むか、またはそれからなる。特定の実施形態において、核酸リンカーは、一本鎖セグメントおよび二本鎖セグメントの両方を有する。特定の実施形態において、リンカーは、RNA破壊、RNAシーケンシング、または「バーコーディング」(「バーコード」配列は、例えば、特定の遺伝子または複数の遺伝子からのDNAの短いセクションを使用する種の同定のための当該技術分野のものに対して既知の使用のための固有のポリヌクレオチド配列)で使用するために当業者に知られている核酸配列を含まない。
基質からの核酸リンカー鎖およびコンジュゲート成分からの核酸リンカー鎖の相補的塩基/セグメントはアニールして、基質をコンジュゲート成分に連結し得るが、特定の実施形態において、基質の核酸リンカー鎖は、コンジュゲート成分に結合および/または共有結合されない。特定の実施形態において、コンジュゲート成分の核酸リンカー鎖は、基質に付着および/または共有結合されない。特定の実施形態において、基質の核酸リンカー鎖は、コンジュゲート成分に付着および/または共有結合されておらず、コンジュゲート成分の核酸リンカー鎖は、基質に付着および/または共有結合されない。したがって、特定の実施形態において、基質およびコンジュゲート成分は、いかなる連結を介しても互いに共有結合されず、代わりに、核酸リンカーのアニールされた部分によって一緒に保持される。特定の実施形態において、核酸は、その5’末端で基質に付着されている。特定の実施形態において、核酸は、その5’末端でコンジュゲート成分に付着されているか、または5’末端の延長部である。特定の実施形態において、核酸は、その3’末端で基質に付着されている。特定の実施形態において、核酸は、その3’末端でコンジュゲート成分に付着されているか、または3’末端の延長部である。
核酸リンカーは任意の長さであり得るが、特定の考慮事項を考慮に入れ得る。例えば、極端に短いリンカーは、抗体またはビーズとコンジュゲート成分を結合させるには接触させるのに近過ぎて、立体障害または他の干渉をもたらす可能性がある。他方、非常に長いリンカーは、産生がより困難であるか、または色素もしくは標識のシグナルが付着された抗体またはビーズに正確に起因しないように、抗体またはビーズを色素または標識の十分な距離内に維持しない可能性がある。特定の実施形態において、核酸リンカーは、少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、65、70、また75ヌクレオチドの長さである。特定の実施形態において、核酸リンカーは、約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50または60ヌクレオチドの長さのいずれかから約11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60または75ヌクレオチドの長さのいずれかである。特定の実施形態において、核酸リンカーの二本鎖セグメントは、約10、15、20、25、30、35、40、または50ヌクレオチドの長さのいずれかから約15、20、25、30、35、40、50、または75ヌクレオチドの長さのいずれかである。特定の実施形態において、核酸リンカーは、約15、20、25、30、または35ヌクレオチドの長さのいずれかから、約20、25、30、35、または40ヌクレオチドの長さのいずれかである。特定の実施形態において、コンジュゲート成分は、核酸を含むか、または核酸からなる。特定の実施形態において、核酸リンカーは、コンジュゲート成分の核酸分子の延長部であり得る。本開示の目的のために、コンジュゲート成分自体が1つ以上の核酸分子を含むかまたは1つ以上の核酸分子から全体的に作製されている場合でさえ、核酸リンカー配列を含む場合、それは「ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分」と見なされることが理解される。例えば、コンジュゲート成分がオリゴヌクレオチドベースの蛍光標識、例えば、PHITONである場合、リンカーの長さはコンジュゲート成分の「エッジ」から決定され、エッジは4ヌクレオチドより長いいずれかの一本鎖セグメントの末端として決定される。コンジュゲート成分が核酸を含む特定の実施形態において、コンジュゲート成分の核酸は、核酸リンカーは含まずに、少なくとも10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、65、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、175、200、300、400、500、750、1000、2000、3000、4000、5000、7500、もしくは10000ヌクレオチド、またはそれらの間の任意の範囲の長さを有する。コンジュゲート成分が核酸を含む特定の実施形態において、コンジュゲート成分の核酸は、核酸リンカーを含まずに、少なくとも10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、65、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、175、200、300、もしくは400ヌクレオチド、またはそれらの間の任意の範囲の長さを有する。コンジュゲート成分が核酸を含む特定の実施形態において、コンジュゲート成分の核酸は、核酸リンカーを含まずに、少なくとも20、25、30、35、40、50、55、60、65、75、80、85、90、95、100、110、もしくは120ヌクレオチド、またはその間の任意の範囲の長さを有する。コンジュゲート成分が核酸を含む特定の実施形態において、コンジュゲート成分の核酸は、三次構造および/または四次構造を有する。前述のように、核酸リンカーは、一本鎖セグメントおよび二本鎖セグメントの両方を含み得る。特定の実施形態において、核酸リンカーの二本鎖セグメントは、少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、50、60、65、70、または75ヌクレオチドの長さである。特定の実施形態において、核酸リンカーの二本鎖セグメントは、約10、15、20、25、30、35、40、50、または60ヌクレオチドの長さのいずれかから約15、20、25、30、35、40、50、60、または75ヌクレオチドの長さのいずれかである。当業者は、二本鎖核酸が一般に相補的塩基対のアニールされた配列からなると考えられているが、二本鎖核酸セグメントにおける対形成のすべてが相補的である必要がないことを認識するであろう。いくつかの非相補的塩基対形成を組み込んで二本鎖核酸を形成するためにアニールする相補的塩基を含む核酸の2つの鎖にはある程度の許容度がある。また、多数の塩基と対形成し得るデオキシイノシンなどの縮重(汎用の)塩基が存在する。特定の実施形態において、核酸リンカーの二本鎖セグメントは、二本鎖セグメントが全体的に相補的な塩基対で構成されなくても、少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、または75の相補的塩基対を含む。特定の実施形態において、核酸リンカーの二本鎖セグメントは、二本鎖セグメントが全体的に相補的塩基対で構成されなくても、約10、15、20、25、30、35、40、50、または60の相補的塩基対のいずれかから約15、20、25、30、35、40、50、60、または75の相補的塩基対のいずれかを含む。特定の実施形態において、核酸リンカーの二本鎖セグメントの少なくとも85%、90%、95%、または98%が、相補的塩基対を形成している。特定の実施形態において、核酸リンカーの二本鎖セグメントは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11個以下のミスマッチ塩基対を有する。しかしながら、特定の実施形態において、二本鎖セグメントの100%が、相補的塩基対である。特定の実施形態において、二本鎖セグメントは、少なくとも約7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、もしくは75の連続した相補的塩基対を含むか、または約7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、もしくは60の連続した相補的塩基対のいずれかから約8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、もしくは75の連続した相補的塩基対のいずれかを含む。
いずれかの相補的配列に限定されないが、特定の実施形態において、核酸リンカーは、相補的ポリアデノシン(ポリA)およびポリチミジン(ポリT)配列、および/または相補的ポリシトシン(ポリC)およびポリグアニジン(ポリG)配列を含み得る。例えば、核酸のC:G含有量は、二本鎖相互作用の重要な熱力学的決定要因であることが知られている。特定の実施形態において、核酸リンカーの二本鎖セグメントは、一方の鎖にポリA配列を含み、他方の鎖にポリチミジンポリT配列を含む。特定の実施形態において、核酸リンカーの二本鎖セグメントは、一方の鎖にポリC配列を含み、他方の鎖にポリG配列を含む。特定の実施形態において、核酸リンカーの二本鎖セグメントは、一方の鎖にポリAおよびポリC配列を含み、他方の鎖にポリTおよびポリG配列を含む。特定の実施形態において、核酸リンカーの二本鎖セグメントは、一方の鎖にポリAおよびポリG配列を含み、他方の鎖にポリTおよびポリC配列を含む。特定の実施形態において、核酸リンカーの二本鎖セグメントは、一方の鎖にポリA、ポリT、ポリC、および/またはポリG配列を含み、他方の鎖にポリT、ポリA、ポリG、および/またはポリC配列を含む。特定の実施形態において、核酸リンカーの二本鎖セグメントは、一方の鎖のポリアデノシン配列(ポリA)および他方の鎖のポリチミジン配列(ポリT)からなる。特定の実施形態において、核酸リンカーの二本鎖セグメントは、一方の鎖のポリシトシン配列(ポリC)および他方の鎖のポリグアニジン配列(ポリG)からなる。本開示を読む当業者は、本明細書の実施形態のいずれかの任意の核酸リンカーが上記の組成物を有し得ることが企図されることを理解するであろう。
特定の相補的配列に限定されないが、特定の実施形態では、核酸リンカーは、固有の識別配列を含む。核酸リンカーの目的のために、「固有の識別配列」は、1つまたは多数の種を区別するために使用され得るオリゴヌクレオチド配列であり、例えば、それらの1つに相補的なプライマー配列は、下流の増幅(PCRなどによる)、ロングリードシーケンシング、または次世代シーケンシング(NGS)のために結合し得、あるいは、相補的配列を使用して、例えば、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を介してプローブされ得る。特定の実施形態において、核酸リンカーの二本鎖セグメントは、固有の識別配列を含む。特定の実施形態において、固有の識別配列は、PCRなどによる核酸増幅のために使用され得る。特定の実施形態において、固有の識別配列は、次世代シーケンシング(NGS)に使用され得る。特定の実施形態において、核酸リンカーは、それが下流のシーケンシングアプリケーションにおいてフィルタリングされることを可能にする配列を含む。例えば、配列が、例えば、相補的プライマー配列が結合し得るものなどの固有の配列を使用することにより、シーケンシングにおいて他のヌクレオチド配列と区別可能であり、すべてのリンカータグ付き種のフィルタリングを下流分析から除外することを可能にする。特定の実施形態において、核酸リンカーは、第3の生体分子による特異的結合のための、および/または酵素的切断(例えば、CRISPR、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、制限酵素)による標的遺伝子編集のための配列を含む。例えば、配列がCRISPR gRNAを介した標的を可能にするように設計され、この標的がCRISPRによって切断される場合、または例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼのDNA結合ドメインの標的部位、あるいは、DNA配列GAATTCを切断する制限酵素、例えばEcoRIエンドヌクレアーゼによる切断を特に標的とする。特定の実施形態において、核酸リンカーは、酵素活性または結合活性を可能にする1つ以上の固有の配列を含む。特定の実施形態において、酵素活性または結合活性を可能にする固有の配列は、二本鎖セグメントに存在する。
特定の実施形態において、核酸リンカーは、基質またはコンジュゲート成分のいずれにも付着していない1つ以上の核酸分子から構成され得る。例えば、追加の核酸分子は、基質に付着した核酸リンカーおよびコンジュゲート成分に付着した核酸リンカーまたはコンジュゲート成分の延長部に一緒に結合する、「ブリッジ」として機能し得る。特定の実施形態において、追加の核酸は、コンジュゲート成分または基質への第2の付着点であり得る。追加の核酸分子はまた、追加の基質または追加のコンジュゲート成分などの追加の成分に付着し、第1の基質および第1のコンジュゲート成分を第2の基質もしくはさらなる基質および/または第2のコンジュゲート成分もしくはさらなるコンジュゲート成分と一緒に連結し得る(図17)。特定の実施形態において、核酸リンカーは、(i)基質に付着した部分、(ii)コンジュゲート成分に付着した部分またはコンジュゲート成分の延長部、および(iii)(i)または(ii)ではない少なくとも1つの付加部分を含む。特定の実施形態において、(iii)は、コンジュゲート成分に付着したもしくはコンジュゲート成分の延長部であるか、または追加のコンジュゲート成分に付着したもしくは追加のコンジュゲート成分の延長部である、第2の部分である。特定の実施形態において、(iii)は、基質に付着した、または追加の基質に付着した第2の部分である。
本開示で使用される「コンジュゲート成分」という用語は、特定の文脈で別段の指定がない限り、バイオコンジュゲートを形成するために本明細書に開示される核酸リンカーを介して基質(例えば、結合分子またはビーズ)に連結される任意の成分を指す。コンジュゲート成分の代表的な例としては、抗体またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体、核酸、アプタマー、タンパク質、色素または標識、小分子、治療用ペプチド、受容体リガンド、薬学的に活性な薬剤、またはオリゴヌクレオチドベースの蛍光標識が挙げられる。特定の実施形態において、例えば、コンジュゲート成分が別の抗体に連結される抗体である場合、どちらの抗体がコンジュゲート成分であるかの区別は、2つが核酸リンカーによって連結される場合に限定されない。特定の実施形態において、コンジュゲート成分は、オリゴヌクレオチドベースの蛍光標識である。例えば、特定の実施形態において、コンジュゲート成分は、本明細書の他の場所で定義されるPHITONである。特定の実施形態におけるように、コンジュゲート成分は、核酸を含むか、または核酸であり、リンカーは、核酸であり、特定の実施形態において、リンカーは、例えば、核酸リンカーが抗体またはビーズに付着するように、コンジュゲート成分に「付着」するのではなく、コンジュゲート成分の核酸鎖の延長部である。
特定の実施形態において、結合分子またはビーズの標識度(DoL)(当該技術分野では、色素対タンパク質(D:P)またはフルオロフォア対タンパク質(F:P)とも呼ばれる)は、化学量論的に制御される。これは、例えば、付着される核酸の利用可能性を介して達成され得る。特定の実施形態において、結合分子のDoLは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のいずれかと2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11のいずれかとの間である。特定の実施形態において、結合分子またはビーズのDoLは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20である。ポリヌクレオチド修飾結合分子上の核酸のDoLは、コンジュゲート成分のDoLとは無関係であってもよく、特定の実施形態では、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、もしくは11、またはエンドポイントを含む、それらの間の任意の範囲である。特定の実施形態において、ビーズのDolは、約100、1,000、10,000、または100,000のいずれかと、約1,000、10,000、100,000、または1,000,000のいずれかとの間である。特定の実施形態において、ポリヌクレオチド修飾ビーズ上の核酸の標識度(DoL)は、コンジュゲート成分のDoLとは無関係である。
本開示のポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートは、多くの用途での使用が企図される。例えば、特定の実施形態において、バイオコンジュゲートは、フローサイトメトリー、抗体スクリーニング、ELISAもしくは他のサンドイッチアッセイ、免疫モニタリング、バイオマーカーアッセイ、ラテラルフロー、ポイントオブケア/迅速診断、画像化、顕微鏡検査、分子診断、次世代シーケンシング、ロングリードシーケンシング、in situシーケンシング、ポリメラーゼ連鎖反応、マイクロアレイ、核酸シーケンシング、アミノ酸シーケンシング、デジタル病理学、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティングのうちの1つ以上のために、コントロールなどの参照サンプルとして、または機器、アッセイ、もしくはシステムの較正用として、または予防および/もしくは治療目的で、細胞、組織、および/または器官を特異的に標識するために使用され得る。
本明細書に提供されるのは、本開示のポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲートおよびポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲートなどのポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートを生成するための方法である。特定の実施形態において、方法は、少なくとも部分的または完全に一本鎖の核酸リンカーを含むポリヌクレオチド修飾基質を、少なくとも部分的または完全に一本鎖の核酸リンカーを有するポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触させることを含む(図18、上)。特定の実施形態において、基質は結合分子である。特定の実施形態において、基板はビーズである。特定の実施形態において、二本鎖核酸リンカーを形成するために、基質の一本鎖リンカー配列の少なくとも一部分は、コンジュゲート成分の一本鎖リンカー配列の一部分に相補的である。接触すると、基質の核酸リンカーおよびコンジュゲート成分の核酸リンカーは、アニールして、基質をコンジュゲート成分に連結する少なくとも部分的に二本鎖のリンカーを形成し得る。結合分子(例えば、抗体)またはビーズなどの多くの可能な基質は、核酸リンカーが化学的に付着していることを必要とし得る。したがって、特定の実施形態において、ポリヌクレオチド修飾基質とポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分とを接触させる前に、方法は、核酸リンカーを基質に付着させてポリヌクレオチド修飾基質を形成するステップを含む。特定の実施形態において、ポリヌクレオチド修飾基質とポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分とを接触させる前に、方法は、核酸リンカーをコンジュゲート成分に付着させてポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分を形成するステップを含む。
ポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートを生成するための特定の実施形態において、方法は、基質をコンジュゲート成分と接触させることであって、基質は結合分子またはビーズである、接触させることと、核酸リンカーを基質に付着させることと、同じ核酸リンカーをコンジュゲート成分に付着させてポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートを形成することと、を含む。特定の実施形態において、核酸リンカーは一本鎖であるか、二本鎖セグメントを含むか、または核酸リンカーは全体的に二本鎖である。特定の実施形態において、核酸リンカーは二本鎖セグメントを含むか、または核酸リンカーは全体的に二本鎖であり、方法は、基質におよびコンジュゲート成分に付着する前に核酸鎖をハイブリダイズして少なくとも部分的に二本鎖の核酸リンカーを形成することを含む。
ポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートを生成するための特定の実施形態において、方法は、核酸リンカーを含むポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分を基質と接触させることであって、基質が結合分子またはビーズである、接触させることと、ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分の核酸リンカーを基質に付着させて、ポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートを形成することと、を含む。特定の実施形態において、核酸リンカーは一本鎖であるか、二本鎖セグメントを含むか、または核酸リンカーは全体的に二本鎖である。特定の実施形態において、核酸リンカーは一本鎖である(図18、下)。特定の実施形態において、核酸リンカーは二本鎖セグメントを含むか、または核酸リンカーは全体的に二本鎖であり、方法は、ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分の核酸リンカーを基質に付着させて、ポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートを形成する前に、核酸鎖をハイブリダイズして、ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分上に少なくとも部分的に二本鎖の核酸リンカーを形成することを含む(図18、中央)。
ポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートを生成するための特定の実施形態において、方法は、核酸リンカーを含むポリヌクレオチド修飾基質をコンジュゲート成分と接触させることであって、基質が結合分子またはビーズである、接触させることと、ポリヌクレオチド修飾基質の核酸リンカーをコンジュゲート成分に付着させて、ポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートを形成することと、を含む。特定の実施形態において、核酸リンカーは一本鎖であるか、二本鎖セグメントを含むか、または核酸リンカーは全体的に二本鎖である。特定の実施形態において、核酸リンカーは一本鎖である。特定の実施形態において、核酸リンカーは二本鎖セグメントを含むか、または核酸リンカーは全体的に二本鎖であり、方法は、ポリヌクレオチド修飾基質の核酸リンカーをコンジュゲート成分に付着させて、ポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートを形成する前に、核酸鎖をハイブリダイズして、ポリヌクレオチド修飾基質上に少なくとも部分的に二本鎖の核酸リンカーを形成することを含む。
ポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートを生成するための特定の実施形態において、方法は、(i)少なくとも部分的にまたは完全に一本鎖の核酸リンカーを含むポリヌクレオチド修飾基質であって、基質が結合分子またはビーズである、ポリヌクレオチド修飾基質と、(ii)少なくとも部分的にまたは完全に一本鎖の核酸リンカーを含むポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分、および(iii)(i)または(ii)の核酸リンカーではないさらに少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーセグメントとを、接触させることを含む。基質の一本鎖リンカー配列の少なくとも一部分は、さらなる核酸リンカーセグメント(iii)の一本鎖部分に相補的であり、かつ/または、コンジュゲート成分の一本鎖リンカー配列の少なくとも一部分は、さらなる核酸リンカーセグメント(iii)の一本鎖部分に相補的であり、したがって、接触するとき、基質の核酸リンカー、コンジュゲート成分の核酸リンカー、およびさらなる核酸リンカーセグメントがアニールして、基質をコンジュゲート成分に連結する少なくとも部分的に二本鎖のリンカーを形成する。特定の実施形態において、(i)、(ii)、および(iii)に接触する前に、方法は、少なくとも部分的にまたは完全に一本鎖の核酸リンカーを基質に付着させて、ポリヌクレオチド修飾基質を形成するステップを含む。特定の実施形態において、(i)、(ii)、および(iii)に接触する前に、方法は、少なくとも部分的にまたは完全に一本鎖の核酸リンカーをコンジュゲート成分に付着させて、ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分を形成するステップを含む。
上記のいずれについても、ポリヌクレオチドをタンパク質または抗体などの分子に結合させる方法が知られており、方法には、NHS-エステル、マレイミド、および「クリック」などのコンジュゲーション化学が含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドをビーズに付着させる方法は知られており、方法は、例えば、タンパク質-ポリヌクレオチドコンジュゲーションについて記載されたのと同じ化学を使用して、ビーズの表面を機能化してポリヌクレオチドを付加することを含む。本明細書の他の場所に記載されるように、結合分子またはビーズのDoLは、化学量論的に制御されて、付着されたポリヌクレオチドの数を制御することができる。本明細書の他の場所でも詳細に記載されるように、ポリヌクレオチド修飾基質の核酸リンカー配列は、ポリA、ポリT、ポリC、および/またはポリG配列を含むかまたはそれらからなり得、修飾コンジュゲート成分の核酸リンカー配列は、ポリA、ポリT、ポリC、および/またはポリG配列を含むかまたはそれらからなり得る。本明細書の他の場所でも記載されるように、核酸リンカーは、固有の識別配列を含むことができる。
また、本明細書に提供されるのは、検出のための標識された基板を製造する方法である。説明目的で、基質は、以下では結合分子と呼ばれるが、結合分子に限定されない。特定の実施形態において、この方法は、高率の方法である。特定の実施形態において、同じ結合分子の別個の結合分子の分子は、異なるコンジュゲート成分で標識される。そのような方法(および以下の方法)の説明目的で、「結合分子」は、結合分子のタイプ、例えば、抗CD4抗体または抗ベータアミロイド抗体を指し、「結合分子の分子」は、そのタイプの結合分子の個々の分子である。例えば、図4において、「Ab1」、「Ab2」、および「Abn」は、異なる結合分子のタイプであり、「Ab1-N1」、「Ab1-N2」、および「Ab1-Nm」は、(異なる標識「N1」、「N2」、および「Nm」を有する)Ab1結合分子の異なる結合分子の分子である。同様に、「Ab2-N1」、「Ab2-N2」、および「Ab2-Nm」は、異なる標識などを有するAb2結合分子の異なる結合分子の分子である。特定の実施形態において、方法は、(a)少なくとも部分的または完全に一本鎖の核酸リンカーを同じ結合分子の少なくとも2つの別個の結合分子の分子に付着させて複数のポリヌクレオチド修飾結合分子の分子を生成し、次いで(b)複数の少なくとも1つのポリヌクレオチド修飾結合分子の分子を、少なくとも部分的にまたは完全に一本鎖の核酸リンカーを含む第1のポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触させ、複数の少なくとも1つの異なるポリヌクレオチド修飾結合分子の分子を、少なくとも部分的にまたは完全に一本鎖の核酸リンカーを含む第2のポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触させることであって、第1および第2のポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分が検出ラベルを含み、少なくとも検出ラベルが異なる、接触させることと、を含む。当業者は、ステップ(a)を実施するパーティーが、ステップ(b)を実施するパーティーから分離され得ることを理解するであろう。したがって、特定の実施形態において、方法は、複数の少なくとも1つのポリヌクレオチド修飾結合分子の分子を、少なくとも部分的にまたは完全に一本鎖の核酸リンカーを含む第1のポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触させ、複数の少なくとも1つの異なるポリヌクレオチド修飾結合分子の分子を、少なくとも部分的にまたは完全に一本鎖の核酸リンカーを含む第2のポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触させることであって、複数のポリヌクレオチド修飾結合分子の分子がすでに調製されている、接触させることと、を含む。本開示の態様と整合して、結合分子の分子の一本鎖核酸リンカー配列の少なくとも一部分は、第1および/または第2のコンジュゲート成分の一本鎖核酸リンカー配列の一部分に相補的であり、接触するとき、結合分子の分子の一本鎖核酸リンカー配列およびコンジュゲート成分の一本鎖核酸リンカー配列がアニールして、結合分子の分子をコンジュゲート成分に連結する二本鎖リンカーを形成する。特定の実施形態において、複数の1つ以上の追加のポリヌクレオチド修飾結合分子の分子は、異なる検出標識(例えば、図4における「Ab1-N1」、「Ab1-N2」および「Ab1-Nm」)を有する1つ以上の追加のポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触させられる。特定の実施形態において、複数のポリヌクレオチド修飾結合分子の分子のうちの少なくとも3、4、5、6、7、8、9、または10個が各々、他と異なる検出標識を有するポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触させられる。特定の実施形態において、結合分子は、抗体またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体である。
当業者は、基質とコンジュゲート成分がそれらのそれぞれのリンカーのハイブリダイゼーションを介して「間接的に」接合される上記の例示的な高率の方法に加えて、同様の高速標識化が、同じ結合分子の別個の結合分子の分子が異なるコンジュゲート成分で標識されるように、本明細書に記載のポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートを生成する他の様々な方法のいずれかを組み込むことによって達成され得ることを理解するであろう。例えば、特定の実施形態において、同じ結合分子の別個の結合分子の分子が異なるコンジュゲート成分で標識される、検出のための標識結合分子を生成する高率の方法は、(a)同じ結合分子の複数の結合分子の分子を取得することと、(b)第1のポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分の核酸リンカーを複数の少なくとも1つの結合分子の分子に付着させ、第2のポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分の核酸リンカーを複数の少なくとも1つの異なる結合分子の分子に付着させることであって、第1および第2のポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分が、同じ結合分子の別個の結合分子の分子が異なるコンジュゲート成分で標識されるように、検出標識を含み、少なくともそれらの検出標識が異なる、付着させることと、を含む。核酸リンカーは、一本鎖であり得るか、二本鎖セグメントを含み得るか、または全体的に二本鎖であり得る。特定の実施形態において、核酸リンカーは二本鎖セグメントを含むか、または核酸リンカーは全体的に二本鎖であり、方法は、ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分の核酸リンカーを結合分子の分子に付着させて、ポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲートを形成する前に、核酸鎖をハイブリダイズして、少なくとも部分的に二本鎖の核酸リンカーを形成することを含む。特定の実施形態において、複数の1つ以上の追加の結合分子の分子が、異なる検出標識を有する1つ以上の追加のポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分に付着される。特定の実施形態において、複数の結合分子の分子のうちの少なくとも3、4、5、6、7、8、9、または10個が各々、他とは異なる検出標識を有するポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触させられる。特定の実施形態において、結合分子は、抗体またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体である。
別個の標識化を達成するために、特定の実施形態は、各コンパートメント内の一意的に標識されたポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触するための別個のコンパートメントへの複数の結合分子の分子またはポリヌクレオチド修飾結合分子の分子を分配、分注などを行い、したがって、同じ結合分子の異標識結合分子の分子を生成することを含む。当業者は、分配/分注が、試薬を別個のチューブにピペッティングするなど手動で、または試薬を多数のボトル、または組織培養タイプのプレートの別個のウェル、または他の容器に高率で分注し得る自動化流体ハンドラなどのシステムによって行われ得ることを理解するであろう。
そのような方法の重要な利点の1つは、複数のリンカー分子の設計、製造、編成、保管などの要件を減らすことができることである。特定の実施形態において、複数の結合分子の分子の少なくとも部分的にまたは完全に一本鎖の核酸リンカーは、ポリヌクレオチド修飾結合分子の分子のすべてについて同じであり、したがって、コンジュゲート成分の少なくとも部分的にまたは完全に一本鎖の核酸リンカーはまた、ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分のすべてについて同じであり得る。
同様に、本明細書で提供されるのは、検出のための標識結合分子を生成する方法であるが、異なる結合分子は、同じコンジュゲート成分で標識される(ただし、同じコンジュゲート成分分子ではない)。これを図4に示し、例えば、「Ab1-N1」、「Ab2-N1」、「Abn-N1」は、同じ標識(「N1」)で標識された異なる結合分子(「Ab1」、「Ab2」、「Abn」)である。特定の実施形態において、この方法は、高率の方法である。特定の実施形態において、方法は、(a)少なくとも部分的にまたは完全に一本鎖の核酸リンカーを少なくとも2つの異なる結合分子に付着させて、少なくとも2つの異なるポリヌクレオチド修飾結合分子を生成し、(b)少なくとも2つの異なるポリヌクレオチド修飾結合分子を、検出標識を含み、少なくとも部分的にまたは完全に一本鎖の核酸リンカーを含むポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触させることを含む。上記のように、当業者は、ステップ(a)を実施するパーティーが、ステップ(b)を実施するパーティーから分離され得ることを理解するであろう。したがって、特定の実施形態において、方法は、少なくとも2つの異なるポリヌクレオチド修飾結合分子を、検出標識を含み、少なくとも部分的にまたは完全に一本鎖の核酸リンカーを含むポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触させることを含む。本開示の態様と整合して、結合分子の一本鎖核酸リンカー配列の少なくとも一部分は、コンジュゲート成分の一本鎖核酸リンカー配列の一部分に相補的であり、接触するとき、リンカーはアニールして、結合分子をコンジュゲート成分に連結する二本鎖リンカーを形成する。特定の実施形態において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ超の追加のポリヌクレオチド修飾結合分子を、ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触させる。特定の実施形態において、結合分子のうちの1つ以上が、抗体またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体である。
当業者は、基質とコンジュゲート成分がそれらのそれぞれのリンカーのハイブリダイゼーションを介して「間接的に」接合される上記の例示的な高率の方法に加えて、同様の高速標識化が、異なる結合分子が同じコンジュゲート成分で標識されるように、本明細書に記載のポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートを生成する他の様々な方法のいずれかを組み込むことによって達成され得ることを理解するであろう。例えば、異なる結合分子が同じコンジュゲート成分で標識される、検出のための標識結合分子を生成する高率の方法は、(a)少なくとも2つの異なる結合分子を取得することと、(b)異なる結合分子が同じコンジュゲート成分で標識されるように、少なくとも2つの異なる結合分子を、検出標識を含むポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分の核酸リンカーに付着させることと、を含む。核酸リンカーは、一本鎖であり得るか、二本鎖セグメントを含み得るか、または全体的に二本鎖であるあり得る。特定の実施形態において、核酸リンカーは二本鎖セグメントを含むか、または核酸リンカーは全体的に二本鎖であり、方法は、ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分の核酸リンカーを結合分子に付着させて、ポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲートを形成する前に、核酸鎖をハイブリダイズして、少なくとも部分的に二本鎖の核酸リンカーを形成することを含む。特定の実施形態において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ超の追加の結合分子を、ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分に付着させる。特定の実施形態において、結合分子のうちの1つ以上が、抗体またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体である。
特定の実施形態は、(本明細書の他の場所に記載されるように)異なる結合分子またはポリヌクレオチド修飾結合分子を、各コンパートメントのポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触させるために、各タイプの結合分子について別個のコンパートメントに分配、分注などを行い、したがって、同じコンジュゲート成分標識で標識された異なる結合分子を生成することを含む。
特定の実施形態において、異なる結合分子の少なくとも部分的にまたは完全に一本鎖の核酸リンカーは、すべてのポリヌクレオチド修飾結合分子について同じであり、単一の少なくとも部分的にまたは完全に一本鎖の核酸配列は、ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分の核酸リンカーとして使用され得る。
さらに、上記の方法を、多数の異なる組み合わせで検出するために標識結合分子または複数の結合分子を生成する方法に組み込むことができる。特定の実施形態において、異なる組み合わせを作成する方法は、1個またはほんの数個の核酸リンカー配列を使用する。特定の実施形態において、この方法は、高率の方法である。例えば、特定の実施形態において、異なるコンジュゲート成分標識を、生成のために高率の様式で結合分子(または本明細書に開示される他の基質)に「印刷」することができる。
特定の実施形態において、本開示のポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートを作製するプロセスは、本明細書の他の場所に記載されるように、成分を互いに接触させることを含み、その結果、一本鎖成分リンカーの相補的部分がアニールして、成分をバイオコンジュゲートに連結する少なくとも部分的に二本鎖のリンカーが形成され得る。成分は、組成物内で互いに接触され得る。例えば、特定の実施形態において、組成物は溶液であり得る。特定の実施形態において、組成物は、(a)少なくとも部分的にまたは完全に一本鎖の核酸リンカー、および(b)少なくとも部分的にまたは完全に一本鎖の核酸リンカーを含むコンジュゲート成分、を含む基質を含む。特定の実施形態において、基質は、結合分子またはビーズである。前述のように、特定の実施形態において、基質の一本鎖核酸リンカー配列の少なくとも配列の十分な部分は、コンジュゲート成分の一本鎖核酸リンカー配列の一部分に相補的であり、核酸がアニールし、基質をコンジュゲート成分に連結する二本鎖核酸リンカーを形成することを可能にする。特定の実施形態において、組成物は、(a)核酸リンカーを含む基質であって、基質が結合分子またはビーズである、基質と、(b)基質をコンジュゲート成分に連結させるために核酸リンカーに付着することができるコンジュゲート成分と、を含む。特定の実施形態において、核酸リンカーは一本鎖であるか、二本鎖セグメントを含むか、または核酸リンカーは全体的に二本鎖である。特定の実施形態において、組成物は、(a)核酸リンカーを含むコンジュゲート成分と、(b)コンジュゲート成分を基質に連結させるために核酸リンカーに付着することができる基質と、を含む。特定の実施形態において、核酸リンカーは一本鎖であるか、二本鎖セグメントを含むか、または核酸リンカーは全体的に二本鎖である。特定の実施形態において、組成物は、(a)核酸リンカーに付着することができる基質であって、基質が結合分子またはビーズである、基質、および核酸リンカーに付着することができるコンジュゲート成分と、(b)核酸リンカーと、を含む。特定の実施形態において、核酸リンカーは一本鎖であるか、二本鎖セグメントを含むか、または核酸リンカーは全体的に二本鎖である。特定の実施形態において、組成物は、(a)少なくとも部分的にまたは完全に一本鎖の核酸リンカーを含む基質であって、基質が結合分子またはビーズである、基質と、(b)少なくとも部分的にまたは完全に一本鎖の核酸リンカーを含むコンジュゲート成分と、(c)さらなる核酸リンカーセグメントであって、(v)(a)、(v)(b)、および(v)(c)がアニールして、(v)(a)、(v)(b)、および(v)(c)を含み、(v)(a)を(v)(b)に連結する少なくとも部分的に二本鎖の核酸リンカーを形成することができる、核酸リンカーセグメントと、を含む。
上記のいずれかの特定の実施形態において、組成物は、本明細書の他の場所に記載されるポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲートまたはポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲートを生成することができる。
本開示の別の態様は、細胞、組織、および/または器官を標識する方法である。特定の実施形態において、細胞、組織、および/または器官は、正常または健常である。特定の実施形態において、細胞、組織、および/または器官は、例えば、異常であるか、罹患しているか、または損傷している。例えば、特定の実施形態において、細胞および/または組織は、癌細胞または腫瘍である。特定の実施形態において、方法は、細胞、組織、および/または器官を、本明細書に開示されるポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲートと接触させることを含み、バイオコンジュゲートの結合分子部分が、細胞、組織、および/または器官の抗原、エピトープ、および/またはハプテンに結合し、コンジュゲート成分部分が、色素などの検出可能な標識を含む。特定の実施形態において、バイオコンジュゲートの結合分子部分は、細胞、組織、および/または器官の抗原、エピトープ、および/またはハプテンを特異的に認識し、それに特異的に結合する。特定の実施形態において、方法は、細胞、組織、および/または器官を、本明細書に開示されるポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲートと接触させることを含み、バイオコンジュゲートの結合分子部分は、細胞、組織、および/もしくは器官上またはその中の受容体に結合し、コンジュゲート成分部分は、色素などの検出可能な標識を含む。特定の実施形態において、バイオコンジュゲートの結合分子部分は、細胞、組織、および/または器官上またはその中の受容体を特異的に認識し、それに特異的に結合する。特定の実施形態において、標識は、視覚的に検出するための標識である。特定の実施形態において、標識は、PHITONなどのオリゴヌクレオチドベースの蛍光標識である。このような標識化は、様々な用途に使用され得る。代表的な例としては、標識された細胞は、フローサイトメトリー、抗体スクリーニング、ELISAもしくは他のサンドイッチアッセイ、免疫モニタリング、バイオマーカーアッセイ、ラテラルフロー、ポイントオブケア/迅速診断、画像化、顕微鏡検査、分子診断、次世代シーケンシング、ロングリードシーケンシング、in situシーケンシング、ポリメラーゼ連鎖反応、マイクロアレイ、核酸シーケンシング、アミノ酸シーケンシング、デジタル病理学、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティングのうちの1つ以上のために、または予防および/もしくは治療目的で、使用され得る。例えば、特定の実施形態において、標識された細胞はフローサイトメトリーで使用される。さらに、特定の実施形態において、標識は、細胞膜の標識であり、例えば、親油性部分が細胞膜を染色することを可能にする標識に付着するか、あるいは、ミリストイル化/パルミトイル化配列を標識に組み込むか、あるいは、レクチン、例えば、細胞膜上の複合糖質を検出するための小麦胚芽凝集素(WGA)へのコンジュゲーションによる。特定の実施形態において、標識は、例えば、二本鎖DNAに特異的なプローブへのコンジュゲーション(DNAは死細胞においてアクセス可能であるために、DNA結合)による、あるいは、標識をアミン反応性部分(死細胞の細胞内タンパク質の多くと反応し、それらの同定および/または分析からの除外を可能にする)に付着させることによる、細胞生存能の標識である。特定の実施形態において、標識は、細胞内標識の娘細胞に対する染色および継代を可能にする酵素活性化部分に付着される。特定の実施形態において、標識は、ゲノム材料を標的とする特定の標識であり、例えば、それが固有の配列RNAまたはDNAに結合することを可能にする配列に結合するか、あるいはそれを含む(例えば、FISHまたは他の画像化または蛍光測定モダリティを介して)。
標識された細胞、組織、および/または器官からのシグナルを定量的に測定するための方法および試薬も提供される。特定の実施形態において、方法は、細胞、組織、および/または器官を、本明細書に開示されるポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲートと接触させることを含み、バイオコンジュゲートの結合分子部分は、抗原、エピトープ、膜、ゲノム材料に結合し、かつ/または細胞、組織、および/または器官のハプテンおよびコンジュゲート成分部分は、検出可能な標識を含み、DoLが既知であるポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲートの存在を測定し、したがって定量的測定を行うことを可能にする。特定の実施形態において、方法は、細胞、組織、および/または器官を、本明細書に開示されるポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲートと接触させることを含み、バイオコンジュゲートの結合分子部分は、細胞、組織、および/および器官の受容体に結合する、または器官およびコンジュゲート成分部分が検出可能な標識を含み、ポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲートの存在を測定し、DoLは既知であり、したがって、定量的測定を行うことが可能である。特定の実施形態において、標識は、視覚的に検出するための標識である。特定の実施形態において、標識は、PHITONなどのオリゴヌクレオチドベースの蛍光標識である。特定の実施形態において、結合分子の標識度(DoL)は、核酸の利用可能性を介して化学量論的に制御される。特定の実施形態において、結合分子のDoLは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10、またはエンドポイントを含むそれらの間の任意の範囲である。特定の実施形態において、ポリヌクレオチド修飾結合分子上の核酸の標識度(DoL)は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11、またはエンドポイントを含むそれらの間の任意の範囲であり、コンジュゲート成分のDoLとは無関係である。特定の実施形態において、既知のDoLなどを有するポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲートを含むコントロールを利用して、定量化を支援し得る。
本明細書で提供されるのはまた、本開示のポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートを生成および/または使用するためのキットである。特定の実施形態において、キットは、本開示のポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートを生成するのに必要な1つ以上の成分を含む。特定の実施形態において、キットは、本開示の組成物を製造するために必要な1つ以上の成分を含む。特定の実施形態において、キットは、本開示の高率の方法で基質を標識するため、細胞、組織、および/もしくは器官を標識するため、ならびに/または本明細書で提供される定量分析を実行するために必要な1つ以上の成分を含む。例えば、特定の実施形態において、キットは、結合分子(例えば、抗体および誘導体)またはビーズ、コンジュゲート成分、一本鎖、部分的に一本鎖/部分的に二本鎖、または完全に二本鎖核酸リンカー、ポリヌクレオチド修飾基質、ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分、および/またはポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートなどの基質のうちの1つ以上を含む。特定の実施形態において、キットは、印刷および/または電子記憶媒体、緩衝液および/もしくは追加の試薬、ならびに/または包装材料のいずれかで、本明細書に開示される任意の方法を実行するための説明書をさらに含む。
ビーズ。
当業者は、多くのタイプのポリスチレンミクロスフェアに精通しているであろう。ポリスチレンミクロスフェアは、大きさと蛍光強度の両方に関して非常に均一である。それらは、生物学的サンプルの大きさ、発光波長、および強度をほぼ複製するように設計される。場合によっては、色素を表面ではなくミクロスフェアのマトリックス内部に含有させることができるため、ビーズは優れた光化学的および物理的安定性を有し、フローサイトメーター(例えば、AlignFlow、ThermoFisherなど)のアライメント、フォーカシング、および較正のために信頼できる参照信号を提供する。このような蛍光色素は、直径2.5μmおよび直径6.0μmの範囲など、フローサイトメトリーで一般的に使用されるレーザ光源による最適な励起のために選択される。別の例(BD Cytometry Setup and Tracking(CS&T)Beads)では、等しい濃度の3つのポリスチレンビーズは、相対強度において、薄暗い、中程度、明るい、と異なる。3つのビーズはすべて、固有のCVが低く、多くのフローサイトメトリー用途で使用される励起波長と発光波長の両方の広い範囲にまたがる色素を含む。ビーズのいくつかの他の例は、抗体捕捉ビーズである。これらのビーズは抗体を捕捉し、蛍光補正のためのコントロールとしての役割を果たす(例えば、OneCompおよびUltraComp eBeads:ポリスチレンミクロスフェア、AbC Total AntibodyおよびArC Amine-Reactive Compensation Bead:ポリスチレンミクロスフェア)。ビーズの他の例としては、計数用ビーズ、滅菌技術ビーズ(例えば、「GloGermビーズ」)、Polyscience Yellow-Green(Yg)ビーズ(0.5μm~10μmまで利用可能な蛍光性および均一性が高い粒子)および定量ビーズが挙げられる。別の例には、よく特徴付けられたビーズであるQuantum MESFビーズ(PE標識抗体)が含まれる。PEのF/P比は、立体的な制約があるため、通常、1:1である。
当業者は、多くのタイプのポリスチレンミクロスフェアに精通しているであろう。ポリスチレンミクロスフェアは、大きさと蛍光強度の両方に関して非常に均一である。それらは、生物学的サンプルの大きさ、発光波長、および強度をほぼ複製するように設計される。場合によっては、色素を表面ではなくミクロスフェアのマトリックス内部に含有させることができるため、ビーズは優れた光化学的および物理的安定性を有し、フローサイトメーター(例えば、AlignFlow、ThermoFisherなど)のアライメント、フォーカシング、および較正のために信頼できる参照信号を提供する。このような蛍光色素は、直径2.5μmおよび直径6.0μmの範囲など、フローサイトメトリーで一般的に使用されるレーザ光源による最適な励起のために選択される。別の例(BD Cytometry Setup and Tracking(CS&T)Beads)では、等しい濃度の3つのポリスチレンビーズは、相対強度において、薄暗い、中程度、明るい、と異なる。3つのビーズはすべて、固有のCVが低く、多くのフローサイトメトリー用途で使用される励起波長と発光波長の両方の広い範囲にまたがる色素を含む。ビーズのいくつかの他の例は、抗体捕捉ビーズである。これらのビーズは抗体を捕捉し、蛍光補正のためのコントロールとしての役割を果たす(例えば、OneCompおよびUltraComp eBeads:ポリスチレンミクロスフェア、AbC Total AntibodyおよびArC Amine-Reactive Compensation Bead:ポリスチレンミクロスフェア)。ビーズの他の例としては、計数用ビーズ、滅菌技術ビーズ(例えば、「GloGermビーズ」)、Polyscience Yellow-Green(Yg)ビーズ(0.5μm~10μmまで利用可能な蛍光性および均一性が高い粒子)および定量ビーズが挙げられる。別の例には、よく特徴付けられたビーズであるQuantum MESFビーズ(PE標識抗体)が含まれる。PEのF/P比は、立体的な制約があるため、通常、1:1である。
定量。
現在、フローサイトメトリー測定と他の蛍光ベースの測定および診断モダリティは相対的である。すなわち、測定は、フローサイトメトリーのように細胞ごとに分子(タンパク質など)の真の数を取得するのではなく、コントロールと比較して行われる。フローサイトメトリーの定量的標準を作成するための努力がなされてきたが、本明細書に記載される抗体の標識の変動性のため、単一の色素(フィコエリトリン)に限定される。
現在、フローサイトメトリー測定と他の蛍光ベースの測定および診断モダリティは相対的である。すなわち、測定は、フローサイトメトリーのように細胞ごとに分子(タンパク質など)の真の数を取得するのではなく、コントロールと比較して行われる。フローサイトメトリーの定量的標準を作成するための努力がなされてきたが、本明細書に記載される抗体の標識の変動性のため、単一の色素(フィコエリトリン)に限定される。
抗体などの結合分子への色素の負荷度(DoL)(すなわち、抗体あたりの色素の数)は、標識の明るさを変化させる。典型的なコンジュゲーション戦略にはばらつきがあるため、DoLはすべての結合分子に分布しており、明るさも同様である。DoLにおけるこの変動を緩和する唯一の方法は、色素の濃度を低下させて、1:1の標識化を実現させることである。ただし、この低濃度での反応は収率が低く、色素を含まない抗体が多く、色素が1つある抗体がいくつか生成される。これは、有用であるほど十分に明るい、定量的な標識抗体を作成することを非現実的なものにする。さらに、従来のコンジュゲーション戦略には、副産物、不活化色素、および非標識抗体を除去するために、反応後の広範なクリーンアップが必要である。
本開示の核酸リンカーシステムは、1:1のDoLを活用することにより、標識されたバイオコンジュゲートの定量分析を可能にする。図5は、従来のコンジュゲーション戦略と本明細書に記載の核酸/ポリヌクレオチドリンカーとの違いを示す。図5は、標識抗体の数および抗体あたりの標識を示す。曲線は、従来のコンジュゲーション法で通常遭遇する分布を示しており、中央の「デルタ」関数は、ポリヌクレオチドリンカーが生成することができるものを表す。
DoLのコントロールにより、観察された蛍光を、「m」ポリヌクレオチド(例えば、ポリA)がロードされた一連の特殊なミクロスフェア/ビーズを分析することによって生成された標準曲線と比較することによって、細胞表面上のタンパク質の数を直接測定することが可能になる。図6は、ビーズのポリAリンカーセグメントに対してアニールすることによって捕捉されたポリTリンカーセグメントを有するPHITON(オリゴヌクレオチドベースの蛍光標識)の概念を示す。次いで、ビーズを洗浄し、遠心分離によって精製して、ビーズの直径のばらつき内で、一定のDoLを有するビーズの集団を生成することができる。
図7は、どのようにビーズ上のリンカーの数(「m」)を変化させることができ、かつ同じ数のPHITONを1:1で捕捉することができるかを示す。
図8は、どのようにビーズにおいてその表面(「m」)上でポリヌクレオチド(例えば、ポリT)の数が変化し、かつ付着したPHITON(「n」)の明るさがその蛍光を直線的に変化させるかを示す。例えば、図8は、2つのPHITON、n=1クラスターおよびn=2クラスターを表す2本の線を示す。ビーズあたりのリンカー数(「m」)がわずかに増加するたびに、n=2クラスターのPHITONがn=1クラスターのPHITONよりも2倍超蛍光を発するために、蛍光が大きく増加するため、それらの傾きは異なる。
(m、n)に十分な数の値があれば、線形回帰を使用して、蛍光シグナルに基づいて表面(ビーズ、細胞など)に連結した色素分子の数を決定することが可能である。さらに、そのような色素標識ビーズを用いた定量は、システムの検出限界、すなわち、システムが検出することができる信号の小ささについての重要な洞察を提供することができる。これは、ポリAテールに依存する任意の3’ベースのRNA検出モダリティの感度を決定するためにも使用され得る。
したがって、本明細書で提供されるコンジュゲーションプロセスにより、他の技術に関連するばらつきを減少させ、結合分子にコンジュゲートされている色素分子(例えば、オリゴベースの色素)または任意の他の分子の数の微調整された制御が可能になる。既知の量の色素およびこれらの色素の各々からの既知の十分に特徴付けられた蛍光を用いて、真に定量的なシステムが開示される。重要なことに、この十分に制御されたシステムで標準曲線を設定する際に(図8を参照されたい)、例えば、フローサイトメトリーにおける細胞の表面上の、バイオコンジュゲートの数を定量的に決定することができる。これは単一の細胞で同時に行うことができ、フローサイトメトリーでの最初の真の定量だけでなく、単一細胞ベースで同時に複数のバイオコンジュゲートにわたってこれを行う能力も可能にする。
補償。
異なるフルオロフォア間の発光スペクトルが重複しているため、補正(他の研究分野ではアンミキシングとも呼ばれる)を使用する。補正の目的は、特定のプローブのスピルオーバー蛍光を「間違った」チャネルから取り除くことである。例えば、フルオレセインの蛍光は主に緑色で、FL1(FITC)チャネルで測定される。しかし、フルオレセインには、FL2(PE)チャネルに現れる蛍光に対して重要な黄色の成分もある。現在の慣行では、細胞は、実験的に使用されるのと同じ色素を有する抗体または抗抗体ビーズで染色される。オフチャネル蛍光を決定するために単一染色コントロールが実施され、これを説明するために補正マトリックスが作成される。これは最近、スペクトル補償に対して延長され、これは、過剰決定システム(つまり、フルオロフォアよりも多くの検出器)であるが、基本的なアプローチは類似する。
異なるフルオロフォア間の発光スペクトルが重複しているため、補正(他の研究分野ではアンミキシングとも呼ばれる)を使用する。補正の目的は、特定のプローブのスピルオーバー蛍光を「間違った」チャネルから取り除くことである。例えば、フルオレセインの蛍光は主に緑色で、FL1(FITC)チャネルで測定される。しかし、フルオレセインには、FL2(PE)チャネルに現れる蛍光に対して重要な黄色の成分もある。現在の慣行では、細胞は、実験的に使用されるのと同じ色素を有する抗体または抗抗体ビーズで染色される。オフチャネル蛍光を決定するために単一染色コントロールが実施され、これを説明するために補正マトリックスが作成される。これは最近、スペクトル補償に対して延長され、これは、過剰決定システム(つまり、フルオロフォアよりも多くの検出器)であるが、基本的なアプローチは類似する。
タンデム色素(すなわち、PE-Cy7またはAPC-Cy7のような2つのフルオロフォアで構成され、蛍光のためFRETに依存し得る色素)は、補償の要件を高める。これらのタンデム色素の使用は、異なる抗体に結合するとこれらの色素のFRET相互作用が変化するため、研究者に負担をかける。これには、単一染色補正コントロールで実験的に使用されるFRET対を用いて正確な抗体を実行する必要があり、これらのタンデムの1つを含有するパネルごとに1つの補償行列になる。例えば、表2は、4つの異なる4つのカラーパネルを示す。
蛍光特性は、CD4-PE-Cy7、CD5-PE-Cy7、CD6-PE-Cy7、およびCD7-PE-Cy7間で異なり、この実験では4つの異なる補償行列(パネルごとに1つ)および7つの異なる補償が実行されることが必要である(表3)。
しかしながら、本開示の特定の実施形態において、より穏やかなコンジュゲーションプロトコルおよび単一種および複数種(FRET)色素の両方を安定化させるDNAベースのプラットフォームをコンジュゲートする特性、色素コンジュゲート抗体(例えば、PHITONコンジュゲート抗体)の光学特性は変化しない。これにより、1つの補償行列および4つの補正コントロールを使用して同じ実験を実行することができる。例えば、PHITON標識抗体を使用すると、実験は次のようになる。
4つのパネルすべてが1つの補償行列を共有し(および有効に共有し得)、4つの補償コントロールの実行のみを必要とするため、実験計画が大幅に簡素化される。
そのようなシステムを使用して、当業者は、抗体を必要とせずに、対応する(相補的)配列を有する核酸リンカーを有するポリヌクレオチド修飾色素に核酸リンカーを介してコンジュゲートしたポリヌクレオチド修飾ビーズを使用することができる(図9)。これらの補償コントロールは、単一染色コントロールを実行するための一貫した方法である。さらに、それらは、抗体上の色素分子の分布の影響を受けない(すなわち、それらはビーズ上の純粋な色素であり、両方とも定量化され得る)ため、単一染色コントロール自体の固有の測定ノイズが最小限に抑えられる。
したがって、上で考察されたように、本開示のコンジュゲーション方法は、色素をビーズ上に直接配置することを可能にし、補償コントロールのための色素コンジュゲート抗体の使用に関連するコストを回避する。そのような方法はまた、発生するばらつきおよび補償行列の乗算を回避する(各タンデムコンジュゲート抗体は異なる挙動をとり、これには独自の補償コントロールが必要であるため)。特定の実施形態は、ユーザが多色コントロールの1つの一貫したセット(例えば、ビーズに直接コンジュゲートされたオリゴベースの色素)を実行することを可能にする。
精製。
本明細書の他の場所で考察された理由のために、精製は必要ない場合もあるが、本開示のバイオコンジュゲートを生成する方法は、例えば、高純度のバイオコンジュゲートが必要である場合に、遊離色素または他のコンジュゲート成分の精製を可能にする(例えば、図3および図10を参照されたい)。例えば、コンジュゲーションを使用して薬物-抗体バイオコンジュゲートを作成する場合、方法はまた、GMP製造プロセスで非結合抗体および薬物の両方の精製を可能にする。
本明細書の他の場所で考察された理由のために、精製は必要ない場合もあるが、本開示のバイオコンジュゲートを生成する方法は、例えば、高純度のバイオコンジュゲートが必要である場合に、遊離色素または他のコンジュゲート成分の精製を可能にする(例えば、図3および図10を参照されたい)。例えば、コンジュゲーションを使用して薬物-抗体バイオコンジュゲートを作成する場合、方法はまた、GMP製造プロセスで非結合抗体および薬物の両方の精製を可能にする。
特定の実施形態において、結合分子などのポリヌクレオチド修飾基質および/またはポリヌクレオチドベースの標識などのコンジュゲート成分は、ポリヌクレオチド修飾基質および/またはポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分から少なくとも部分的に相補的な配列を有する核酸鎖への一本鎖リンカー領域をアニールすることによって、アニールされた二本鎖リンカーを含むポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートを含む組成物から捕捉され得る。特定の実施形態において、相補的配列を有する核酸鎖は、精製のためにビーズにまたは表面に付着させられる。特定の実施形態において、ポリヌクレオチド修飾基質および/またはポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分の一本鎖リンカー領域がビーズに連結された後、ビーズは、遠心分離による除去などによって、ポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートから分離される。特定の実施形態において、ポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートは、相補的配列を有する固定化された核酸上で成分を通過させることによって分離される。特定の実施形態において、ビーズは、ビーズと、クロマトグラフィーカラム内にあるビーズなどの固定化表面の両方として機能することができる。
特定の実施形態において、この方法は、連結をコンジュゲートで置き換えることによって再生することができる廃棄物(例えば、非結合の、除去されたコンジュゲート)を生成する。
オリゴヌクレオチドベースの蛍光標識。
オリゴヌクレオチドベースの蛍光標識は、WO/2018/231805に詳細に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。標識として使用され得るオリゴヌクレオチドベースの蛍光標識は、様々な手法で作成することができる。いくつかの実施例において、DNA自己組織化を使用して、標識内の共振器の相対位置が、所望の時間的減衰プロファイルに従って指定された位置に対応することを確実にすることができる。例えば、ネットワークの各共振器は、それぞれの指定されたDNA鎖に結合され得る(図14)。各DNA鎖は、1つ以上の他のDNA鎖の部分を補完する1つ以上の部分を含み得、その結果、DNA鎖は、指定された相対位置に共振器を維持するナノ構造に自己組織化する。
オリゴヌクレオチドベースの蛍光標識は、WO/2018/231805に詳細に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。標識として使用され得るオリゴヌクレオチドベースの蛍光標識は、様々な手法で作成することができる。いくつかの実施例において、DNA自己組織化を使用して、標識内の共振器の相対位置が、所望の時間的減衰プロファイルに従って指定された位置に対応することを確実にすることができる。例えば、ネットワークの各共振器は、それぞれの指定されたDNA鎖に結合され得る(図14)。各DNA鎖は、1つ以上の他のDNA鎖の部分を補完する1つ以上の部分を含み得、その結果、DNA鎖は、指定された相対位置に共振器を維持するナノ構造に自己組織化する。
DNA自己組織化および他の新興のナノスケール製造技術により、特定の構造の多くのインスタンスをナノスケールで正確に製造することができる。例えば、WO/2018/231805に記載されるように、PHITONは、化学的方法で生成されたカスタムの合成DNAをアニールすることによって作製される。複数の鎖は、混合およびアニールされる前に、フルオロフォア、ペプチド、小分子などに事前にコンジュゲートされる。配列は、最低エネルギーの単一の有限組織化が存在し、溶液、乾燥、または凍結において安定であり、任意のコンジュゲート材料の相対位置を維持するように設計される。このような精度により、フルオロフォア、量子ドット、色素分子、プラズモンナノロッド、または他の光共振器を、様々な光共振器ネットワークを作成するために、互いに対して正確な位置および/または方向に配置することができる。このような共振器ネットワークを、様々な異なる用途を容易にするために指定することができる。いくつかの実施例において、共振器ネットワークは、それらが光励起(例えば、照明のパルスによる)と再放出との間に事前に指定された時間的関係を示すように設計することができる。これにより、単一の励起波長と単一の検出波長を使用して検出され得る、時間的に多重化された標識およびタガントが可能になる。追加的または代替的に、これらの共振器ネットワークによる、励起に対する光学的再放出のタイミングの確率的性質を利用して、確率変数のサンプルを生成することができる。これらの共振器ネットワークは、暗状態を示す1つ以上の「入力共振器」を含み得る。そのような入力共振器を含む共振器ネットワークは、共振器ネットワークを通る励起子または他のエネルギーの流れを制御するための論理ゲートまたは他の構造を実装するように構成され得る。次いで、そのような構造を使用して、例えば、単一の共振器ネットワークによる様々な異なる分析物の検出を可能にし、共振器ネットワークを使用して生成された確率変数の分布を制御し、生物学的サンプルを画像化するのに使用される標識のセットをさらに多重化し、または一部の他の用途を容易にすることができる。
これらの共振器ネットワークには、フルオロフォア、量子ドット、色素、ラマン色素、導電性ナノロッド、発色団、または他の光共振器構造のネットワークが含まれる。ネットワークは、抗体、アプタマー、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)の鎖、または目的の分析物への選択的な結合を可能にするように構成された他の受容体(例えば、表面タンパク質、分子エピトープ、特徴的なヌクレオチド配列、または目的の分析物の他の特徴的な特徴)をさらに含むことができる。標識を使用して、サンプルを観察したり、サンプルの内容物を同定したり(例えば、細胞、タンパク質、またはサンプル内の他の粒子もしくは物質を同定したり)、同定に基づいてそのような内容物を並べ替えたり(例えば、同定された細胞のタイプまたは他の特性に応じてフローサイトメーター内で細胞を並べ替えたり)、または他のいくつかの用途を容易にすることができる。本明細書に開示される特定の実施形態において、標識は、ポリヌクレオチドリンカーを介して、抗体またはビーズなどの基質に連結される。
例示的な用途では、そのような共振器ネットワークを適用して(例えば、共振器ネットワークを抗体、アプタマー、または他の分析物特異的受容体に結合することによって)、目的の生物学的または物質的なサンプルまたは他の環境の多数の異なる標識の存在を検出、区別、またはさもなければ観察することができる。そのような標識は、サンプル中(例えば、フローサイトメトリー装置のチャネル内)の目的の1つ以上の分析物の存在、量、または位置の検出を可能にし得る。識別可能な標識の大規模なライブラリにアクセスすることで、多数の異なる分析物の同時検出を可能にすることができる。追加的または代替的に、識別可能な標識の大規模なライブラリへのアクセスは、同じ分析物と、例えば、異なるエピトープ、表面タンパク質、または分析物の他の特徴に、結合するために複数の標識を使用することによって、特定の分析物(例えば、目的の細胞型またはサブタイプ)のより正確な検出を可能にすることができる。さらに、そのような大きな標識のライブラリへのアクセスは、例えば、サンプル中の異なる濃度を有する分析物に対応する異なる標識の有効輝度がこのようなサンプルを光学的に調べる場合もほぼ同じであることを確実にするために、目的の対応する分析物の推定密度または数に従って標識の選択を可能にし得る。
このような標識は、励起スペクトル、発光スペクトル、蛍光寿命、蛍光強度、光退色に対する感受性、分析物への結合または他のいくつかの環境要因への蛍光依存性、再放出光の偏光、または他のいくつかの光学特性に関して異なることによって識別可能であり得る。ただし、利用可能なフルオロフォアまたは他の光学的に識別可能な物質に関する制限、および目的の共通サンプル物質の波長透過性/適合性に関する制限のために、発光または励起スペクトルに関する差異に依存する場合、大きな識別可能な標識のライブラリを生成することは困難であり得る。
WO/2018/231805に、時間減衰プロファイルならびに/または励起および発光スペクトルに関して異なる光学標識を指定、製造、検出、および識別するための方法が記載されている。追加的または代替的に、提供される標識は、既存の標識(例えば、フルオロフォアベースの標識)と比較して増強された明るさを有し得、パネル設計を容易にするため、または異なる標識の相対的な明るさを可能にしていくつかの他の考慮を容易にするために設定可能な明るさを有し得る。そのような標識は、標識の励起(例えば、超高速レーザーパルスによる)に続く標識による光の再放出の時間依存確率に関して異なり得る。追加的または代替的に、そのような標識は、標識の励起波長と標識の発光波長との間の差異を増大させるための共振器のネットワークを含むことができる(例えば、入力共振器と出力共振器との間に多数の媒介共振器を挿入して、入力共振器と直接エネルギー伝達が好ましくない出力共振器の間で送信される励起を可能にすることによって)。さらに、そのような標識は、標識を検出および識別するときにさらなる多重化を可能にするために、論理ゲートまたは他の光学的に制御可能な構造を含み得る。
WO/2018/231805に記載される共振器ネットワーク(例えば、標識の一部として含まれる共振器ネットワーク)は、1つ以上の入力および/または読み出し共振器、出力共振器、暗状態提示「論理入力」共振器、および/または媒介共振器が、共振器の指定されたネットワークに従って配置されるように、さらに、ネットワークの時間減衰プロファイル、ネットワークの明るさ、励起スペクトル、発光スペクトル、ストークスシフト、またはネットワークのいくつかの他の光学特性、またはネットワークの目的のいくつかの他の検出可能な特性(例えば、目的の分析物への結合状態)がその特定化(例えば、特定の時間減衰プロファイル、照明に応じた放出確率)に対応するように、様々な方式で、製造され得る。そのような配置は、共振器間の相対的な位置、距離、向き、または他の関係(例えば、共振器の対の間の)が、共振器間の指定された位置、距離、向き、または他の関係に対応することを保証することを含み得る。
これには、DNA自己組織化を使用して1つ以上の共振器ネットワークの複数のインスタンスを製造することが含まれる。例えば、複数の異なるDNA鎖を、共振器ネットワークのそれぞれの共振器(例えば、入力共振器、出力共振器、および/またはメディエータ共振器)に結合する(例えば、チミジン上の一級アミノ修飾基を介して、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル修飾色素分子を付着させる)ことができる。DNA鎖の対は、DNA鎖が混合され、指定された条件(例えば、指定されたpHまたは指定された温度プロファイル)にさらされたときに、DNA鎖の相補的な部分が整列し、互いに結合して、共振器ネットワークの共振器の相対的な位置および/または向きを維持する半剛性ナノ構造を形成するように、少なくとも部分的に相補的な部分を有することができる。
図15に、このような共振器ネットワークの概略図を示す。入力共振器、出力共振器、および2つのメディエータ共振器がそれぞれのDNA鎖に結合される。次いで、結合されたDNA鎖は、追加のDNA鎖とともに、入力共振器、メディエータ共振器、および出力共振器が共振器ワイヤを形成するように、図示のナノ構造に自己組織化する。いくつかの実施例において、そのような方法または他の技術を介して、共振器ネットワークの単一のインスタンスの一部として(例えば、共振器ネットワークの明るさを増加させるために)、複数の別個の同一または異なるネットワークを形成することができる。
そのような共振器ネットワークの共振器間の距離を、共振器ネットワークが1つ以上の所望の挙動を示すように指定することができる(例えば、特定の励起波長の光によって励起され、かつ指定された時間減衰プロファイルに従って発光波長での光を応答して再放出する)。これは、隣接する共振が互いにエネルギーを伝達することができるように(例えば、双方向にまたは一方向に)、さらに、共振器が互いにクエンチし、さもなければ互いの光学特性に干渉しないように、隣接する共振器間の距離を指定することを含むことができる。共振器がリンカーを介してバックボーンに(例えば、アミド結合(例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル分子によって作成される)を介してDNAバックボーンにまたは他の連結構造に)結合される実施例において、リンカーを、これらの考慮事項により、ならびにリンカーの長さを念頭に置いて、指定されたバックグラウンド上の位置に結合することができる。例えば、結合位置は、リンカーの長さの2倍を超える距離によって分離され得る(例えば、共振器が互いに接触するのを防ぎ、したがって互いにクエンチするか、さもなければ互いの光学特性を妨害するために)。追加的または代替的に、結合位置は、共振器が互いにエネルギーを伝達し得る最大距離未満の距離だけ分離され得る。例えば、共振器は、フォースター共鳴エネルギー移動を介してエネルギーを伝達するときにフォースター半径によって特徴付けられるフルオロフォアまたは他のいくつかの光共振器であり得、結合位置は、フォースター半径未満の距離だけ分離され得る。
サンプル内のラベルを識別するためのシステムおよび方法の例。
存在、同一性、絶対量もしくは相対量、またはサンプルもしくは目的の他の環境に存在し得る本明細書に記載の標識の他の特性を検出するために、サンプル(例えば、生物学的サンプル、またはフローサイトメーター内の細胞の流れ)またはいくつかの他の目的の環境を調べることは、様々な用途で有益であり得る。そのような調査は、例えば、サンプル内に存在し、1つ以上の種々の標識が結合するように構成される1つ以上の分析物に関する位置、濃度、または他の情報を決定するために、サンプルの画像化を容易にすることができる。そのような調査は、そのような内容物を分類するために、またはいくつかの他の利益を提供するために、サンプルの細胞、タンパク質、RNAの鎖、または他の内容物の識別を容易にすることができる。例えば、フローサイトメトリー装置は、細胞(または他の目的の粒子)が流れるフローチャネルを含むことができる。そのようなフローチャネルについて、本明細書では、チャネル内の1つ以上の標識を識別するために、および/または細胞のタイプまたはサブタイプを識別するために、細胞の特性を決定するために、または識別された標識に基づいていくつかの他の情報を決定するために、調査することができる。次いで、そのような情報を使用して、例えば、細胞タイプに従って、細胞を分類することができる。
存在、同一性、絶対量もしくは相対量、またはサンプルもしくは目的の他の環境に存在し得る本明細書に記載の標識の他の特性を検出するために、サンプル(例えば、生物学的サンプル、またはフローサイトメーター内の細胞の流れ)またはいくつかの他の目的の環境を調べることは、様々な用途で有益であり得る。そのような調査は、例えば、サンプル内に存在し、1つ以上の種々の標識が結合するように構成される1つ以上の分析物に関する位置、濃度、または他の情報を決定するために、サンプルの画像化を容易にすることができる。そのような調査は、そのような内容物を分類するために、またはいくつかの他の利益を提供するために、サンプルの細胞、タンパク質、RNAの鎖、または他の内容物の識別を容易にすることができる。例えば、フローサイトメトリー装置は、細胞(または他の目的の粒子)が流れるフローチャネルを含むことができる。そのようなフローチャネルについて、本明細書では、チャネル内の1つ以上の標識を識別するために、および/または細胞のタイプまたはサブタイプを識別するために、細胞の特性を決定するために、または識別された標識に基づいていくつかの他の情報を決定するために、調査することができる。次いで、そのような情報を使用して、例えば、細胞タイプに従って、細胞を分類することができる。
目的の環境内の標識を検出および/または識別するためのそのような方法は、目的の環境に照明を提供すること(例えば、1つ以上の超短パルスの照明の形態で)、および照明に応答して環境から放出される光子の1つ以上の特性(例えば、そのような光子の波長またはスペクトル、例えば、照明の1つ以上のパルスの、照明のタイミングに対するそのような光子の放出のタイミング)を検出することを含むことができる。これは、照明の単一パルスを提供することと、環境内の1つ以上の標識の複数のインスタンスから応答して放出される光子を検出することと、を含むことができる。追加的または代替的に、1つ以上の標識の1つ以上のインスタンスは、複数の照明パルスによる複数回の照明であり得、照明パルスに対する、応答的に放出された光子のタイミングが検出され得る。次いで、応答的に放出された光子のタイミングに関する情報を使用して、環境内に存在する1つ以上の標識を識別し、そのような標識の結合状態または他の特性を判定し、環境内の標識の絶対量または相対量を決定し、または環境内に存在する本明細書に記載の1つ以上の標識に関連する他の情報を決定することができる。
照明を、1つ以上の照明パルスとして環境に提供することができる。提供される照明は、特定の波長、例えば、1つ以上の標識の入力共振器の励起波長を有することができる。このような励起波長は、例えば、入力共振器と同じフルオロフォア、量子ドット、色素、または他の光学物質または構造を含む標識の一部またはすべてのために、目的の環境内に存在する標識の一部またはすべてに共通であり得る。追加的または代替的に、複数の異なる波長の光を提供して、例えば、複数の異なる標識の複数の異なる入力共振器を励起することができる。いくつかの実施例において、そのような異なる波長の光を異なる時点で(例えば、異なる照明パルスの一部として)提供して、複数の異なるラベルおよび/または複数の異なるラベルのセットのスペクトル多重化検出を容易にすることができる。いくつかの実施例において、単一のラベルは、複数の異なる入力共振器を含み得、異なる入力共振器は、例えば、それぞれの異なる照明パルスの一部分として、それぞれの異なる波長の光によって励起され得る。
環境内の標識の識別を改善するために、環境を調査するために使用される照明のパルスは、超短パルス(例えば、アト秒からナノ秒のオーダーの持続時間を有するパルス)であり得る。このような超短パルスは、モードロック発振器から放出される広帯域パルスとして提供され得る。標識が長寿命状態を有する共振器(例えば、ランタニド原子または他のランタニド化合物または錯体)を含む実施例において、照明のパルスは、例えば、マイクロ秒ほどで、より長い持続時間を有し得る。
そのような照明のパルスと比較して、照明のパルスに応答して環境から光子を放出するタイミングは、様々な方式で検出され得る。いくつかの実施例において、個々の光子のタイミングは、例えば、1つ以上の単一光子アバランシェダイオード、光電子増倍管、または他の単一光子検出器を使用して検出され得る。そのような検出器の出力は、時間相関単一光子カウンターの一部として、照明のパルスが環境に提供された後の時間の関数として決定される光子の計数を決定するために使用され得る。そのような検出された光子のタイミングを使用して、サンプルの照明に応答したサンプルからの光子の放出のタイミングの確率密度関数を決定することができる。
追加的または代替的に、環境からの光子の放出のタイミングを検出することは、放出された光子の割合または強度における1つ以上のピークのタイミングを検出すること、または放出光子のタイミングのいくつかの他の集合特性を検出することを含み得る(例えば、既知の時間減衰プロファイルの対応するピークの遅延に一致させることができる、光子の放出率のピークの遅延タイミングを決定するために)。このような検出には、目的の環境から放出された光子を受容するように構成された単一光子アバランシェダイオードまたは他の光検出器要素の出力に、ピーク検出器、微分器、整合フィルター、またはいくつかの他のアナログまたはデジタル信号処理技術を、適用することが含まれる。
1つ以上の既知の標識が目的の環境内に存在し得、そのような標識の同一性を判定すること、および/または環境内の標識に関する他の情報を判定することが有益であり得る。上記のように、そのような標識は、それらの時間的減衰プロファイルに従って識別され得、すなわち、各既知の標識は、それぞれの異なる時間減衰プロファイルによって特徴付けられ得る。したがって、環境内に存在する1つ以上の標識の同一性は、環境からの光子の放出の検出されたタイミングを時間減衰プロファイルの辞書と比較することによって判定され得、辞書内の時間減衰プロファイルの各々は、環境内に存在し得るそれぞれの既知の標識に対応する。
環境を調査することには、複数の異なる波長範囲内の光子の放出のタイミングを検出することが含まれ得る。これは、標識の2つの異なる出力共振器からの光子の放出のタイミングを検出するために行うことができる。追加的または代替的に、これは、出力共振器、1つ以上の媒介共振器、および/または標識の入力共振器からの光子の放出のタイミングを検出するために行うことができる。
さらに、環境内に存在する1つ以上の標識は、標識の時間的減衰プロファイルは、暗状態提示共振器がそれぞれの暗状態にあるかどうかに依存するように、暗状態提示共振器を含んでもよい。例えば、標識は、第1の暗状態提示共振器を含み得、第1の暗状態提示共振器がその暗状態にあるときに第1の時間減衰プロファイルを示し得、標識は、第1の暗状態提示共振器がその暗状態にないときに第2の時間減衰プロファイルを示し得る。そのような実施例において、標識の検出および/または識別は、暗状態提示共振器(複数可)がその暗状態にない期間中に、および暗状態に入るように暗状態提示共振器(複数可)を誘導する異なる期間中に(例えば、暗状態提示共振器の励起波長で照明を提供することによって)、励起および再放出のタイミングを検出することを含み得る。
実施例1.
固有で非常に多様な配列ではなくポリヌクレオチド配列を使用すると、下流の用途でのコンジュゲートの収量および/またはコンジュゲートの性能に大きな影響を与え得ることに注意することが重要である。図11および図12は、これを末梢血単核細胞(PBMC)染色データを使用して示し、非常に多様な配列およびポリヌクレオチド配列の両方を使用してコンジュゲートしたPHITON標識抗体の性能を比較している。これら2つのデータセットのオーバーレイは、両方のコンジュゲーション方法がほぼ同一の染色パターンを生成し、したがって、コンジュゲーションの収率または染色結果を大幅に変えないことを示す。
固有で非常に多様な配列ではなくポリヌクレオチド配列を使用すると、下流の用途でのコンジュゲートの収量および/またはコンジュゲートの性能に大きな影響を与え得ることに注意することが重要である。図11および図12は、これを末梢血単核細胞(PBMC)染色データを使用して示し、非常に多様な配列およびポリヌクレオチド配列の両方を使用してコンジュゲートしたPHITON標識抗体の性能を比較している。これら2つのデータセットのオーバーレイは、両方のコンジュゲーション方法がほぼ同一の染色パターンを生成し、したがって、コンジュゲーションの収率または染色結果を大幅に変えないことを示す。
実施例2.
同じポリヌクレオチド配列を使用するコンジュゲートは、コンジュゲーション後に一緒に混合することもでき、有意な交換、すなわち、1つのコンジュゲートの変性および混合物中の他の種との副産物の再ハイブリダイゼーションを示すことなく、溶液中で安定を保ち得る。図13は、非常に多様で固有の配列と、両方のコンジュゲートに対する同じポリヌクレオチド配列の両方を使用して、Nova-Blue610-CD3とNovaYellow610-CD4との混合物で染色したPBMCを用いて、これを示す。図13のオーバーレイは、固有の配列が使用されているか、同じポリヌクレオチド配列が使用されているかに関係なく、結果がほぼ同じであることを示す。
同じポリヌクレオチド配列を使用するコンジュゲートは、コンジュゲーション後に一緒に混合することもでき、有意な交換、すなわち、1つのコンジュゲートの変性および混合物中の他の種との副産物の再ハイブリダイゼーションを示すことなく、溶液中で安定を保ち得る。図13は、非常に多様で固有の配列と、両方のコンジュゲートに対する同じポリヌクレオチド配列の両方を使用して、Nova-Blue610-CD3とNovaYellow610-CD4との混合物で染色したPBMCを用いて、これを示す。図13のオーバーレイは、固有の配列が使用されているか、同じポリヌクレオチド配列が使用されているかに関係なく、結果がほぼ同じであることを示す。
実施例3.
結合した1つ以上(一般に複数)の一本鎖核酸リンカー(例えば、ポリA)を含むビーズを使用して、非結合リンカー(例えば、ポリT)の親和性を使用してポリヌクレオチド修飾抗体とアニールして、ビーズの表面に結合した後、非コンジュゲートポリヌクレオチド修飾色素を精製することができる。図10は、結合色素と非結合色素の混合物をポリAビーズと反応させ、洗浄し、遠心分離(除去)して精製された上清を生成するこのプロセスを示す。
結合した1つ以上(一般に複数)の一本鎖核酸リンカー(例えば、ポリA)を含むビーズを使用して、非結合リンカー(例えば、ポリT)の親和性を使用してポリヌクレオチド修飾抗体とアニールして、ビーズの表面に結合した後、非コンジュゲートポリヌクレオチド修飾色素を精製することができる。図10は、結合色素と非結合色素の混合物をポリAビーズと反応させ、洗浄し、遠心分離(除去)して精製された上清を生成するこのプロセスを示す。
このような精製により、色素連結が全体のポリA鎖ではないが、1~10ヌクレオチドだけ少ない、10~20ヌクレオチドのより長い遊離ポリT鎖を使用して、色素とポリAビーズとの間の連結を置換することで再生され得る、廃棄物(例えば、除去された非結合色素)が生成される。このプロセスにより、色素が遊離のポリT鎖に交換され、洗浄と遠心分離の後、抗体への再コンジュゲーションに好適な精製された非結合の色素が上清に残る。
実施例4.
化学量論を変えることにより、光学特性を維持しながら、コンジュゲートの明るさを増加させることができる。例えば、色素:タンパク質(D:P)比を2コア色素について2に変化させる場合、これにより、所与の色素の明るさの増幅は4倍になる。別の例として、D:P比4および完全にロードされた単一の色素ラベル(例えば、PHITON上の16個の個別の色素)を用いると、4×16=64倍の明るさが得られ、個々の細胞上の極々少ない数の分子(現在は検出可能ではない)を検出する方式(そのうえ定量的な)が得られる。
化学量論を変えることにより、光学特性を維持しながら、コンジュゲートの明るさを増加させることができる。例えば、色素:タンパク質(D:P)比を2コア色素について2に変化させる場合、これにより、所与の色素の明るさの増幅は4倍になる。別の例として、D:P比4および完全にロードされた単一の色素ラベル(例えば、PHITON上の16個の個別の色素)を用いると、4×16=64倍の明るさが得られ、個々の細胞上の極々少ない数の分子(現在は検出可能ではない)を検出する方式(そのうえ定量的な)が得られる。
したがって、本発明の広さおよび範囲は、上記の例示的な実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物に従ってのみ規定されるべきである。
Claims (44)
- 核酸リンカーを介してコンジュゲート成分に連結された結合分子を含むポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲートであって、
任意選択で、前記核酸リンカーが二本鎖セグメントを含み、
任意選択で、前記核酸リンカーが全体的に二本鎖である、
ポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲート。 - 前記コンジュゲート成分が核酸を含み、前記核酸リンカーが前記コンジュゲート成分の核酸鎖の延長部を含み、
任意選択で、前記コンジュゲート成分の前記核酸が、前記核酸リンカーを含まずに、少なくとも10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、65、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、175、200、300、もしくは400ヌクレオチド、またはそれらの間の任意の範囲の長さを有し、
任意選択で、前記コンジュゲート成分の前記核酸が、三次および/または四次構造を有する、請求項1に記載のポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲート。 - 前記結合分子が、抗体またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体、ペプチド、組換え、天然、もしくは操作された受容体/リガンドタンパク質、アプタマー、テトラマー(T細胞受容体の検出に使用されるペプチドを有する折り畳みMHCタンパク質)、非抗体タンパク質または抗体模倣物、例えば、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、ファイノマー、クニッツドメインペプチド、nanoCLAMP、設計アンキリンリピートタンパク質(DARPin)、モノボディ、ナノボディ、アンチカリン、アフィボディ、およびSOMAmerであり、
任意選択で、前記結合分子が、抗体またはその抗原結合断片、変異体、または誘導体であり、
任意選択で、前記結合分子が受容体リガンドである、請求項1または2に記載のポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲート。 - 前記核酸リンカーが、約10、15、20、25、30、35、40、または50ヌクレオチドの長さのいずれかから約15、20、25、30、35、40、50、または75ヌクレオチドの長さのいずれかであり、
任意選択で、前記コンジュゲート成分が核酸を含み、前記核酸リンカーの前記長さが前記コンジュゲート成分のエッジから決定され、前記コンジュゲート成分の前記エッジが4ヌクレオチドより長い任意の一本鎖セグメントの末端である、請求項1~3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲート。 - 前記核酸リンカーの前記二本鎖セグメントが、約10、15、20、25、30、35、40、または50ヌクレオチドの長さのいずれかから約15、20、25、30、35、40、50、または75ヌクレオチドの長さのいずれかである、請求項4に記載のポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲート。
- 前記二本鎖セグメントが、約10、15、20、25、30、35、40、または50の相補的塩基対のいずれかから約15、20、25、30、35、40、50、または75の相補的塩基対のいずれかを含み、
任意選択で、前記二本鎖セグメントの少なくとも85%、90%、95%、もしくは98%が相補的塩基対を形成しているか、または前記二本鎖セグメントが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、もしくは11個以下のミスマッチ塩基対を有し、
任意選択で、前記二本鎖セグメントが、少なくとも約7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20の連続した相補的塩基対を含むか、または約7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、もしくは50の連続した相補的塩基対のいずれかから約8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、65、70、もしくは75の連続した相補的塩基対のいずれかを含み、
任意選択で、前記二本鎖セグメントの100%が相補的な塩基対を形成している、請求項5に記載のポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲート。 - 前記核酸リンカーの前記二本鎖セグメントが、一方の鎖にポリアデノシン配列(ポリA)を含み、他方の鎖にポリチミジン配列(ポリT)を含むか、
前記核酸リンカーの前記二本鎖セグメントが、一方の鎖にポリシトシン配列(ポリC)を含み、他方の鎖にポリグアニジン配列(ポリG)を含むか、
前記核酸リンカーの前記二本鎖セグメントが、一方の鎖にポリAおよびポリC配列を含み、他方の鎖にポリTおよびポリG配列を含むか、または、
前記核酸リンカーの前記二本鎖セグメントが、一方の鎖にポリAおよびポリG配列を含み、他方の鎖にポリTおよびポリC配列を含み、
任意選択で、前記核酸リンカーの前記二本鎖セグメントが、一方の鎖のポリアデノシン配列(ポリA)および他方の鎖のポリチミジン配列(ポリT)からなるか、または、
任意選択で、前記核酸リンカーの前記二本鎖セグメントが、一方の鎖のポリシトシン配列(ポリC)および他方の鎖のポリグアニジン配列(ポリG)からなる、請求項1~6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲート。 - 前記コンジュゲート成分が、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体、核酸、アプタマー、タンパク質、色素もしくは標識、小分子、治療用ペプチド、受容体リガンド、薬学的に活性な薬剤、またはオリゴヌクレオチドベースの蛍光標識である、請求項1~7のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲート。
- 前記コンジュゲート成分が、オリゴヌクレオチドベースの蛍光標識である、請求項1~7のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲート。
- 前記結合分子の標識度(DoL)は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、もしくは11、またはエンドポイントを含むそれらの間の任意の範囲であり、
前記結合分子の標識度(DoL)が、前記核酸の利用可能性を介して化学量論的に制御され、かつ/または
ポリヌクレオチド修飾結合分子上の前記核酸の標識度(DoL)が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、もしくは11、またはエンドポイントを含むその間の任意の範囲であり、前記コンジュゲート成分のDoLとは無関係である、請求項1~9のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲート。 - 前記バイオコンジュゲートが、フローサイトメトリー、抗体スクリーニング、ELISAもしくは他のサンドイッチアッセイ、免疫モニタリング、バイオマーカーアッセイ、ラテラルフロー、ポイントオブケア/迅速診断、画像化、顕微鏡検査、分子診断、次世代シーケンシング、ロングリードシーケンシング、in situシーケンシング、ポリメラーゼ連鎖反応、マイクロアレイ、核酸シーケンシング、アミノ酸シーケンシング、デジタル病理学、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティングのうちの1つ以上のために、または予防および/もしくは治療目的で、細胞、組織、および/もしくは器官を特異的に標識するために使用され得る、請求項1~10のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲート。
- 前記核酸リンカーが、固有の識別配列を含み、
任意選択で、前記核酸リンカーの前記二本鎖セグメントが、固有の識別配列を含む、請求項1~11のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲート。 - 前記固有の識別配列が、核酸増幅および/または次世代シーケンシングのために使用され得る、請求項12に記載のポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲート。
- 前記核酸リンカーは、それが下流のシーケンシング用途においてフィルタリングされることを可能にする配列を含み、
前記核酸リンカーが、第3の生体分子による特異的結合のための、および/または酵素的切断を介した標的遺伝子編集のための配列(例えば、CRISPR、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、制限酵素)を含み、
前記核酸リンカーが、酵素活性または結合活性を可能にする2つ以上の固有の配列を含み、かつ/または、
酵素活性または結合活性を可能にする固有の配列が前記二本鎖セグメントに存在する、請求項1~13のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲート。 - 前記核酸リンカーが、(i)前記結合分子に付着した部分、(ii)前記コンジュゲート成分に付着した部分または前記コンジュゲート成分の延長部、および(iii)(i)または(ii)ではない少なくとも1つの追加部分を含み、
任意選択で、(iii)はまた、前記コンジュゲート成分に付着したもしくは前記コンジュゲート成分の延長部であるか、または追加のコンジュゲート成分に付着したもしくは追加のコンジュゲート成分の延長部である、第2の部分であり得る、請求項1~14のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲート。 - 核酸リンカーを介してコンジュゲート成分に連結されたビーズを含むポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲートであって、
任意選択で、前記核酸リンカーが二本鎖セグメントを含み、
任意選択で、前記核酸リンカーが全体的に二本鎖である、
ポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲート。 - 前記コンジュゲート成分が核酸を含み、前記核酸リンカーが前記コンジュゲート成分の核酸鎖の延長部を含み、
任意選択で、前記コンジュゲート成分の前記核酸が、前記核酸リンカーを含まずに、少なくとも10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、65、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、175、200、300、もしくは400ヌクレオチド、またはそれらの間の任意の範囲の長さを有し、
任意選択で、前記コンジュゲート成分の前記核酸が、三次構造および/または四次構造を有する、請求項16に記載のポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲート。 - 前記核酸リンカーが、約10、15、20、25、30、35、40、または50ヌクレオチドの長さのいずれかから約15、20、25、30、35、40、50、または75ヌクレオチドの長さのいずれかであり、
任意選択で、前記コンジュゲート成分が核酸を含み、前記核酸リンカーの前記長さが前記コンジュゲート成分のエッジから決定され、前記コンジュゲート成分の前記エッジが4ヌクレオチドより長い任意の一本鎖セグメントの末端である、請求項16または17に記載のポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲート。 - 前記核酸リンカーの前記二本鎖セグメントが、約10、15、20、25、30、35、40、または50ヌクレオチドの長さのいずれかから約15、20、25、30、35、40、50、または75ヌクレオチドの長さのいずれかである、請求項18に記載のポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲート。
- 前記二本鎖セグメントが、約10、15、20、25、30、35、40、または50の相補的塩基対のいずれかから約15、20、25、30、35、40、50、または75の相補的塩基対のいずれかを含み、
任意選択で、前記二本鎖セグメントの少なくとも85%、90%、95%、もしくは98%が相補的塩基対を形成しているか、または前記二本鎖セグメントが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、もしくは11個以下のミスマッチ塩基対を有し、
任意選択で、前記二本鎖セグメントが、少なくとも約7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20の連続した相補的塩基対を含むか、または約7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、もしくは50の連続した相補的塩基対のいずれかから約8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、65、70、もしくは75の連続した相補的塩基対のいずれかを含み、
任意選択で、前記二本鎖セグメントの100%が相補的な塩基対を形成している、請求項19に記載のポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲート。 - 前記核酸リンカーの前記二本鎖セグメントが、一方の鎖にポリアデノシン配列(ポリA)を含み、他方の鎖にポリチミジン配列(ポリT)を含むか、
前記核酸リンカーの前記二本鎖セグメントが、一方の鎖にポリシトシン配列(ポリC)を含み、他方の鎖にポリグアニジン配列(ポリG)を含むか、
前記核酸リンカーの前記二本鎖セグメントが、一方の鎖にポリAおよびポリC配列を含み、他方の鎖にポリTおよびポリG配列を含むか、または、
前記核酸リンカーの前記二本鎖セグメントが、一方の鎖にポリAおよびポリG配列を含み、他方の鎖にポリTおよびポリC配列を含み、
任意選択で、前記核酸リンカーの前記二本鎖セグメントが、一方の鎖のポリアデノシン配列(ポリA)および他方の鎖のポリチミジン配列(ポリT)からなるか、または、
任意選択で、前記核酸リンカーの前記二本鎖セグメントが、一方の鎖のポリシトシン配列(ポリC)および他方の鎖のポリグアニジン配列(ポリG)からなる、請求項16~20のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲート。 - 前記コンジュゲート成分が、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体、核酸、アプタマー、タンパク質、色素もしくは標識、小分子、治療用ペプチド、受容体リガンド、薬学的に活性な薬剤、またはオリゴヌクレオチドベースの蛍光標識である、請求項16~21のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲート。
- 前記コンジュゲート成分が、オリゴヌクレオチドベースの蛍光標識である、請求項16~21のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲート。
- 前記ビーズのDoLは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、もしくは11、またはエンドポイントを含むそれらの間の任意の範囲であり、
前記ビーズのDoLは、100、1,000、10,000、100,000、もしくは1,000,000、またはエンドポイントを含むその間の任意の範囲であり、および/または
前記ビーズの標識度(DoL)が、前記核酸の利用可能性を介して化学量論的に制御され、
ポリヌクレオチド修飾ビーズ上の前記核酸の標識度(DoL)は、前記コンジュゲート成分のDoLとは無関係である、請求項16~23のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲート。 - 前記バイオコンジュゲートが、フローサイトメトリー、抗体スクリーニング、ELISAもしくは他のサンドイッチアッセイ、免疫モニタリング、バイオマーカーアッセイ、ラテラルフロー、ポイントオブケア/迅速診断、画像化、顕微鏡検査、分子診断、次世代シーケンシング、ロングリードシーケンシング、in situシーケンシング、ポリメラーゼ連鎖反応、マイクロアレイ、核酸シーケンシング、アミノ酸シーケンシング、デジタル病理学、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティングのうちの1つ以上のために、コントロールや、機器、アッセイ、もしくはシステムの較正用などの参照サンプルとして、または予防および/もしくは治療目的で、細胞、組織、および/もしくは器官を標識するために使用され得る、請求項16~24のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲート。
- 前記核酸リンカーが固有の識別配列を含み、
任意選択で、前記核酸リンカーの前記二本鎖セグメントが、固有の識別配列を含む、請求項16~25のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲート。 - 前記固有の識別配列が、核酸増幅および/または次世代シーケンシングのために使用され得る、請求項26に記載のポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲート。
- 前記核酸リンカーは、それが下流のシーケンシング用途においてフィルタリングされることを可能にする配列を含み、
前記核酸リンカーが、第3の生体分子による特異的結合のための、および/または酵素的切断を介した標的遺伝子編集のための配列(例えば、CRISPR、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、制限酵素)を含み、
前記核酸リンカーが、酵素活性または結合活性を可能にする2つ以上の固有の配列を含み、かつ/または、
酵素活性または結合活性を可能にする固有の配列が前記二本鎖セグメントに存在する、請求項16~27のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲート。 - 前記核酸リンカーが、(i)前記ビーズに付着した部分、(ii)前記コンジュゲート成分に付着した部分または前記コンジュゲート成分の延長部、および(iii)(i)または(ii)ではない少なくとも1つの追加部分を含み、
任意選択で、(iii)はまた、前記コンジュゲート成分に付着したもしくは前記コンジュゲート成分の延長部であるか、または追加のコンジュゲート成分に付着したもしくは追加のコンジュゲート成分の延長部である、第2の部分であり得る、請求項16~28のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲート。 - 請求項1~15のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲートまたは請求項16~29のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲートを生成する方法であって、前記方法が、
(i)少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを含むポリヌクレオチド修飾基質を、少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを含むポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触させることであって、前記基質が結合分子またはビーズであり、
前記基質の前記一本鎖リンカー配列の少なくとも一部分は、前記コンジュゲート成分の前記一本鎖リンカー配列の一部分に相補的であり、接触するとき、前記基質の前記核酸リンカーおよび前記コンジュゲート成分の前記核酸リンカーがアニールして、前記基質を前記コンジュゲート成分に連結する少なくとも部分的に二本鎖のリンカーを形成し、
任意選択で、前記ポリヌクレオチド修飾基質と前記ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分とを接触させる前に、前記方法が、前記少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを前記基質に付着させて前記ポリヌクレオチド修飾基質を形成するステップを含み、かつ/または、
任意選択で、前記ポリヌクレオチド修飾基質と前記ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分とを接触させる前に、前記方法が、前記少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを前記コンジュゲート成分に付着させて、前記ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分を形成するステップを含む、接触させること、
(ii)基質をコンジュゲート成分と接触させることであって、前記基質が結合分子またはビーズである、接触させること、核酸リンカーを前記基質に付着させること、および、同じ核酸リンカーを前記コンジュゲート成分に付着させて、前記ポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートを形成することであって、
任意選択で、前記核酸リンカーが二本鎖セグメントを含むか、または前記核酸リンカーが全体的に二本鎖であり、前記方法が、前記基質におよび前記コンジュゲート成分に付着する前に少なくとも部分的に二本鎖の核酸リンカーを形成するために核酸鎖をハイブリダイズすることを含む、形成すること、
(iii)核酸リンカーを含むポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分を基質と接触させることであって、前記基質が結合分子またはビーズである、接触させること、および、前記ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分の前記核酸リンカーを前記基質に付着させて、前記ポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートを形成することであって、
任意選択で、前記核酸リンカーが二本鎖セグメントを含むか、または前記核酸リンカーが全体的に二本鎖であり、前記方法が、前記ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分の前記核酸リンカーを前記基質に付着させて、前記ポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートを形成する前に、核酸鎖をハイブリダイズして、前記ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分上に少なくとも部分的に二本鎖の核酸リンカーを形成することを含む、形成すること、
(iv)核酸リンカーを含むポリヌクレオチド修飾基質をコンジュゲート成分と接触させることであって、前記基質が結合分子またはビーズであり、前記ポリヌクレオチド修飾基質の前記核酸リンカーを前記コンジュゲート成分に付着させて、前記ポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートを形成し、
任意選択で、前記核酸リンカーが二本鎖セグメントを含むか、または前記核酸リンカーが全体的に二本鎖であり、前記方法が、前記ポリヌクレオチド修飾基質の前記核酸リンカーを前記コンジュゲート成分に付着させて、前記ポリヌクレオチド修飾バイオコンジュゲートを形成する前に、核酸鎖をハイブリダイズして、前記ポリヌクレオチド修飾基質上に少なくとも部分的に二本鎖の核酸リンカーを形成することを含む、接触させること、あるいは、
(v)(i)少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを含むポリヌクレオチド修飾基質であって、前記基質が結合分子またはビーズである、ポリヌクレオチド修飾基質と、(ii)少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを含むポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と、(iii)(i)または(ii)の前記核酸リンカーではない、さらなる少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーセグメントと、を接触させることであって、
前記基質の前記一本鎖リンカー配列の少なくとも一部分は、前記さらなる核酸リンカーセグメント(iii)の一本鎖部分に相補的であり、かつ/または、前記コンジュゲート成分の前記一本鎖リンカー配列の少なくとも一部分は、前記さらなる核酸リンカーセグメント(iii)の一本鎖部分に相補的であり、接触するとき、前記基質の前記核酸リンカー、前記コンジュゲート成分の前記核酸リンカー、および前記さらなる核酸リンカーセグメントがアニールして、前記基質を前記コンジュゲート成分に連結する少なくとも部分的に二本鎖のリンカーを形成する、接触させること、を含む、方法。 - 前記ポリヌクレオチド修飾基質の前記一本鎖核酸リンカーが、ポリA配列を含み、前記ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分の前記一本鎖核酸リンカーが、ポリT配列を含むか、または
前記ポリヌクレオチド修飾基質の前記一本鎖核酸リンカーが、ポリT配列を含み、前記ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分の前記一本鎖核酸リンカーが、ポリA配列を含むか、または、
前記ポリヌクレオチド修飾基質の前記一本鎖核酸リンカーが、ポリC配列を含み、前記ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分の前記一本鎖核酸リンカーが、ポリG配列を含むか、または、
前記ポリヌクレオチド修飾基質の前記一本鎖核酸リンカーが、ポリG配列を含み、前記ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分の前記一本鎖核酸リンカーが、ポリC配列を含むか、または、
前記ポリヌクレオチド修飾基質の前記一本鎖核酸リンカーが、ポリC配列ならびにポリAおよび/もしくはポリT配列を含み、前記ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分の前記一本鎖核酸リンカーが、ポリG配列ならびにポリAおよび/もしくはポリT配列を含むか、または、
前記ポリヌクレオチド修飾基質の前記一本鎖核酸リンカーが、ポリG配列ならびにポリAおよび/もしくはポリT配列を含み、前記ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分の前記一本鎖核酸リンカーが、ポリC配列ならびにポリAおよび/もしくはポリT配列を含む、請求項30に記載の方法。 - 検出のための標識結合分子を生成する高率の方法であって、同じ結合分子の別個の結合分子の分子が異なるコンジュゲート成分で標識され、前記方法が、
(a)少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを前記同じ結合分子の少なくとも2つの別個の結合分子の分子に付着させて、複数のポリヌクレオチド修飾結合分子の分子を生成することと、
(b)複数の少なくとも1つのポリヌクレオチド修飾結合分子の分子を、少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを含む第1のポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触させ、前記複数の少なくとも1つの異なるポリヌクレオチド修飾結合分子の分子を、少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを含む第2のポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触させることであって、前記第1および第2のポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分が検出標識を含み、少なくともそれらの検出標識が異なる、接触させることと、を含み、
前記結合分子の分子の前記核酸リンカーの前記一本鎖配列の少なくとも一部分は、前記第1および/または第2のコンジュゲート成分の前記核酸リンカーの一本鎖配列に相補的であり、接触するとき、前記核酸リンカーがアニールして、前記結合分子の分子を前記コンジュゲート成分に連結する二本鎖リンカーを形成し、
任意選択で、前記複数の1つ以上の追加のポリヌクレオチド修飾結合分子の分子が、異なる検出標識を有する1つ以上の追加のポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触させられ、
任意選択で、前記複数のポリヌクレオチド修飾結合分子の分子のうちの少なくとも3、4、5、6、7、8、9、または10個が各々、他とは異なる検出標識を有するポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触し、
任意選択で、前記結合分子が、抗体またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体であり、または、
前記検出のための標識結合分子を生成する高率の方法が、核酸リンカーを、請求項30に記載の結合分子、コンジュゲート成分、もしくは結合分子とコンジュゲート成分との両方に直接付着することによって実行され、かつ/または、検出のための標識結合分子を生成する前記高率が、請求項30に記載の追加の核酸リンカーセグメントを使用して実行され、
前記同じ結合分子の別個の結合分子の分子が、異なるコンジュゲート成分で標識されており、
任意選択で、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、または10個の別個の結合分子の分子が各々、他とは異なる検出標識を有するコンジュゲート成分で標識されており、
任意選択で、前記結合分子が、抗体またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体である、方法。 - 各コンパートメント内の一意的に標識されたポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触させるために、前記複数のポリヌクレオチド修飾結合分子の分子を別個のコンパートメントに分注し、したがって、前記同じ結合分子の異なる標識された結合分子の分子を生成することを含む、請求項32に記載の方法。
- 前記複数の結合分子の分子の前記少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーが、前記ポリヌクレオチド修飾結合分子の分子のすべてについて同じであり、前記コンジュゲート成分の少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーが、すべての前記ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分について同じである、請求項32または33に記載の方法。
- 検出のための標識結合分子を生成する高率の方法であって、異なる結合分子が同じコンジュゲート成分で標識され、前記方法が、
(a)少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを少なくとも2つの異なる結合分子に付着させて、少なくとも2つの異なるポリヌクレオチド修飾結合分子を生成することと、
(b)少なくとも2つの異なるポリヌクレオチド修飾結合分子を、検出標識を含み、少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを含むポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触させることと、を含み、
前記結合分子の前記核酸リンカーの前記一本鎖配列の少なくとも一部分は、前記コンジュゲート成分の前記核酸リンカーの一本鎖配列に相補的であり、接触するときに、前記核酸リンカーがアニールして、前記結合分子を前記コンジュゲート成分に連結する二重鎖リンカーを形成し、
任意選択で、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ超の追加のポリヌクレオチド修飾結合分子が、前記ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触し、
任意選択で、前記結合分子の1つ以上が、抗体またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体であり、
前記検出のための標識結合分子を生成する高率の方法が、核酸リンカーを、請求項30に記載の結合分子、コンジュゲート成分、もしくは結合分子とコンジュゲート成分との両方に直接付着することによって実行され、かつ/または、検出のための標識結合分子を高率で生成することが、請求項30に記載の追加の核酸リンカーセグメントを使用して実行され、
任意選択で、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ超の追加のポリヌクレオチド修飾結合分子が、前記ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触し、
任意選択で、前記結合分子が、抗体またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体である、方法。 - 各コンパートメント内の前記ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分と接触させるために、各タイプの結合分子について別個のコンパートメントに異なるポリヌクレオチド修飾結合分子を分注し、したがって、同じ標識で標識された異なる結合分子を生成することを含む、請求項35に記載の方法。
- 前記異なる結合分子の前記少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーがすべての前記ポリヌクレオチド修飾結合分子について同じであり、単一の少なくとも部分的に一本鎖の核酸配列が前記ポリヌクレオチド修飾コンジュゲート成分の前記核酸リンカーとして使用される、請求項35または36に記載の方法。
- 検出のための1つの標識結合分子または複数の標識結合分子を生成する高率の方法であって、前記方法が、請求項32~34のいずれか一項に記載の方法と請求項35~37のいずれか一項に記載の方法を組み合わせることを含む、方法。
- 組成物であって、
(i)(a)少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを含む基質であって、前記基質が結合分子またはビーズである、基質、および
(i)(b)少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを含むコンジュゲート成分であって、
前記基質の前記核酸リンカーの一本鎖配列の少なくとも十分な部分が、前記リンカーがアニールし、前記基質を前記コンジュゲート成分に連結する少なくとも部分的に二本鎖のリンカーを形成することを可能にするために、前記コンジュゲート成分の前記核酸リンカーの前記一本鎖配列の一部分に相補的である、コンジュゲート成分、
(ii)(a)核酸リンカーを含む基質であって、前記基質が、結合分子またはビーズである、基質、および
(ii)(b)前記核酸リンカーに付着して、前記基質を前記コンジュゲート成分に連結することができるコンジュゲート成分、
(iii)(a)核酸リンカーを含むコンジュゲート成分、
(iii)(b)前記核酸リンカーに付着して、前記コンジュゲート成分を前記基質に連結することができる基質、
(iv)(a)核酸リンカーに付着することができる基質であって、前記基質が、結合分子またはビーズであり、コンジュゲート成分が核酸リンカーに付着することができる、基質、および
(iv)(b)核酸リンカーであって、前記核酸リンカーが、一本鎖であるか、二本鎖セグメントを含むか、または前記核酸リンカーが全体的に二本鎖である、核酸リンカー、あるいは
(v)(a)少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを含む基質であって、前記基質が結合分子またはビーズである、基質、
(v)(b)少なくとも部分的に一本鎖の核酸リンカーを含むコンジュゲート成分、および
(v)(c)さらなる核酸リンカーセグメント、を含み、
(v)(a)、(v)(b)、および(v)(c)がアニールして、(v)(a)、(v)(b)、および(v)(c)を含み、かつ(v)(a)を(v)(b)に連結する少なくとも部分的に二本鎖の核酸リンカーを形成することができる、組成物。 - 前記組成物が、請求項1~15のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲートまたは請求項16~29のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲートを生成することができる、請求項39に記載の組成物。
- 細胞、組織、および/または器官を標識する方法であって、前記方法が、前記細胞、組織、および/または器官を、請求項1~15のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲートと接触させることを含み、前記バイオコンジュゲートの結合分子部分が、前記細胞、組織、および/または器官の抗原、エピトープ、および/またはハプテンに結合し、前記バイオコンジュゲートのコンジュゲート成分部分が、検出可能な標識を含み、
任意選択で、前記バイオコンジュゲートの前記結合分子部分が、前記細胞、組織、および/または器官の抗原、エピトープ、および/またはハプテンを特異的に認識し、かつそれらに特異的に結合するか、
任意選択で、前記標識が視覚的検出のための標識であるか、
任意選択で、前記標識された細胞が、フローサイトメトリー、抗体スクリーニング、ELISAもしくは他のサンドイッチアッセイ、免疫モニタリング、バイオマーカーアッセイ、ラテラルフロー、ポイントオブケア/迅速診断、画像化、顕微鏡検査、分子診断、次世代シーケンシング、ロングリードシーケンシング、in situシーケンシング、ポリメラーゼ連鎖反応、マイクロアレイ、核酸シーケンシング、アミノ酸シーケンシング、デジタル病理学、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティングのうちの1つ以上のために、コントロールや、機器、アッセイ、システムの較正用などの参照サンプルとして、または予防および/もしくは治療目的で、使用され得るか、
任意選択で、前記標識が、細胞膜のための標識であるか、
任意選択で、前記標識が、細胞生存能のための標識であるか、または
任意選択で、前記標識が、ゲノム材料を標的する特定の標識である、方法。 - 前記標識された細胞が、フローサイトメトリーで使用される、請求項41に記載の方法。
- 標識された細胞、組織、および/または器官からのシグナルを定量的に測定する方法であって、前記方法が、
(a)前記細胞、組織、および/または器官を、請求項1~15のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲートと接触させることであって、前記バイオコンジュゲートの結合分子部分が、前記細胞、組織、および/または器官の抗原、エピトープ、膜、ゲノム物質および/またはハプテンに結合し、前記バイオコンジュゲートのコンジュゲート成分部分が、検出可能な標識を含む、接触させることと、
(b)結合分子のDoLが既知である前記ポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲートの存在を測定し、したがって、定量的測定を行うことを可能にすることと、を含み、
任意選択で、前記結合分子の標識度(DoL)が、前記核酸の利用可能性を介して化学量論的に制御され、
任意選択で、前記結合分子のDoLが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11、またはエンドポイントを含むそれらの間の任意の範囲であり、
任意選択で、ポリヌクレオチド修飾結合分子上の前記核酸の標識度(DoL)は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11、またはエンドポイントを含むそれらの間の任意の範囲であり、前記コンジュゲート成分のDoLとは無関係であり、かつ/または
任意選択で、ポリヌクレオチド修飾結合分子上の前記核酸の標識度(DoL)は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、もしくは11、またはエンドポイントを含むそれらの間の任意の範囲であり、前記コンジュゲート成分のDoLとは無関係である、方法。 - 請求項1~15のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾結合分子バイオコンジュゲートを生成し、請求項16~29のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド修飾ビーズバイオコンジュゲートを生成し、請求項39または40に記載の組成物を生成し、または請求項1~43に記載のいずれかの方法を実行するために必要な1つ以上の成分を含むキットであって、
任意選択で、前記キットが、印刷された説明書および/または電子記憶媒体上のいずれかの説明書、緩衝液および/もしくは追加の試薬、ならびに/または包装材料をさらに含む、キット。
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