JP2007501601A - イオンチャネルにおける変異 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 なし
Description
a)多数の異なる変異したサブユニット対が、IGEの原因であり得る。2つの変異したサブユニットの組み合わせが、約30%の浸透度を有するIGE遺伝子型をもたらす。
b)変異したサブユニットの全ての対立遺伝子頻度は、約8%である。人口の約15%が、1つ以上の変異したサブユニット遺伝子を有し、そして1%が、2つ以上の変異したサブユニットを有すると計算された。
c)サブ症候群は、変異したサブユニット対の特定の組み合わせによって主として決定されるが、さらに影響の小さい、1つ以上の他の遺伝子(イオンチャネルサブユニットを含む)が、表現型を改変し得る。
d)古典的IGEを生じる変異したサブユニットの組み合わせは、GEFS+を生じる組み合わせとは大きく異なるが、いくつかのサブユニットは、両方の症候群に関与し得る。
e)単一の「機能の変化(change of function)」の変異を有する個体は、IGEを有さないが、このような変異は、単純な熱性痙攣(IGEの発端者の親類において頻度の増大が観察される)に寄与し得る。
(1)ポリペプチド産生のために有効な条件下で、上記のような核酸分子を含む発現ベクターを用いてトランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程;および
(2)変異体イオンチャネルサブユニットを回収する工程。
本発明のなお別の局面によれば、てんかん、ならびにイオンチャネル機能不全に関連した他の障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)を処置する方法が提供される。この方法は、このイオンチャネルが、上記のようなチャネルを含むサブユニット中に変異を含む場合、このような処置の必要な被験体に対して、イオンチャネルもしくはイオンチャネルサブユニットの選択的アンタゴニスト、アゴニスト、またはモジュレーターを投与する工程を包含する。このような変異事象は、同じまたは異なるイオンチャネルのサブユニット(代表的には、表1に同定されたもの)において、単独で発現される場合、または1つ以上のさらなる変異と組み合わせて発現される場合、この障害の原因であり得る。
本発明のなお別の局面によれば、本発明のペプチド、詳細には、精製された変異体イオンチャネルサブユニットポリペプチド、およびこれらを発現する細胞と同様に、本発明の核酸分子は、てんかん、およびイオンチャネル機能不全に関連した他の障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)の処置のための候補薬物のスクリーニングのために有用である。
スクリーニングアッセイから特定され、かつイオンチャネルを野生型活性に回復させることが示された化合物を、上記のように、治療上有効な用量で患者に投与して、てんかん、およびイオンチャネル機能不全に関連した他の障害を処置または寛解させることができる。治療上有効な量とは、障害の症状の寛解を生じるのに十分な化合物の量をいう。
イオンチャネルサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列を、てんかん、およびイオンチャネル機能不全に関連する他の障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)の診断または予後のために用いることができる。従って、これらの障害、またはこれらの障害に対する素因の診断または予後において本発明の一部として組み込まれた核酸分子の使用が意図される。表1に挙げられた新規な変異事象を組み込む核酸分子を、この目的のために用いることができる。
さらなる実施形態において、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列のいずれかに由来する、完全なcDNA、オリゴヌクレオチド、またはさらに長いフラグメントを、マイクロアレイにおけるプローブとして用いることができる。このマイクロアレイは、障害の遺伝的基礎を理解するために、本発明の一部を形成するイオンチャネルサブユニットにおける遺伝的改変体、変異、および多形性の同定を通じて、てんかん、およびイオンチャネル機能不全に関連する他の障害の診断または予後のために用いられてもよいし、または治療剤の活性を発達させて、モニターするために用いられてもよい。
本発明はまた、表1に挙げられたような新規なイオンチャネル変異体または改変体を含む核酸分子を含む、遺伝的に改変された(ノックアウト、ノックイン、およびトランスジェニック)、非ヒト動物モデルの生成を提供する。これらの動物は、イオンチャネルの機能の研究のために、イオンチャネルサブユニットにおける変異体の組み合わせが相互作用して、疾患を生じる機構、および組織の発達に対するこれらの変異体の影響を研究するために、候補の薬学的化合物のスクリーニングのために、変異体イオンチャネルまたは変異体イオンチャネルの組み合わせを発現する外植された哺乳動物細胞培養物の作製のために、ならびに可能性のある治療介入の評価のために有用である。
本発明の好ましい形態を、単に例示の目的で、以下の実施形態および添付の図面を参照して、ここで記載する。
図1は、イオンチャネルサブユニット化学量論、および複数対単一のイオンチャネルサブユニット変異の影響の例を提示する。図1A:代表的なチャネルは、3つの異なるタイプの5つのサブユニットを有し得る。図1B:非近交系集団において、特発性全身性てんかんのような複雑な疾患は、2つ(またはそれ以上)の異なるサブユニット遺伝子における変異に起因するかもしれない。各々のサブユニット遺伝子の対立遺伝子の1つだけが異常であるので、発現されたサブユニットの半分が変異を有する。図1C:近交系集団において、単一のサブユニット遺伝子の両方の対立遺伝子が罹患しており、そのため全ての発現されたサブユニットが変異する。図1D:常染色体優性障害は、重篤な機能的結果を生じる単一のイオンチャネルサブユニット変異に起因するかもしれない。
図2は、カリウムチャネルを構成するKCNQ2イオンチャネルサブユニットにおいて同定された変異の位置を示す。M:ミスセンス変異;T:短縮変異;F:フレームシフト変異;S:スプライシング部位変異。
図3は、てんかんの血統の例であって、ここでこの血統を構成する個体についてのイオンチャネルサブユニットの変異プロフィールが、決定されはじめている例を示す。IGE個体における新規なイオンチャネルサブユニット変異および改変の同定が、組み合わせられて障害を生じ得る方法を例示するために、これらの例が用いられている。
図4は、R353GおよびL619R KCNQ2変異体のツーハイブリッド分析の結果を示す。酵母は、空のDB(BAIT)プラスミド(DBLeu)で形質転換され、Aに示されるようなDB−Q2C wt、DB−Q2C R353G変異体またはDB−Q2 L619R変異体、およびAD−CaM(TARGET)ベクターがギャップ修復によって導入された。酵母コントロール株(Invitrogen(商標))は比較のためにすべてのプレートに含められた。コントロール1は相互作用を有さない。コントロール2は弱い相互作用を有する。コントロール3は少し強い相互作用を有する。コントロール4は強い相互作用を有する。コントロール5は極めて強い相互作用を有する。Bは、−leu −tryp選抜培地での形質転換された酵母およびコントロールの増殖を示す。酵母は、もしそれらがDBプラスミドを含むなら−leuで増殖することができ、もしそれらがADプラスミドを含むなら−trypで増殖することができる。Cは、48時間後の−leu −tryp −his +40mM 3ATでの形質転換された酵母およびコントロールの増殖を示す。酵母はもしhisレポーター遺伝子がBAITプラスミドとTARGETプラスミドの間の相互作用によって活性化されるなら−his+3ATで増殖することができる。D−Fは、BAITプラスミドとTARGETプラスミドの間の相互作用のためのLacZフィルターアッセイを示し、写真は2時間後に(D)、7時間後に(E)および24時間後に(F)撮影された。BAITプラスミドとTARGETプラスミドの間の相互作用によるβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の活性化はコロニーの暗い外観に導く。
図5は、R353GおよびL619R KCNQ2変異体を使用したCaM親和性実験の結果を示す。棒グラフは、KCNQ2C−CaM結合効率の尺度としてのβ−ガラクトシダーゼ活性についてのCPRGアッセイからの値を示す。棒グラフ中の各バーの面積はBAITのCaM結合効率に等しい。破線はステューデントのt検定による統計学的比較を示し、*はP<0.01を示し、**はP<0.001を示す。
引用された以前の研究(その開示は、本明細書において参考として援用される、Wallaceら、1998;PCT/AU01/00581;Wallaceら、2001b;オーストラリア特許AU−B−56247/96;Steinleinら、1995;PCT/AU01/00541;Phillipsら、2001;PCT/AU01/00729;PCT/AU01/01648;PCT/AU02/00910;Wallaceら、2001a)によって、てんかんに関連する多数のイオンチャネルサブユニットにおける変異が、同定されている。これらとしては、電位開口型のイオンチャネルサブユニット(例えば、SCN1A,SCN1B、KCNQ2、KCNQ3)、またはリガンド依存型のイオンチャネルサブユニット(例えば、CHRNA4、CHRNB2、GABRG2、GABRD)が挙げられる。イオンチャネル遺伝子におけるさらなる変異を同定するため、イオンチャネルを含むサブユニットを、てんかん患者における分子欠陥についてスクリーニングした。
てんかんに罹患した個体の大集団に対して、注意深い臨床的な表現型特定を行い、それらの家族歴に関するさらなるデータを収集した。血液収集、および引き続く実験手順におけるその使用のために、各々の個体からインフォームドコンセントをとった。臨床的な表現型は、古典的なIGE症例、ならびにGEFS+、および熱性痙攣症例を包含していた。
96ウェルプレートを構成する個体において、特定のイオンチャネルエキソンのSSCP解析、その後のSSCPバンドシフトの配列決定を実施して、配列の変更を特定した。
ある場合には、イオンチャネル単独における単一の変異では、てんかん表現型を生じるには不十分である。しかし二遺伝子モデル(PCT/AU01/00872)によって提唱されるような、変異(各々がイオンチャネルにおける機能のわずかな変化を付与する)の組み合わせは、てんかん表現型を生じるのには十分であるかもしれない。
本発明の変異体イオンチャネルおよび変異体イオンチャネルサブユニットの構造および機能は、様々な分子生物学的研究を使用して決定されることができる。これらの研究は、イオンチャネルサブユニットがイオンチャネルの機能に影響を与えるメカニズムについての手掛かりを与えるかもしれない。例えば、変異体イオンチャネルと相互作用するタンパク質(または相互作用がイオンチャネルサブユニット中の変異によって妨げられるタンパク質)を同定することは、変異の結果として妨げられる分子メカニズムを決定するのに役立つかもしれない。酵母ツーハイブリッド系などの手法はかかる相互作用タンパク質を発見して同定するために使用されることができる。
てんかんの原因となる多数のKCNQ2変異体の同定(本研究で同定したKCNQ2変異体を含む)にもかかわらず、転換の原因となる基礎的な生物学的メカニズムは大部分が特徴付けられないままである。これらのメカニズムの同定に向けて、KCNQ2の大きな細胞内C−末端領域が酵母ツーハイブリッド手法を使用して他のタンパク質との相互作用についてスクリーニングされた。C−末端はKCNQ2タンパク質の63%を占め、他のKCNQサブユニットにも共通し、保存された「Aドメイン」を含む(Jentsch,2000;Schwakeら、2000)。この「Aドメイン」は、サブユニット相互作用に関与し、並びに少なくともKCNQ1でサブユニット会合に関連してきた他の遠位の短い保存された領域に関与すると考えられている(Jentsch,2000;Schmittら、2000)。
酵母ツーハイブリッドスクリーニングは、ProQuest(商標)Two−Hybrid SystemをGateway(商標)Technology(Invitrogen(商標))と共に、製造者の手引きに従って使用して行われた。KCNQ2 C−末端エントリー(BAIT)クローンはpENTR Directional TOPO(登録商標)Cloning Kit(Invitrogen(商標))を使用して作成された。以下のプライマーが、ヒトKCNQ2の配列(Genbankアクセッション番号NM 172107)に基づいてKCNQ2の細胞内C−末端領域を増幅するために設計された:
1611塩基対のクローニングされたフラグメントは、KCNQ2タンパク質のアミノ酸373−382に対応するエクソン10a(本発明者らが増幅したすべてのクローンに見出される)を含んでいた。余分の30塩基対(10アミノ酸)が本発明者らの番号付けには含まれていた。PCR生成物はTOPO(登録商標)Cloning反応を介してpENTR/D−TOPO(登録商標)ベクター(Invitrogen(商標))中に製造者の指示に従ってクローニングされた。配列の確認後、KCNQ2 cDNAフラグメントは、DNA Bindingドメイン(DB)Gateway(商標)Destination Vector(Invitrogen(商標))であるpDEST(商標)32中にサブクローニングされた。
本発明のC−末端変異がCaM結合に影響を与えたことを評価するため、同定された変異のうちの二つの(R353GおよびL619R)は変異誘発によってDB−Q2C構築物中に導入され、酵母ツーハイブリッド手法を使用してCaMとの相互作用について再分析された。
Claims (85)
- 前記被験体由来のcDNAが、配列番号1〜72のうちの1つに示される配列を含む請求項1に記載の方法。
- 前記被験体由来のcDNAが、配列番号1〜72のうちの1つに示される配列を有する請求項1に記載の方法。
- 前記変異事象は、組み立てられたイオンチャネルの機能化を破壊して、てんかんの表現型を前記被検体において生じる請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異事象は、組み立てられたイオンチャネルの機能化を破壊して、イオンチャネル機能不全に関連した1つ以上の障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)を前記被検体において発生させる請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異事象は、前記イオンチャネルサブユニット遺伝子における1つ以上のさらなる変異または改変と組み合わせて発現されたときに、組み立てられたイオンチャネルの機能化を破壊して、てんかんの表現型を生じる請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異事象は、前記イオンチャネルサブユニット遺伝子における1つ以上のさらなる変異または改変と組み合わせて発現されたときに、組み立てられたイオンチャネルの機能化を破壊して、イオンチャネル機能不全に関連した1つ以上の障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)を発生させる請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットをコードする単離された核酸分子であって、それに由来するcDNAが、配列番号1〜72のうちの1つに示される配列を含む請求項8に記載の単離された核酸分子。
- 変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットをコードする単離された核酸分子であって、それに由来するcDNAが、配列番号1〜72のうちの1つに示される配列を有する請求項8に記載の単離された核酸分子。
- 前記変異事象は、組み立てられたイオンチャネルの機能化を破壊して、てんかんの表現型を生じる請求項8〜10のいずれか一項に記載の変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットをコードする単離された核酸分子。
- 前記変異事象は、組み立てられたイオンチャネルの機能化を破壊して、イオンチャネル機能不全に関連した1つ以上の障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)を発生させる請求項8〜10のいずれか一項に記載の変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットをコードする単離された核酸分子。
- 前記変異事象は、前記イオンチャネルサブユニット遺伝子における1つ以上のさらなる変異または改変と組み合わせて発現されたときに、組み立てられたイオンチャネルの機能化を破壊して、てんかんの表現型を生じる請求項8〜10のいずれか一項に記載の変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットをコードする単離された核酸分子。
- 前記変異事象は、前記イオンチャネルサブユニット遺伝子における1つ以上のさらなる変異または改変体と組み合わせて発現されたときに、組み立てられたイオンチャネルの機能化を破壊して、イオンチャネル機能不全に関連した1つ以上の障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)を発生させる請求項8〜10のいずれか一項に記載の変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットをコードする単離された核酸分子。
- 配列番号1〜72に示されるヌクレオチド配列のいずれか1つを含む単離された核酸分子。
- 配列番号1〜72に示されるヌクレオチド配列のいずれか1つからなる単離された核酸分子。
- 変異体KCNQ2サブユニットをコードする単離された核酸分子であって、変異事象がKCNQ2サブユニットのC末端ドメインで生じており、てんかん表現型を生じるように、サブユニットのカルモジュリン結合親和性の破壊に導く、単離された核酸分子。
- 変異事象がエキソン8、エキソン11、エキソン14またはエキソン15で生じている請求項17に記載の単離された核酸分子。
- 変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットである、単離されたポリペプチドであって、配列番号73〜95のうちの1つに記載のアミノ酸配列を含む請求項19に記載の単離されたポリペプチド。
- 変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットである、単離されたポリペプチドであって、配列番号73〜95のうちの1つに記載のアミノ酸配列を有する請求項19に記載の単離されたポリペプチド。
- 前記変異事象は、組み立てられたイオンチャネルの機能化を破壊して、てんかんの表現型を生じる請求項19〜21のいずれか一項に記載の変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットである、単離されたポリペプチド。
- 前記変異事象は、組み立てられたイオンチャネルの機能化を破壊して、イオンチャネル機能不全に関連した1つ以上の他の障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)を発生させる請求項19〜21のいずれか一項に記載の変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットである、単離されたポリペプチド。
- 前記変異事象は、前記イオンチャネルサブユニット遺伝子における1つ以上のさらなる変異または改変と組み合わせて発現されたときに、組み立てられたイオンチャネルの機能化を破壊して、てんかんの表現型を生じる請求項19〜21のいずれか一項に記載の変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットである、単離されたポリペプチド。
- 前記変異事象は、前記イオンチャネルサブユニット遺伝子における1つ以上のさらなる変異または改変体と組み合わせて発現されたときに、組み立てられたイオンチャネルの機能化を破壊して、イオンチャネル機能不全に関連した1つ以上の障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)を発生させる請求項19〜21のいずれか一項に記載の変異体または改変体のイオンチャネルサブユニットである、単離されたポリペプチド。
- 配列番号73〜95のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
- 配列番号73〜95のいずれか1つに示されるアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド。
- 変異体KCNQ2サブユニットである単離されたポリペプチドであって、変異事象がKCNQ2サブユニットのC末端ドメインで生じており、てんかん表現型を生じるように、サブユニットのカルモジュリン結合親和性の破壊に導く、単離されたポリペプチド。
- 請求項19〜28のいずれか一項に規定されるポリペプチドを含むイオンチャネルサブユニットを含有する組み立てられた哺乳動物のイオンチャネルである単離されたポリペプチド複合体。
- 請求項8〜18のいずれか一項に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項30に記載の少なくとも一つの発現ベクターを含む細胞。
- 二つ以上の発現ベクターを含む請求項31に記載の細胞。
- 少なくとも1つのイオンチャネル型を含む細胞であって、各イオンチャネル型が請求項19〜28のいずれか一項に記載の少なくとも1つの変異体ポリペプチドを組入れている細胞。
- 二つ以上の変異体ポリペプチドを組み入れているイオンチャネルを含む請求項33に記載の細胞。
- 各々が一つ以上の変異体ポリペプチドを組み入れている二つ以上のイオンチャネル型を含む請求項33に記載の細胞。
- 以下の工程を包含するポリペプチドを調製する方法:
(1)ポリペプチド産生のために有効な条件下で、請求項31〜35のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程;および
(2)ポリペプチドを回収する工程。 - 請求項36の方法によって調製されたポリペプチド。
- 請求項19〜28のいずれか一項または請求項37に記載の単離されたポリペプチドと、または請求項29に記載の単離されたポリペプチド複合体と免疫学的に反応性である抗体。
- モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはFabフラグメント、(Fab′)2フラグメント、Fvフラグメントを含む抗体フラグメント、単鎖抗体および単一ドメイン抗体からなる群から選択される請求項38に記載の抗体。
- てんかんを処置する方法であって、このような処置の必要な被検体に対して請求項38または39に記載の抗体を投与することを含む方法。
- てんかんの処置のための医薬の製造における、請求項38または39に記載の抗体の使用。
- イオンチャネル機能不全に関連した障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)を処置する方法であって、このような処置の必要な被験体に対して、請求項38または39に記載の抗体を投与する工程を包含する方法。
- イオンチャネル機能不全に関連した障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)を処置するための医薬の製造における、請求項38または39に記載の抗体の使用。
- てんかんを処置する方法であって、このような処置の必要な被験体に対して、請求項19〜28のいずれか一項に規定される、変異事象または事象の組み合わせを含むイオンチャネルの選択的アンタゴニスト、アゴニスト、またはモジュレーターを投与する工程を包含する方法。
- てんかんの処置のための医薬の製造における、請求項19〜28のいずれか一項に規定される、変異事象を含むイオンチャネルの選択的アンタゴニスト、アゴニスト、またはモジュレーターの使用。
- イオンチャネル機能不全に関連した障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)を処置する方法であって、このような処置の必要な被験体に対して、請求項19〜28のいずれか一項に規定される、変異事象または事象の組み合わせを含むイオンチャネルの選択的アンタゴニスト、アゴニスト、またはモジュレーターを投与する工程を包含する方法。
- イオンチャネル機能不全に関連した障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)を処置するための医薬の製造における、請求項19〜28のいずれか一項に規定される、変異事象を含むイオンチャネルの選択的アンタゴニスト、アゴニスト、またはモジュレーターの使用。
- てんかんを処置する方法であって、このような処置の必要な被験体に対して、請求項8〜18のいずれか一項に記載の核酸分子の相補体(アンチセンス)であり、そして請求項8〜18のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるmRNAとハイブリダイズするRNA分子をコードする、単離されたDNA分子を投与する工程を包含する方法。
- てんかんの処置のための医薬の製造における、請求項8〜18のいずれか一項に記載の核酸分子の相補体であり、そして請求項8〜18のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるmRNAとハイブリダイズするRNA分子をコードする、DNA分子の使用。
- イオンチャネル機能不全に関連した障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)を処置する方法であって、このような処置の必要な被験体に対して、請求項8〜18のいずれか一項に記載の核酸分子の相補体(アンチセンス)であり、そして請求項8〜18のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるmRNAとハイブリダイズするRNA分子をコードする、単離されたDNA分子を投与する工程を包含する方法。
- イオンチャネル機能不全に関連した障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)を処置するための医薬の製造における、請求項8〜18のいずれか一項に記載の核酸分子の相補体であり、そして請求項8〜18のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるmRNAとハイブリダイズするRNA分子をコードする、DNA分子の使用。
- てんかんを処置する方法であって、このような処置の必要な被験体に対して、請求項38または39に記載の抗体、請求項19〜28のいずれか一項に規定される、変異事象または事情の組み合わせを含むイオンチャネルのアンタゴニスト、アゴニスト、またはモジュレーターまたは請求項8〜18のいずれか一項に記載の核酸分子の相補体であり、そして請求項8〜18のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるmRNAとハイブリダイズするRNA分子をコードするDNA分子を、野生型イオンチャネルサブユニットと組み合わせて投与する工程を包含する方法。
- てんかんの処置のための医薬の製造における、請求項38または39に記載の抗体、請求項19〜28のいずれか一項に規定される、変異事象または事情の組み合わせを含むイオンチャネルのアンタゴニスト、アゴニスト、またはモジュレーターまたは請求項8〜18のいずれか一項に記載の核酸分子の相補体であり、そして請求項8〜18のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるmRNAとハイブリダイズするRNA分子をコードするDNA分子の、野生型イオンチャネルサブユニットと組み合わせでの使用。
- イオンチャネル機能不全に関連した障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)を処置する方法であって、このような処置の必要な被験体に対して、請求項38または39に記載の抗体、請求項19〜28のいずれか一項に規定される、変異事象または事情の組み合わせを含むイオンチャネルのアンタゴニスト、アゴニスト、またはモジュレーターまたは請求項8〜18のいずれか一項に記載の核酸分子の相補体であり、そして請求項8〜18のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるmRNAとハイブリダイズするRNA分子をコードするDNA分子を、野生型イオンチャネルサブユニットと組み合わせて投与する工程を包含する方法。
- イオンチャネル機能不全に関連した障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)を処置するための医薬の製造における、請求項38または39に記載の抗体、請求項19〜28のいずれか一項に規定される、変異事象または事情の組み合わせを含むイオンチャネルのアンタゴニスト、アゴニスト、またはモジュレーターまたは請求項8〜18のいずれか一項に記載の核酸分子の相補体であり、そして請求項8〜18のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるmRNAとハイブリダイズするRNA分子をコードするDNA分子の、野生型イオンチャネルサブユニットと組み合わせでの使用。
- 候補薬剤のスクリーニングのための請求項8〜18のいずれか一項記載の核酸分子の使用。
- てんかんの処置のために有用な候補薬剤のスクリーニングのための請求項8〜18のいずれか一項に記載の核酸分子の使用。
- イオンチャネル機能不全に関連した障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)の処置のために有用な候補薬剤のスクリーニングのための請求項8〜18のいずれか一項に記載の核酸分子の使用。
- 候補薬剤のスクリーニングのための請求項19〜28のいずれか一項または請求項37に記載のポリペプチドまたは請求項29に記載のポリペプチド複合体の使用。
- てんかんの処置のために有用な候補薬剤のスクリーニングのための請求項19〜28のいずれか一項または請求項37に記載のポリペプチドまたは請求項29に記載のポリペプチド複合体の使用。
- イオンチャネル機能不全に関連した障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)の処置のために有用な候補薬剤のスクリーニングのための請求項19〜28のいずれか一項または請求項37に記載のポリペプチドまたは請求項29に記載のポリペプチド複合体の使用。
- 候補薬剤のスクリーニングのための請求項31〜35のいずれか一項に記載の細胞の使用。
- てんかんの処置のために有用な候補薬剤のスクリーニングのための請求項31〜35のいずれか一項に記載の細胞の使用。
- イオンチャネル機能不全に関連した障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)の処置のために有用な候補薬剤のスクリーニングのための請求項31〜35のいずれか一項に記載の細胞の使用。
- 請求項56〜64のいずれか一項に記載の使用を通して特定される化合物。
- 請求項65に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
- 請求項8〜18のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含む遺伝的に改変された非ヒト動物。
- 請求項8〜18のいずれか一項に記載の二つ以上の単離された核酸分子を含む遺伝的に改変された非ヒト動物。
- 動物がラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、および非ヒト霊長類(例えば、サル、およびチンパンジー)からなる群から選択される請求項67または68に記載の遺伝的に改変された非ヒト動物。
- 以下の工程を包含する、二つ以上のイオンチャネル変異の組み合わせを含む非ヒト形質転換動物の作成方法:
(1)請求項8〜18のいずれか一項に記載の第一の核酸分子を含む非ヒト形質転換動物を作成し;
(2)請求項8〜18のいずれか一項に記載の第二の核酸分子を含む一つ以上の追加の非ヒト形質転換動物を作成し;そして
(3)ヒトの疾患の原因であるイオンチャネル変異の組み合わせを効果的に模倣する二つ以上のイオンチャネル変異の組み合わせを含む子孫を作成するために交配の組み合わせを実行する。 - 請求項70の方法によって作成された非ヒト形質転換動物。
- 候補薬剤のスクリーニングのための請求項67〜69のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された非ヒト動物または請求項71に記載の非ヒト形質転換動物の使用。
- てんかんの処置のために有用な候補薬剤のスクリーニングのための請求項67〜69のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された非ヒト動物または請求項71に記載の非ヒト形質転換動物の使用。
- イオンチャネル機能不全に関連した障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)の処置のために有用な候補薬剤のスクリーニングのための請求項67〜69のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された非ヒト動物または請求項71に記載の非ヒト形質転換動物の使用。
- てんかんの診断または予後のための請求項8〜18のいずれか一項に記載の単離された核酸分子の使用。
- イオンチャネル機能不全に関連した障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)の診断または予後のための請求項8〜18のいずれか一項に記載の単離された核酸分子の使用。
- てんかんの診断または予後のための請求項19〜28のいずれか一項または請求項37に記載のポリペプチドまたは請求項29に記載のポリペプチド複合体の使用。
- イオンチャネル機能不全に関連した障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)の診断または予後のための請求項19〜28のいずれか一項または請求項37に記載のポリペプチドまたは請求項29に記載のポリペプチド複合体の使用。
- てんかんの診断または予後のための請求項38または39に記載の抗体の使用。
- イオンチャネル機能不全に関連した障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)の診断または予後のための請求項38または39に記載の抗体の使用。
- 以下の工程を包含する、てんかんの診断または予後のための方法:
(1)被検体からDNAを得る;そして
(2)前記被検体からのイオンチャネルの一つ以上のサブユニットのDNAを対応する天然のサブユニットのDNAと比較する;
ここで、請求項8〜18のいずれか一項に記載の一つ以上のDNA分子の特定はてんかんまたはそれに対する素因の徴候である。 - 以下の工程を包含する、イオンチャネル機能不全に関連した障害(以下を包含するが、それに限定されない:高カリウム血症性周期性四肢麻痺、または低カリウム血症性周期性四肢麻痺、筋緊張症、悪性高熱症、筋無力症、心不整脈、突発性運動失調、片頭痛、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症(精神***病)、ビックリ病、不安、抑うつ、恐怖強迫性症候群、神経因性疼痛、炎症性疼痛、慢性疼痛/急性疼痛、バーター症候群、多発性嚢胞腎、デント病、乳幼児高インスリン血症性低血糖症、嚢胞性繊維症、先天性停在夜盲症、または全色盲)の診断または予後のための方法:
(1)被検体からDNAを得る;そして
(2)前記被検体からのイオンチャネルの一つ以上のサブユニットのDNAを対応する天然のサブユニットのDNAと比較する;
ここで、請求項8〜18のいずれか一項に記載の一つ以上のDNA分子の特定は前記障害またはそれに対する素因の徴候である。 - 各DNAフラグメントが配列決定され、配列が比較される請求項81または82に記載の方法。
- DNAフラグメントが制限酵素分析に供される請求項81または82に記載の方法。
- DNAフラグメントがSSCP分析に供される請求項81または82に記載の方法。
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