JP5589391B2 - 併行糖化発酵反応によるエタノールの連続製造方法 - Google Patents
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Description
バイオマス資源中の多糖類から発酵基質となる単糖や少糖類を作る方法として、酵素やその酵素を生産する微生物を用いてセルロースやヘミセルロースを加水分解する酵素糖化法が、環境負荷の小さい方法として検討されている。
Scott,C.D.らは、古紙の糖化装置として、連続的な磨砕と膜を用いた分離と酵素の再利用、固定化菌体による酵素の生産、高濃度のスラリー状態で処理、による低コスト化が可能であると予測している。この古紙の糖化装置による糖化法については、生成物阻害を避けるため、反応液は膜により分離し、限外濾過膜で酵素を回収し、固定化したβグルコシダーゼでセロビオースをグルコースに分解し、グルコースは逆浸透膜で濃縮すること、酵素を大量(濾紙分解活性で基質1gに対して80−160単位)に添加した主反応槽に高速遠心ポンプによる磨砕を行う循環ラインを設けて、常にセルロース繊維から新しい表面を露出させ、反応後の液から限外ろ過によって酵素を分離回収しながら行う連続反応槽を採用すること、を想定してコストを予測している。摩砕しながら高い酵素濃度で処理することにより、糖化率は25時間で100%であるとされている。この方法では、酵素の回収率は24時間で95%以上であるとされているが、酵素が残渣に吸着するため、pHや温度を変えて酵素を基質残渣から剥がして回収するとしている。
このように、バイオマス資源の酵素糖化については、現状では、コストがまだ高いことが問題であり、何らかの方法でコストを下げる工夫が必要となっている。
しかしながら、セルロース系バイオマスから糖類を製造することは、トウモロコシデンプンなどから糖を製造する場合に比べて、酵素による糖化が容易でなく、デンプンを原料とする場合に比べて経済性が劣っていた。
セルロース系バイオマスの糖化、発酵では、糖化酵素のコストが高いことが課題であり、糖化酵素の糖化効率を高めることが重要であるにもかかわらず、至適温度で反応できないという課題があった。そこで、酒酵母より高い温度で増殖し、発酵することができる微生物の開発は重要である。このような微生物としてイサチェンキア・オリエンタリスが単離されている(特許文献7参照)。また、特許文献8では、高温で同時糖化発酵できる酵母について記載されている。
本発明は、セルロース系バイオマスを酵素による糖化の原料とし、併行糖化発酵を行うに際し、糖化酵素の活性を損なうプロテアーゼ等を分泌することがなく、酵素の至適温度である高温条件で発酵でき、かつ、生成物阻害のない微生物を利用して併行糖化発酵を行うと共に、該微生物の特性を効率よく利用して、併行糖化発酵後の発酵液からの酵素の回収、再利用設備及び生成物回収設備を簡略化することを可能とした連続的なエタノールの製造方法の発明である。
併行糖化発酵処理層で処理されたスラリーから固液分離装置で未反応バイオマスを分離・回収して前記併行糖化発酵処理槽に戻すとともに、未反応バイオマスが除かれた酵素及び生成エタノールを含有する処理液を緩衝貯留槽に送って一時貯留液として貯留し、
該緩衝貯留槽中の貯留液の一定量を取り出して生成物分離装置で生成エタノール分と酵素含有液分とに分離し、生成エタノール分をエタノール貯留槽に送って回収し、酵素含有液分を前記緩衝貯留槽に戻し、かつ、前記緩衝貯留槽から一定量の貯留液を取り出して酵素源として前記併行糖化醗酵処理槽に循環供給することよりなる、使用酵素の循環再利用手段及び生成エタノール分と酵素含有液分とを分離する手段を有する、セルロース系バイオマスの併行糖化発酵処理によるエタノールの連続的な製造方法であって、
前記緩衝貯留槽は、生成エタノール分と酵素含有液分との分離を行う前記生成物分離装置での分離操作に必要な貯留液の流速及び圧力を確保できる流量で常時貯留液を生成物分離装置に供給すること、及び貯留液を前記酵素源として前記併行糖化醗酵処理槽に循環供給することを常時可能とする貯留容量を有することを特徴とする、セルロース系バイオマスからエタノールを連続的に製造する方法。
所定の滞留時間で併行糖化発酵を行うために、イサチェンキア・オリエンタリスの濃度は106〜108個/mlが好ましい。酵素の活性は、所望の滞留時間で所定の糖化率となるような濃度が好ましく、滞留時間が48時間として、基質1gに対して濾紙崩壊活性で10単位が例示されるが、基質の種類、前処理の方法によって適宜酵素の添加量を調節する。特に、滞留時間を15ないし35時間となるように大量の酵素を添加し、反応効率を高めて、酵素あたりの基質分解量をなるべく高く維持し、その酵素を回収再利用して有効に利用することが好ましい。
滞留時間が長い併行糖化発酵処理槽から固液分離装置を経て緩衝貯留槽に導入される酵素及び生成エタノールを含有する処理液量が限外ろ過に必要な流量と圧力を得ることができる流量となっていなくても、安定して限外濾過を行うことを可能ならしめるために、緩衝貯留槽の容量を大きくして、併行糖化発酵槽から固液分離装置を経て緩衝貯留槽に導入される酵素及び生成エタノールを含有する処理液を予め貯留しておく。
新たに加える酵素は、当初用いた酵素でもよいし、別の酵素成分でもよい。特に酵素活性が失われやすいβグルコシダーゼの場合は新たな酵素の追加が好ましい。
(1)CBH I活性
1.25mM 4−Methyl−umberiferyl−cellobiosideを含む125mM 酢酸緩衝液(pH4.0)16μlに、酵素液4μlを加え、50℃、10min反応を行ったのち、500mM glycine−NaOH緩衝液(pH10.0)100μlを添加し、反応を停止させた。これを350nmの励起光での460nmの蛍光を測定し、1分間に1μmolのウンベリフェロンを生成する酵素の量を1単位とした。
1.25mMの4−Methyl−umberiferyl−glucosideを含む125mM 酢酸緩衝液(pH4.0) 16μlに、酵素液4μlを加え、50℃、10min反応を行ったのち、500mM glycine−NaOH緩衝液(pH10.0)100μlを添加し、反応を停止させた。これを350nmの励起光での460nmの蛍光を測定し、1分間に1μmolのウンベリフェロンを生成する酵素の量を1単位とした。
溶液中のエタノール及びグルコースの濃度はグルコースセンサー(王子計測機器製BF−400型)で定量した。
<参考例>
コピー用紙の古紙をシュレッダーで破砕し、固形分濃度8%となるように懸濁し、ジェネンコア社製GC220糖化酵素液を4gを加えたYM培地(pH5)に、イサチェンキア・オリエンタリス121株(独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号FERM P−19368)を108個/mlになるように懸濁し、シリコン栓をして39℃に保温した。24、48時間後に上清中のCBH I、βグルコシダーゼ活性、グルコース濃度とエタノール濃度を測定した。結果は表1に示す。
実施例1でイサチェンキア・オリエンタリス121株の代わりにサッカロミセス・セレビシエ244株を使用し、併行糖化発酵の温度を30℃で行った他は、参考例と同様に実施した。
図1に示す連続糖化発酵プロセスを構築した。各設備はそれぞれ次のように調整した。
1.基質貯留槽
基質:コピー用紙濃度を水に懸濁し、pH5に調整した後、オートクレーブにて121℃、15分加熱滅菌し基質槽にいれた。ライン11からの流量を1時間に75g(内訳:基質10.5g、水64.5g)となるようにフィーダーP1を調整した。
酵母:イサチェンキア・オリエンタリス121株を108個/mlになるように添加した。
反応液全量:2.5kg
酵素:Genencor社製GC220酵素を200g添加した。
窒素源:1%CSL及び0.5%硫安を添加した。
運転条件:希釈率0.06h−1、滞留時間16.7時間、250−300rpm;pH5、38℃
限外濾過装置に必要な流量を確保するために、緩衝作用を持たせ貯留槽を設置した。
液全量:2.5kg
酵素:Genencor社製GC220酵素液200g
生成物分離装置〔ここでは限外濾過装置を用いた(Minimate TFF Capsule,10K membrane, 日本ポール社)〕、ライン16の流出量が1時間に75gとなるようにフィードコントローラーで自動制御した。
緩衝貯留槽における酵素活性(CBH I活性、βグルコシダーゼ活性)を24時間ごとに測定し、その結果を図2に示す。
CBH I活性、βグルコシダーゼ活性は、初期に投入した活性を100として示した。
実施例でイサトケンキア・オリエンタリス121株を用いる代わりに、サッカロミセス・セレビシエ244株で行った。糖化発酵槽の温度は30℃で行い、酵素活性は実施例と同様に測定し、結果を図3に示す。
11〜16:送液ライン
Claims (5)
- 基質貯留槽から供給されるセルロース系バイオマス含有スラリーを、セルラーゼによる糖化反応とイサチェンキア・オリエンタリス(Issatchenkia orientalis)に属する温度35〜45℃で増殖可能で酵素失活原因物質を分泌しない微生物による発酵反応とを温度35〜45℃、pH3〜7、滞留時間15〜35時間で同時に行う併行糖化発酵処理槽で連続的に処理し、
併行糖化発酵処理槽で処理されたスラリーから固液分離装置で未反応バイオマスを分離・回収して前記併行糖化発酵処理槽に戻すとともに、未反応バイオマスが除かれた酵素、微生物及び生成エタノールを含有する処理液を緩衝貯留槽に送って一時貯留液として貯留し、
該緩衝貯留槽中の貯留液の一定量を取り出して生成物分離装置で生成エタノール分と酵素及び微生物含有液分とに分離し、生成エタノール分をエタノール貯留槽に送って回収し、酵素及び微生物含有液分を前記緩衝貯留槽に戻し、かつ、前記緩衝貯留槽から一定量の貯留液を取り出して酵素源として前記併行糖化発酵処理槽に循環供給することよりなる、使用酵素の循環再利用手段及び生成エタノール分と酵素及び微生物含有液分とを分離する手段を有する、セルロース系バイオマスの併行糖化発酵処理によるエタノールの連続的な製造方法であって、
前記緩衝貯留槽は、生成エタノール分と酵素及び微生物含有液分との分離を行う前記生成物分離装置での分離操作に必要な貯留液の流速及び圧力を確保できる流量で常時貯留液を生成物分離装置に供給すること、及び貯留液を前記酵素源として前記併行糖化発酵処理槽に循環供給することを常時可能とする貯留容量を有することを特徴とする、セルロース系バイオマスからエタノールを連続的に製造する方法。 - 前記生成物分離装置は、限外ろ過装置及び/又は蒸留装置であることを特徴とする、請求項1記載のセルロース系バイオマスからエタノールを連続的に製造する方法。
- 前記併行糖化発酵処理槽における併行糖化発酵処理が、セルラーゼの添加割合がセルロース系バイオマス基質1gに対してろ紙崩壊活性で10単位以上という条件下で併行糖化発酵反応を行う処理であることを特徴とする、請求項1又は2に記載のセルロース系バイオマスからエタノールを連続的に製造する方法。
- 前記緩衝貯留槽は、該貯留槽内の一時貯留液の酵素濃度測定装置を備えており、酵素濃度の測定値に基づいて、前記併行糖化発酵処理槽に循環供給される貯留液への補充酵素量が調整されることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載のセルロース系バイオマスからエタノールを連続的に製造する方法。
- 前記セルロース系バイオマスが、樹皮及び古紙から選ばれる少なくとも1種である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のセルロース系バイオマスからエタノールを連続的に製造する方法。
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