JP5569768B2 - Nucleoside triphosphate derivative, nucleic acid probe, multi-labeled nucleic acid probe, and method for detecting target nucleic acid - Google Patents
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Description
本発明は、ヌクレオシド三リン酸誘導体、核酸プローブ、マルチラベル化核酸プローブおよび標的核酸の検出方法に関する。 The present invention relates to a nucleoside triphosphate derivative, a nucleic acid probe, a multilabeled nucleic acid probe, and a method for detecting a target nucleic acid.
何らかの標識が施されたＲＮＡプローブなどの核酸プローブを用い、細胞レベルにおけるＤＮＡやＲＮＡの発現パターンを検出、可視化することによって、生命現象に関する数多くの疑問点を解明することが可能となる。細胞レベルでの遺伝子発現パターンを可視化するこのような手法をｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＩＳＨ）と言うが、この際に使用されるプローブの標識法は大別して、「放射性同位体標識法」（例えば、非特許文献１参照）、「蛍光抗体標識法」、「酵素抗体標識法」に分類される。歴史的には、放射性同位体を取り込ませた核酸プローブが先に確立したが、近年その取り扱いが制限されてきたこともあって、放射性同位体元素を用いない蛍光抗体標識法や酵素抗体標識法が注目されている。 By using a nucleic acid probe such as an RNA probe with some labeling and detecting and visualizing the expression pattern of DNA and RNA at the cellular level, it becomes possible to elucidate many questions regarding life phenomena. Such a technique for visualizing the gene expression pattern at the cell level is called in situ hybridization (ISH). The labeling method of the probe used at this time is roughly classified into “radioisotope labeling method”. (For example, see Non-Patent Document 1), “fluorescent antibody labeling method”, and “enzyme antibody labeling method”. Historically, nucleic acid probes incorporating radioactive isotopes have been established earlier, but due to their limited handling in recent years, fluorescent antibody labeling methods and enzyme antibody labeling methods that do not use radioactive isotopes Is attracting attention.
これらの手法のうち、現在主流となっている蛍光抗体標識法や酵素抗体標識法は、核酸プローブ作製時に抗原やビオチンでラベル化しておき、それらを標的核酸にハイブリダイズした後、酵素もしくは蛍光物質によって標識された抗体やアビジンを用いて免疫染色法により検出するといった手法である。 Among these methods, the fluorescent antibody labeling method and enzyme antibody labeling method, which are currently mainstream, are labeled with an antigen or biotin at the time of nucleic acid probe preparation, hybridized to the target nucleic acid, and then the enzyme or fluorescent substance. This is a technique of detecting by immunostaining using an antibody or avidin labeled with the above.
これらの蛍光抗体標識法や酵素抗体標識法において、酵素や蛍光色素は抗原−抗体反応により核酸プローブと結合している。この抗原−抗体反応は一般に反応特異性が高いとされているが、生体試料を用いた場合には非特異的結合が生じてしまうことが多く、バックグラウンドノイズの原因となっている。また、抗原抗体反応により生成する結合は共有結合ではないため、その結合は強固ではない。 In these fluorescent antibody labeling methods and enzyme antibody labeling methods, enzymes and fluorescent dyes are bound to nucleic acid probes by an antigen-antibody reaction. This antigen-antibody reaction is generally considered to have high reaction specificity. However, when a biological sample is used, nonspecific binding often occurs, which causes background noise. Moreover, since the bond produced by the antigen-antibody reaction is not a covalent bond, the bond is not strong.
例えば、酵素抗体標識法を利用した核酸プローブとしては、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）などの抗体認識部位で修飾したヌクレオチド誘導体を複数個ランダムに導入した抗原マルチラベル化核酸プローブが知られている。この抗原マルチラベル化核酸プローブと標的核酸とのｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションの後、抗体認識部位を認識する酵素標識化抗体との抗原−抗体反応を行い、酵素アルカリホスファターゼとのハイブリッドによる発色反応を利用して検出を行う。しかしながら、酵素標識された抗体が非常に高価であること、抗原−抗体反応に伴う操作の煩雑化や非特異的吸着などによるバックグラウンドの増加など、幾つかの問題を有している。 For example, as a nucleic acid probe using an enzyme antibody labeling method, an antigen multi-labeled nucleic acid probe in which a plurality of nucleotide derivatives modified at an antibody recognition site such as digoxigenin (DIG) are randomly introduced is known. After in situ hybridization between the antigen multilabeled nucleic acid probe and the target nucleic acid, an antigen-antibody reaction with an enzyme-labeled antibody that recognizes the antibody recognition site is performed, and a color reaction by a hybrid with the enzyme alkaline phosphatase is utilized. To detect. However, the enzyme-labeled antibody has several problems, such as the fact that the antibody is very expensive, the operation associated with the antigen-antibody reaction is complicated, and the background is increased due to nonspecific adsorption.
一方、アルキンとアジド化合物が［３＋２］型の付加環化反応を起こし、１，２，３−トリアゾール環を形成するＨｕｉｓｇｅｎ環化反応に代表される、いわゆる「クリックケミストリ」が知られている。クリックケミストリによれば、簡単かつ短時間に複数の化合物を結合させることができる（例えば、非特許文献２参照）。 On the other hand, so-called “click chemistry”, which is represented by a Huisgen cyclization reaction in which an alkyne and an azide compound undergo a [3 + 2] type cycloaddition reaction to form a 1,2,3-triazole ring, is known. According to click chemistry, it is possible to bind a plurality of compounds easily and in a short time (see, for example, Non-Patent Document 2).
例えば、特許文献１には、標識部分を有するアルキン誘導体とアジド基を有するデオキシヌクレオチド誘導体とのクリックケミストリを利用して、マイクロアレイを用いてｍＲＮＡの検出を行うことが記載されている。 For example, Patent Document 1 describes that mRNA is detected using a microarray using click chemistry of an alkyne derivative having a labeling moiety and a deoxynucleotide derivative having an azide group.
また、特許文献２には、標識部分を有するアジドとエチニル基を有するデオキシヌクレオチド誘導体とのクリックケミストリを利用して、ＤＮＡの検出を行うことが記載されている。特許文献２の方法は、エチニル基を有するデオキシヌクレオチド誘導体を細胞内でそのままＤＮＡに取り込ませて、標識部分を有するアジドと反応させて、細胞内で合成されたＤＮＡ鎖を細胞内で検出するものであり、ＩＳＨ法に利用することはできない。 Patent Document 2 describes that DNA is detected using click chemistry of an azide having a labeling moiety and a deoxynucleotide derivative having an ethynyl group. In the method of Patent Document 2, a deoxynucleotide derivative having an ethynyl group is incorporated into DNA as it is in a cell and reacted with an azide having a labeled portion, and a DNA strand synthesized in the cell is detected in the cell. And cannot be used for the ISH method.
本発明は、新規なヌクレオシド三リン酸誘導体、核酸プローブ、および簡便かつ高感度に標的核酸を検出することができるマルチラベル化核酸プローブ、その核酸プローブまたはマルチラベル化核酸プローブを用いた標的核酸の検出方法である。 The present invention relates to a novel nucleoside triphosphate derivative, a nucleic acid probe, and a multilabeled nucleic acid probe that can detect a target nucleic acid easily and with high sensitivity, and a target nucleic acid using the nucleic acid probe or the multilabeled nucleic acid probe. It is a detection method.
本発明は、エチニル基またはアジド基を有するヌクレオシド三リン酸誘導体である。 The present invention is a nucleoside triphosphate derivative having an ethynyl group or an azide group.
また、前記ヌクレオシド三リン酸誘導体が、下記式（１）で示されるものであることが好ましい。
（式（１）中、Ｘは、エチニル基またはアジド基を有する置換基、Ｗは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
Moreover, it is preferable that the said nucleoside triphosphate derivative is what is shown by following formula (1).
(In formula (1), X represents a substituent having an ethynyl group or an azide group, and W represents a hydrogen atom or a hydroxyl group.)
また、前記ヌクレオシド三リン酸誘導体が、下記式（２）で示されるものであることが好ましい。
（式（２）中、Ｘ１およびＸ２のうち少なくとも１つは、エチニル基またはアジド基を有する置換基で残りは水素原子を表し、Ｗは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
Moreover, it is preferable that the said nucleoside triphosphate derivative is what is shown by following formula (2).
(In formula (2), at least one of X 1 and X 2 is a substituent having an ethynyl group or an azide group, the remainder represents a hydrogen atom, and W represents a hydrogen atom or a hydroxyl group.)
また、前記ヌクレオシド三リン酸誘導体が、下記式（３）で示されるものであることが好ましい。
（式（３）中、Ｘは、エチニル基またはアジド基を有する置換基、Ｗは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
Moreover, it is preferable that the said nucleoside triphosphate derivative is what is shown by following formula (3).
(In formula (3), X represents a substituent having an ethynyl group or an azide group, and W represents a hydrogen atom or a hydroxyl group.)
また、前記ヌクレオシド三リン酸誘導体が、下記式（４）で示されるものであることが好ましい。
（式（４）中、Ｘは、エチニル基またはアジド基を有する置換基、Ｗは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
Moreover, it is preferable that the said nucleoside triphosphate derivative is what is shown by following formula (4).
(In formula (4), X represents a substituent having an ethynyl group or an azide group, and W represents a hydrogen atom or a hydroxyl group.)
また、本発明は、構成単位として、前記ヌクレオシド三リン酸誘導体が複数個導入されている核酸である核酸プローブである。 The present invention also provides a nucleic acid probe that is a nucleic acid into which a plurality of the nucleoside triphosphate derivatives are introduced as a structural unit.
また、本発明は、前記核酸プローブにおけるエチニル基と、アジド基を有し標識部分を含む標識化合物のアジド基との反応、または、前記核酸プローブにおけるアジド基と、エチニル基を有し標識部分を含む標識化合物のエチニル基との反応、により、複数の標識部分が導入されているマルチラベル化核酸プローブである。 Further, the present invention provides a reaction between an ethynyl group in the nucleic acid probe and an azide group of a labeled compound having an azide group and including a label moiety, or an azide group in the nucleic acid probe and a label moiety having an ethynyl group. A multilabeled nucleic acid probe into which a plurality of labeling moieties have been introduced by reaction with an ethynyl group of a labeling compound.
また、前記マルチラベル化核酸プローブにおいて、前記標識部分が、酵素および蛍光色素のうち少なくとも１つであることが好ましい。 In the multi-labeled nucleic acid probe, the labeling part is preferably at least one of an enzyme and a fluorescent dye.
また、前記マルチラベル化核酸プローブにおいて、前記酵素が、超好熱菌由来の酵素であることが好ましい。 In the multilabeled nucleic acid probe, the enzyme is preferably an enzyme derived from a hyperthermophilic bacterium.
また、本発明は、標的核酸の検出方法であって、前記マルチラベル化核酸プローブと、対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させ、結合している前記マルチラベル化核酸プローブを、前記標識部分により検出する標的核酸の検出方法である。 The present invention also relates to a method for detecting a target nucleic acid, wherein the multilabeled nucleic acid probe and the target nucleic acid present in the target are specifically bound to each other by a nucleic acid moiety and bound. In this method, a nucleic acid probe is detected by the labeling moiety.
また、本発明は、標的核酸の検出方法であって、前記核酸プローブと、対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させた後、前記核酸プローブにおけるエチニル基と、アジド基を有し標識部分を含む標識化合物のアジド基とを反応させて、または、前記核酸プローブにおけるアジド基と、エチニル基を有し標識部分を含む標識化合物のエチニル基とを反応させて、複数の標識部分を導入し、結合している前記核酸プローブを、前記標識部分により検出する標的核酸の検出方法である。 The present invention also relates to a method for detecting a target nucleic acid, wherein after the nucleic acid probe and a target nucleic acid present in a target are specifically bound to each other by a nucleic acid moiety, an ethynyl group in the nucleic acid probe and an azide React with an azide group of a labeled compound having a group and having a label moiety, or reacting an azide group in the nucleic acid probe with an ethynyl group of a labeled compound having an ethynyl group and including a label moiety Is a method for detecting a target nucleic acid, in which the labeled nucleic acid probe is detected by the labeled moiety.
本発明では、共有結合的に複数の標識部分を導入したマルチラベル化核酸プローブを簡易に得るための新規なヌクレオシド三リン酸誘導体、核酸プローブを提供することができる。 The present invention can provide a novel nucleoside triphosphate derivative and nucleic acid probe for easily obtaining a multi-labeled nucleic acid probe into which a plurality of labeling moieties are covalently introduced.
また、本発明では、ターゲットとなる標的核酸にハイブリダイズする前に、核酸プローブにおけるエチニル基と標識化合物のアジド基との簡易な反応、または核酸プローブにおけるアジド基と標識化合物のエチニル基との簡易な反応によって、予め共有結合的に複数の標識部分を核酸プローブに導入することにより、簡便かつ高感度に標的核酸を検出することが可能なマルチラベル化核酸プローブを提供することができる。 In the present invention, before hybridizing to the target nucleic acid to be targeted, a simple reaction between the ethynyl group in the nucleic acid probe and the azide group of the labeled compound, or a simple reaction between the azide group in the nucleic acid probe and the ethynyl group of the labeled compound. By introducing a plurality of labeling moieties into the nucleic acid probe covalently in advance by a simple reaction, a multi-labeled nucleic acid probe capable of detecting the target nucleic acid easily and with high sensitivity can be provided.
また、本発明では、予め共有結合的に複数の標識部分を導入したマルチラベル化核酸プローブを用いることにより、簡便かつ高感度に標的核酸を検出することが可能な標的核酸の検出方法を提供することができる。 In addition, the present invention provides a method for detecting a target nucleic acid that can detect a target nucleic acid easily and with high sensitivity by using a multi-labeled nucleic acid probe in which a plurality of labeled moieties are covalently introduced in advance. be able to.
また、本発明では、核酸プローブをターゲットとなる標的核酸にハイブリダイズさせた後、核酸プローブにおけるエチニル基と標識化合物のアジド基との簡易な反応、または核酸プローブにおけるアジド基と標識化合物のエチニル基との簡易な反応によって、共有結合的に複数の標識部分を導入することにより、簡便かつ高感度に標的核酸を検出することが可能な標的核酸の検出方法を提供することができる。 In the present invention, after the nucleic acid probe is hybridized to the target nucleic acid to be targeted, a simple reaction between the ethynyl group in the nucleic acid probe and the azide group of the labeled compound, or the azide group in the nucleic acid probe and the ethynyl group of the labeled compound By introducing a plurality of labeling moieties covalently by a simple reaction with the above, it is possible to provide a method for detecting a target nucleic acid that can detect a target nucleic acid easily and with high sensitivity.
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。 Embodiments of the present invention will be described below. This embodiment is an example for carrying out the present invention, and the present invention is not limited to this embodiment.
本発明者らは、核酸プローブに複数の標識部分を共有結合的に導入する手法として、アルキンとアジド化合物が［３＋２］型の付加環化反応を起こし、１，２，３−トリアゾール環を形成するＨｕｉｓｇｅｎ環化反応に代表される、いわゆる「クリックケミストリ」に着目した。クリックケミストリによれば、簡単かつ短時間に複数の化合物を結合させることができる。このクリックケミストリを用いて、複数の標識部分を導入したマルチラベル化核酸プローブの創製を行う。 As a technique for covalently introducing a plurality of labeling moieties into a nucleic acid probe, the present inventors form a 1,2,3-triazole ring by causing a [3 + 2] -type cycloaddition reaction between an alkyne and an azide compound. The so-called “click chemistry” represented by the Huisgen cyclization reaction. According to click chemistry, it is possible to bind a plurality of compounds easily and in a short time. Using this click chemistry, a multi-labeled nucleic acid probe having a plurality of labeled moieties introduced therein is created.
具体的には、例えば、図１に示す、ウリジン三リン酸（ｕｒｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＵＴＰ）に、アジドが反応可能なエチニル基を有する置換基を結合させたヌクレオシド三リン酸誘導体であるアルキン化ＵＴＰを合成し、図２に示すように、核酸プローブとなるＲＮＡを調製する際にアルキン化ＵＴＰを取り込ませることによって、アルキンが複数箇所導入されたアルキン化ＲＮＡを調製する。その後、標識部分を導入した、アジド基などのエチニル基と反応する部分を有する化合物と結合させることによって、ＲＮＡと標識部分が１：ｎ（ｎは２以上の整数）であるマルチラベル化核酸プローブを創製することができる。 Specifically, for example, as shown in FIG. 1, an alkynylated UTP, which is a nucleoside triphosphate derivative in which a substituent having an ethynyl group capable of reacting with azide is bound to uridine triphosphate (UTP), is shown in FIG. As shown in FIG. 2, by synthesizing and incorporating alkyne UTP when preparing RNA to be a nucleic acid probe, an alkyne RNA having a plurality of alkynes introduced therein is prepared. Subsequently, the multilabeled nucleic acid probe in which RNA and the labeling moiety are 1: n (n is an integer of 2 or more) by binding with a compound having a moiety that reacts with an ethynyl group such as an azide group, into which the labeling moiety has been introduced. Can be created.
また、アジド基を有する置換基を結合させたヌクレオシド三リン酸誘導体を合成し、図３に示すように、核酸プローブとなるＲＮＡを調製する際に取り込ませることによって、アジド基が複数箇所導入されたアジド化ＲＮＡを調製してもよい。その後、標識部分を導入した、エチニル基などのアジド基と反応する部分を有する化合物と結合させることによって、ＲＮＡと標識部分が１：ｎ（ｎは２以上の整数）であるマルチラベル化核酸プローブを創製することができる。 Further, by synthesizing a nucleoside triphosphate derivative to which a substituent having an azide group is bonded, as shown in FIG. 3, the nucleoside triphosphate derivative is incorporated when preparing RNA to be a nucleic acid probe, thereby introducing a plurality of azide groups. Azido RNA may also be prepared. Subsequently, the multilabeled nucleic acid probe in which RNA and the labeled portion are 1: n (n is an integer of 2 or more) by binding with a compound having a portion that reacts with an azide group such as an ethynyl group into which the labeled portion has been introduced. Can be created.
図２，図３では、１つのアジド基を有する標識化合物、または１つのエチニル基を有する標識化合物を用いて反応を行う例を示しているが、図４のような複数のアジド基を有する標識化合物、または複数のエチニル基を有する標識化合物を用いて反応を行ってもよい。 FIGS. 2 and 3 show an example in which a reaction is carried out using a labeling compound having one azide group or a labeling compound having one ethynyl group, but a label having a plurality of azide groups as shown in FIG. The reaction may be carried out using a compound or a labeled compound having a plurality of ethynyl groups.
このマルチラベル化核酸プローブは、ターゲットとなる標的核酸にハイブリダイズした後、直ちに検出反応を行うことができる。アルキンとアジド基の化学反応は反応特異性が高く、結合が強固なため、抗原−抗体反応と比較して、反応時間の短縮などの操作の大幅な簡素化、バックグラウンドの低下、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件の最適化の容易化、コストの抑制などが見込まれる。 This multi-labeled nucleic acid probe can perform a detection reaction immediately after hybridizing to a target nucleic acid. The chemical reaction between the alkyne and the azide group has high reaction specificity and strong binding. Therefore, compared to the antigen-antibody reaction, operations such as shortening the reaction time are greatly simplified, background is reduced, and after hybridization. Easier optimization of cleaning conditions and cost reduction are expected.
＜ヌクレオシド三リン酸誘導体＞
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、エチニル基またはアジド基を有する。エチニル基またはアジド基を有するヌクレオシド三リン酸誘導体としては、エチニル基またはアジド基を有する、ウリジン三リン酸（ｕｒｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＵＴＰ）誘導体、アデノシン三リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＡＴＰ）誘導体、グアノシン三リン酸（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＧＴＰ）誘導体、シチジン三リン酸（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＣＴＰ）誘導体、デオキシウリジン三リン酸（ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＵＴＰ）誘導体、デオキシアデノシン三リン酸（ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＡＴＰ）誘導体、デオキシグアノシン三リン酸（ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＧＴＰ）誘導体、デオキシシチジン三リン酸（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＣＴＰ）誘導体などが挙げられる。本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体において、エチニル基またはアジド基は、例えば、ウラシル、アデニン、グアニン、シトシンの部分に直接または置換基を介して結合されている。
<Nucleoside triphosphate derivative>
The nucleoside triphosphate derivative according to this embodiment has an ethynyl group or an azide group. Examples of nucleoside triphosphate derivatives having an ethynyl group or an azide group include uridine triphosphate (UTP) derivatives, adenosine triphosphate (ATP) derivatives, guanosine triphosphates having an ethynyl group or an azide group. Guanosineine triphosphate (GTP) derivative, cytidine triphosphate (CTP) derivative, deoxyuridine triphosphate (dUTP) derivative, deoxyadenosine triphosphate (deoxyadenosine TP) derivative Phosphoric acid (deoxyguanosine) and triphosphate (dGTP) derivatives and deoxycytidine triphosphate (dCTP) derivatives. In the nucleoside triphosphate derivative according to this embodiment, the ethynyl group or the azide group is bound to, for example, a uracil, adenine, guanine, or cytosine moiety directly or through a substituent.
これらのヌクレオシド三リン酸誘導体は、ＵＴＰ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰまたはそれらの各種誘導体から得ることができる。 These nucleoside triphosphate derivatives can be obtained from UTP, ATP, GTP, CTP, dUTP, dATP, dGTP, dCTP or their various derivatives.
また、これらのヌクレオシド三リン酸誘導体は、ウリジン、ウリジンの一リン酸（ＵＭＰ）および二リン酸（ＵＤＰ）、アデノシン、アデノシンの一リン酸（ＡＭＰ）および二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン、グアノシンの一リン酸（ＧＭＰ）および二リン酸（ＧＤＰ）、シチジン、シチジンの一リン酸（ＣＭＰ）および二リン酸（ＣＤＰ）、デオキシウリジン、デオキシウリジンの一リン酸（ｄＵＭＰ）および二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシアデノシン、デオキシアデノシンの一リン酸（ｄＡＭＰ）および二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシグアノシン、デオキシグアノシンの一リン酸（ｄＧＭＰ）および二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシシチジン、デオキシシチジンの一リン酸（ｄＣＭＰ）および二リン酸（ｄＣＤＰ）ならびにそれらの各種誘導体から得てもよい。 These nucleoside triphosphate derivatives also include uridine, uridine monophosphate (UMP) and diphosphate (UDP), adenosine, adenosine monophosphate (AMP) and diphosphate (ADP), guanosine, guanosine. Monophosphate (GMP) and diphosphate (GDP), cytidine, cytidine monophosphate (CMP) and diphosphate (CDP), deoxyuridine, deoxyuridine monophosphate (dUMP) and diphosphate ( dUDP), deoxyadenosine, deoxyadenosine monophosphate (dAMP) and diphosphate (dADP), deoxyguanosine, deoxyguanosine monophosphate (dGMP) and diphosphate (dGDP), deoxycytidine, deoxycytidine mono Phosphate (dCMP) and diphosphate (dCDP) and their It may be obtained from the seed derivatives.
例えば、ウリジン、アデノシン、グアノシン、シチジン、デオキシウリジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジンのリン酸化酵素などによるリン酸化（例えば、生物工学会誌，８５（９），ｐ３９７−３９９（２００７）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８７（６），ｐ７３２−７３８（１９９９）など参照）や、プロトンスポンジ存在下でのオキシ塩化リンなどによるリン酸化（例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２９（３６），ｐ４５２５−４５２８（１９８８）など参照）などによって、それらの三リン酸体を得ることができる。 For example, phosphorylation of uridine, adenosine, guanosine, cytidine, deoxyuridine, deoxyadenosine, deoxyguanosine, deoxycytidine phosphorylase, etc. (for example, Journal of Biotechnology, 85 (9), p397-399 (2007), Journal of Bioscience and Bioengineering, 87 (6), p732-738 (1999) and the like, and phosphorylation with phosphorus oxychloride in the presence of a proton sponge (for example, Tetrahedron Letters, 29 (36), p4525-4528 (1988) These triphosphates can be obtained.
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、例えば、下記式（１）で示され、アジドが反応可能なエチニル基、またはエチニル基が反応可能なアジド基を有するウリジン三リン酸誘導体である。
（式（１）中、Ｘは、エチニル基またはアジド基を有する置換基、Ｗは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
The nucleoside triphosphate derivative according to this embodiment is, for example, a uridine triphosphate derivative represented by the following formula (1) and having an azide-reactive ethynyl group or an azide group capable of reacting with an ethynyl group.
(In formula (1), X represents a substituent having an ethynyl group or an azide group, and W represents a hydrogen atom or a hydroxyl group.)
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、例えば、下記式（２）で示され、アジドが反応可能なエチニル基、またはエチニル基が反応可能なアジド基を有するアデノシン三リン酸誘導体である。
（式（２）中、Ｘ１およびＸ２のうち少なくとも１つは、エチニル基またはアジド基を有する置換基で残りは水素原子を表し、Ｗは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
The nucleoside triphosphate derivative according to this embodiment is, for example, an adenosine triphosphate derivative represented by the following formula (2) and having an azide-reactive ethynyl group or an ethynyl group-reactive azide group.
(In formula (2), at least one of X 1 and X 2 is a substituent having an ethynyl group or an azide group, the remainder represents a hydrogen atom, and W represents a hydrogen atom or a hydroxyl group.)
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、例えば、下記式（３）で示され、アジドが反応可能なエチニル基、またはエチニル基が反応可能なアジド基を有するシチジン三リン酸誘導体である。
（式（３）中、Ｘは、エチニル基またはアジド基を有する置換基、Ｗは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
The nucleoside triphosphate derivative according to this embodiment is, for example, a cytidine triphosphate derivative represented by the following formula (3) and having an azide-reactive ethynyl group or an azide group capable of reacting with an ethynyl group.
(In formula (3), X represents a substituent having an ethynyl group or an azide group, and W represents a hydrogen atom or a hydroxyl group.)
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、例えば、下記式（４）で示され、アジドが反応可能なエチニル基、またはエチニル基が反応可能なアジド基を有するグアノシン三リン酸誘導体である。
（式（４）中、Ｘは、エチニル基またはアジド基を有する置換基、Ｗは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
The nucleoside triphosphate derivative according to this embodiment is, for example, a guanosine triphosphate derivative represented by the following formula (4) and having an azide-reactive ethynyl group or an azide group capable of reacting with an ethynyl group.
(In formula (4), X represents a substituent having an ethynyl group or an azide group, and W represents a hydrogen atom or a hydroxyl group.)
Ｘで表されるエチニル基を有する置換基としては、特に制限はないが、例えば、エチニル基や、エチニル基を有する直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基を含む置換基が挙げられ、合成のし易さなどを考慮して決めればよい。具体的には、例えば、下記式（５），（６）で表される置換基などが挙げられる。
（式（５）中、ＹおよびＺは、それぞれ独立して２価の連結基を表す。）
（式（６）中、ＹおよびＺは、それぞれ独立して２価の連結基を表す。）
The substituent having an ethynyl group represented by X is not particularly limited, and examples thereof include an ethynyl group, a linear, branched, cyclic saturated or unsaturated alkyl group having an ethynyl group, an aminoalkyl group, and an aryl group. And a substituent containing a heteroaryl group, and may be determined in consideration of easiness of synthesis. Specific examples include substituents represented by the following formulas (5) and (6).
(In formula (5), Y and Z each independently represent a divalent linking group.)
(In formula (6), Y and Z each independently represent a divalent linking group.)
ＹおよびＺで表される２価の連結基としては、それぞれ独立して、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基などの炭素数１〜４８のアルキレン基、エテニレン基、プロペニレン基、ブテニレン基などの炭素数２〜４８のアルケニレン基、エチニレン基、プロピニレン基などの炭素数２〜４８のアルキニレン基、例えば−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−または−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｎ−（ｎは繰り返し数であり、ｎ＝２，４，８，１２，２４などの整数）基などのオキシアルキレン基などが挙げられる。これらのうち、Ｙはエテニレン基、Ｚはエチレン基であることが好ましい。式（１）で示されるヌクレオシド三リン酸誘導体において、Ｗがヒドロキシル基、Ｘが式（５）で表される置換基で、Ｙがプロペニレン基、Ｚがエチレン基であるヌクレオシド三リン酸誘導体が、図１に示すアルキン化ＵＴＰである。 The divalent linking group represented by Y and Z is independently an alkylene group having 1 to 48 carbon atoms such as a methylene group, an ethylene group, a propylene group, or a butylene group, an ethenylene group, a propenylene group, or a butenylene group. alkenylene group having a carbon number of 2 to 48 such as, ethynylene group, an alkynylene group having a carbon number of 2 to 48, such as propynylene, for example - (C 2 H 4 O) n - or - (C 3 H 6 O) n - ( n is the number of repetitions, and examples thereof include oxyalkylene groups such as n = 2, 4, 8, 12, and 24) groups. Of these, Y is preferably an ethenylene group and Z is preferably an ethylene group. In the nucleoside triphosphate derivative represented by the formula (1), a nucleoside triphosphate derivative in which W is a hydroxyl group, X is a substituent represented by the formula (5), Y is a propenylene group, and Z is an ethylene group. 1 is an alkyne UTP shown in FIG.
Ｙ，Ｚを適宜選択することにより、エチニル基とＵＴＰとを連結するリンカー部位の構造を最適化し、例えば柔軟なリンカー部位を導入することで、アジド誘導体のアクセスを向上することができる。 By appropriately selecting Y and Z, it is possible to optimize the structure of the linker moiety that links the ethynyl group and UTP. For example, by introducing a flexible linker moiety, the access of the azide derivative can be improved.
また、Ｘで表されるアジド基を有する置換基としては、特に制限はないが、例えば、アジド基や、アジド基を有する直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基を含む置換基が挙げられ、合成のし易さなどを考慮して決めればよい。 Further, the substituent having an azide group represented by X is not particularly limited, and examples thereof include an azide group, a linear, branched, cyclic saturated or unsaturated alkyl group having an azide group, and an aminoalkyl group. And a substituent containing an aryl group or a heteroaryl group, and may be determined in consideration of easiness of synthesis.
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体の一例であるアルキン化ＵＴＰの調製方法の一例を図５に示す。これは、本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体の調製方法の一例であって、これに限定されるものではない。 An example of a method for preparing an alkynylated UTP that is an example of a nucleoside triphosphate derivative according to this embodiment is shown in FIG. This is an example of a method for preparing the nucleoside triphosphate derivative according to the present embodiment, and is not limited thereto.
まず、４−ペンチン酸などの末端にエチニル基を有するカルボン酸のカルボキシル基にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：ＮＨＳ）基などを導入し、活性化しておく（ＮＨＳ化アルキン）。そして、アミノアリルＵＴＰなどの末端をアミノ化した置換基を有するＵＴＰと、ＮＨＳ化アルキンとを縮合することにより、アルキン化ＵＴＰを得ることができる。 First, an N-hydroxysuccinimide (NHS) group or the like is introduced into the carboxyl group of a carboxylic acid having an ethynyl group at the terminal, such as 4-pentynoic acid, and activated (NHS alkyne). And alkyne UTP can be obtained by condensing UTP which has the substituent which aminated the terminal, such as aminoallyl UTP, and NHS alkyne.
アルキン化ＵＴＰの精製は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ゲル濾過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）などにより行うことができる。また、アルキン化ＵＴＰの同定は、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ、ＮＭＲ、ＩＲなどにより行うことができる。また、ＨＰＬＣにより、生成物の確認および収率を求めることができる。 The alkyne UTP can be purified by high performance liquid chromatography (HPLC), gel filtration chromatography (GPC) or the like. In addition, the alkynylated UTP can be identified by MALDI TOF-MS, NMR, IR, or the like. Moreover, confirmation and a yield of a product can be calculated | required by HPLC.
＜核酸プローブ＞
本実施形態に係る核酸プローブは、構成単位として、前記ヌクレオシド三リン酸誘導体を調製したのち、このヌクレオシド三リン酸誘導体が複数個導入されている核酸であり、核酸部分が、検出対象である標的核酸の標的分子特異的配列の全部または一部に相補的な配列を有するものである。
<Nucleic acid probe>
The nucleic acid probe according to the present embodiment is a nucleic acid in which a plurality of the nucleoside triphosphate derivatives are introduced after preparing the nucleoside triphosphate derivative as a constituent unit, and the nucleic acid portion is a target to be detected It has a sequence complementary to all or part of the target molecule-specific sequence of the nucleic acid.
核酸には、ＤＮＡ、ＰＮＡおよびＲＮＡが含まれる。核酸の配列および長さには特に制限はない。長さに関しては、例えば少なくとも２０ｍｅｒ程度であればよい。 Nucleic acids include DNA, PNA and RNA. There is no particular limitation on the sequence and length of the nucleic acid. For example, the length may be at least about 20 mer.
例えば、アルキン化ＵＴＰなどのエチニル基を有するヌクレオシド三リン酸誘導体を基質として、ＲＮＡポリメラーゼ活性のある酵素を用いて複数のアルキン化ＵＴＰを取り込ませて、アルキン（エチニル基）が複数箇所に導入され、所望の配列を有する核酸プローブであるアルキン化ＲＮＡ（図２）を調製することができる。 For example, using a nucleoside triphosphate derivative having an ethynyl group such as an alkynylated UTP as a substrate, an alkyne (ethynyl group) is introduced at multiple locations by incorporating multiple alkyne UTPs using an enzyme having RNA polymerase activity. Alkylated RNA (FIG. 2), which is a nucleic acid probe having a desired sequence, can be prepared.
また、例えば、アジド基を有するヌクレオシド三リン酸誘導体を基質として、ＲＮＡポリメラーゼ活性のある酵素を用いて取り込ませて、アジド基が複数箇所に導入され、所望の配列を有する核酸プローブであるアジド化ＲＮＡ（図３）を調製することができる。 Further, for example, a nucleoside triphosphate derivative having an azide group is used as a substrate and incorporated using an enzyme having RNA polymerase activity, and the azide group is introduced into a plurality of positions, and azide is a nucleic acid probe having a desired sequence RNA (FIG. 3) can be prepared.
＜マルチラベル化核酸プローブ＞
本実施形態に係るマルチラベル化核酸プローブは、上記核酸プローブにおける構成単位であるヌクレオシド三リン酸誘導体のアルキン（エチニル基）と、アジド基を有し標識部分を含む標識化合物のアジド基との反応により、複数の標識部分が導入されているものである。例えば、アルキン（エチニル基）が複数箇所に導入された核酸プローブであるアルキン化ＲＮＡに、標識蛍光色素を導入したアジド化合物、標識酵素を導入したアジド化合物などを結合させることによって、ＲＮＡと標識部分が１：ｎであるマルチラベル化核酸プローブを創製することができる（図２）。核酸プローブにおけるエチニル基と標識化合物のアジド基との簡易な反応によって、簡単かつ短時間に複数の化合物を結合させることができる。
<Multi-labeled nucleic acid probe>
The multilabeled nucleic acid probe according to the present embodiment is a reaction between the alkyne (ethynyl group) of the nucleoside triphosphate derivative, which is a constituent unit in the nucleic acid probe, and the azide group of a labeled compound having an azide group and including a labeling moiety. Thus, a plurality of label portions are introduced. For example, RNA and a labeled moiety can be obtained by binding an azide compound introduced with a labeled fluorescent dye, an azide compound introduced with a labeled enzyme, or the like to an alkyne RNA, which is a nucleic acid probe in which alkynes (ethynyl groups) are introduced at multiple locations. A multi-labeled nucleic acid probe with a 1: n can be created (FIG. 2). By a simple reaction between an ethynyl group in a nucleic acid probe and an azide group of a labeled compound, a plurality of compounds can be bound easily and in a short time.
また、本実施形態に係るマルチラベル化核酸プローブは、上記核酸プローブにおける構成単位であるヌクレオシド三リン酸誘導体のアジド基と、エチニル基を有し標識部分を含む標識化合物のエチニル基（アルキン）との反応により、複数の標識部分が導入されているものである。例えば、アジド基が複数箇所に導入された核酸プローブに、標識蛍光色素を導入したアルキン化合物、標識酵素を導入したアルキン化合物などを結合させることによって、ＲＮＡと標識部分が１：ｎであるマルチラベル化核酸プローブを創製することができる（図３）。 Further, the multi-labeled nucleic acid probe according to the present embodiment includes an azide group of a nucleoside triphosphate derivative, which is a constituent unit in the nucleic acid probe, and an ethynyl group (alkyne) of a labeled compound having an ethinyl group and including a labeling moiety. In this reaction, a plurality of labeling moieties are introduced. For example, RNA and a labeled portion are 1: n by binding an alkyne compound having a labeled fluorescent dye or an alkyne compound having a labeled enzyme to a nucleic acid probe having azide groups introduced at a plurality of locations. A nucleic acid probe can be created (FIG. 3).
ＲＮＡと標識部分との比率ｎは、２以上であれば特に制限はなく、適宜調整することができるが、ｎが大きいほど検出感度が高くなり好ましい。ただし、ｎが大きすぎると、標的核酸とのハイブリダイゼーションの効率が低下する場合がある。 The ratio n between the RNA and the labeled moiety is not particularly limited as long as it is 2 or more and can be appropriately adjusted. However, the larger n is, the higher the detection sensitivity is preferable. However, if n is too large, the efficiency of hybridization with the target nucleic acid may decrease.
本実施形態に係るマルチラベル化核酸プローブにおいて、エチニル基とアジド基との反応により得られる連結部は、１，２，３−トリアゾール環を形成することにより構成されている。 In the multi-labeled nucleic acid probe according to the present embodiment, the linking portion obtained by the reaction between the ethynyl group and the azide group is formed by forming a 1,2,3-triazole ring.
標識部分を導入したアジド化合物としては、特に制限はなく、例えば、下記式（７）で表される。
（式（７）中、Ｒは、標識部分を少なくとも１つ含む置換基であり、ｎは１以上である。ｎは、例えば、１〜３０である。）
There is no restriction | limiting in particular as an azide compound which introduce | transduced the label | marker part, For example, it represents with following formula (7).
(In Formula (7), R is a substituent containing at least one labeling moiety, and n is 1 or more. N is, for example, 1 to 30.)
標識部分を導入したアルキン化合物としては、特に制限はなく、例えば、下記式（８）で表される。
（式（８）中、Ｒは、標識部分を少なくとも１つ含む置換基であり、ｍは１以上である。ｍは、例えば、１〜３０である。）
There is no restriction | limiting in particular as an alkyne compound which introduce | transduced the label | marker part, For example, it represents with following formula (8).
(In Formula (8), R is a substituent containing at least one labeling moiety, and m is 1 or more. M is, for example, 1 to 30.)
標識化合物におけるアジド基またはエチニル基の導入率は、アジド基またはエチニル基を導入する際のアジド化試薬またはアルキン化試薬の化学量論比を変えることなどにより制御することができる。 The introduction rate of the azide group or ethynyl group in the labeling compound can be controlled by changing the stoichiometric ratio of the azide reagent or alkyne reagent when introducing the azide group or ethynyl group.
Ｒで表される標識部分を少なくとも１つを含む置換基としては、特に制限はないが、例えば、標識部分それ自体や、標識部分を少なくとも１つを含む直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基を含む置換基が挙げられ、合成のし易さなどを考慮して決めればよい。具体的には、例えば、下記式（９）で表される置換基などが挙げられる。
（式（９）中、Ａは、標識部分を表し、ｎは１〜２４を表す。）
The substituent containing at least one labeling moiety represented by R is not particularly limited. For example, the labeling part itself, or a linear, branched, cyclic saturated or unsaturated group containing at least one labeling part is included. Substituents including a saturated alkyl group, aminoalkyl group, aryl group, and heteroaryl group are given, and may be determined in consideration of easiness of synthesis. Specifically, the substituent etc. which are represented by following formula (9) are mentioned, for example.
(In formula (9), A represents a labeling moiety, and n represents 1 to 24.)
標識部分としては、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な標識（例えば、磁性ナノ粒子）、熱的に検出可能な標識（例えば、温度応答性高分子）、電気的に検出可能な標識（例えば、フェロセン部位を有する高分子）などが挙げられ、検出感度、取り扱い性などの点から、酵素および蛍光色素のうち少なくとも１つが好ましい。 Labeling moieties include enzymes, fluorescent dyes, compounds containing radioisotopes, magnetically detectable labels (eg, magnetic nanoparticles), thermally detectable labels (eg, temperature responsive polymers), electrical And a detectable label (for example, a polymer having a ferrocene moiety) and the like, and at least one of an enzyme and a fluorescent dye is preferable from the viewpoint of detection sensitivity and handling property.
蛍光色素としては、選択された波長の紫外光、可視光などの放射線による照射に応答して蛍光または燐光を発する物質であればよく、特に制限はないが、例えば、蛍光色素としてフルオレセイン、ローダミン、ダンシル、カルボシアニン誘導体など、あるいは蛍光タンパク質として緑色蛍光タンパク質とその変異体などが挙げられる。 The fluorescent dye is not particularly limited as long as it is a substance that emits fluorescence or phosphorescence in response to irradiation with a selected wavelength of ultraviolet light, visible light or the like, and examples of the fluorescent dye include fluorescein, rhodamine, Examples of dansyl and carbocyanine derivatives, and fluorescent proteins include green fluorescent protein and mutants thereof.
放射性同位体としては、例えば、重水素（２Ｈ）、三重水素（３Ｈ）、１０Ｂ、１１Ｂ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏなどが挙げられる。 Examples of the radioisotope include deuterium ( 2 H), tritium ( 3 H), 10 B, 11 B, 13 C, 15 N, 18 O, and the like.
酵素としては、発色反応などを利用して検出を行うことができる性質を有するものであればよく特に制限はない。例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。これらのうち、高い触媒活性と安定性の観点から、アルカリホスファターゼあるいはペルオキシダーゼが好ましい。 The enzyme is not particularly limited as long as it has a property capable of performing detection using a color development reaction or the like. For example, alkaline phosphatase (AP), glutathione-S-transferase (GST), luciferase, peroxidase and the like can be mentioned. Of these, alkaline phosphatase or peroxidase is preferable from the viewpoint of high catalytic activity and stability.
マルチラベル化核酸プローブと標的核酸の間でより厳密に塩基配列特異的な二本鎖形成を行うためには、比較的高温（例えば、７０℃以上）の条件下で行うことがあるため、常温菌由来の酵素を利用すると活性の損失が懸念される。そこで、標的酵素としては、超好熱菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来アルカリホスファターゼ（ＰｆｕＡＰ）が好ましい。超好熱菌は一般の生物がほとんど生育できない極限環境で生育することができる微生物であるため、超好熱菌由来のタンパク質は非常に高い耐熱性を有している。さらに、熱に対する耐性だけでなく、一般的に、変性剤、有機溶媒、ｐＨなどに対する耐性も常温菌由来酵素に比べて極めて高いことから、ＰｆｕＡＰを使用することによって、酵素の失活を伴わない厳密な二本鎖形成を達成することができると考えられる。 In order to more precisely perform base sequence-specific duplex formation between the multi-labeled nucleic acid probe and the target nucleic acid, it may be performed under relatively high temperature conditions (eg, 70 ° C. or higher). If an enzyme derived from a fungus is used, there is a concern about loss of activity. Therefore, as the target enzyme, a hyperthermophilic bacterium Pyrococcus furiosus-derived alkaline phosphatase (PfuAP) is preferable. Since hyperthermophilic bacteria are microorganisms that can grow in extreme environments where general organisms hardly grow, proteins derived from hyperthermophilic bacteria have very high heat resistance. Furthermore, not only the resistance to heat, but generally the resistance to denaturing agents, organic solvents, pH, etc. is extremely higher than that of enzymes derived from room temperature bacteria, so the use of PfuAP does not cause enzyme inactivation. It is believed that exact duplex formation can be achieved.
本実施形態に係るマルチラベル化核酸プローブの好ましい態様の一つは、ＰｆｕＡＰとアルキン化ＲＮＡまたはアジド化ＲＮＡとの複合体である。このような複合体は、安定な酵素であるＰｆｕＡＰと、安定な分子であるＲＮＡが、１，２，３−トリアゾール環という安定な共有結合で連結されているため、複合体全体としても安定性であるというメリットがある。 One of the preferred aspects of the multi-labeled nucleic acid probe according to this embodiment is a complex of PfuAP and alkyne RNA or azide RNA. In such a complex, PfuAP, which is a stable enzyme, and RNA, which is a stable molecule, are linked by a stable covalent bond called a 1,2,3-triazole ring, so that the entire complex is also stable. There is a merit that it is.
核酸プローブにおける構成単位であるヌクレオシド三リン酸誘導体のアルキン（エチニル基）と、標識部分を導入したアジド化合物との反応、またはヌクレオシド三リン酸誘導体のアジド基と、標識部分を導入したアルキン化合物との反応は、例えば、硫酸銅などをアスコルビン酸のような適当な還元剤で１価の状態にした銅触媒を用いて、ＴＢＳなどの溶媒中、ｐＨ５〜９、４〜９０℃の温度で、３０分〜２４時間程度の反応時間で行うことができる。また、触媒を用いずに、ｐＨ５〜９、１５〜９０℃の温度で、３０分〜２４時間程度の反応時間で行ってもよい。 Reaction of an alkyne (ethynyl group) of a nucleoside triphosphate derivative, which is a structural unit in a nucleic acid probe, with an azide compound into which a labeled moiety has been introduced, or an azide group of a nucleoside triphosphate derivative and an alkyne compound into which a labeled moiety has been introduced The reaction of, for example, using a copper catalyst in which copper sulfate or the like is monovalent with an appropriate reducing agent such as ascorbic acid, in a solvent such as TBS, at a pH of 5 to 9 or 4 to 90 ° C., The reaction can be performed in a reaction time of about 30 minutes to 24 hours. Moreover, you may carry out for the reaction time of about 30 minutes-24 hours at the temperature of pH 5-9, 15-90 degreeC, without using a catalyst.
アルキン（エチニル基）を有するアルキン化ＲＮＡにおけるアルキンの数に対する、標識部分を導入したアジド化合物におけるアジド基の数の比率（［アジド基数］／［アルキン基数］）、または、アジド基を有するアジド化ＲＮＡにおけるアジド基の数に対する、標識部分を導入したアルキン化合物におけるアルキンの数の比率（［アルキン基数］／［アジド基数］）は、１／１００〜１００の範囲が好ましく、１／１０〜１０の範囲がより好ましく、１／２〜２の範囲がさらに好ましい。 Ratio of the number of azide groups in the azide compound having a labeled moiety introduced to the number of alkynes in the alkyne RNA having an alkyne (ethynyl group) ([number of azide groups] / [number of alkyne groups]) or azidation having an azide group The ratio of the number of alkynes in the alkyne compound into which the labeled moiety is introduced to the number of azide groups in RNA ([number of alkyne groups] / [number of azide groups]) is preferably in the range of 1/100 to 100, and preferably 1/10 to 10 The range is more preferable, and the range of 1/2 to 2 is more preferable.
蛍光色素部分を導入したアジド化合物、アルキン化合物は、例えば、蛍光タンパク質の表面に存在するカルボキシル基を活性エステル化し、ここにアミノ化されたアジド化合物を導入したり、活性エステル化されたアルキン化合物を調製し、これにより蛍光タンパク質の表面に存在するアミノ基を修飾することで調製することができる（例えば、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３１３６−３１３８（２００７）参照）。 An azide compound or alkyne compound into which a fluorescent dye moiety has been introduced is, for example, an active esterification of a carboxyl group present on the surface of a fluorescent protein, an azide compound that has been aminated, or an active esterified alkyne compound. It can be prepared by modifying the amino group present on the surface of the fluorescent protein (see, for example, Chem. Commun., 3136-3138 (2007)).
酵素部分を導入したアジド化合物、アルキン化合物は、例えば、酵素の表面に存在するカルボキシル基を活性エステル化し、ここにアミノ化されたアジド化合物を導入したり、活性エステル化されたアルキン化合物を調製し、これにより酵素の表面に存在するアミノ基を修飾することで調製することができる（例えば、Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２４，２６６−２７２（２００８）参照）。 An azide compound or alkyne compound into which an enzyme moiety has been introduced is, for example, an active esterification of a carboxyl group present on the surface of the enzyme, an azide compound that has been aminated is introduced here, or an active esterified alkyne compound is prepared. Thus, it can be prepared by modifying the amino group present on the surface of the enzyme (see, for example, Langmuir, 24, 266-272 (2008)).
このような高い反応率が達成できる方法により得られたマルチラベル化核酸プローブ溶液には、未反応の核酸プローブ（例えば、遊離のアルキン化ＲＮＡ）がほとんど存在せず、以下で詳述する、標的核酸の検出にそのまま用いたとしても、マルチラベル化核酸プローブと未反応分子との競合が実質的に生じないか、生じたとしても目的とする検出の結果には実質的な影響を与えないほど少ないと考えられる。したがって、マルチラベル化核酸プローブ溶液を精製することなく、直接検出へと利用できるメリットがある。 In the multi-labeled nucleic acid probe solution obtained by the method capable of achieving such a high reaction rate, there is almost no unreacted nucleic acid probe (for example, free alkylated RNA). Even if it is used as it is for nucleic acid detection, competition between the multi-labeled nucleic acid probe and the unreacted molecule does not occur substantially, or even if it occurs, it does not substantially affect the desired detection result. It is thought that there are few. Therefore, there is a merit that it can be used for direct detection without purifying the multi-labeled nucleic acid probe solution.
＜標的核酸の検出方法＞
本実施形態に係る標的核酸の検出方法は、構成単位として上記ヌクレオシド三リン酸誘導体が複数個導入されている核酸である核酸プローブにおけるアルキン（エチニル基）と、アジド基を有し標識部分を含む標識化合物のアジド基との反応、または、核酸プローブにおけるアジド基と、エチニル基を有し標識部分を含む標識化合物のエチニル基との反応により、複数の標識部分が導入されているマルチラベル化核酸プローブであって、標識部分が容易に検出可能な性質を有し、かつ核酸部分が標的核酸に特異的に結合可能な塩基配列を有するものであるマルチラベル化核酸プローブを準備し、マルチラベル化核酸プローブと対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させ、結合しているマルチラベル化核酸プローブを、標識部分により検出する工程を含む（図６参照）。
<Detection method of target nucleic acid>
The method for detecting a target nucleic acid according to the present embodiment includes an alkyne (ethynyl group) in a nucleic acid probe that is a nucleic acid into which a plurality of the nucleoside triphosphate derivatives are introduced as a structural unit, and a label portion having an azide group A multi-labeled nucleic acid in which a plurality of labeling moieties are introduced by reaction with an azide group of a labeled compound or reaction of an azide group in a nucleic acid probe with an ethynyl group of a labeled compound having an ethinyl group and containing a labeled moiety Prepare a multi-labeled nucleic acid probe that has a property that the label portion can be easily detected and the nucleic acid portion has a base sequence that can specifically bind to the target nucleic acid. A nucleic acid probe and a target nucleic acid present in an object are specifically bound to each other by a nucleic acid moiety, and a bound multi-labeled nucleic acid probe is Comprising the step of detecting by 識部 minute (see Fig. 6).
本実施形態に係る標的核酸の検出方法は、標的核酸の定性、定量、識別、染色、局在化の調査などの目的で用いることができる。 The method for detecting a target nucleic acid according to this embodiment can be used for the purpose of qualitative, quantitative, identification, staining, localization investigation of the target nucleic acid.
この方法においては、上記マルチラベル化核酸プローブが用いられるが、核酸部分は、標的核酸に特異的に結合可能な核酸配列を有するものとする。標識部分は、容易に検出可能な性質を有するものである。この方法において、標的核酸を含む標的分子は、核酸、比較的低分子の有機化合物（ＡＴＰ）、タンパク質、ペプチド、金属イオン、複雑な構造を持つ多量体、ウイルスなどでありうる。検出対象は、（ｉ）ＤＮＡ転写膜、または（ｉｉ）細胞もしくは個体組織切片などである。 In this method, the multi-labeled nucleic acid probe is used, and the nucleic acid portion has a nucleic acid sequence that can specifically bind to the target nucleic acid. The label moiety has an easily detectable property. In this method, the target molecule including the target nucleic acid may be a nucleic acid, a relatively small organic compound (ATP), a protein, a peptide, a metal ion, a multimer having a complex structure, a virus, or the like. The detection target is (i) a DNA transfer membrane, or (ii) a cell or individual tissue section.
検出対象が（ｉ）の場合、標的核酸は、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡまたはゲノム断片ＤＮＡなどであり、（ｉｉ）の場合、標的核酸は、細胞または個体組織中に含まれる核酸（ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）などである。本方法は、従来法、例えばジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識化プローブを用いる方法に比較して、種々の点で優れている。例えば、ＤＩＧ法では、核酸プローブのＤＩＧ修飾および標識化された抗ＤＩＧ抗体が必要であり、それに伴う煩雑な洗浄操作が必要となるが、本実施形態に係るマルチラベル化核酸プローブを用いれば、ＤＩＧ標識化プローブおよび標識化抗ＤＩＧ抗体が不要になるため、試薬、手間および時間を大幅に削減することが可能となる。また、１つの認識部位（核酸）に対して複数のシグナル増幅部位（標識部分）を配置することにより、検出感度の向上が可能になる。 When the detection target is (i), the target nucleic acid is DNA amplified by PCR or genomic fragment DNA, and in the case of (ii), the target nucleic acid is a nucleic acid (mRNA or DNA contained in a cell or individual tissue). ) Etc. This method is superior in various respects as compared with the conventional method, for example, a method using a digoxigenin (DIG) labeled probe. For example, the DIG method requires a DIG modification of the nucleic acid probe and a labeled anti-DIG antibody, which requires a complicated washing operation, but if the multi-labeled nucleic acid probe according to this embodiment is used, Since the DIG-labeled probe and the labeled anti-DIG antibody are not required, it is possible to greatly reduce the reagent, labor, and time. Further, by arranging a plurality of signal amplification sites (labeled portions) for one recognition site (nucleic acid), detection sensitivity can be improved.
この方法においては、標的核酸に、マルチラベル化核酸プローブを供し、標的核酸とマルチラベル化核酸プローブの標的核酸相補的配列を有する部分とをハイブリダイズさせるが、このハイブリダイズのための条件は、当業者であれば、用いる核酸部分の長さ、塩基配列などに応じて、適宜設計することができる。 In this method, the target nucleic acid is provided with a multilabeled nucleic acid probe, and the target nucleic acid is hybridized with a portion having a target nucleic acid complementary sequence of the multilabeled nucleic acid probe. The conditions for the hybridization are as follows: A person skilled in the art can design appropriately according to the length, base sequence, etc. of the nucleic acid moiety used.
また、本実施形態に係る標的核酸の検出方法は、核酸部分が標的核酸に特異的に結合可能な塩基配列を有するものである、構成単位として上記ヌクレオシド三リン酸誘導体が複数個導入されている核酸である核酸プローブと、対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させた後、核酸プローブにおけるアルキン（エチニル基）と、アジド基を有し標識部分を含む標識化合物のアジド基とを反応させて、または、核酸プローブにおけるアジド基と、エチニル基を有し標識部分を含む標識化合物のエチニル基とを反応させて、容易に検出可能な性質を有する複数の標識部分を導入したアジド化合物またはアルキン化合物を結合させ、結合している核酸プローブを、標識部分により検出する工程を含む（図７参照）。 Further, in the method for detecting a target nucleic acid according to the present embodiment, a plurality of the above nucleoside triphosphate derivatives are introduced as a structural unit in which the nucleic acid portion has a base sequence that can specifically bind to the target nucleic acid. A nucleic acid probe, which is a nucleic acid, and a target nucleic acid present in a target are specifically bound by a nucleic acid moiety, and then an alkyne (ethynyl group) in the nucleic acid probe and a labeled compound having an azide group and including a labeling moiety By reacting with an azide group or reacting an azide group in a nucleic acid probe with an ethynyl group of a labeled compound having an ethynyl group and containing a labeled moiety, a plurality of label moieties having easily detectable properties are obtained. It includes a step of binding the introduced azide compound or alkyne compound and detecting the bound nucleic acid probe with a labeling moiety (see FIG. 7).
この方法においては、上記核酸プローブが用いられるが、核酸部分は、標的核酸に特異的に結合可能な核酸配列を有するものとする。また、標識部分は、容易に検出可能な性質を有するものである。 In this method, the nucleic acid probe is used, and the nucleic acid portion has a nucleic acid sequence that can specifically bind to the target nucleic acid. The label portion has a property that can be easily detected.
本方法は、従来法、例えばジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識化プローブを用いる方法に比較して、種々の点で優れている。例えば、ＤＩＧ法では、核酸プローブのＤＩＧ修飾および標識化された抗ＤＩＧ抗体が必要であり、それに伴う煩雑な洗浄操作が必要となるが、本実施形態に係る核酸プローブを用いれば、ＤＩＧ標識化プローブおよび標識化抗ＤＩＧ抗体が不要になるため、試薬、手間および時間を大幅に削減することが可能となる。また、１つの認識部位（核酸）に対して複数のシグナル増幅部位（標識部分）を配置することにより、検出感度の向上が可能になる。 This method is superior in various respects as compared with the conventional method, for example, a method using a digoxigenin (DIG) labeled probe. For example, in the DIG method, DIG modification of a nucleic acid probe and a labeled anti-DIG antibody are required, and a complicated washing operation is required, but if the nucleic acid probe according to this embodiment is used, DIG labeling Since the probe and the labeled anti-DIG antibody are not necessary, it is possible to greatly reduce the reagent, labor and time. Further, by arranging a plurality of signal amplification sites (labeled portions) for one recognition site (nucleic acid), detection sensitivity can be improved.
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example and a comparative example are given and this invention is demonstrated in detail more concretely, this invention is not limited to a following example.
本実施例では、Ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）法への応用を目指して、酵素マルチラベル化ＲＮＡの開発を行った。酵素ラベル化の手法としては、酵素部分を有するアジドとエチニル基とのクリックケミストリを利用した。アジドと反応するアルキン（エチニル基）を導入したアルキン化ＵＴＰを合成し、ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによる転写反応によってアルキン化ＲＮＡを調製した。さらに、アジド基を有するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を調製し、アジドとエチニル基とのＨｕｉｓｇｅｎ環化反応によるマルチラベル化核酸プローブを調製し、その性能をドットブロットによって評価した。 In this example, enzyme multi-labeled RNA was developed for application to the in situ hybridization (ISH) method. As a method for enzyme labeling, click chemistry of an azide having an enzyme moiety and an ethynyl group was used. Alkylated UTP into which alkyne (ethynyl group) that reacts with azide was introduced was synthesized, and alkyne RNA was prepared by transcription reaction using RNA polymerase. Furthermore, an alkaline phosphatase (AP) having an azide group was prepared, a multi-labeled nucleic acid probe by a Huisgen cyclization reaction between an azide and an ethynyl group was prepared, and its performance was evaluated by dot blot.
（実施例１）
＜アルキン化ＵＴＰの合成・精製＞
アルキン化ＵＴＰの合成スキームは、図５に示す通りである。
Example 1
<Synthesis and purification of alkyne UTP>
The synthesis scheme of alkyne UTP is as shown in FIG.
まず１００ｍＭ Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１００ｍＭ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、５０ｍＭ ４−ペンチン酸を、室温（調製した日は２７℃）でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４ｍＬ中で２０時間反応させることにより、ＮＨＳ化アルキン（５０ｍＭ）を調製した。その後、２５ｍＭのＮＨＳ化アルキンと５ｍＭのａｍｉｎｏａｌｌｙｌ ＵＴＰとを、１００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）とＤＭＦの混合溶媒（ｖ／ｖ＝１／１）０．３２ｍＬ中において２５℃で１２時間反応させた。反応終了後、サンプルをＭｉｌｌｉ−Ｑ水で１０倍希釈し、ＨＰＬＣ（日本分光製）（高速液体クロマトグラフ・ポンプ：ＴＲＩ ＲＯＴＡＲ−Ｖ型、バリアブル・ループ・インジェクタ：ＶＬ−６１３型、紫外可視分光検出器：ＵＶＩＤＥＣ−１００−ＩＶ型）によって精製を行った。ＨＰＬＣの測定条件は表１の通りとした。生成物の同定は、レーザイオン化飛行時間型質量分析装置であるＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（島津製作所製 ＡＸＩＭＡ（登録商標）−ＣＦＲ Ｐｌｕｓ）によって行った。なお、サンプル調製手順は、まず、試料１μＬをＭＡＬＤＩ用試料プレートの上に滴下し、次にその上から、マトリックス溶液としてα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）の１０ｍｇ／ｍｌ溶液（５０％アセトニトリル溶液、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む）を滴下し、その後、風乾して、得られた試料プレートをＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ装置のイオン源内に導入して計測した。 First, 100 mM N, N′-diisopropylcarbodiimide (DIC), 100 mM N-hydroxysuccinimide (NHS), 50 mM 4-pentynoic acid was added at room temperature (27 ° C. on the day of preparation) in 4 mL of N, N-dimethylformamide (DMF). Was reacted for 20 hours to prepare NHS-modified alkyne (50 mM). Then, 25 mM NHS alkyne and 5 mM aminoallyl UTP were reacted for 12 hours at 25 ° C. in 0.32 mL of a mixed solvent of 100 mM borate buffer (pH 8.8) and DMF (v / v = 1/1). I let you. After completion of the reaction, the sample was diluted 10-fold with Milli-Q water, and HPLC (manufactured by JASCO) (high performance liquid chromatograph pump: TRI ROTAR-V type, variable loop injector: VL-613 type, UV-visible spectroscopy) Purification was performed by a detector: UVIDEC-100-IV type). The HPLC measurement conditions were as shown in Table 1. The product was identified by MALDI TOF-MS (AXIMA (registered trademark) -CFR Plus manufactured by Shimadzu Corporation), which is a laser ionization time-of-flight mass spectrometer. The sample preparation procedure was as follows. First, 1 μL of a sample was dropped onto a MALDI sample plate, and then a 10 mg / ml solution of α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) as a matrix solution (50 % Acetonitrile solution and 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) were added dropwise, then air-dried, and the obtained sample plate was introduced into an ion source of a MALDI TOF-MS apparatus and measured.
アルキン化ＵＴＰを合成した後、表１に示す条件で逆相ＨＰＬＣを行った際の結果を図８に示す。保持時間１３．８１３分のピークを回収してＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った（図９参照）。その結果、６１７．９９のピークが確認され、理論分子量の６１８．０４と良く一致した結果が得られたため、アルキン化ＵＴＰの合成が示された。また、得られた生成物の量より反応率を算出すると約６７％であった。 FIG. 8 shows the results when reverse-phase HPLC was performed under the conditions shown in Table 1 after synthesizing alkyne UTP. A peak with a retention time of 13.813 minutes was collected and subjected to MALDI TOF-MS analysis (see FIG. 9). As a result, a peak of 617.999 was confirmed, and the result was in good agreement with the theoretical molecular weight of 618.04, indicating the synthesis of alkynated UTP. The reaction rate calculated from the amount of the product obtained was about 67%.
＜核酸プローブ（アルキン化ＲＮＡ）の調製＞
核酸プローブ（アルキン化ＲＮＡ）をＴ７ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて、表２の反応条件で調製した（配列番号１）。反応は、３７℃で２時間反応させて行った。アルキン化ＵＴＰの導入量を０％、４０％、８０％と変えて核酸プローブの調製を行った。
<Preparation of nucleic acid probe (alkyne RNA)>
A nucleic acid probe (alkynylated RNA) was prepared using T7 polymerase under the reaction conditions shown in Table 2 (SEQ ID NO: 1). The reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. Nucleic acid probes were prepared by changing the amount of alkyne UTP introduced into 0%, 40%, and 80%.
転写反応後、マイクロチップ型電気泳動装置（Ｅｘｐｅｒｉｏｎ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で確認を行ったところ、図１０に示すように、ＲＮＡ転写反応時のアルキン化ＵＴＰの導入量が増加するに伴い、高分子側へバンドがシフトし、アルキンの導入量の調整が可能であることがわかった。 After the transcription reaction, confirmation was performed with a microchip electrophoresis apparatus (Experion, manufactured by BIO-RAD). As shown in FIG. 10, as the amount of alkyne UTP introduced during the RNA transcription reaction increased, It was found that the band shifted to the polymer side and the amount of alkyne introduced could be adjusted.
＜アジド化ＡＰの調製＞
（１）ＮＨＳ化アジドの調製
まず、１００ｍＭのＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、和光純工業株式会社製）、１００ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、キシダ化学株式会社製）、５０ｍＭのＯ−（２−Ａｚｉｄｏｅｔｈｙｌ）−Ｏ−［２−（ｄｉｇｌｙｃｏｌｙｌ−ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ］ｈｅｐｔａｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（シグマ・アルドリッチ社製）を、室温（調製した日は２０℃）でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、キシダ化学株式会社製）２ｍＬ中で２０時間反応させることにより、Ｏ−（２−Ａｚｉｄｏｅｔｈｙｌ）−Ｏ−［２−（ｄｉｇｌｙｃｏｌｙｌ−ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ］ｈｅｐｔａｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌをＮＨＳ化した（ＮＨＳ化アジド）。
<Preparation of azide AP>
(1) Preparation of NHS Azide First, 100 mM N, N′-diisopropylcarbodiimide (DIC, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 100 mM N-hydroxysuccinimide (NHS, manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.), 50 mM O— (2-Azidoethyl) -O- [2- (digitally-amino) ethyl] heptaethylene glycol (manufactured by Sigma-Aldrich) is dimethyl sulfoxide (DMSO, manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.) at room temperature (prepared on 20 ° C) By reacting in 2 mL for 20 hours, O- (2-Azidoethyl) -O- [2- (digitally-amino) ethyl] heptaethylene glycol was NHS-modified (NHS-modified azide).
（２）アジド化ＡＰの調製
１０ｍＭのＮＨＳ化アジドと、５ｍｇ／ｍＬ（１００μＭ）の大腸菌由来アルカリホスファターゼ（ＡＰ、和光純薬工業株式会社製）とを、５０ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）中において、室温（調製した日は２０℃）で一晩（１６時間）反応させ、アジド化されたＡｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（アジド化ＡＰ）を得た。なお、ＡＰをアジド化する際、ＡＰ（８μＭ）と反応させるＮＨＳ化アジドの量を等量（８μＭ）、１０倍量（８０μＭ）、１００倍量（８００μＭ）と３段階に設定した。以下、下記の通り表記する。
１倍量のＮＨＳ化アジドでアジド化したＡＰ ： １×アジド化ＡＰ
１０倍量のＮＨＳ化アジドでアジド化したＡＰ ： １０×アジド化ＡＰ
１００倍量のＮＨＳ化アジドでアジド化したＡＰ ： １００×アジド化ＡＰ
(2) Preparation of azide AP 10 mM NHS azide and 5 mg / mL (100 μM) of Escherichia coli-derived alkaline phosphatase (AP, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were mixed with 50 mM borate buffer (pH 8.8). The mixture was reacted overnight (16 hours) at room temperature (20 ° C. on the day of preparation) to obtain azido Alkaline phosphatase (azidated AP). In addition, when azating AP, the amount of NHS azide to be reacted with AP (8 μM) was set in three steps: an equal amount (8 μM), a 10-fold amount (80 μM), and a 100-fold amount (800 μM). Hereinafter, the notation is as follows.
AP azide with 1 volume of NHS azide: 1 × Azide AP
AP azide with 10 times the amount of NHS azide: 10 × Azide AP
AP azide with 100 times the amount of NHS azide: 100 × Azide AP
反応後、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で精製し、１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）にバッファ交換した。限外濾過カラム（アミコンウルトラ-４ ３０Ｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濃縮後、ＢＣＡ法で各アジド化ＡＰの濃度を定量した。 After the reaction, it was purified with a PD-10 column (manufactured by GE Healthcare Bioscience), and the buffer was exchanged with a 10 mM borate buffer solution (pH 8.8). After concentration with an ultrafiltration column (Amicon Ultra-4 30K, manufactured by Millipore), the concentration of each azido AP was quantified by the BCA method.
（３）ＢＣＡ法によるアジド化ＡＰ濃度の定量
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ、シグマ・アルドリッチ社製）を０．１ｍｇ／ｍＬ〜１．０ｍｇ／ｍＬの６段階に水で希釈したものと、各アジド化ＡＰを水で５倍希釈したものを、９６穴プレート（ポリソープ、Ｎｕｎｃ社製）にそれぞれ１０μＬずつ添加し、そこにビシンコニン酸溶液（シグマ・アルドリッチ社製）と硫酸銅溶液（Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ） ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、シグマ・アルドリッチ社製）を５０：１で混合した調製液を２００μＬ添加して、３７℃で３０分反応させた。反応終了後、プレートリーダ（Ｐｏｗｅｒ Ｗａｖｅ Ｘ、ＢＩＯ−ＴＥＫ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製）で５６２ｎｍの吸光度を測定した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄの結果より検量線を作成して各アジド化ＡＰの濃度を定量した結果、１×アジド化ＡＰは２．２ｍｇ／ｍＬ、１０×アジド化ＡＰは２．２９ｍｇ／ｍＬ、１００×ＡＰは２．２３ｍｇ／ｍＬであった。
(3) Quantification of azide AP concentration by BCA method Protein Standard (Bovine Serum Albumin, manufactured by Sigma-Aldrich) diluted with water in 6 stages of 0.1 mg / mL to 1.0 mg / mL, and each azide 10 μL each of diluted AP diluted 5 times with water is added to each 96-well plate (Polysoap, Nunc), and a bicinchoninic acid solution (Sigma-Aldrich) and a copper sulfate solution (Copper (II)) 200 μL of a solution prepared by mixing 50: 1 of sulfate solution (manufactured by Sigma-Aldrich) was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. After completion of the reaction, absorbance at 562 nm was measured with a plate reader (Power Wave X, manufactured by BIO-TEK INSTRUMENTS). As a result of preparing a calibration curve from the results of Protein Standard and quantifying the concentration of each azide AP, 1 × azide AP was 2.2 mg / mL, 10 × azide AP was 2.29 mg / mL, and 100 × AP was It was 2.23 mg / mL.
（４）活性測定
各アジド化ＡＰを１０ｍＭホウ酸緩衝液で２．８μＭに希釈したものを、ＡＰの基質である１ｍＭ ４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム・６水和物（以下ｐ−ＮＰＰ、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で調製）９９０μＬに１０μＬ添加し（アジド化ＡＰの終濃度２８ｎＭ）、２５℃で８０秒間反応させ、ｐ−ＮＰＰがＡＰによって脱リン酸化されて生じるｐ−ニトロフェノールの４１０ｎｍの吸光度を測定することによって、ＡＰの酵素活性を評価した。対照サンプルとしてアジド化してないＡＰも測定した。
(4) Activity measurement Each azidated AP diluted to 2.8 μM with 10 mM borate buffer was used as 1 mM 4-nitrophenyl phosphate disodium hexahydrate (hereinafter referred to as p-NPP, which is a substrate of AP). (Prepared with 1M Tris-HCl pH 8.0) 10 μL was added to 990 μL (final concentration of azide AP 28 nM), reacted at 25 ° C. for 80 seconds, and p-nitrophenol produced by dephosphorylation of p-NPP by AP The enzyme activity of AP was evaluated by measuring absorbance at 410 nm. A non-azidated AP was also measured as a control sample.
各アジド化ＡＰの酵素活性の測定結果を図１１に示す。１×アジド化ＡＰおよび１０×アジド化ＡＰはアジド化によって活性の低下は見られなかったが、１００×アジド化ＡＰは活性が対照実験（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の約６０％に低下した。 The measurement result of the enzyme activity of each azido AP is shown in FIG. While 1 × azide AP and 10 × azide AP did not show a decrease in activity due to azidation, 100 × azide AP decreased the activity to about 60% of the control experiment (Control).
＜アルキン化ＢＳＡとのクリックケミストリによるアジド化の確認＞
（１）アルキン化ＢＳＡの調製
まず、１００ｍＭ Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、和光純工業株式会社製）、１００ｍＭ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、キシダ化学株式会社製）、５０ｍＭ ４−ペンチン酸（シグマ・アルドリッチ社製）を撹拌しながら室温（調製した日は２０℃）で２０時間反応させることにより、ＮＨＳ化アルキンを調製した。その後、７．５μＭ ＢＳＡと１ｍＭ ＮＨＳ化アルキンを１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）中で室温（調製した日は２０℃）下で１６時間撹拌した。反応後はＰＤ−１０カラムで精製し、限外濾過カラムで濃縮した後、ＢＣＡ法でアルキン化ＢＳＡの濃度を定量した。
<Confirmation of azidation by click chemistry with alkyne BSA>
(1) Preparation of alkyne BSA First, 100 mM N, N′-diisopropylcarbodiimide (DIC, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 100 mM N-hydroxysuccinimide (NHS, manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.), 50 mM 4-pentynoic acid ( NHS alkyne was prepared by reacting Sigma-Aldrich) at room temperature (20 ° C. on the day of preparation) with stirring for 20 hours. Thereafter, 7.5 μM BSA and 1 mM NHS-modified alkyne were stirred in 100 mM borate buffer (pH 8.8) at room temperature (prepared at 20 ° C.) for 16 hours. After the reaction, the product was purified with a PD-10 column, concentrated with an ultrafiltration column, and then the concentration of alkyne BSA was quantified by the BCA method.
（２）ＢＣＡ法によるアルキン化ＢＳＡ濃度の定量
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ、シグマ・アルドリッチ社製）を０．１ｍｇ／ｍＬ〜１．０ｍｇ／ｍＬの６段階に水で希釈したものと、アルキン化ＢＳＡを水で５倍希釈したものを、９６穴プレート（ポリソープ、Ｎｕｎｃ社製）にそれぞれ１０μＬずつ添加し、そこにビシンコニン酸溶液（シグマ・アルドリッチ社製）と硫酸銅溶液（Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ） ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、シグマ・アルドリッチ社製）を５０：１で混合した調製液を２００μＬ添加して３７℃で３０分反応させた。反応終了後、プレートリーダ（Ｐｏｗｅｒ Ｗａｖｅ Ｘ、ＢＩＯ−ＴＥＫ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製）で５６２ｎｍの吸光度を測定した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄの結果より検量線を作成してアルキン化ＢＳＡの濃度を定量した結果、４．６５ｍｇ／ｍＬであった。
(2) Determination of alkyne BSA concentration by BCA method Protein Standard (Bovine Serum Albumin, Sigma-Aldrich) diluted with water in 6 stages from 0.1 mg / mL to 1.0 mg / mL, and alkyne 10 μL each of BSA diluted 5 times with water is added to 96-well plates (Polysoap, Nunc), and bicinchoninic acid solution (Sigma-Aldrich) and copper sulfate solution (Copper (II) sulfate). 200 μL of a solution prepared by mixing solution (manufactured by Sigma-Aldrich) at 50: 1 was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. After completion of the reaction, absorbance at 562 nm was measured with a plate reader (Power Wave X, manufactured by BIO-TEK INSTRUMENTS). It was 4.65 mg / mL as a result of preparing the analytical curve from the result of Protein Standard and quantifying the density | concentration of alkyne BSA.
（３）クリックケミストリによるアジド化の確認
各アジド化ＡＰ（１×アジド化ＡＰ、１０×アジド化ＡＰ、１００×アジド化ＡＰ）１０μｇ、アルキン化ＢＳＡ １０μｇ、硫酸銅（ＣｕＳＯ４）１ｍＭ、Ｔｒｉｓ[（１−ｂｅｎｚｙｌ−１Ｈ−１，２，３−ｔｒｉａｚｏｌ−４−ｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ]ａｍｉｎｅ（ＴＢＴＡ、シグマ・アルドリッチ社製）０．１ｍＭ、アスコルビン酸ナトリウム １ｍＭの条件の下、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）緩衝液（ｐＨ７．７）中で２５℃、１６時間反応させた。反応後、１２％アクリルアミドゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色で染色した。
(3) Confirmation of Azide by Click Chemistry Each Azide AP (1 × Azide AP, 10 × Azide AP, 100 × Azide AP) 10 μg, Alkynated BSA 10 μg, Copper Sulfate (CuSO 4 ) 1 mM, Tris [ (1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) methyl] amine (TBTA, manufactured by Sigma-Aldrich) 0.1 mM, sodium ascorbate 1 mM, TBS (Tris-buffered saline) ) It was reacted in a buffer solution (pH 7.7) at 25 ° C. for 16 hours. After the reaction, SDS-PAGE was performed on a 12% acrylamide gel and stained with CBB staining.
アルキンＢＳＡとのクリック反応後のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１２に示す。１０×アジド化ＡＰと１００×アジド化ＡＰを用いてクリック反応した場合、アルキンＢＳＡのバンドとアジド化ＡＰのバンドが薄くなり、高分子側へスメアリングしていた。また、スメアリングはＮＨＳアジドの添加量に伴って、より高分子側にシフトしており、１００×アジド化ＡＰを用いた場合では電気泳動で流れずにＷｅｌｌに保持されている産物も得られた。これより、ＮＨＳ化アジドの添加量に伴ってＡＰがアジド化していることが確認された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥレベルでは、１×アジド化ＡＰのアジド化は確認できなかった。 The result of SDS-PAGE after the click reaction with alkyne BSA is shown in FIG. When a click reaction was performed using 10 × azide AP and 100 × azide AP, the alkyne BSA band and the azide AP band were thinned and smeared to the polymer side. In addition, the smearing is shifted to the polymer side with the addition amount of NHS azide, and when 100 × azidated AP is used, a product that is retained in the well without flowing by electrophoresis is also obtained. It was. From this, it was confirmed that AP was azinated with the addition amount of NHS azide. At the SDS-PAGE level, azidation of 1 × azide AP could not be confirmed.
（４）ＴＮＢＳ法によるＡＰのアジド化率の算出
１０ｍＭ各ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）で０．５ｍｇ／ｍＬ(１０μＭ)に希釈したアジド化ＡＰ ５０μＬ、４％炭酸水素ナトリウム溶液 ５０μＬ、０．１％ ２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＴＮＢＳ）溶液５０μＬを９６穴プレート（ポリソープ、Ｎｕｎｃ社製）に入れ、４０℃で２時間振盪しながら反応させた後、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）５０μＬと１Ｍ塩酸２５μＬを添加して反応を停止した。その後、プレートリーダ（Ｐｏｗｅｒ Ｗａｖｅ Ｘ、ＢＩＯ−ＴＥＫ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製）で３４０ｎｍの吸光度を測定した。
(4) Calculation of AP azidation rate by TNBS method 50 μL of azide AP diluted to 0.5 mg / mL (10 μM) with 10 mM borate buffer (pH 8.8), 50 μL of 4% sodium bicarbonate solution, 0 50% of a 1% sodium 2,4,6-trinitrobenzenesulfonate (TNBS) solution was placed in a 96-well plate (Polysoap, Nunc), reacted at 40 ° C. with shaking for 2 hours, and then 2% dodecyl sulfate. The reaction was stopped by adding 50 μL of sodium (SDS) and 25 μL of 1M hydrochloric acid. Thereafter, the absorbance at 340 nm was measured with a plate reader (Power Wave X, manufactured by BIO-TEK INSTRUMENTS).
ＴＮＢＳ法の結果を図１３に示す。ＡＰをアジド化する際のＮＨＳ化アジドの添加量に伴って３４０ｎｍの吸光値が低下している。これらの結果より、アジド化していないＡＰをコントロールとしてアジド化率を算出すると、１×アジド化ＡＰは約１．０％、１０×アジド化ＡＰは約８．７％、１００×アジド化ＡＰは約３５．５％となった。 The result of the TNBS method is shown in FIG. The absorbance value at 340 nm decreases with the addition amount of NHS azide when AP is azidated. From these results, when the azidation rate was calculated using the non-azidated AP as a control, 1 × azidated AP was about 1.0%, 10x azidized AP was about 8.7%, and 100 × azidated AP was It became about 35.5%.
＜Ｈｕｉｓｇｅｎ環化反応によるマルチラベル化核酸プローブの調製＞
それぞれ調製したアルキン化ＲＮＡとアジド化ＡＰとを、Ｈｕｉｓｇｅｎ環化反応により結合させ、マルチラベル化核酸プローブを調製した。アルキン化ＲＮＡとして、アルキン化ＵＴＰ導入量が０％（Negative control）、４０％、８０％（それぞれ、４０％アルキン化ＲＮＡ、８０％アルキン化ＲＮＡと表記）のものを用い、アジド化ＡＰとして、１×アジド化ＡＰ、１０×アジド化ＡＰ、１００×アジド化ＡＰを用いた。反応条件を表４に示す。反応は、２５℃で６時間あるいは１６時間反応させて行った。サブマリン型電気泳動装置によるアガロース電気泳動の結果を図１４に示す。
<Preparation of multilabeled nucleic acid probe by Huisgen cyclization reaction>
Each prepared alkyne RNA and azido AP were combined by a Huisgen cyclization reaction to prepare a multi-labeled nucleic acid probe. As the alkylated RNA, those having an alkylated UTP introduction amount of 0% (Negative control), 40%, 80% (represented as 40% alkynylated RNA and 80% alkynylated RNA, respectively), and as azido AP, 1 × azide AP, 10 × azide AP, 100 × azide AP were used. The reaction conditions are shown in Table 4. The reaction was carried out by reacting at 25 ° C. for 6 hours or 16 hours. The results of agarose electrophoresis using a submarine type electrophoresis apparatus are shown in FIG.
アルキンが導入されたアルキン化ＲＮＡとアジド化ＡＰを用いて反応を行った時、１０×アジド化ＡＰは８０％アルキン化ＲＮＡと、１００×アジド化ＡＰは４０％および８０％アルキン化ＲＮＡとの反応において、高分子側にスメアーした。このように、アルキンが導入されたアルキン化ＲＮＡとアジド化ＡＰとの間でＨｕｉｓｇｅｎ環化反応が起こっており、ラベル化が確認された。また、より多くのアルキンでラベル化された核酸プローブ（４０％＜８０％）を、より多くのアジド基で修飾された酵素（１×＜１０×＜１００×アジド化ＡＰ）と反応させると、より多くのクリック産物を得ることができることが分かり、また、反応時間を長く（６ｈｒ＜１６ｈｒ）してもより多くのクリック産物が得られることが分かる。 When the reaction was performed using an alkyne-introduced RNA into which alkyne was introduced and azide AP, 10 × azide AP was 80% alkyne RNA, and 100 × azide AP was 40% and 80% alkyne RNA. In the reaction, smearing was performed on the polymer side. Thus, the Huisgen cyclization reaction occurred between the alkyne RNA into which the alkyne was introduced and the azide AP, and the labeling was confirmed. Alternatively, when more alkyne-labeled nucleic acid probes (40% <80%) are reacted with more azide-modified enzymes (1 × <10 × <100 × azidated AP), It can be seen that more click products can be obtained, and that more click products can be obtained even if the reaction time is increased (6 hr <16 hr).
＜ドットブロットによる検出感度の評価＞
ドットブロットにより、Ｈｕｉｓｇｅｎ環化反応により調製したマルチラベル化核酸プローブの検出感度の評価を行った。なお、ハイブリダイセーション時の各種溶液組成およびプロトコールは、市販の検出キットＡｌｋｐｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）に準拠した。ターゲットＲＮＡとして、プローブと相補的なＲＮＡ（センス鎖）を用いた。
<Evaluation of detection sensitivity by dot blot>
The detection sensitivity of the multilabeled nucleic acid probe prepared by the Huisgen cyclization reaction was evaluated by dot blot. In addition, the various solution composition and protocol at the time of hybridization followed the commercially available detection kit Alkphos Direct (made by GE Healthcare Bioscience). As target RNA, RNA complementary to the probe (sense strand) was used.
評価は、検出用メンブレンの作製、プレハイブリダイゼーション（５５℃、３０分）、ハイブリダイゼーション（５５℃、１６時間）、メンブレン洗浄を行った後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴで検出を行った（２５℃、４時間）。 Evaluation was performed by BCIP / NBT after detection membrane preparation, prehybridization (55 ° C., 30 minutes), hybridization (55 ° C., 16 hours), membrane washing (25 ° C., 4 minutes). time).
（１）センス鎖ＲＮＡ、アンチセンス鎖ＲＮＡの調製
ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより転写を行うことによって、センス鎖ＲＮＡ、アンチセンス鎖ＲＮＡを調製した。標的核酸（ターゲット）としては、マウス中にて発現パターンが既知であるＳｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）というタンパク質をコードするｍＲＮＡ（ｓｈｈ）をモデルとした。そこでまず、ＳＨＨをコードした遺伝子を含むプラスミドをテンプレートとしてＰＣＲを行い、長さ約１０００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。この際、上流にはＴ３プロモータ、下流にはＴ７プロモータが含まれるようにプライマ設計を施した。次に得られたＰＣＲ産物を基に、Ｔ３ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（センス鎖（Ｓ） 調製用）を用いてＲＮＡ合成を行い、Ｔ３ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで転写反応を行ってセンス鎖配列を調製した（配列番号２）。同様にＴ７ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（アンチセンス鎖（ＡＳ） 調製用）を用いてＲＮＡ合成を行い、Ｔ７ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにで転写反応を行ってアンチセンス鎖配列を合成した（配列番号３）。条件は以下の表３に示す。反応は３７℃で２時間行い、得られたセンス鎖ＲＮＡ、アンチセンス鎖はエタノール沈殿によって回収し、ＴＥバッファ２０μＬで縣濁した。ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとＤＴＴを添加し、ＲＮａｓｅによる分解を抑えた。
(1) Preparation of sense strand RNA and antisense strand RNA Sense strand RNA and antisense strand RNA were prepared by performing transcription | transfer by RNA polymerase. As a target nucleic acid (target), mRNA (shh) encoding a protein called Sonic hedgehog (SHH) whose expression pattern is known in mice was used as a model. Therefore, PCR was first performed using a plasmid containing a gene encoding SHH as a template to obtain a DNA fragment having a length of about 1000 bp. At this time, the primer design was performed so that the T3 promoter was included upstream and the T7 promoter was included downstream. Next, based on the obtained PCR product, RNA synthesis was performed using T3 polymerase (for preparation of sense strand (S)), and a transcription reaction was performed with T3 polymerase to prepare a sense strand sequence (SEQ ID NO: 2). Similarly, RNA synthesis was performed using T7 polymerase (for preparation of antisense strand (AS)), and transcription reaction was performed using T7 polymerase to synthesize an antisense strand sequence (SEQ ID NO: 3). The conditions are shown in Table 3 below. The reaction was performed at 37 ° C. for 2 hours, and the obtained sense strand RNA and antisense strand were recovered by ethanol precipitation and suspended in 20 μL of TE buffer. RNase inhibitor and DTT were added to suppress degradation by RNase.
（２）ＲＮＡ濃度の測定
転写反応後、Ｎａｎｏ ＤｒｏｐにてＲＮＡ濃度を測定した。その結果、センス鎖は１０１９ｎｇ／μＬ、アンチセンス鎖は８１５ｎｇ／μＬであった。
(2) Measurement of RNA concentration After the transcription reaction, the RNA concentration was measured by Nano Drop. As a result, the sense strand was 1019 ng / μL and the antisense strand was 815 ng / μL.
（３）検出用メンブレンの作製
まず、ターゲットとなるセンス鎖ＲＮＡ、アンチセンス鎖ＲＮＡを１００ｆｇ／μＬ〜５０ｎｇ／μＬの７段階の濃度に滅菌水を用いて希釈したものを、それぞれ１μＬずつプラスのチャージを持つメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライした。その後、８０℃で２時間ベーキングした。
(3) Preparation of membrane for detection First, 1 μL each of the target sense strand RNA and antisense strand RNA diluted with sterilized water to 7 concentrations from 100 fg / μL to 50 ng / μL. The membrane was applied to a membrane having a charge (Hybond N + , manufactured by GE Healthcare Bioscience). Then, it baked at 80 degreeC for 2 hours.
（４）ハイブリダイゼーション
上記検出用メンブレンの作製で作製したメンブレンをキットに添付されているハイブリダイゼーションバッファに移し、５５℃で３０分間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、上述したマルチラベル化核酸プローブを濃度が５０ｎｇ／ｍＬとなるように添加して５５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。
(4) Hybridization The membrane prepared in the preparation of the detection membrane was transferred to the hybridization buffer attached to the kit, and prehybridization was performed at 55 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the above-described multilabeled nucleic acid probe was added so as to have a concentration of 50 ng / mL, and hybridization was carried out at 55 ° C. overnight.
（５）メンブレン洗浄
ハイブリダイゼーション後、メンブレンをＷａｓｈＩバッファ（表６）に移し、５５℃で振とうしながら１５分洗浄した。この操作を２回繰り返した。その後、ＷａｓｈＩＩバッファ（表７）にて洗浄した。この操作を２回繰り返した。
(5) Membrane washing After hybridization, the membrane was transferred to a WashI buffer (Table 6) and washed for 15 minutes while shaking at 55 ° C. This operation was repeated twice. Thereafter, it was washed with a Wash II buffer (Table 7). This operation was repeated twice.
（６）検出
ＮＴＭＴｘバッファ（表８）で室温、５分間洗浄したメンブレンをＳｔａｉｎｉｎｇ溶液（３７５μｇ／ｍＬ ＮＢＴ＋１８８μｇ／ｍＬ ＢＣＩＰ ｉｎ ＮＴＭＴｘ）に移し、室温で４時間、遮光下で発色させた。結果を図１５に示す。なお、ＮＢＴとは、Ｎｉｔｒｏ ｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅの略称であり、ＢＣＩＰは、５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｓａｌｔのことである。
(6) Detection Membranes washed with NTMTx buffer (Table 8) at room temperature for 5 minutes were transferred to a staining solution (375 μg / mL NBT + 188 μg / mL BCIP in NTMTx), and developed at room temperature for 4 hours under light shielding. The results are shown in FIG. Note that NBT is an abbreviation for Nitro blue tetrazolium chloride, and BCIP is 5-Bromo-4-chloro-3-indylphosphate, toluidine salt.
このように、Ｈｕｉｓｇｅｎ環化反応により調製したマルチラベル化プローブを用いてドットを検出することができた。まず、クリック反応の反応時間を６時間あるいは１６時間として調製した場合、４０％アルキン化ＲＮＡと１００×アジド化ＡＰの組み合わせにおいて１００ｐｇ／μＬのドットまで検出することができた。図１５より、クリック反応の時間を延ばすとより高分子量の産物が多く得られているが、検出限界に差は見られず、シグナル強度がやや向上した。同条件下における市販のＡｌｋｐｈｏｓＤｉｒｅｃｔの検出限界が１ｎｇ／μＬ程度であった（図１６参照）ので、市販プローブと同等以上の性能を有していると言える。一方、４０％と８０％アルキン化ＲＮＡとの比較においては、８０％アルキン化ＲＮＡを用いた方が検出感度が向上し、４０％アルキン化ＲＮＡと１００×アジド化ＡＰの組み合わせにおいて１０ｐｇ／μＬのドットまで検出することができた。マルチラベル化核酸プローブにおける標識部分の導入量を調整することにより、検出感度とアンチセンス（ＡＳ）鎖に対する非特異的なシグナルの生成とのバランスをとることが可能である。 Thus, dots could be detected using the multilabeled probe prepared by the Huisgen cyclization reaction. First, when the reaction time of the click reaction was adjusted to 6 hours or 16 hours, it was possible to detect up to 100 pg / μL dots in the combination of 40% alkyne RNA and 100 × azide AP. From FIG. 15, when the click reaction time was extended, more high molecular weight products were obtained, but no difference was observed in the detection limit, and the signal intensity was slightly improved. Since the detection limit of commercially available AlkphosDirect under the same conditions was about 1 ng / μL (see FIG. 16), it can be said that the performance is equivalent to or better than that of a commercially available probe. On the other hand, in the comparison between 40% and 80% alkylated RNA, the detection sensitivity was improved when 80% alkylated RNA was used, and the combination of 40% alkylated RNA and 100 × azidated AP was 10 pg / μL. Even dots could be detected. By adjusting the amount of the labeled moiety introduced in the multilabeled nucleic acid probe, it is possible to balance detection sensitivity and generation of a non-specific signal for the antisense (AS) chain.
Claims (7)
（式（１）中、Ｘは、式（５）で示される置換基を表し、式（５）中、Ｙはプロペニレン基、Ｚは炭素数１〜４８のアルキレン基、Ｗはヒドロキシル基を表す。）
(In the formula (1), X represents a substituent represented by the formula (5), wherein (5), Y is propenylene group, Z is an alkylene group of carbon number 1 to 48, W represents a hydroxyl group .)
前記核酸がＲＮＡであることを特徴とする核酸プローブ。 A nucleic acid into which a plurality of nucleoside triphosphate derivatives according to claim 1 are introduced as a structural unit,
A nucleic acid probe, wherein the nucleic acid is RNA.
前記標識部分が、酵素および蛍光色素のうち少なくとも１つであることを特徴とするマルチラベル化核酸プローブ。 The multi-labeled nucleic acid probe according to claim 3,
The multi-labeled nucleic acid probe, wherein the labeling portion is at least one of an enzyme and a fluorescent dye.
前記酵素が、超好熱菌由来の酵素であることを特徴とするマルチラベル化核酸プローブ。 The multi-labeled nucleic acid probe according to claim 4,
A multilabeled nucleic acid probe, wherein the enzyme is an enzyme derived from a hyperthermophilic bacterium.
請求項３〜５のいずれか１項に記載のマルチラベル化核酸プローブと、対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させ、結合している前記マルチラベル化核酸プローブを、前記標識部分により検出することを特徴とする標的核酸の検出方法。 A method for detecting a target nucleic acid, comprising:
A multilabeled nucleic acid probe according to any one of claims 3 to 5 and a target nucleic acid present in an object are specifically bound by a nucleic acid moiety, and the multilabeled nucleic acid probe bound thereto is A method for detecting a target nucleic acid, which comprises detecting with the labeling moiety.
請求項２に記載の核酸プローブと、対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させた後、
前記核酸プローブにおけるエチニル基と、アジド基を有し標識部分を含む標識化合物のアジド基とを反応させて複数の標識部分を導入し、結合している前記核酸プローブを、前記標識部分により検出することを特徴とする標的核酸の検出方法。 A method for detecting a target nucleic acid, comprising:
After the nucleic acid probe according to claim 2 and the target nucleic acid present in the target are specifically bound to each other by the nucleic acid moiety,
Wherein the ethynyl group in nucleic acid probe is reacted with an azide group of the labeling compound containing a labeling moiety having an azide group introduced labeling portions of the multiple, the said nucleic acid probes are attached, detected by the labeling moiety And a method for detecting a target nucleic acid.
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