JP5576010B2 - ラフォラ病遺伝子 - Google Patents
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Description
本発明は、ラフォラ病に関与する新規の遺伝子、EPM2B;その遺伝子によってコードされるタンパク質、malin;並びにラフォラ病を診断および治療する方法に関する。
ラフォラ病(LD、OMIM 254780)は、青年期に発症する進行性てんかんで最も一般的かつ重篤な形態である。増加性発作は、認知症に向かって知らない間に進行する認知減退、および通常発症の10年以内の死が平行して生じる(1、2)。細胞レベルで、LDは、ポリグルコサン(またはラフォラ体)と呼ばれるデンプン様グルコース重合体(4)の小胞体(ER)随伴蓄積(reticulum-associated accumulation)(3)によって特徴付けられる。遺伝的形質は、遺伝的異質性をもった常染色体劣性であるが、臨床症状は同質である(5)。本発明者らは、炭水化物結合ドメインをもつ二重特異性ホスファターゼ(Laforinと名づけた)をコードする染色体6q24上のEPM2A遺伝子における突然変異が、LDを生じさせることを以前に発見した(6、7および国際公開公報第00/05405号)。
本発明者らは、染色体6p22.3上に新規遺伝子EPM2Bを位置的にクローン化した。これは、それぞれユビキチンを媒介した特異的基質の制御(8、9)およびタンパク質-タンパク質相互作用(10-13)のためにデザインされる複合体の特徴である、推定上のRINGフィンガー・ドメインと6つのNHLモチーフをもつタンパク質とをコードする。malinと名付けられたタンパク質産物に対して有害作用を生じさせることが予測されるEPM2Bの21個の異なったDNA配列バリエーションは、LDと同時分離されることが39ファミリーにおいて見いだされた。laforinおよびmalinは、両方ともERに局在し、これらがニューロンのポリグルコサン蓄積およびてんかんを妨げるのに関連した経路で作動することを示唆する。また、本発明者らは、イヌにおけるEPM2Bを単離し、およびシーケンスし、LDをもつイヌにおけるEPM2Bの突然変異を示した。
(a)配列番号:1(図6A)および配列番号:3(図7A)に示したとおりの、TがUであってもよい核酸配列;
(b)(a)に対して相補的な核酸配列;
(c)(a)もしくは(b)の核酸配列に対して実質的に配列相同性を有する核酸配列;
(d)(a)、(b)、もしくは(c)の核酸配列の類似体である核酸配列;または、
(e)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)、(b)、(c)、もしくは(d)の核酸配列に対してハイブリダイズする核酸配列。
を有する12塩基反復の2対立遺伝子の伸長を有した。したがって、本発明は、EPM2B(配列番号:3)のイヌ配列のヌクレオチド番号1001で始まる配列
の繰り返しを検出することを含む、犬科の動物においてラフォラ病を検出する方法をさらに提供する。
本発明者らによる以前の研究は、LD患者の〜70%が染色体6q24(6,7,14)上のEPM2A遺伝子に劣性突然変異を有することを示唆した。残りの患者において原因となる遺伝子を同定するために、本発明者らは、初めに、フレンチ-カナディアン(French-Canadian:F-C)単離体(isolate)(15)に由来する非EPM2A LDファミリー(LD6、LD7、LD27、LD28)のサブセットに対して連鎖およびホモ接合性マッピングを行った(表1)。このアプローチにより、染色体6p22.3上の2.2Mbの領域に第2のLD遺伝子座(EPM2B)が局在することを導いた(図1)。これらのF-Cファミリー由来の病気に冒された全ての個体は、全ての臨界区間にわたって珍しいハプロタイプに関してホモ接合性であることが見いだされた(図2a)。さらに遺伝子座を絞り込むために、病気に冒された複数の個体を有する5つのさらなるLDファミリーを、臨界領域を包含するDNA配列から開発することができたあらゆるマイクロサテライト・マーカーを使用して調べた。4つのファミリーにおいて、病気に冒された個体が、臨界区間にわたって全てのマーカーについてホモ接合性であった。しかし、1つのファミリー(LD38324)では、病気に冒された2つの個体のホモ接合性の鎖が、臨界領域に部分的に及び、D6S1688とD6S1567との間の840kbにEPM2B遺伝子座を減少することができた(図1および2a)。
先に述べたとおり、本発明は、ラフォラ病に関与する単離された核酸分子に関する。用語「単離された」は、組換えDNA技術によって産生したときに、細胞形質成分もしくは培地が実質的にない核酸、または化学物質前駆体、または化学的に合成したときのその他の化学物質をいう。用語「核酸」は、DNAおよびRNAを含むことが意図され、二本鎖または一本鎖のいずれであってもよい。
(a)配列番号:1(図6A)もしくは配列番号:3(図7A)に示すとおりの核酸配列であって、TがUであってもよい核酸配列;
(b)(a)に対して相補的な核酸配列;
(c)(a)もしくは(b)の核酸配列に対して実質的に配列相同性を有する核酸配列;
(d)(a)、(b)、もしくは(c)の核酸配列の類似体である核酸配列;または、
(e)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で(a)、(b)、(c)、もしくは(d)の核酸配列に対してハイブリダイズする核酸配列。
。
本発明は、本発明の核酸分子によってコードされる単離されたタンパク質をさらに含む。本発明の状況の範囲内で、本発明のタンパク質は、生物活性を保持する、種々のタンパク質一次構造形態を含んでいてもよい。
本発明は、診断および治療的適用における、EPM2B核酸配列およびタンパク質およびこれらのモジュレーターの使用と同様に、抗体およびアンチセンス・オリゴヌクレオチドの調製、EPM2Bおよびこれらの変異された形態を研究するための実験系の調製、EPM26発現および/または活性を調整する物質の単離を含む(しかし、これらに限定されない)、本発明の核酸分子およびタンパク質の全ての使用を含む。いくつかの使用をさらに以下に記載してある。
前述のように、本発明者らは、遺伝子EPM2Bが、ラフォラ病の人々および犬科の動物において変異されていると断定した。結果として、本発明は、EPM2B遺伝子またはタンパク質の突然変異を検出することによってラフォラ病を検出する方法も含む。
一つの態様において、本発明は、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくは、ヒトまたは犬科の動物から得られる試料中のEPM2B遺伝子における突然変異を検出することを含む、ラフォラ病を検出するための方法を提供する。
を有する12塩基反復の2対立遺伝子の伸長を有した。本発明者らは、この12ヌクレオチド繰り返しが、イヌ、オオカミ、キツネ、コヨーテ、およびジャッカルを含む犬科の動物スーパーファミリーに特異的であることを示し、この繰り返しは、イヌを大量の配列伸長にかかりやすくする素因になり、これがEPM2B遺伝子に有害であり、ラフォラ病を生じさせることを示した。本発明者らは、したがって、イヌを含む犬科の動物が、ラフォラてんかんにかかりやすいということを発見した。したがって、本発明は、EPM2B(配列番号:3)のイヌ配列におけるヌクレオチド番号1001で始まる配列
の繰り返しを検出することを含む、犬科の動物においてラフォラ病を検出する方法をさらに提供する。一つの態様において、本方法は、配列番号:5において、少なくとも3つの繰り返し、好ましくは少なくとも10の繰り返し、より好ましくは約14〜約26の繰り返しを検出することを含む。
もう一つの態様において、本発明は、ラフォラ病を有することが疑われる哺乳類、好ましくはヒトまたはイヌ由来の試料において、malinタンパク質が存在するか、または変異されているかどうかを決定することを含む、ラフォラ病を検出するための方法を提供する。
を参照されたい)。
本発明の方法を実施するために適した試薬は、適切な容器にパックされて、必要な材料を提供する便利なキットにパックされてもよい。このようなキットは、本明細書に記載されている方法、および任意に本発明の方法を行う際に有用な適切な支援によって、試料中の本発明の核酸分子またはタンパク質を検出するために必要とされる全ての試薬を含んでもよい。
上記した抗体およびアンチセンス・オリゴヌクレオチドに加えて、EPM2B発現または活性を調整するその他の物質、並びにmalinの変異した形態を調整する物質を同定してもよい。
malin活性に影響を及ぼす物質は、これらがmalinおよび/または変異したmalinと結合する能力に基づいて同定することができる。
(a)反応するmalinと試験物質を、malinと試験物質との間で複合体を形成することができる条件下で反応させる工程、および
(b)遊離の物質について、または複合体を形成していないmalinについて、malinと試験物質の複合体をアッセイする工程を含み、複合体の存在は、試験物質がmalinに結合できることを示す方法を提供する。
また、本発明は、本発明のmalinのペプチドミメティックおよび変異されたmalinタンパク質を含む。たとえば、malinの変異されたドメインに由来するペプチドは、変異されたタンパク質の天然の結合を模倣するような方法で関連する分子と直接的または間接的に相互作用する。このようなペプチドは、競合阻害剤、エンハンサー、ペプチドミメティック等を含んでもよい。実質的にこれらのペプチド類、並びにこれらのペプチドに対して相同的、相補的、またはさもなければ機能的もしくは構造的に同等な分子の全てを、本発明の目的を達成するために使用してもよい。
一つの態様に従って、本発明は、変異したmalinタンパク質の活性を増減する能力について候補化合物をスクリーニングするための方法を可能にする。本方法は、malin活性をアッセイするため、候補もしくは試験化合物の有無における活性をアッセイするため、および化合物がmalin活性の増減をもたらすかどうかを決定するためのアッセイ系を提供することを含む。このような化合物は、ラフォラ病を治療する際に有用であり得る。
(a)malinタンパク質またはmalinタンパク質をコードする核酸と共に試験化合物をインキュベートする工程;および、
(b)malinタンパク質の活性または発現の量を決定し、対照(すなわち、試験物質の非存在下において)と比較する工程を含み、対照と比較したmalinタンパク質活性または発現の変化は、試験化合物がmalinタンパク質の活性または発現に対して効果を有することを示す方法を提供する。
前述のように、本発明のEPM2B遺伝子およびmalinは、ラフォラ病に関与する可能性が高い。したがって、本発明は、ラフォラ病を治療する方法であって、その必要がある細胞または動物に対し、EPM2B/malin発現および/または活性を調整する薬剤の有効な量を投与することを含む方法を提供する。また、本発明はラフォラ病を治療するための、もしくはラフォラ病を治療するための薬物を調製するための、EPM2B/malin発現および/または活性を調整する薬剤の使用を提供する。
EPM2Bおよび変異されたEPM2Bをコードする核酸、malinおよび変異されたmalinタンパク質、抗体、およびアンチセンス・オリゴヌクレオチド、並びにEPM2B/malinおよび/または変異されたEPM2B/malinを調整するその他の薬剤を含む上述した物質は、インビボでの投与に適した生物学的に適合性を有する形態で、被検者に投与するための薬学的組成物中に処方してもよい。「インビボでの投与に適した生物学的に適合性を有する形態」とは、治療的な効果が任意の有毒作用を上回って投与されるような物質の形態を意味する。物質は、ヒト、および動物を含む、生きている生物に投与してもよい。
また、本発明は、EPM2B遺伝子およびmalinタンパク質の機能を研究するための方法、並びに実験モデルを含む。EPM2B遺伝子を欠いた、もしくはmalin発現を部分的に欠いた細胞、組織、および非ヒト動物は、EPM2B遺伝子に特異的な欠失または変異を有する組換え発現ベクターを使用して開発してもよい。組換え発現ベクターを、相同組換えによってEPM2B遺伝子を不活性化または変化させるために使用して、これにより、EPM2B欠損細胞、組織、または動物を作製してもよい。
実施例1
本発明者らは、全ての利用できるデータベースを調べ、染色体6p22.3(図1)上の新たに定義された臨界領域において7つの注釈がついた遺伝子を見いだした。これらの予測される機能的特徴に基づいて、EPM2Bハプロタイプを有するLD患者のDNAシーケンシングを介した突然変異スクリーニングのため、それぞれの遺伝子を優先させたが、病原性変異体は同定されなかった。同時に、本発明者らの解析により、その他のより高等脊椎動物(ラット、マウス、およびイヌと、それぞれ75%、78%、87%のヌクレオチド同一性)におけるオーソロガスなユニット(タンパク質コード能力に相当)と広範な配列同一性を共有する、以前に特徴付けられていない、見かけ上単一エキソン(1188 bp)遺伝子を発見するに至った。また、EPM2Bと命名されたヒト遺伝子は、その5'末端に真核生物の翻訳開始部位のコンセンサス配列の提唱された特徴の全てを、およびその3'-末端に2つの推定ポリアデニル化シグナルを有した(図1)。さらに、ヒトおよびマウスにおける発現配列タグ(EST)およびcDNAデータは、単一エキソン・ユニットが本物の遺伝子であることを指示した。
試料
この研究に記載されている全ての患者は、形式的に、皮膚、骨格筋、肝臓、または脳の生検において特徴的なラフォラ体が存在することに基づいて、青年期発生進行性ミオクローヌスてんかんであると診断された。ホモ接合性マッピング、突然変異スクリーニング、または両方によって6q24におけるEPM2A遺伝子座の関与について、それぞれのLD個体およびこれらのファミリー・メンバー(入手できるならば)を調べた。
確立されたもの(D6S274、D6S285、D6S966、D6S1567、D6S1678、D6S1688、D6S1959)および新たなもの(BV012563、BV012730、BV012565、BV012566、BV012568)についての情報および増幅条件は、UniSTSおよびEntrez Nucleotidesデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)において見いだされる。DNA配列バリエーションは、PCR産物をシーケンシングすることによって検出した。EPM2Bをスクリーニングするために、重複断片を増幅する2セットのプライマー対を使用したEPM2B-1F:
とEPM2B-1R:
;EPM2B-2F:
とEPM2B-2R:
(図1を参照されたい)。PCRは、緩衝液[75mMのトリス-HCl(pH 8.8)、20mMの(NH4)2SO4、0.01% Tween 20、1.5mM MgCl2、1M Betaine、0.2mM dNTP、0.2μMのそれぞれのプライマー、2.5 UnitsのTaq Polymerase(MBI Fermentas)]中で50ngのDNAで行った。サイクル条件は、以下のとおりであった:94℃で3分間の最初の変性、続く94℃で30秒の変性、60℃で30秒のアニーリング、および72℃で30秒の伸長を35サイクル、72℃における10分間の最終伸長。PCR産物は、microCLEAN(Microzone Ltd.)を使用して精製した。3μl(100ng/μl)の精製したPCR産物をシーケンシングテンプレートとして使用した。全ての反応について、1μl(5pmol)のプライマー、1.5μlの5×シーケンシング緩衝液(Applied Biosystems)、1μlのBigDye Terminator v3.1、および7.5μlのH2Oを14μlの反応体積で使用した。Thermocycling(MJ Research, Inc.)条件は、96℃で30秒の変性;50℃で20秒のアニーリング;および60℃で4分の伸長;35サイクルであった。その後に全ての反応をマルチスクリーン-HVフィルタープレート(Millipore)を使用して精製し、ABI-3700を使用して解析した。LD患者において検出された全ての配列変異体は、50(100染色体)のランダムに選択したDNA試料のコレクションで調べた。
遺伝子注釈データおよびEST配列は、主にUniversity of California Santa Cruz(UCSC)ゲノム・ブラウザ(http://genome.ucsc.edu/)およびCelera Genomics(http://www.celera.com/)から得た。さらなる推定遺伝子は、Genescriptアルゴリズム(http://tcag.bioinfo.sickkids.on.ca/genescript/)およびヒトとマウス配列との間の多種VISTA(http://www-gsd.lbl.gov/vista/)整列を使用して注釈をつけた。RINGフィンガー・ドメインは、Pfam、Prosite、InterProScan、SMART、およびMotifScanによって予測した。NHLドメインは、PfamおよびInterProScanを使用して同定した。EPM2Bオルソログは、GenBank非重複性データベースに対するBLASTNおよびBLASTP解析を使用して同定した。配列分析によるmalinの細胞内局在性の予測は、PSORT IIを使用して行った。有意なシグナルペプチド配列(ER、ゴルジ複合体、リソソーム、および統合された必須原形質膜タンパク質の認識用)、ミトコンドリアのターゲティング配列、核局在化シグナル、およびペルオキシソームのターゲティング・シグナルは同定されなかった。human multiple-tissue blot Iおよびhuman brain blot II(Clontech)を、プライマー
および
を使用してEPM2Bのコード領域の557bp断片を増幅して作製された[32P ] dCTP標識されたプローブでプローブした。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、製造業者の説明書に従って行った。
laforinの細胞質アイソフォームをコードするmycタグを付けたEPM2A転写物A発現構築物(pcDNA3mycEPM2A)が、記載されている(24)。mycタグを付けたEPM2B構築物は、同じ一般的なプロトコルを使用して作製した(pcDNA3mycEPM2B)。全長EPM2Bは、BamHI制限部位(下線を引いてある)と開始コドン(大文字)を含む(フォワード)プライマー
およびNotI部位(下線を引いてある)を含む(リバース)プライマー
を使用して、ゲノムDNAからPCRによって増幅した。この産物を哺乳類発現ベクターpcDNA3(Invitrogen)の対応する部位にクローン化した。次いで、5'KpnI-タグを付け、および3'BamHIタグを付けたプライマーで以前のmycを含むベクターから増幅した後に、インフレームでMycを導入した。pcDNA3mycEPM2AおよびpcDNA3mycEPM2B(2mg)をLipofectamine-Plus(Invitrogen)を使用してCos-7細胞にトランスフェクトし、5時間DMEM(Sigma-Aldrich)中で脂質-DNA複合体に曝露した。形質移入48時間後に、培養をPBS中で2回リンスし、アセトン:メタノール(1:1)混合物中で15分間-20℃で固定した。次いで、これらをmyc-laforinおよびERマーカーGRP94に対する抗体で染色した。培養を1時間(10%のBSA/PBS)ブロックし、室温で45分間抗Mycおよび抗ERと共にインキュベートした。スライドをPBSで洗浄し、ブロッキング溶液中の二次抗体(FITC標識されたヤギ抗マウス(1:400、緑色フィルターを介して検出可能);テキサスレッド標識されたロバ抗ヤギ(1:400、赤色フィルターを介して検出可能);Jackson Immuno Research Laboratories)と共にインキュベートした。マウンティング(Dako Anti-Fade)に続いて、これらを免疫蛍光光学顕微鏡によって解析した。電子顕微鏡検査のために、生検材料をLD患者から得られた冷却した汎用固定液に入れた。次いで、標準的なプロトコルを使用して、これを超微細構造的レベルで解析した。
実施例1に記載されている突然変異に加えて、本発明者らは、ラフォラ病と関連するEPM2Bにおいてさらなる4つの突然変異を見いだした。これらの突然変異は、実施例1と同じ様式で記載されていた。DNAは、実施例1に記載されているものと臨床的に類似したラフォラ病患者由来の血液から得た。EPM2Bにおける4つの突然変異は、以下のとおりである:1)位置606におけるヌクレオチドTの欠失;2)ヌクレオチド923におけるAからTへの変化;3)ヌクレオチド580におけるGからTへの変化;および4)ヌクレオチド199におけるGからTへの変化。後の突然変異は、スーダンおよびイタリアのファミリーにおいて見いだされた。さらなる突然変異は、表1の下段に一覧を記載してある。
ラフォラ病は、驚くべき頻度でイヌにおいても発見された。進行性ミオクローヌスてんかん(PME)は、英国において繁殖された人気のミニチュア・ワイアーヘアード・ダックスフンド(MWHD)において一般的である(〜5%)。本発明者らは、これらのイヌの臨床病理学的表現型を特徴づけ、これらがLDを有することを示した。本発明者らは、基礎になる疾患遺伝子座のマップを作製し、特異的疾患関連突然変異(EPM2B遺伝子において):いずれかの種における第1コーディング12塩基反復の伸長と、ヒトを越えた第1の病原性タンデム型繰り返し伸長とを同定した。本発明者らは、伸長突然変異が再発性であり、MWHD以外のてんかんのイヌにも影響を及ぼすことを示し、これがイヌ(およびその他の犬科の動物)に特有の配列変異により生じて、その種がLDにかかりやすいことを証明した。最後に、本発明者らは、キャリアおよび発症前動物において伸長対立遺伝子を検出し、MWHDおよび将来発症するイヌ集団に由来する疾患を根絶させるための試験を発明した。
Claims (27)
- 動物由来の試料に含まれる配列番号:1に示した配列を含むEPM2B遺伝子における突然変異を検出する段階を含む、ラフォラ病またはラフォラ病の素因を検出する方法であって、該ラフォラ病がEPM2B遺伝子における突然変異と関連し、該突然変異が、EPM2Bタンパク質の構造変化を生じさせる、ナンセンス突然変異、ミスセンス突然変異、挿入突然変異、または欠失突然変異である、前記方法。
- 配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号205におけるCからGへの変化を検出する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号76におけるTからAへの変化を検出する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド位置1048および1049におけるヌクレオチドGAの欠失を検出する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド位置468および469におけるヌクレオチドAGの欠失を検出する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号992におけるヌクレオチドGの欠失を検出する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド位置373〜382における10bpの欠失を検出する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド位置661〜692における32bpの欠失を検出する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号260におけるTからCへの変化を検出する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号905におけるAからCへの変化を検出する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号98におけるTからCへの変化を検出する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号892における2つのTの挿入を検出する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号436におけるGからAへの変化を検出する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号1100におけるヌクレオチドTの欠失を検出する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号838におけるGからAへの変化を検出する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号676におけるCからTへの変化を検出する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド位置468におけるヌクレオチドAの欠失を検出する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド位置204におけるヌクレオチドCの欠失を検出する段階を含む、請求項1記載の方法。
- EPM2B遺伝子における1つまたは複数の突然変異を検出する段階を含み、該1つまたは複数の突然変異が、
(a)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号205におけるCからGへの変化;
(b)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号76におけるTからAへの変化;
(c)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド位置1048および1049におけるヌクレオチドGAの欠失;
(d)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド位置468および469におけるヌクレオチドAGの欠失;
(e)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号992におけるヌクレオチドGの欠失;
(f)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド位置373〜382における10bpの欠失;
(g)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド位置661〜692における32bpの欠失;
(h)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号260におけるTからCへの変化;
(i)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号905におけるAからCへの変化;
(j)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号98におけるTからCへの変化;
(k)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号892における2つのTの挿入;
(l)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号436におけるGからAへの変化;
(m)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号1100におけるヌクレオチドTの欠失;
(n)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号838におけるGからAへの変化;
(o)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号676におけるCからTへの変化;
(p)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド位置468におけるヌクレオチドAの欠失;および
(q)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド位置204におけるヌクレオチドCの欠失
からなる群より選択される、請求項1記載の方法。 - 配列番号:1に示した配列によってコードされるタンパク質の突然変異を検出する段階を含む、ラフォラ病を検出するための方法であって、該タンパク質が、配列番号:2(図6B)に示したアミノ酸配列を有し、該ラフォラ病が該タンパク質の突然変異と関連する、前記方法。
- EPM2Bタンパク質の突然変異を検出する段階を含み、該突然変異が、
(a)配列番号:2に示したEPM2Bポリペプチド配列の位置69におけるPからAへの突然変異;
(b)配列番号:2に示したEPM2Bポリペプチド配列の位置26におけるCからSへの突然変異;
(c)配列番号:2に示したEPM2Bポリペプチド配列の位置340におけるフレームシフト突然変異;
(d)配列番号:2に示したEPM2Bポリペプチド配列の位置158におけるフレームシフト突然変異;
(e)配列番号:2に示したEPM2Bポリペプチド配列の位置321におけるフレームシフト突然変異;
(f)配列番号:2に示したEPM2Bポリペプチド配列の位置125におけるフレームシフト突然変異;
(g)配列番号:2に示したEPM2Bポリペプチド配列の位置16におけるフレームシフト突然変異;
(h)配列番号:2に示したEPM2Bポリペプチド配列の位置87におけるLからPへの突然変異;
(i)配列番号:2に示したEPM2Bポリペプチド配列の位置29におけるQからPへの突然変異;
(j)配列番号:2に示したEPM2Bポリペプチド配列の位置33におけるFからSへの突然変異;
(k)配列番号:2に示したEPM2Bポリペプチド配列の位置298におけるフレームシフト突然変異;
(l)配列番号:2に示したEPM2Bポリペプチド配列の位置146におけるDからNへの突然変異;
(m)配列番号:2に示したEPM2Bポリペプチド配列の位置362におけるフレームシフト突然変異;
(n)配列番号:2に示したEPM2Bポリペプチド配列の位置279におけるEからKへの突然変異;
(o)配列番号:2に示したEPM2Bポリペプチド配列の位置226におけるナンセンス突然変異;
(p)配列番号:2に示したEPM2Bポリペプチド配列の位置158におけるフレームシフト突然変異;および
(q)配列番号:2に示したEPM2Bポリペプチド配列の位置69におけるフレームシフト突然変異
からなる群より選択される、請求項20記載の方法。 - 配列番号:1に示した核酸配列の突然変異の検出のための試薬を含む、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法を実施するためのキット。
- 配列番号:2に示したタンパク質配列の突然変異の検出のための試薬を含む、請求項20または21記載の方法を実施するためのキット。
- ヒトから得られた試験試料中の核酸において1つまたは複数の突然変異の存在を検出することを含む、ラフォラ病またはラフォラ病の素因を検出する方法であって、該試験試料がEPM2B遺伝子を含み、
(a)EPM2B遺伝子を含む試験試料を分析して、該遺伝子の核酸配列を決定する工程、
(b)該試験試料中の該遺伝子の核酸配列と配列番号:1に示した核酸配列を比較する工程、および
(c)該試験試料中のEPM2B遺伝子の配列と配列番号:1に示した核酸配列の間に差異が存在する場合には、差異を決定することによって、該試験試料のEPM2B遺伝子における1つまたは複数の突然変異の存在を検出する工程であって、該突然変異が、ナンセンス突然変異、ミスセンス突然変異、挿入突然変異、および欠失突然変異からなる群より選択され、該1つまたは複数の突然変異の存在が、ラフォラ病またはラフォラ病の素因を示す、工程
を含む、前記方法。 - 前記試験試料が、分析前に適したPCRプライマー配列を用いて増幅される、請求項24記載の方法。
- 前記EPM2B遺伝子において検出された1つまたは複数の突然変異が、
(a)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号205におけるCからGへの変化;
(b)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号76におけるTからAへの変化;
(c)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド位置1048および1049におけるヌクレオチドGAの欠失;
(d)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド位置468および469におけるヌクレオチドAGの欠失;
(e)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号992におけるヌクレオチドGの欠失;
(f)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド位置373〜382における10bpの欠失;
(g)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド位置661〜692における32bpの欠失;
(h)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号260におけるTからCへの変化;
(i)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号905におけるAからCへの変化;
(j)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号98におけるTからCへの変化;
(k)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号892における2つのTの挿入;
(l)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号436におけるGからAへの変化;
(m)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号1100におけるヌクレオチドTの欠失;
(n)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号838におけるGからAへの変化;
(o)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号676におけるCからTへの変化;
(p)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド位置468におけるヌクレオチドAの欠失;および
(q)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド位置204におけるヌクレオチドCの欠失
からなる群より選択される、請求項24記載の方法。 - 配列番号:1に対して少なくとも1つの突然変異を有することを除き、配列番号:1に示した配列を含む単離された核酸分子であって、
該少なくとも1つの突然変異が、
(a)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号205におけるCからGへの変化;
(b)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号76におけるTからAへの変化;
(c)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド位置1048および1049におけるヌクレオチドGAの欠失;
(d)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド位置468および469におけるヌクレオチドAGの欠失;
(e)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号992におけるヌクレオチドGの欠失;
(f)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド位置373〜382における10bpの欠失;
(g)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド位置661〜692における32bpの欠失;
(h)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号260におけるTからCへの変化;
(i)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号905におけるAからCへの変化;
(j)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号98におけるTからCへの変化;
(k)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号892における2つのTの挿入;
(l)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号436におけるGからAへの変化;
(m)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号1100におけるヌクレオチドTの欠失;
(n)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号838におけるGからAへの変化;
(o)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド番号676におけるCからTへの変化;
(p)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド位置468におけるヌクレオチドAの欠失;および
(q)配列番号:1に示したEPM2B遺伝子配列のヌクレオチド位置204におけるヌクレオチドCの欠失
からなる群より選択される、前記核酸分子。
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