JP5704481B2 - Nucleic acid detection kit - Google Patents
Nucleic acid detection kit Download PDFInfo
- Publication number
- JP5704481B2 JP5704481B2 JP2010049631A JP2010049631A JP5704481B2 JP 5704481 B2 JP5704481 B2 JP 5704481B2 JP 2010049631 A JP2010049631 A JP 2010049631A JP 2010049631 A JP2010049631 A JP 2010049631A JP 5704481 B2 JP5704481 B2 JP 5704481B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- group
- enzyme
- detection kit
- acid detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 178
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 172
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 172
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 80
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 105
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 105
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 claims description 94
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 claims description 94
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 79
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 50
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- -1 nucleoside triphosphate Chemical class 0.000 claims description 34
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 claims description 32
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 31
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 30
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 30
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 30
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 29
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims description 16
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 16
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 15
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 14
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 14
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 11
- 125000005678 ethenylene group Chemical group [H]C([*:1])=C([H])[*:2] 0.000 claims description 9
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 8
- 125000000051 benzyloxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])O* 0.000 claims description 6
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 claims description 6
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 6
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000004450 alkenylene group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000002102 aryl alkyloxo group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 claims 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 83
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 83
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 description 49
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 47
- 229950010342 uridine triphosphate Drugs 0.000 description 46
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 40
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 37
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 37
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 33
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 31
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 23
- PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N UTP Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N uridine-triphosphate Chemical group OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 19
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical group C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 15
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 15
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N dCTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 15
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Chemical group C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Triphosphate Chemical group O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 14
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 14
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical group C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 13
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 12
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 11
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 11
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- BRARRAHGNDUELT-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypicolinic acid Chemical compound OC(=O)C1=NC=CC=C1O BRARRAHGNDUELT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 8
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 8
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 7
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 7
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical group ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 5
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000000534 N(2)-L-lysino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])N([H])[H])([H])[H] 0.000 description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 5
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 4
- 125000004103 aminoalkyl group Chemical group 0.000 description 4
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 4
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC=C1O WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical class OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000004417 unsaturated alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- VHOHAIFYJIBUFF-ASCMOBCVSA-N (4S)-4-amino-5-[1-[(2S)-2-carboxy-2-(phenylmethoxycarbonylamino)ethyl]cyclohexa-2,4-dien-1-yl]-5-oxopentanoic acid Chemical compound C([C@H](NC(=O)OCC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1(C(=O)[C@H](CCC(O)=O)N)CC=CC=C1 VHOHAIFYJIBUFF-ASCMOBCVSA-N 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KHWCHTKSEGGWEX-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyadenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 KHWCHTKSEGGWEX-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxycytosine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091029845 Aminoallyl nucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 102000003693 Hedgehog Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000031 Hedgehog Proteins Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N Uridinemonophosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 2
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 2
- IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N cytidine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- IERHLVCPSMICTF-UHFFFAOYSA-N cytidine monophosphate Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(COP(O)(O)=O)O1 IERHLVCPSMICTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JSRLJPSBLDHEIO-SHYZEUOFSA-N dUMP Chemical compound O1[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 JSRLJPSBLDHEIO-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N desoxyuridine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 2
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 235000013928 guanylic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 238000010534 nucleophilic substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- XHXFXVLFKHQFAL-UHFFFAOYSA-N phosphoryl trichloride Chemical compound ClP(Cl)(Cl)=O XHXFXVLFKHQFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 2
- DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N uridine 5'-monophosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-ULQXZJNLSA-N 4-amino-1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-tritiopyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C([3H])=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-ULQXZJNLSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001007348 Arachis hypogaea Galactose-binding lectin Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N Deoxycytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1OC(CO)C(O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 241000257465 Echinoidea Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000239205 Merostomata Species 0.000 description 1
- 241001467460 Myxogastria Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101150053185 P450 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241001495137 Streptomyces mobaraensis Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- AJWDUWKCBCUZII-UHFFFAOYSA-N acetic acid 2-aminoethanol Chemical compound C(C)(=O)O.C(C)(=O)O.C(C)(=O)O.C(O)CN AJWDUWKCBCUZII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 239000005456 alcohol based solvent Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 238000012769 bulk production Methods 0.000 description 1
- 125000005569 butenylene group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007810 chemical reaction solvent Substances 0.000 description 1
- 229910001429 cobalt ion Inorganic materials 0.000 description 1
- XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N cobalt(2+) Chemical compound [Co+2] XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001295 dansyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=C2C([H])=C([H])C([H])=C(C2=C1[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- MHUWZNTUIIFHAS-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MHUWZNTUIIFHAS-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 1
- FOBPTJZYDGNHLR-UHFFFAOYSA-N diphosphorus Chemical compound P#P FOBPTJZYDGNHLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOMCKELMLXHYHH-UHFFFAOYSA-L dipotassium;phthalate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C([O-])=O GOMCKELMLXHYHH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006735 epoxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000000816 ethylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical group [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 229960004502 levodopa Drugs 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- CRVGTESFCCXCTH-UHFFFAOYSA-N methyl diethanolamine Chemical compound OCCN(C)CCO CRVGTESFCCXCTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 125000005702 oxyalkylene group Chemical group 0.000 description 1
- QWYZFXLSWMXLDM-UHFFFAOYSA-M pinacyanol iodide Chemical class [I-].C1=CC2=CC=CC=C2N(CC)C1=CC=CC1=CC=C(C=CC=C2)C2=[N+]1CC QWYZFXLSWMXLDM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 125000006410 propenylene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002572 propoxy group Chemical group [*]OC([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- GAPYKZAARZMMGP-UHFFFAOYSA-N pyridin-1-ium;acetate Chemical compound CC(O)=O.C1=CC=NC=C1 GAPYKZAARZMMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSHGUCSTWRSQAF-FJSLEGQWSA-N s-peptide Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 QSHGUCSTWRSQAF-FJSLEGQWSA-N 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003883 substance clean up Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N sulfuryl dichloride Chemical compound ClS(Cl)(=O)=O YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920000208 temperature-responsive polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000000383 tetramethylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 238000006276 transfer reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、核酸検出用キットに関する。 The present invention relates to a nucleic acid detection kit.
何らかの標識が施されたＲＮＡプローブなどの核酸プローブを用い、細胞レベルにおけるＤＮＡやＲＮＡの発現パターンを検出、可視化することによって、生命現象に関する数多くの疑問点を解明することが可能となる。細胞レベルでの遺伝子発現パターンを可視化するこのような手法をｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＩＳＨ）と言うが、この際に使用されるプローブの標識法は大別して、「放射性同位体標識法」、「蛍光抗体標識法」、「酵素抗体標識法」に分類される。歴史的には、放射性同位体を取り込ませた核酸プローブが先に確立したが、近年その取り扱いが制限されてきたこともあって、放射性同位体元素を用いない蛍光抗体標識法や酵素抗体標識法が注目されている。 By using a nucleic acid probe such as an RNA probe with some labeling and detecting and visualizing the expression pattern of DNA and RNA at the cellular level, it becomes possible to elucidate many questions regarding life phenomena. Such a technique for visualizing the gene expression pattern at the cell level is called in situ hybridization (ISH). The labeling method of the probe used at this time is roughly classified into “radioisotope labeling method”. ”,“ Fluorescent antibody labeling method ”, and“ enzyme antibody labeling method ”. Historically, nucleic acid probes incorporating radioactive isotopes have been established earlier, but due to their limited handling in recent years, fluorescent antibody labeling methods and enzyme antibody labeling methods that do not use radioactive isotopes Is attracting attention.
これらの手法は、核酸プローブ作製時に抗原やビオチンでラベル化しておき、それらを標的核酸にハイブリダイズした後、酵素もしくは蛍光物質によって標識された抗体やアビジンを用いて免疫染色法により検出するといった手法である。感度という観点から見ると、酵素反応によるシグナル増幅効果が得られる酵素抗体標識法が優れており、現在最も広く使用されている。 These techniques include labeling with antigen or biotin at the time of nucleic acid probe preparation, hybridizing them to the target nucleic acid, and then detecting by immunostaining using an antibody or avidin labeled with an enzyme or a fluorescent substance. It is. From the viewpoint of sensitivity, an enzyme antibody labeling method that provides a signal amplification effect by an enzyme reaction is excellent, and is currently most widely used.
酵素抗体標識法を利用した核酸プローブとしては、例えば、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）などの抗体認識部位で修飾したヌクレオチド誘導体を複数個ランダムに導入した抗原マルチラベル化核酸プローブが知られている。この抗原マルチラベル化核酸プローブと標的核酸とのｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションの後、抗体認識部位を認識する酵素標識化抗体との抗原−抗体反応を行い、酵素アルカリホスファターゼとのハイブリッドによる発色反応を利用して検出を行う。しかしながら、酵素標識された抗体が非常に高価であること、抗原−抗体反応に伴う操作の煩雑化や非特異吸着などによるバックグラウンドの増加など、幾つかの問題を有している。 As a nucleic acid probe using an enzyme antibody labeling method, for example, an antigen multi-labeled nucleic acid probe in which a plurality of nucleotide derivatives modified at an antibody recognition site such as digoxigenin (DIG) are randomly introduced is known. After in situ hybridization between the antigen multilabeled nucleic acid probe and the target nucleic acid, an antigen-antibody reaction with an enzyme-labeled antibody that recognizes the antibody recognition site is performed, and a color reaction by a hybrid with the enzyme alkaline phosphatase is utilized. To detect. However, the enzyme-labeled antibody has several problems such as being very expensive, complicated operation associated with the antigen-antibody reaction, and increased background due to non-specific adsorption.
一方、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、ＴＧａｓｅが認識可能なリシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有するペプチドまたはタンパク質へ、アニオン性であり、かつＴＧａｓｅが認識可能なグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する外来分子を部位特異的に連結する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。 On the other hand, by using transglutaminase (TGase), a peptide or protein having a lysine (Lys) residue or primary amine that can be recognized by TGase, and a glutamine (Gln) residue that is anionic and can recognize TGase. A method of site-specifically linking a foreign molecule having a group is known (see, for example, Patent Document 1).
本発明は、簡便かつ高感度に標的核酸を検出することができる核酸検出用キットである。 The present invention is a kit for nucleic acid detection capable of detecting a target nucleic acid with ease and high sensitivity.
本発明は、下記式（５）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸と、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）とを含む核酸検出用キットである。
（式（５）中、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、エテニレン基、−（Ｃ ２ Ｈ ４ Ｏ） ｎ −または−（Ｃ ３ Ｈ ６ Ｏ） ｎ −（ここで、ｎ＝２，４，８，１２，２４）基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であり、Ｚは、ジニトロフェニル基またはＬ−３，４−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基であり、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基である。また、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。）
The present invention is a nucleic acid detection kit comprising an enzyme substrate-modified nucleoside triphosphate represented by the following formula (5) and transglutaminase (TGase) .
(In formula (5), X and Y are each independently an ethenylene group, — (C 2 H 4 O) n — or — (C 3 H 6 O) n — (where n = 2, 4). , 8, 12, 24) which may be substituted with an alkylene group having 1 to 48 carbon atoms or an alkenylene group having 2 to 48 carbon atoms, and Z is a dinitrophenyl group or L-3,4-dihydroxy group. An alkyl group having 1 to 48 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 48 carbon atoms, an aryl group having 6 to 48 carbon atoms, an aryloxy group having 6 to 48 carbon atoms, and 7 carbon atoms, which may be substituted with a phenyl group An arylalkyl group having ˜48 or an arylalkyloxy group having 7 to 48 carbon atoms, B is a hydrogen atom or a hydroxyl group, and Y and Z are independently substituted at least one by an amino acid other than Lys. Even It has.)
また、前記核酸検出用キットにおいて、前記Ｘはエテニレン基、Ｙはメチレン基であり、Ｚはベンジルオキシ基であることが好ましい。 In the nucleic acid detection kit, X is preferably an ethenylene group, Y is a methylene group, and Z is preferably a benzyloxy group.
また、前記核酸検出用キットにおいて、酵素と、蛍光色素と、放射性同位体を含む化合物と、磁気的に検出可能な化合物と、熱的に検出可能な化合物と、電気的に検出可能な化合物とのうち少なくとも１つである標識部分を含む標識化合物を含み、前記標識化合物がリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有することが好ましい。 Further, in the nucleic acid detection kit, and enzymes, and fluorescent dyes, and compounds containing a radioactive isotope, a magnetically detectable compound, and thermally detectable compound, electrically detectable compound look containing a labeling compound containing a labeling portion is at least one of the, the labeled compound is preferably has a lysine (Lys) residue or a primary amine.
また、前記核酸検出用キットにおいて、前記リシン（Ｌｙｓ）残基が、ＭＴＧに認識されるアミノ酸配列中に存在することが好ましい。 In the nucleic acid detection kit, the lysine (Lys) residue is preferably present in an amino acid sequence recognized by MTG.
また、前記核酸検出用キットにおいて、前記標識部分が、酵素および蛍光色素のうち少なくとも１つであることが好ましい。 In the nucleic acid detection kit, the labeling part is preferably at least one of an enzyme and a fluorescent dye.
また、前記核酸検出用キットにおいて、前記酵素が、超好熱菌由来の酵素であることが好ましい。 In the nucleic acid detection kit, the enzyme is preferably an enzyme derived from a hyperthermophilic bacterium.
また、前記核酸検出用キットにおいて、前記Ｂが水素原子の場合には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのうち少なくとも１つ、前記Ｂがヒドロキシル基の場合には、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰのうち少なくとも１つを含むことが好ましい。 In the nucleic acid detection kit, when B is a hydrogen atom, at least one of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, and when B is a hydroxyl group, ATP, CTP, GTP, UTP It is preferable that at least one of them is included.
本発明では、簡便かつ高感度に標的核酸を検出することができる核酸検出用キットを提供することができる。 The present invention can provide a nucleic acid detection kit that can detect a target nucleic acid simply and with high sensitivity.
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。 Embodiments of the present invention will be described below. This embodiment is an example for carrying out the present invention, and the present invention is not limited to this embodiment.
本発明の実施の形態に係る核酸検出用キットは、下記式（１），（２），（３）または（４）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸を含む。式（１），（２），（３）または（４）において、Ａ、Ａ１またはＡ２は、リシン（Ｌｙｓ）残基またはグルタミン（Ｇｌｎ）残基以外のアミノ酸残基を含んでいてもよい。
（式（１）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
（式（２）中、Ａ１およびＡ２のうち少なくとも１つは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基で残りは水素原子を表し、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
（式（３）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
（式（４）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
The kit for detecting a nucleic acid according to an embodiment of the present invention includes an enzyme substrate-modified nucleoside triphosphate represented by the following formula (1), (2), (3) or (4). In the formula (1), (2), (3) or (4), A, A 1 or A 2 may contain an amino acid residue other than a lysine (Lys) residue or a glutamine (Gln) residue. Good.
(In the formula (1), A is a linear, branched, cyclic saturated or unsaturated alkyl group having a glutamine (Gln) residue, a lysine (Lys) residue or a primary amine, an aminoalkyl group, A substituent containing at least one of an aryl group and a heteroaryl group, and B represents a hydrogen atom or a hydroxyl group.)
(In the formula (2), at least one of A 1 and A 2 is a linear, branched, cyclic saturated or unsaturated group having a glutamine (Gln) residue, a lysine (Lys) residue or a primary amine. (Substituents containing at least one of a saturated alkyl group, aminoalkyl group, aryl group, and heteroaryl group, the remainder represents a hydrogen atom, and B represents a hydrogen atom or a hydroxyl group.)
(In the formula (3), A is a linear, branched, cyclic saturated or unsaturated alkyl group having a glutamine (Gln) residue, a lysine (Lys) residue or a primary amine, an aminoalkyl group, A substituent containing at least one of an aryl group and a heteroaryl group, and B represents a hydrogen atom or a hydroxyl group.)
(In the formula (4), A is a linear, branched, cyclic saturated or unsaturated alkyl group having a glutamine (Gln) residue, a lysine (Lys) residue or a primary amine, an aminoalkyl group, A substituent containing at least one of an aryl group and a heteroaryl group, and B represents a hydrogen atom or a hydroxyl group.)
本実施形態に係る核酸検出用キットは、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を含んでもよい。また、本実施形態に係る核酸検出用キットは、リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な化合物、熱的に検出可能な化合物および電気的に検出可能な化合物のうち少なくとも１つである標識部分を含む標識化合物を含んでもよい。さらに、本実施形態に係る核酸検出用キットは、上記式（１），（２），（３）または（４）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸においてＢが水素原子の場合には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのうち少なくとも１つを含んでもよく、Ｂがヒドロキシル基の場合には、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰのうち少なくとも１つを含んでもよい。 The nucleic acid detection kit according to the present embodiment may contain transglutaminase (TGase). In addition, the nucleic acid detection kit according to the present embodiment includes a compound having an lysine (Lys) residue, a primary amine or a glutamine (Gln) residue, an enzyme, a fluorescent dye, a radioactive isotope, and magnetic detection. A labeled compound comprising a labeling moiety that is at least one of a possible compound, a thermally detectable compound and an electrically detectable compound may be included. Furthermore, in the nucleic acid detection kit according to the present embodiment, when B is a hydrogen atom in the enzyme substrate-modified nucleoside triphosphate represented by the above formula (1), (2), (3) or (4), At least one of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP may be included, and when B is a hydroxyl group, at least one of ATP, CTP, GTP, and UTP may be included.
本実施形態に係る核酸検出用キットは、上記式（１），（２），（３）または（４）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸と、溶媒と、必要に応じてｐＨ調整剤とを含む酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸含有溶液を含むものであってもよい。また、本実施形態に係る核酸検出用キットは、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）と、溶媒と、必要に応じてｐＨ調整剤とを含むトランスグルタミナーゼ含有溶液を含んでもよい。また、本実施形態に係る核酸検出用キットは、リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な化合物、熱的に検出可能な化合物および電気的に検出可能な化合物のうち少なくとも１つである標識部分を含む標識化合物と、溶媒と、必要に応じてｐＨ調整剤とを含む標識化合物含有溶液を含んでもよい。さらに、本実施形態に係る核酸検出用キットは、上記式（１），（２），（３）または（４）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸においてＢが水素原子の場合には、ｄＡＴＰと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むｄＡＴＰ含有溶液、ｄＣＴＰと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むｄＣＴＰ含有溶液、ｄＧＴＰと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むｄＧＴＰ含有溶液、ｄＴＴＰと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むｄＴＴＰ含有溶液のうち少なくとも１つを含んでもよく、Ｂがヒドロキシル基の場合には、ＡＴＰと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むＡＴＰ含有溶液、ＣＴＰと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むＣＴＰ含有溶液、ＧＴＰと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むＧＴＰ含有溶液、ＵＴＰと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むＵＴＰ含有溶液のうち少なくとも１つを含んでもよい。 The kit for nucleic acid detection according to this embodiment includes an enzyme substrate-modified nucleoside triphosphate represented by the above formula (1), (2), (3) or (4), a solvent, and a pH adjuster as necessary. And an enzyme substrate-modified nucleoside triphosphate-containing solution. Moreover, the nucleic acid detection kit according to the present embodiment may include a transglutaminase-containing solution containing transglutaminase (TGase), a solvent, and, if necessary, a pH adjuster. In addition, the nucleic acid detection kit according to the present embodiment includes a compound having an lysine (Lys) residue, a primary amine or a glutamine (Gln) residue, an enzyme, a fluorescent dye, a radioactive isotope, and magnetic detection. Containing a labeling compound comprising a labeling moiety that is at least one of a possible compound, a thermally detectable compound and an electrically detectable compound, a solvent, and optionally a pH adjusting agent It may contain a solution. Furthermore, in the nucleic acid detection kit according to the present embodiment, when B is a hydrogen atom in the enzyme substrate-modified nucleoside triphosphate represented by the above formula (1), (2), (3) or (4), a dATP-containing solution containing dATP, a solvent and, if necessary, a pH adjusting agent, a dCTP-containing solution containing dCTP, a solvent and, if necessary, a pH adjusting agent, a dGTP, a solvent, and a pH adjusting agent if necessary It may contain at least one of dGTP-containing solution, dTTP-containing solution containing dTTP, a solvent and, if necessary, a pH adjusting agent. When B is a hydroxyl group, ATP, a solvent and pH adjustment as necessary ATP-containing solution containing an agent, a CTP-containing solution containing CTP, a solvent and, if necessary, a pH adjusting agent, a GTP-containing solution containing a GTP, a solvent and, if necessary, a pH adjusting agent, UTP It may include at least one of UTP containing solution optionally with medium containing a pH adjusting agent.
本実施形態に係る核酸検出用キットは、上記式（１），（２），（３）または（４）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸と、Ｂが水素原子の場合には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのうち少なくとも１つと、溶媒と、必要に応じてｐＨ調整剤とを含むヌクレオシド三リン酸含有溶液を含んでもよく、Ｂがヒドロキシル基の場合には、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰのうち少なくとも１つと、溶媒と、必要に応じてｐＨ調整剤とを含むヌクレオシド三リン酸含有溶液を含むものであってもよい。 The kit for nucleic acid detection according to the present embodiment comprises dATP when the enzyme substrate-modified nucleoside triphosphate represented by the above formula (1), (2), (3) or (4) and B is a hydrogen atom. , DCTP, dGTP, dTTP, and a nucleoside triphosphate-containing solution containing a solvent and, if necessary, a pH adjuster. When B is a hydroxyl group, ATP, CTP, GTP , A solution containing a nucleoside triphosphate containing at least one of UTP, a solvent, and, if necessary, a pH adjusting agent.
本発明者らは、核酸プローブに複数の酵素を共有結合的に導入する手法として、微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）などのトランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）が有する部位特異的なタンパク質修飾能に着目した。ＴＧａｓｅはアシル転移反応を触媒する酵素であり、例えば、タンパク質中の特定のＧｌｎ残基（Ｑ）のγ−カルボキシアミド基と、Ｌｙｓ残基（Ｋ）のε−アミノ基や各種一級アミンとの共有結合を触媒する酵素である。このＴＧａｓｅを用いて、複数の標識酵素などの標識部分を導入したマルチラベル化核酸プローブの創製を行うことができる。 The present inventors paid attention to the site-specific protein modification ability of transglutaminase (TGase) such as microorganism-derived transglutaminase (MTG) as a technique for covalently introducing a plurality of enzymes into a nucleic acid probe. TGase is an enzyme that catalyzes an acyl transfer reaction. For example, TGase includes a γ-carboxyamide group of a specific Gln residue (Q) in a protein, an ε-amino group of a Lys residue (K), and various primary amines. An enzyme that catalyzes a covalent bond. Using this TGase, a multi-labeled nucleic acid probe into which a labeling moiety such as a plurality of labeling enzymes has been introduced can be created.
具体的には、例えば、図１に示す、ウリジン三リン酸（ｕｒｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＵＴＰ）に、ＴＧａｓｅが認識するＧｌｎ（ＭＴＧ認識Ｇｌｎ）を有するＺ−ＱＧを結合させたヌクレオチド誘導体であるＺ−ＱＧ−ＵＴＰを、図２に示すように、核酸プローブとなるＲＮＡを調製する際に取り込ませることによって、ＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎが複数箇所導入されたＺ−ＱＧ ＲＮＡを調製する。その後、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＬｙｓなどのＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓを導入した標識酵素などの標識化合物を結合させることによって、ＲＮＡと標識酵素などの標識部分が１：ｎ（ｎは２以上の整数）であるマルチラベル化核酸プローブを創製することができる。 Specifically, for example, as shown in FIG. 1, Z-QG is a nucleotide derivative in which Z-QG having Gln (MTG recognition Gln) recognized by TGase is bound to uridine triphosphate (UTP). As shown in FIG. 2, Z-QG RNA into which a plurality of TGase recognition Gln are introduced is prepared by incorporating -UTP when preparing RNA as a nucleic acid probe. Then, by using a TGase such as MTG to bind a labeling compound such as a labeling enzyme introduced with a TGase recognition Lys such as MTG recognition Lys, the labeling portion such as RNA and the labeling enzyme is 1: n (n is 2 or more). Multilabeled nucleic acid probes can be created.
このマルチラベル化核酸プローブは、ターゲットとなる標的核酸にハイブリダイズした後、直ちに検出反応を行うことができるため、既存の手法と比較して、操作の大幅な簡素化、バックグラウンドの低下、バルク酵素である微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）を用いることによるコストの抑制などが見込まれる。 This multi-labeled nucleic acid probe can perform a detection reaction immediately after hybridizing to the target nucleic acid. Therefore, compared to existing methods, the operation is greatly simplified, the background is reduced, and the bulk Cost reduction by using microorganism-derived transglutaminase (MTG), which is an enzyme, is expected.
なお、図２において、核酸プローブにおけるＧｌｎ残基と、標識化合物におけるＬｙｓ残基とは逆であってもよい。すなわち、ＴＧａｓｅが認識するＬｙｓ（ＭＴＧ認識Ｌｙｓ）を有するヌクレオシド三リン酸誘導体を、核酸プローブとなるＲＮＡを調製する際に取り込ませることによって、ＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓが複数箇所導入された核酸プローブを調製する。その後、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＧｌｎなどのＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎを導入した標識化合物を結合させることによって、ＲＮＡと標識部分が１：ｎ（ｎは２以上の整数）であるマルチラベル化核酸プローブを創製してもよい。 In FIG. 2, the Gln residue in the nucleic acid probe and the Lys residue in the labeled compound may be reversed. That is, a nucleoside triphosphate derivative having Lys recognized by TGase (MTG recognition Lys) is incorporated during preparation of RNA to be a nucleic acid probe, thereby preparing a nucleic acid probe having a plurality of TGase recognition Lys introduced therein. . Then, by using a TGase such as MTG, a labeled compound into which a TGase recognition Gln such as an MTG recognition Gln is introduced is bound to form a multilabel where the RNA and the labeling moiety are 1: n (n is an integer of 2 or more). Nucleic acid probes may be created.
また、図３に示すように、Ｚ−ＱＧ ＲＮＡなどの核酸プローブをターゲットとなる標的核酸にハイブリダイズした後、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＬｙｓなどのＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓを導入した標識酵素などの標識化合物を結合させてもよい。ＲＮＡと標識酵素などの標識部分が１：ｎ（ｎは２以上の整数）となり、このように導入した標識部分の検出反応を行うことにより、既存の手法と比較して、操作の大幅な簡素化、バックグラウンドの低下、バルク酵素である微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）を用いることによるコストの抑制などが見込まれる。 Moreover, as shown in FIG. 3, after hybridizing a nucleic acid probe such as Z-QG RNA to a target nucleic acid as a target, a labeling enzyme into which TGase recognition Lys such as MTG recognition Lys is introduced using TGase such as MTG. A labeling compound such as may be bound. The labeling part such as RNA and labeling enzyme becomes 1: n (n is an integer of 2 or more). By performing the detection reaction of the introduced labeling part in this way, the operation is greatly simplified compared to existing methods. , Reduction of background, and cost reduction by using microorganism-derived transglutaminase (MTG), which is a bulk enzyme, are expected.
なお、図３において、核酸プローブにおけるＧｌｎ残基と、標識化合物におけるＬｙｓ残基とは逆であってもよい。すなわち、ＴＧａｓｅが認識するＬｙｓ（ＭＴＧ認識Ｌｙｓ）を有するヌクレオシド三リン酸誘導体を合成し、核酸プローブとなるＲＮＡを調製する際に取り込ませることによって、ＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓが複数箇所導入された核酸プローブを調製する。その後、核酸プローブをターゲットとなる標的核酸にハイブリダイズした後、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＧｌｎなどのＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎを導入した標識化合物を結合させてもよい。 In FIG. 3, the Gln residue in the nucleic acid probe and the Lys residue in the labeled compound may be reversed. That is, by synthesizing a nucleoside triphosphate derivative having Lys (MTG recognition Lys) recognized by TGase and incorporating RNA when preparing a nucleic acid probe, a nucleic acid probe having a plurality of TGase recognition Lys introduced therein is obtained. Prepare. Then, after hybridizing the nucleic acid probe to the target nucleic acid as a target, a labeled compound into which TGase recognition Gln such as MTG recognition Gln is introduced may be bound using TGase such as MTG.
本実施形態に係る核酸検出用キットを用いて、ＱＧ基を導入した核酸とＮ末端にＫ残基等を有する酵素を、ＭＴＧを用いて結合させることにより、容易に酵素標識核酸を得ることができる。また、ＤＮＡ、ＲＮＡの両方に標識することができる。酵素標識した核酸プローブは、フィルターハイブリダイゼーションやＩＳＨなどの核酸検出アッセイに用いることができる。 Using the nucleic acid detection kit according to this embodiment, an enzyme-labeled nucleic acid can be easily obtained by binding a nucleic acid introduced with a QG group and an enzyme having a K residue or the like at the N-terminus using MTG. it can. Moreover, both DNA and RNA can be labeled. The enzyme-labeled nucleic acid probe can be used for nucleic acid detection assays such as filter hybridization and ISH.
＜酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸＞
本実施形態に係る核酸検出用キットに含まれる酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸は、ＴＧａｓｅが認識可能なグルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する上記式（１），（２），（３）または（４）で示されるヌクレオシド三リン酸である。上記式（１），（２），（３）または（４）で示されるヌクレオシド三リン酸は、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、ウリジン三リン酸（ｕｒｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＵＴＰ）誘導体、アデノシン三リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＡＴＰ）誘導体、グアノシン三リン酸（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＧＴＰ）誘導体、シチジン三リン酸（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＣＴＰ）誘導体、デオキシウリジン三リン酸（ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＵＴＰ）誘導体、デオキシアデノシン三リン酸（ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＡＴＰ）誘導体、デオキシグアノシン三リン酸（ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＧＴＰ）誘導体、デオキシシチジン三リン酸（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＣＴＰ）誘導体である。本実施形態に係る酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸において、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンは、ウラシル、アデニン、グアニン、シトシンの部分に直接または置換基を介して結合されている。
<Enzyme substrate modified nucleoside triphosphate>
The enzyme substrate-modified nucleoside triphosphate contained in the nucleic acid detection kit according to the present embodiment has a glutamine (Gln) residue, a lysine (Lys) residue, or a primary amine that can be recognized by TGase (1 ), (2), (3) or (4). The nucleoside triphosphate represented by the above formula (1), (2), (3) or (4) is a uridine triphosphate having a glutamine (Gln) residue, a lysine (Lys) residue or a primary amine. Acid (uridine triphosphate: UTP) derivative, adenosine triphosphate (ATP) derivative, guanosine triphosphate (GTP) derivative, cytidine triphosphate (CTP) triphosphate derivative: CTP (Deoxyuridine triphosphate: dUTP) derivative, deoxyadenosine triphosphate (dATP) derivative, deo Shiguanoshin triphosphate (deoxyguanosine triphosphate: dGTP) derivatives, deoxycytidine triphosphate (deoxycytidine triphosphate: dCTP) derivatives. In the enzyme substrate-modified nucleoside triphosphate according to the present embodiment, the glutamine (Gln) residue, lysine (Lys) residue or primary amine is directly or via a substituent on the uracil, adenine, guanine, or cytosine moiety. Are combined.
これらの酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸は、ＵＴＰ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰまたはそれらの各種誘導体から得ることができる。 These enzyme substrate-modified nucleoside triphosphates can be obtained from UTP, ATP, GTP, CTP, dUTP, dATP, dGTP, dCTP, or various derivatives thereof.
また、これらの酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸は、ウリジン、ウリジンの一リン酸（ＵＭＰ）および二リン酸（ＵＤＰ）、アデノシン、アデノシンの一リン酸（ＡＭＰ）および二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン、グアノシンの一リン酸（ＧＭＰ）および二リン酸（ＧＤＰ）、シチジン、シチジンの一リン酸（ＣＭＰ）および二リン酸（ＣＤＰ）、デオキシウリジン、デオキシウリジンの一リン酸（ｄＵＭＰ）および二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシアデノシン、デオキシアデノシンの一リン酸（ｄＡＭＰ）および二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシグアノシン、デオキシグアノシンの一リン酸（ｄＧＭＰ）および二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシシチジン、デオキシシチジンの一リン酸（ｄＣＭＰ）および二リン酸（ｄＣＤＰ）ならびにそれらの各種誘導体から得てもよい。 These enzyme substrate modified nucleoside triphosphates are uridine, uridine monophosphate (UMP) and diphosphate (UDP), adenosine, adenosine monophosphate (AMP) and diphosphate (ADP), guanosine. Guanosine monophosphate (GMP) and diphosphate (GDP), cytidine, cytidine monophosphate (CMP) and diphosphate (CDP), deoxyuridine, deoxyuridine monophosphate (dUMP) and diphosphorus Acid (dUDP), deoxyadenosine, deoxyadenosine monophosphate (dAMP) and diphosphate (dADP), deoxyguanosine, deoxyguanosine monophosphate (dGMP) and diphosphate (dGDP), deoxycytidine, deoxycytidine Monophosphate (dCMP) and diphosphate (dCDP) and It may be obtained from various derivatives of al.
例えば、ウリジン、アデノシン、グアノシン、シチジン、デオキシウリジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジンのリン酸化酵素などによるリン酸化（例えば、生物工学会誌，８５（９），ｐ３９７−３９９（２００７）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８７（６），ｐ．７３２−７３８（１９９９）など参照）や、プロトンスポンジ存在下でのオキシ塩化リンなどによるリン酸化（例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２９（３６），ｐ．４５２５−４５２８（１９８８）など参照）などによって、それらの三リン酸体を得ることができる。 For example, phosphorylation of uridine, adenosine, guanosine, cytidine, deoxyuridine, deoxyadenosine, deoxyguanosine, deoxycytidine phosphorylase, etc. (for example, Journal of Biotechnology, 85 (9), p397-399 (2007), Journal of Bioscience and Bioengineering, 87 (6), p. 732-738 (1999), etc.) or phosphorylation with phosphorus oxychloride in the presence of a proton sponge (for example, Tetrahedron Letters, 29 (36), p. 4525- 4528 (1988) and the like) and the triphosphates can be obtained.
上記式（１）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸は、下記式（５）で示される、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有するＴＧａｓｅ基質修飾ヌクレオチド三リン酸であることが好ましい。
式（５）中、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基などの炭素数１〜４８のアルキレン基、エテニレン基、プロペニレン基、ブテニレン基などの炭素数２〜４８のアルケニレン基などが挙げられる。これらのうち、Ｘ，Ｙは、それぞれ独立して炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基、炭素数１〜４８のアルコキシ基であることが好ましく、Ｘはエテニレン基、Ｙはメチレン基であることがより好ましい。Ｘ，Ｙはさらにエテニレン基、オキシアルキレン基、例えば−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−または−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｎ−（ｎは繰り返し数でありｎ＝２，４，８，１２，２４）基などで置換されていてもよい。 In the formula (5), X and Y are each independently a carbon number such as an alkylene group having 1 to 48 carbon atoms such as a methylene group, an ethylene group, a propylene group, or a butylene group, an ethenylene group, a propenylene group, or a butenylene group. Examples include 2-48 alkenylene groups. Among these, X and Y are each independently preferably an alkylene group having 1 to 48 carbon atoms, an alkenylene group having 2 to 48 carbon atoms, or an alkoxy group having 1 to 48 carbon atoms, and X is an ethenylene group, More preferably, Y is a methylene group. X and Y are further an ethenylene group, an oxyalkylene group, such as — (C 2 H 4 O) n — or — (C 3 H 6 O) n — (n is a repeating number, and n = 2, 4, 8, 12 , 24) may be substituted with a group or the like.
Ｚで表される置換基としては、メチル基、エチル基、プロピル基などの炭素数１〜４８のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基、プロピオキシ基などの炭素数１〜４８のアルコキシ基、フェニル基、ナフチル基などの炭素数６〜４８のアリール基、フェニルオキシ基などの炭素数６〜４８のアリールオキシ基、ベンジル基などの炭素数７〜４８のアリールアルキル基、ベンジルオキシ基などの炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基などが挙げられる。これらのうち、Ｚは、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基であることが好ましく、Ｚはベンジルオキシ基であることがより好ましい。Ｚはさらにジニトロフェニル基、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニル基などで置換されていてもよい。また、上述したＹで表される置換との組み合わせで、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。Ｂは水素原子またはヒドロキシル基である。 Examples of the substituent represented by Z include an alkyl group having 1 to 48 carbon atoms such as a methyl group, an ethyl group and a propyl group, an alkoxy group having 1 to 48 carbon atoms such as a methoxy group, an ethoxy group and a propoxy group, and a phenyl group. , An aryl group having 6 to 48 carbon atoms such as a naphthyl group, an aryloxy group having 6 to 48 carbon atoms such as a phenyloxy group, an arylalkyl group having 7 to 48 carbon atoms such as a benzyl group, and a carbon number such as a benzyloxy group Examples include 7 to 48 arylalkyloxy groups. Among these, Z is an alkyl group having 1 to 48 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 48 carbon atoms, an aryl group having 6 to 48 carbon atoms, an aryloxy group having 6 to 48 carbon atoms, and a 7 to 48 carbon atom. It is preferably an arylalkyl group or an arylalkyloxy group having 7 to 48 carbon atoms, and Z is more preferably a benzyloxy group. Z may be further substituted with a dinitrophenyl group, an L-3,4-dihydroxyphenyl group, or the like. In combination with the substitution represented by Y described above, at least one of Y and Z may be independently substituted with an amino acid other than Lys. B is a hydrogen atom or a hydroxyl group.
Ｘを適宜選択することにより、Ｚ−ＱＧとＵＴＰとを連結するリンカー部位の構造を最適化し、例えば柔軟なリンカー部位を導入することで、酵素などのアクセスを向上することができる。また、Ｙ，Ｚを適宜選択することにより、基質ペプチド配列を最適化し、例えば酵素などの親和性を向上することができる。 By appropriately selecting X, the structure of the linker site that links Z-QG and UTP can be optimized, and for example, by introducing a flexible linker site, access to enzymes and the like can be improved. In addition, by appropriately selecting Y and Z, the substrate peptide sequence can be optimized, and for example, the affinity of an enzyme or the like can be improved.
微生物由来ＴＧａｓｅ（ＭＴＧ）を用いる場合、ＭＴＧが認識可能なＧｌｎ残基は、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミルグリシン（Ｚ−ＱＧ）として存在することが好ましい。Ｚ−ＱＧは、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）などよりも分子サイズが小さいため好ましい。式（５）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸において、Ｂがヒドロキシル基、Ｘがエテニレン基、Ｙがメチレン基、Ｚがベンジルオキシ基であるヌクレオチド誘導体が、ＵＴＰにＺ−ＱＧを結合させたヌクレオチド誘導体Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰである。Ｂが水素原子、Ｘがエテニレン基、Ｙがメチレン基、Ｚがベンジルオキシ基であるヌクレオチド誘導体が、ｄＵＴＰにＺ−ＱＧを結合させたヌクレオチド誘導体Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰである。また、酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸中には、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基または第一級アミンが共存しないようなものを選択することが好ましい。共存する場合には、ＴＧａｓｅにより、自己架橋する可能性があり、目的のマルチラベル化核酸プローブの収率に好ましくない影響を与える場合があるからである。 When microorganism-derived TGase (MTG) is used, the Gln residue that can be recognized by MTG is preferably present as benzyloxycarbonyl-L-glutamylglycine (Z-QG). Z-QG is preferable because it has a smaller molecular size than digoxigenin (DIG) or the like. In the enzyme substrate-modified nucleoside triphosphate represented by the formula (5), a nucleotide derivative in which B is a hydroxyl group, X is an ethenylene group, Y is a methylene group, and Z is a benzyloxy group allows Z-QG to bind to UTP. The nucleotide derivative Z-QG-UTP. A nucleotide derivative in which B is a hydrogen atom, X is an ethenylene group, Y is a methylene group, and Z is a benzyloxy group is a nucleotide derivative Z-QG-dUTP in which Z-QG is bonded to dUTP. In addition, it is preferable to select an enzyme substrate-modified nucleoside triphosphate that does not co-exist with a Lys residue or primary amine that can be recognized by TGase. In the case of coexistence, TGase may cause self-crosslinking, which may adversely affect the yield of the target multilabeled nucleic acid probe.
また、微生物由来ＴＧａｓｅの良基質として、ＬＬＱＧ（配列番号：１）、ＬＡＱＧ（配列番号：２）、ＬＧＱＧ（配列番号：３）、ＰＬＡＱＳＨ（配列番号：４）、ＦＥＲＱＨＭＤＳ（配列番号：５）、もしくはＴＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号：６）のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＧＬＧＱＧＧＧ（配列番号：７）、ＧＦＧＱＧＧＧ（配列番号：８）、ＧＶＧＱＧＧＧ（配列番号：９）、もしくはＧＧＬＱＧＧＧ（配列番号：１０）のアミノ酸配列からなるペプチドが知られている。また、ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ ｌｉｖｅｒ由来のＴＧａｓｅの良基質として、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミルフェニルアラニン（Ｚ−ＱＦ）、またはＥＡＱＱＩＶＭ（配列番号：１１）のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＧＧＧＱＬＧＧ（配列番号：１２）、ＧＧＧＱＶＧＧ（配列番号：１３）、ＧＧＧＱＲＧＧ（配列番号：１４）、ＧＱＱＱＬＧ（配列番号：１５）、ＰＮＰＱＬＰＦ（配列番号：１６）もしくはＰＫＰＱＱＦＭ（配列番号：１７）のアミノ酸配列からなるペプチドが知られている。ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基は、用いるＴＧａｓｅの種類に応じ、このようなペプチドとして存在してもよい。 Moreover, as a good substrate of microorganism-derived TGase, LLQG (SEQ ID NO: 1), LAQG (SEQ ID NO: 2), LGQG (SEQ ID NO: 3), PLAQSH (SEQ ID NO: 4), FERQHMDS (SEQ ID NO: 5), Alternatively, a peptide consisting of the amino acid sequence of TEQKLISEEDL (SEQ ID NO: 6), or an amino acid of GLGQGGG (SEQ ID NO: 7), GGGQGGG (SEQ ID NO: 8), GVGQGGGG (SEQ ID NO: 9), or GGLQGGGG (SEQ ID NO: 10) Peptides consisting of sequences are known. Further, as a good substrate for TGase derived from guinea pig river, a peptide consisting of an amino acid sequence of benzyloxycarbonyl-L-glutamylphenylalanine (Z-QF) or EAQQIVM (SEQ ID NO: 11), or GGGQLGGG (SEQ ID NO: 12) , GGGQVGG (SEQ ID NO: 13), GGGQRGG (SEQ ID NO: 14), GQQQLG (SEQ ID NO: 15), PNPQLPF (SEQ ID NO: 16) or PKPQQFM (SEQ ID NO: 17) is known. Yes. A Gln residue that can be recognized by TGase may exist as such a peptide depending on the type of TGase used.
また、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基は、ＦＹＰＬＱＭＲ（配列番号：２７）、ＹＰＬＱＭＲ（配列番号：２８）、ＰＬＱＭＲ（配列番号：２９）、ＦＹＰＬＱＭＧ（配列番号：３０）、ＹＰＬＱＭＧ（配列番号：３１）、ＹＰＬＱＭ（配列番号：３２）、ＰＬＱＭＧ（配列番号：３３）、ＦＹＰＬＱＧ（配列番号：３４）、ＹＰＬＱＧ（配列番号：３５）またはＰＬＱＧ（配列番号：３６）のアミノ酸配列からなるペプチドとして存在してもよい。これにより、ＴＧａｓｅによる架橋反応の反応性が高くなる。 Gln residues that can be recognized by TGase are FYPLQMR (SEQ ID NO: 27), YPLQMR (SEQ ID NO: 28), PLQMR (SEQ ID NO: 29), FYPLQMG (SEQ ID NO: 30), YPLQMG (SEQ ID NO: 31). ), YPLQM (SEQ ID NO: 32), PLQMG (SEQ ID NO: 33), FYPLQG (SEQ ID NO: 34), YPLQG (SEQ ID NO: 35) or a peptide consisting of the amino acid sequence of PLQG (SEQ ID NO: 36). May be. Thereby, the reactivity of the crosslinking reaction by TGase becomes high.
なお、Ｎ末端がグリシン（Ｇ）である基質ペプチドは、Ｎ末端アミノ基がＴＧａｓｅの基質になりうるため、自己架橋による副産物が生じうる。したがって、Ｎ末端がグリシン（Ｇ）である基質ペプチドについては、Ｎ末端アミノ基の水素を適切な基で置換することによりＴＧａｓｅの基質とはならないように保護して、所望の連結を行うことができるようにするとよい。なお、本明細書において「Ｎ末端保護」というときは、特別な場合を除き、このような意味で用いている。そして、Ｎ末端保護の手段により、反応性が異なることが知られている。詳細には、ほ乳類由来ＴＧａｓｅに関して、ＧＱＱＱＬＧのＮ末端アセチル化による保護（すなわち、Ａｃ−ＧＱＱＱＬＧ）、またＮ末端アミノ酸をＤＯＰＡ（Ｌ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）にする（すなわち、ＤＯＰＡ−ＧＱＱＱＬＧ）と反応性が向上することが知られている。このような保護の例を、本実施形態においても利用することができる。 In addition, since the N-terminal amino group can be a substrate for TGase in the substrate peptide whose N-terminus is glycine (G), a by-product due to self-crosslinking can occur. Therefore, for a substrate peptide whose N-terminus is glycine (G), it can be protected from becoming a substrate for TGase by replacing the hydrogen of the N-terminal amino group with an appropriate group, and desired ligation can be performed. You should be able to do it. In the present specification, “N-terminal protection” is used in this sense except in special cases. It is known that the reactivity varies depending on the N-terminal protection means. Specifically, with regard to mammalian-derived TGase, protection by G-terminal Q-acetylation of GQQQLG (ie, Ac-GQQQLG) and N-terminal amino acid as DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine) (ie, DOPA-GQQQLG) It is known that the reactivity is improved. Examples of such protection can also be used in this embodiment.
Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの調製方法を図４に示す。これは、本実施形態に係る酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸の調製方法の一例であって、これに限定されるものではない。 A method for preparing Z-QG-UTP is shown in FIG. This is an example of a method for preparing the enzyme substrate-modified nucleoside triphosphate according to the present embodiment, and is not limited thereto.
まず、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミルグリシン（Ｚ−ＱＧ）にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：ＮＨＳ）基などを導入し、活性化しておく（ＮＨＳ化Ｚ−ＱＧ）。そして、アミノアリルＵＴＰなどの末端をアミノ化した置換基を有するＵＴＰと、ＮＨＳ化Ｚ−ＱＧとを縮合することにより、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰを得ることができる。 First, an N-hydroxysuccinimide (NHS) group or the like is introduced into benzyloxycarbonyl-L-glutamylglycine (Z-QG) and activated (NHS-ized Z-QG). And Z-QG-UTP can be obtained by condensing UTP which has the substituent which aminated terminal, such as aminoallyl UTP, and NHS-ized Z-QG.
また、Ｃ末端のカルボキシル基を活性エステル化する上述の方法に加えて、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を有するペプチドをＵＴＰに導入する方法として、アミノ基と反応性の高い官能基をペプチドに導入する方法がある。例えば、アルデヒド化、アシルアジド化、スルフォニルクロライド化、エポキシ化、イソシアネート化、またはイソチオシアネート化した基質ペプチドを調製できれば、これをアミノ化ＵＴＰと反応させることにより、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を有するＵＴＰを調製することができる。ただし、これらの反応性官能基は、基質ペプチドにおいてＴＧａｓｅ認識に影響がない部分に導入する必要がある。したがって、上述のように、Ｇｌｎ残基とは離れたＣ末端のカルボキシル基を活性化する方法は、この目的において最も優れたものの一つである。 In addition to the above-described method for active esterification of the C-terminal carboxyl group, as a method for introducing a peptide having a Gln residue that can be recognized by TGase into UTP, a functional group highly reactive with an amino group is added to the peptide. There is a way to introduce. For example, if an aldehyded, acylazidated, sulfonyl chlorided, epoxidized, isocyanated, or isothiocyanated substrate peptide can be prepared, it can be reacted with aminated UTP to have a Gln residue that can be recognized by TGase. UTP can be prepared. However, these reactive functional groups need to be introduced into a portion of the substrate peptide that does not affect TGase recognition. Therefore, as described above, the method of activating the C-terminal carboxyl group separated from the Gln residue is one of the most excellent for this purpose.
また、例えば、ＰＬＱＭＲのアミノ酸配列からなるペプチドをｄＵＴＰに導入したＡｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰは、例えば、アルデヒド化、アシルアジド化、スルフォニルクロライド化、エポキシ化、イソシアネート化、またはイソチオシアネート化した基質ペプチドにＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基などを導入し、活性化しておき、アミノアリルｄＵＴＰなどの末端をアミノ化した置換基を有するｄＵＴＰと縮合することによって、得ることができる。 In addition, for example, Ac-PLQMR-dUTP in which a peptide consisting of the amino acid sequence of PLQMR is introduced into dUTP is obtained by adding N to a substrate peptide obtained by, for example, aldehyde formation, acylazidation, sulfonyl chloride formation, epoxidation, isocyanate formation, or isothiocyanate formation. It can be obtained by introducing a hydroxysuccinimide (NHS) group or the like, activating it, and condensing with dUTP having a substituent which is aminated at the end such as aminoallyl dUTP.
Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰ等の精製は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ゲル濾過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）などにより行うことができる。また、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰ等の同定は、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ、ＮＭＲ、ＩＲなどにより行うことができる。また、ＨＰＬＣにより、生成物の確認および収率を求めることができる。 Purification of Z-QG-UTP and the like can be performed by high performance liquid chromatography (HPLC), gel filtration chromatography (GPC) and the like. Moreover, identification of Z-QG-UTP etc. can be performed by MALDI TOF-MS, NMR, IR, etc. Moreover, confirmation and a yield of a product can be calculated | required by HPLC.
＜ＴＧａｓｅ基質マルチラベル化核酸＞
本実施形態に係る核酸検出キットを用いて調製することができるＴＧａｓｅ基質マルチラベル化核酸は、構成単位として、上記式（１）〜（５）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸が複数個導入されているＴＧａｓｅ基質マルチラベル化核酸であり、核酸部分が、検出対象である標的核酸の標的分子特異的配列の全部または一部に相補的な配列を有するものである。
<TGase substrate multi-labeled nucleic acid>
The TGase substrate multilabeled nucleic acid that can be prepared using the nucleic acid detection kit according to the present embodiment includes a plurality of enzyme substrate-modified nucleoside triphosphates represented by the above formulas (1) to (5) as structural units. An introduced TGase substrate multi-labeled nucleic acid, wherein the nucleic acid portion has a sequence complementary to all or part of the target molecule-specific sequence of the target nucleic acid to be detected.
核酸には、ＤＮＡ、ＰＮＡおよびＲＮＡが含まれる。核酸の配列および長さには特に制限はない。長さに関しては、例えば少なくとも２０ｍｅｒ程度であればよい。 Nucleic acids include DNA, PNA and RNA. There is no particular limitation on the sequence and length of the nucleic acid. For example, the length may be at least about 20 mer.
例えば、本実施形態に係る核酸検出キットに含まれるＺ−ＱＧ−ＵＴＰを基質として、ＲＮＡポリメラーゼ活性のある酵素を用いて複数のＺ−ＱＧ−ＵＴＰを取り込ませて、ＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎが複数箇所に導入され、所望の配列を有するＴＧａｓｅ基質マルチラベル化核酸プローブＺ−ＱＧ ＲＮＡ（図２）を調製することができる。 For example, Z-QG-UTP contained in the nucleic acid detection kit according to the present embodiment is used as a substrate, a plurality of Z-QG-UTPs are incorporated using an enzyme having RNA polymerase activity, and TGase recognition Gln is present at a plurality of locations. A TGase substrate multi-labeled nucleic acid probe Z-QG RNA (FIG. 2) introduced and having the desired sequence can be prepared.
＜マルチラベル化核酸プローブ＞
本実施形態に係るマルチラベル化核酸プローブは、上記核酸プローブにおける構成単位である酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸のグルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンのうち少なくとも２つに、リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有し標識部分を含む標識化合物を結合して構成することができる。マルチラベル化核酸プローブは、例えば、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＧｌｎなどのＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎが複数箇所に導入された核酸プローブＺ−ＱＧ ＲＮＡに、ＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓを導入した標識酵素などを結合させることによって、ＲＮＡと標識酵素などの標識部分が１：ｎであるマルチラベル化核酸プローブを創製することができる（図２）。
<Multi-labeled nucleic acid probe>
The multi-labeled nucleic acid probe according to this embodiment is a glutamine (Gln) residue, a lysine (Lys) residue or a primary amine of an enzyme substrate-modified nucleoside triphosphate that is a constituent unit in the nucleic acid probe. Alternatively, a labeling compound having a lysine (Lys) residue or primary amine or glutamine (Gln) residue and containing a labeling moiety can be bound. The multi-labeled nucleic acid probe is, for example, a labeling enzyme in which TGase recognition Lys is introduced into a nucleic acid probe Z-QG RNA in which TGase recognition Gln such as MTG recognition Gln is introduced at a plurality of locations using TGase such as MTG. By binding, a multi-labeled nucleic acid probe having a labeling portion such as RNA and a labeling enzyme of 1: n can be created (FIG. 2).
ＲＮＡと標識酵素などの標識部分との比率ｎは、２以上であれば特に制限はなく、適宜調整することができるが、ｎが大きいほど検出感度が高くなり好ましい。ただし、ｎが大きすぎると、標的核酸とのハイブリダイゼーションの効率が低下する場合がある。 The ratio n between the RNA and a labeling moiety such as a labeling enzyme is not particularly limited as long as it is 2 or more, and can be adjusted as appropriate. However, if n is too large, the efficiency of hybridization with the target nucleic acid may decrease.
また、例えば、以下の方法により、異なる標識酵素、異なる蛍光色素などの異なる標識部分を有する複数のマルチラベル化核酸プローブを調製することができる。
（１）ＴＧａｓｅの由来を変える。
（２）ＴＧａｓｅの基質特異性を変える。
In addition, for example, a plurality of multilabeled nucleic acid probes having different labeling portions such as different labeling enzymes and different fluorescent dyes can be prepared by the following method.
(1) Change the origin of TGase.
(2) Change the substrate specificity of TGase.
（１）の方法では、例えば、用いるＴＧａｓｅの種類に応じて、異なる基質ペプチドで修飾されたＵＴＰなどを調製すればよい。 In the method (1), for example, UTP modified with a different substrate peptide may be prepared according to the type of TGase used.
（２）の方法では、例えば、ＴＧａｓｅに、タンパク質工学的にアミノ酸変異を導入して基質特異性を変えればよい。例えば、ＭＴＧを大腸菌で調製し（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｋ． Ｍａｒｘ，Ｔｈｏｍａｓ Ｃ． Ｈｅｒｔｅｌ ａｎｄ Ｍａｒｋｕｓ Ｐｉｅｔｚｓｃｈ，Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ４０，Ｉｓｓｕｅ ６，２ Ｍａｙ ２００７，ｐ．１５４３−１５５０，”Ｓｏｌｕｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏ−ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ”参照）、さらに変異体ライブラリーを作って耐熱性の向上したＭＴＧを取得することができる（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｋ． Ｍａｒｘ，Ｔｈｏｍａｓ Ｃ． Ｈｅｒｔｅｌ ａｎｄ Ｍａｒｋｕｓ Ｐｉｅｔｚｓｃｈ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １３６，Ｉｓｓｕｅｓ ３−４，１０ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００８，ｐ．１５６−１６２，”Ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｈｅａｔ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｖａｒｉａｎｔｓ”参照）。 In the method (2), for example, an amino acid mutation may be introduced into TGase by protein engineering to change the substrate specificity. For example, MTG is prepared in E. coli (see, for example, Christian K. Marx, Thomas C. Hertel and Markus Pietzsch, Enzyme and Microbiology Technology, Volume 40, Issue 6, 15p50, 15 May 2007, 50 May 15p. pro-transglutaminase from Streptomyces mobaraensis in Escherichia coli "), and MTG with improved thermostability can be obtained by creating a mutant library (see, for example, Christian K. Marx, Thomas P. Thomas P. h, Journal of Biotechnology, Volume 136, Issues 3-4,10 September 2008, p.156-162, "Random mutagenesis of a recombinant microbial transglutaminase for the generation of thermostable and heat-sensitive variants" reference).
本明細書において、「ＴＧａｓｅにより結合する」というときは、特別な場合を除き、得られる連結部は、Ｌｙｓ残基とＧｌｎ残基とが、ε（γ−グルタミル）リシン結合を形成することにより構成されている。 In the present specification, “binding by TGase” means that, except for a special case, the resulting linking part is formed by forming an ε (γ-glutamyl) lysine bond between a Lys residue and a Gln residue. It is configured.
本実施形態においては、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基は、第一級アミンであってもよい。本明細書では、Ｌｙｓ残基を例に説明するが、その説明は、特別な場合を除き、第一級アミンにも当てはまる。 In the present embodiment, the Lys residue that can be recognized by TGase may be a primary amine. In the present specification, the Lys residue is described as an example, but the description also applies to a primary amine except in special cases.
リシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有し標識部分を含む標識化合物としては、特に制限はない。 There is no restriction | limiting in particular as a labeled compound which has a lysine (Lys) residue or a primary amine and contains a labeling part.
標識部分としては、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な標識（例えば、磁性ナノ粒子）、熱的に検出可能な標識（例えば、温度応答性高分子）、電気的に検出可能な標識（例えば、フェロセン部位を有する高分子）などが挙げられ、検出感度、取り扱い性などの点から、酵素および蛍光色素のうち少なくとも１つが好ましい。 Labeling moieties include enzymes, fluorescent dyes, compounds containing radioisotopes, magnetically detectable labels (eg, magnetic nanoparticles), thermally detectable labels (eg, temperature responsive polymers), electrical And a detectable label (for example, a polymer having a ferrocene moiety) and the like, and at least one of an enzyme and a fluorescent dye is preferable from the viewpoint of detection sensitivity and handling property.
蛍光色素としては、選択された波長の紫外光、可視光などの放射線による照射に応答して蛍光または燐光を発する物質であればよく、特に制限はないが、例えば、蛍光色素としてフルオレセイン、ローダミン、ダンシル、カルボシアニン誘導体など、あるいは蛍光タンパク質として緑色蛍光タンパク質とその変異体などが挙げられる。 The fluorescent dye is not particularly limited as long as it is a substance that emits fluorescence or phosphorescence in response to irradiation with a selected wavelength of ultraviolet light, visible light or the like, and examples of the fluorescent dye include fluorescein, rhodamine, Examples of dansyl and carbocyanine derivatives, and fluorescent proteins include green fluorescent protein and mutants thereof.
放射性同位体としては、例えば、重水素（２Ｈ）、三重水素（３Ｈ）、１０Ｂ、１１Ｂ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏなどが挙げられる。 Examples of the radioisotope include deuterium ( 2 H), tritium ( 3 H), 10 B, 11 B, 13 C, 15 N, 18 O, and the like.
ＴＧａｓｅに対し、Ｌｙｓ残基（または第一級アミン）供与体となる基質は、Ｇｌｎ残基供与体となる基質に比較して構造的な制約が少ないと考えられる。したがって、修飾しようとする標識酵素が、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を元来有している場合もあり、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含むタグを酵素に付加する場合もある。 A substrate that serves as a Lys residue (or primary amine) donor for TGase is considered to have fewer structural restrictions than a substrate that serves as a Gln residue donor. Therefore, the labeling enzyme to be modified may originally have a Lys residue that can be recognized by TGase, or a tag that includes a Lys residue that can be recognized by TGase may be added to the enzyme.
ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基（Ｋ）は、ＭＫＨＫＧＳ（配列番号：１８）、ＭＲＨＫＧＳ（配列番号：２４）、ＭＲＲＫＧＳ（配列番号：２５）、ＭＨＲＫＧＳ（配列番号：２６）のアミノ酸配列を有するペプチドとして存在してもよい。このようなＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含むペプチドによるタグ化は、標識酵素を、タンパク質の所望の部位、例えばＣ末端またはＮ末端に連結する目的で用いることができる。ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含む他のペプチドまたはそのアミノ酸配列の例としては、改変型Ｓ−ｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＳＧＭＫＥＴＡＡＡＲＦＥＲＡＨＭＤＳＧＳ（配列番号：１９））、ＭＧＧＳＴＫＨＫＩＰＧＧＳ（配列番号：２０）、Ｎ末端グリシン（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ＧＧＧ、Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ＧＧＧＧＧ（配列番号：２１））、Ｎ末端ＭＫＨＫＧＳと対象タンパク質間のリンカー部位を伸ばしたＭＫＨＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＳ（配列番号：２２）などが挙げられる。 The Lys residue (K) that can be recognized by TGase is a peptide having an amino acid sequence of MKHKGS (SEQ ID NO: 18), MRHKGS (SEQ ID NO: 24), MRRKGS (SEQ ID NO: 25), MHRKGS (SEQ ID NO: 26). May exist as Such tagging with a peptide containing a Lys residue that can be recognized by TGase can be used for the purpose of linking a labeling enzyme to a desired site of the protein, for example, the C-terminus or the N-terminus. Examples of other peptides containing Lys residues recognizable by TGase or amino acid sequences thereof include modified S-peptide (GSGMKETAAARFERAHMGSGS (SEQ ID NO: 19)), MGGSTKHKIPGGGS (SEQ ID NO: 20), N-terminal glycine (N -Terminal GGG, N-terminal GGGGG (SEQ ID NO: 21)), MKHKGGGSGGGSGS (SEQ ID NO: 22) in which the linker site between the N-terminal MKHKGS and the target protein is extended.
Ｃ末端またはＮ末端にＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含むペプチドを付加した標識酵素は、遺伝子工学的な手法を用いて、組換えタンパク質として調製することができる。Ｃ末端またはＮ末端にＴＧａｓｅの基質ペプチドタグが導入された当該組換えタンパク質の精製は、それぞれＮ末端またはＣ末端に付加した精製用ペプチドタグ（例えば、（Ｈｉｓ）６−ｔａｇ（ヘキサヒスチジンタグ））を利用し（ＴＧａｓｅの反応性の低下を回避するために、基質ペプチドタグを入れた末端とは異なる末端に精製用ペプチドタグを入れるようにデザインするとよい。）、ゲル濾過クロマトグラフィなどにより行うことができ、またアミノ酸配列の確認は当該タンパク質をコードするプラスミドベクターの遺伝子配列をＤＮＡシーケンサにて確認するか、Ｎ末端に導入された基質ペプチドについてはＮ末端分析により直接同定することができる。タンパク質の精製の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどで行うことができる。 A labeling enzyme to which a peptide containing a Lys residue capable of recognizing TGase at the C-terminus or N-terminus can be prepared as a recombinant protein using genetic engineering techniques. Purification of the recombinant protein in which a TGase substrate peptide tag is introduced at the C-terminus or N-terminus is carried out by purifying the peptide tag for purification added to the N-terminus or C-terminus (for example, (His) 6 -tag (hexahistidine tag)) (To avoid a decrease in TGase reactivity, it may be designed so that the purification peptide tag is inserted at a terminal different from the terminal where the substrate peptide tag is inserted.) The amino acid sequence can be confirmed by confirming the gene sequence of the plasmid vector encoding the protein with a DNA sequencer, or the substrate peptide introduced at the N-terminus can be directly identified by N-terminus analysis. Confirmation of protein purification can be performed by SDS-PAGE or the like.
標識酵素としては、発色反応、化学発光などを利用して検出を行うことができる性質を有するものであればよく特に制限はない。例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、ならびにＰ４５０およびそれらの変異体などが挙げられる。これらのうち、高い触媒活性と安定性の観点から、アルカリホスファターゼあるいはペルオキシダーゼが好ましい。ペプチドタグが容易に導入可能との観点からは、遺伝子工学的に製造可能なタンパク質が好ましい。 The labeling enzyme is not particularly limited as long as it has a property capable of performing detection using a color development reaction, chemiluminescence, or the like. Examples include alkaline phosphatase (AP), glutathione-S-transferase (GST), luciferase, peroxidase, and P450 and variants thereof. Of these, alkaline phosphatase or peroxidase is preferable from the viewpoint of high catalytic activity and stability. From the viewpoint that a peptide tag can be easily introduced, a protein that can be produced by genetic engineering is preferred.
酵素マルチラベル化核酸プローブと標的核酸の間でより厳密に塩基配列特異的な二本鎖形成を行うためには、比較的高温（例えば、７０℃以上）の条件下で行うことがあるため、常温菌由来の酵素を利用すると活性の損失が懸念される。そこで、標的酵素としては、超好熱菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来アルカリホスファターゼ（ＰｆｕＡＰ）が好ましい。 In order to more precisely perform base sequence-specific duplex formation between an enzyme multi-labeled nucleic acid probe and a target nucleic acid, it may be performed under relatively high temperature conditions (for example, 70 ° C. or higher) If an enzyme derived from a thermophilic bacterium is used, there is a concern about loss of activity. Therefore, as the target enzyme, a hyperthermophilic bacterium Pyrococcus furiosus-derived alkaline phosphatase (PfuAP) is preferable.
超好熱菌由来の酵素は、一般的に有機溶媒や熱に対して高い安定性を示すことが知られているため好ましく（例えば、Ｈ．Ａｔｏｍｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９，ｐ．１６６−１７３（２００５）参照）、さらに、大腸菌を宿主とした大量調製が比較的容易に行うことができる点においても好ましい。大腸菌を宿主として耐熱性酵素を調製する場合、細胞破砕液を高温処理（例えば、８０℃で３０分温置）することで、大腸菌由来の共雑タンパク質のほとんどを沈殿させ、粗精製を容易に行うことができる。 Enzymes derived from hyperthermophilic bacteria are preferred because they are generally known to exhibit high stability against organic solvents and heat (for example, H. Atomi, Current Opinion in Chemical Biology, 9, p. 166). -173 (2005)), and is also preferable in that a large-scale preparation using E. coli as a host can be performed relatively easily. When preparing a thermostable enzyme using Escherichia coli as a host, the cell disruption solution is subjected to high-temperature treatment (for example, incubation at 80 ° C. for 30 minutes) to precipitate most of the E. coli-derived concomitant proteins and facilitate crude purification. It can be carried out.
超好熱菌は一般の生物がほとんど生育できない極限環境で生育することができる微生物であるため、超好熱菌由来のタンパク質は非常に高い耐熱性を有している。さらに、熱に対する耐性だけでなく、一般的に、変性剤、有機溶媒、ｐＨなどに対する耐性も常温菌由来酵素に比べて極めて高いことから、ＰｆｕＡＰを使用することによって、酵素の失活を伴わない厳密な二本鎖形成を達成することができると考えられる。 Since hyperthermophilic bacteria are microorganisms that can grow in extreme environments where general organisms hardly grow, proteins derived from hyperthermophilic bacteria have very high heat resistance. Furthermore, not only the resistance to heat, but generally the resistance to denaturing agents, organic solvents, pH, etc. is extremely higher than that of enzymes derived from room temperature bacteria, so the use of PfuAP does not cause enzyme inactivation. It is believed that exact duplex formation can be achieved.
本実施形態に係る酵素マルチラベル化核酸プローブの好ましい態様の一つは、ＰｆｕＡＰとＺ−ＱＧ ＲＮＡとの複合体またはＰｆｕＡＰとＺ−ＱＧ ＤＮＡとの複合体である。このような複合体は、安定な酵素であるＰｆｕＡＰと、安定な分子であるＲＮＡまたはＤＮＡが、アミド結合という安定な共有結合で連結されているため、複合体全体としても安定性であるというメリットがある。 One of the preferable aspects of the enzyme multi-labeled nucleic acid probe according to this embodiment is a complex of PfuAP and Z-QG RNA or a complex of PfuAP and Z-QG DNA. In such a complex, PfuAP, which is a stable enzyme, and RNA or DNA, which is a stable molecule, are linked by a stable covalent bond called an amide bond, so that the entire complex is also stable. There is.
また、酵素マルチラベル化核酸プローブにおいて、酵素が有機溶媒や熱に対して安定な酵素であってもよい。このような安定性の高い酵素は、自然界からのスクリーニング（例えば、化学と工業，ｖｏｌ．６１（Ｎｏ．６），ｐ．５７１−５７５（２００８）、内山拓，宮崎健太郎，バイオサイエンスとインダストリー，ｖｏｌ．６６（Ｎｏ．５），ｐ．２３４−２３９（２００８）、道久則之，バイオサイエンスとインダストリー，ｖｏｌ．６６（Ｎｏ．１２），ｐ．６６７−６７０（２００８））や、タンパク質工学的手法により安定性を高める技術（例えば、荻野博康，ＢＩＯ ＩＮＤＵＳＴＲＹ，ｖｏｌ．２５（Ｎｏ．７），ｐ．１６−２３（２００８）、宮崎健太郎，ＢＩＯ ＩＮＤＵＳＴＲＹ，ｖｏｌ．２５（Ｎｏ．７），ｐ．５２−５８（２００８））により得ることができる。これらの手法により、常温菌由来の酵素であっても、有機溶媒耐性や耐熱性を有する酵素へと変換することができる。 In the enzyme multi-labeled nucleic acid probe, the enzyme may be an enzyme that is stable against an organic solvent or heat. Such highly stable enzymes are screened from nature (for example, Chemistry and Industry, vol. 61 (No. 6), p. 571-575 (2008), Taku Uchiyama, Kentaro Miyazaki, Bioscience and Industry, vol.66 (No.5), p.234-239 (2008), Noriyuki Michihisa, Bioscience and Industry, vol.66 (No.12), p.667-670 (2008)) and protein engineering Techniques for improving stability by techniques (for example, Hiroyasu Kanno, BIO INDUSTRY, vol. 25 (No. 7), p. 16-23 (2008), Kentaro Miyazaki, BIO INDUSTRY, vol. 25 (No. 7), p. .52-58 (2008)). By these techniques, even an enzyme derived from a thermophilic bacterium can be converted into an enzyme having resistance to organic solvents and heat resistance.
蛍光色素部分を導入した、リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する標識化合物は、例えば、カルボキシル基にジアミンを導入する方法で調製することができる（例えば、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ １,Ｓｅｃｔｉｏｎ ４．３，ｐ．１００−１０４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ．を参照）。 A labeled compound having a lysine (Lys) residue or a primary amine or glutamine (Gln) residue into which a fluorescent dye moiety has been introduced can be prepared, for example, by a method of introducing a diamine into a carboxyl group (for example, (See GT Hermanson (1996), Bioconjugate Technologies, Chapter 1, Section 4.3, p. 100-104, Academic Press, San Diego.).
トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）としては、種々のものを用いることができる。現在、ＴＧａｓｅとして、哺乳類（ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ、ヒト）、無脊椎動物（昆虫、カブトガニ、ウニ）、植物、菌類、原生生物（粘菌）由来のものが知られており、またヒトの場合については、８種類のアイソザイムが見つかっている。本実施形態において用いることのできるＴＧａｓｅの好ましい例は、安定性、ハンドリングの容易さ、バルク生産が可能などの点から微生物由来微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）である。 Various types of transglutaminase (TGase) can be used. Currently, TGases are known to be derived from mammals (guinea pigs, humans), invertebrates (insects, horseshoe crabs, sea urchins), plants, fungi, and protists (slime molds). Eight types of isozymes have been found. A preferred example of TGase that can be used in this embodiment is microorganism-derived microorganism-derived transglutaminase (MTG) in terms of stability, ease of handling, and bulk production.
本実施形態においてＭＴＧを用いた場合、予想されているＭＴＧの触媒反応から、Ｌｙｓ残基を有する標識酵素などの標識部分を含む標識化合物とＺ−ＱＧ ＲＮＡとの連結反応は、ＭＴＧ活性中心であるシステイン（Ｃｙｓ）残基の、Ｚ−ＱＧ ＲＮＡのＧｌｎへの求核置換反応によるアシル−酵素複合体の形成と、続いて起こる標識化合物のＬｙｓによるアシル−酵素複合体への求核置換反応によるＭＴＧの脱離、の２段階で進行すると予想される。 In the present embodiment, when MTG is used, the ligation reaction between a labeled compound containing a labeling moiety such as a labeling enzyme having a Lys residue and Z-QG RNA from the expected catalytic reaction of MTG is performed at the MTG activity center. Formation of an acyl-enzyme complex by nucleophilic substitution reaction of a certain cysteine (Cys) residue to Gln of Z-QG RNA, and subsequent nucleophilic substitution reaction of the labeled compound to an acyl-enzyme complex by Lys It is expected to proceed in two stages: MTG desorption by.
本実施形態の核酸検出用キットにおいては、ＴＧａｓｅが認識可能なグルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有するＺ−ＱＧ ＲＮＡに対する、ＴＧａｓｅが認識可能なリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する標識化合物のモル濃度比は、好ましくは２以上であり、より好ましくは５以上である。なお、本明細書で単に「濃度比」というときは、特別な場合を除き、モル濃度による比を指す。例えば、Ｚ−ＱＧ ＲＮＡに対するＮＫ１４−ＰｆｕＡＰのモル濃度比は、[ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ]／[Ｚ−ＱＧ ＲＮＡ]と表すこともできる。 In the nucleic acid detection kit of the present embodiment, lysine (Lys) capable of recognizing TGase with respect to Z-QG RNA having a glutamine (Gln) residue, lysine (Lys) residue or primary amine capable of recognizing TGase. ) The molar concentration ratio of the labeled compound having a residue, primary amine or glutamine (Gln) residue is preferably 2 or more, more preferably 5 or more. In the present specification, the term “concentration ratio” refers to a ratio based on molar concentration unless otherwise specified. For example, the molar concentration ratio of NK14-PfuAP to Z-QG RNA can also be expressed as [NK14-PfuAP] / [Z-QG RNA].
［ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰの調製］
ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰとは、ＭＫＨＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＳの配列を有するアミノ酸１４残基からなる付加配列を遺伝子工学的にＰｆｕＡＰのＮ末端に、精製用タグをＣ末端に導入したものである。ＰｆｕＡＰの発現ベクターは香川大学櫻庭春彦教授より委譲頂いた。ＰＣＲによりＰｆｕＡＰをコードする領域を増幅する際、それぞれのタグが導入されるようにタンパク質発現用ベクターｐＥＴ２２に組換え、大腸菌ＢＬ２１株を形質転換した。アンピシリンを含むＬＢ培地にて前培養、本培養を経て、得られた形質転換体を遠心分離により収菌し、２５ｍＭ ＴＢＳで２回洗浄した。得られた菌体を凍結・融解させた後、超音波処理により細胞を粉砕し、遠心分離により可溶性画分を回収した。超高熱菌由来のＰｆｕＡＰは高温条件下でも安定であるので、得られた無細胞抽出液を８０℃で３０分処理し、他のタンパク質を沈殿させることによって粗精製を行った。粗精製後、遠心分離・フィルター濾過によって上澄みを回収し、Ｈｉｓ−ｔａｇカラムによって精製した。精製後、限外濾過による濃縮を行い、ＰＤ−１０カラムを用いて溶媒を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）へと置換し、実験に供するまで凍結保存した。
[Preparation of NK14-PfuAP]
NK14-PfuAP is obtained by genetically engineering an additional sequence consisting of 14 amino acids having the MKHKGGGSGGGSGS sequence at the N-terminus of PfuAP and a purification tag at the C-terminus. The expression vector for PfuAP was transferred from Professor Haruhiko Kaniwa of Kagawa University. When a region encoding PfuAP was amplified by PCR, the protein expression vector pET22 was recombined so that each tag was introduced, and Escherichia coli BL21 strain was transformed. After preculture and main culture in an LB medium containing ampicillin, the obtained transformant was collected by centrifugation and washed twice with 25 mM TBS. After freezing and thawing the obtained bacterial cells, the cells were pulverized by ultrasonic treatment, and the soluble fraction was recovered by centrifugation. Since PfuAP derived from hyperthermophilic bacteria is stable even under high temperature conditions, the resulting cell-free extract was treated at 80 ° C. for 30 minutes to precipitate other proteins, thereby carrying out crude purification. After crude purification, the supernatant was collected by centrifugation and filter filtration, and purified by a His-tag column. After purification, concentration by ultrafiltration was performed, the solvent was replaced with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) using a PD-10 column, and the solution was stored frozen until it was used for the experiment.
また、ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰの大腸菌での発現量の向上のため、大腸菌のコドン使用頻度に合わせて塩基配列が改変されたＮＫ１４−ＰｆｕＡＰの発現ベクター（アクセッション番号：ＡＢ４７９３８３、配列番号：２３）を用いてもよい。この発現ベクターは、Codon Devices社（http://www.codondevices.com）に受託合成して得た。ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰをコードする遺伝子領域の両端に適切な制限酵素サイトを導入しておき、これらを利用することでタンパク質発現用ベクターｐＥＴ２２に組換え、得られたＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ発現ベクターにより大腸菌ＢＬ２１株を形質転換した。アンピシリンを含むＬＢ培地にて前培養、本培養を経て、得られた形質転換体を遠心分離により収菌し、２５ｍＭ ＴＢＳで２回洗浄した。得られた菌体を凍結・融解させた後、超音波処理により細胞を粉砕し、遠心分離により可溶性画分を回収した。超高熱菌由来のＰｆｕＡＰは高温条件下でも安定であるので、得られた無細胞抽出液を８０℃で３０分処理し、他のタンパク質を沈殿させることによって粗精製を行った。粗精製後、遠心分離・フィルター濾過によって上澄みを回収し、Ｈｉｓ−ｔａｇカラムによって精製した。精製後、限外濾過による濃縮を行い、ＰＤ−１０カラムを用いて溶媒を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）へと置換し、実験に供するまで凍結保存した。 Further, in order to improve the expression level of NK14-PfuAP in Escherichia coli, an NK14-PfuAP expression vector (accession number: AB479383, SEQ ID NO: 23) whose base sequence is modified in accordance with the codon usage frequency of Escherichia coli is used. May be. This expression vector was obtained by commissioned synthesis at Codon Devices (http://www.codondevices.com). An appropriate restriction enzyme site is introduced at both ends of the gene region encoding NK14-PfuAP, and these are used to recombine into the protein expression vector pET22. The resulting NK14-PfuAP expression vector is used to transform E. coli BL21 strain. Transformed. After preculture and main culture in an LB medium containing ampicillin, the obtained transformant was collected by centrifugation and washed twice with 25 mM TBS. After freezing and thawing the obtained bacterial cells, the cells were pulverized by ultrasonic treatment, and the soluble fraction was recovered by centrifugation. Since PfuAP derived from hyperthermophilic bacteria is stable even under high temperature conditions, the resulting cell-free extract was treated at 80 ° C. for 30 minutes to precipitate other proteins, thereby carrying out crude purification. After crude purification, the supernatant was collected by centrifugation and filter filtration, and purified by a His-tag column. After purification, concentration by ultrafiltration was performed, the solvent was replaced with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) using a PD-10 column, and the solution was stored frozen until it was used for the experiment.
ＴＧａｓｅとしてＭＴＧを用いて連結反応を行う場合には、上述のようにモル濃度比が適切な範囲となるようにすることに加えて、ｐＨ５．０〜８．０、温度４〜５０℃（例えば、室温（例えば、１８℃〜２２℃））の条件で行うことが好ましい。このようにすれば、１２時間以内、好ましくは６時間以内、より好ましくは３時間以内に、充分に高い反応率が達成可能である。 When performing a ligation reaction using MTG as TGase, in addition to adjusting the molar concentration ratio to an appropriate range as described above, pH 5.0 to 8.0, temperature 4 to 50 ° C. (for example, , Preferably at room temperature (for example, 18 ° C. to 22 ° C.). In this way, a sufficiently high reaction rate can be achieved within 12 hours, preferably within 6 hours, more preferably within 3 hours.
このような高い反応率が達成できる方法により得られたマルチラベル化核酸プローブ溶液には、未反応の核酸プローブ（例えば、遊離のＺ−ＱＧ ＲＮＡ）がほとんど存在せず、以下で詳述する、標的核酸の検出にそのまま用いたとしても、マルチラベル化核酸プローブと未反応分子との競合が実質的に生じないか、生じたとしても目的とする検出の結果には実質的な影響を与えないほど少ないと考えられる。したがって、マルチラベル化核酸プローブ溶液を精製することなく、直接検出へと利用できるメリットがある。 The multi-labeled nucleic acid probe solution obtained by the method capable of achieving such a high reaction rate has almost no unreacted nucleic acid probe (for example, free Z-QG RNA), which will be described in detail below. Even if it is used as it is for detection of the target nucleic acid, competition between the multi-labeled nucleic acid probe and the unreacted molecule does not substantially occur, or even if it occurs, it does not substantially affect the target detection result. It is thought that there are few. Therefore, there is a merit that it can be used for direct detection without purifying the multi-labeled nucleic acid probe solution.
本実施形態に係る核酸検出用キットを用いた酵素マルチラベル化核酸プローブの形成方法は、従来法に比較して、以下の特徴およびメリットを有する。
・対象となる標識酵素は、ＴＧａｓｅが認識可能なリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する酵素、ＴＧａｓｅが認識可能なリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を導入することができるあらゆる酵素を包含する。また、インテインのような大きなタンパク質性タグを必要としない。
・酵素の修飾部位は、Ｃ末端に限定されない。ＴＧａｓｅ活性なＬｙｓ残基またはＧｌｎ残基が存在するか、そのようなＬｙｓ残基またはＧｌｎ残基を有するタグを導入することができる部位であれば、修飾可能である。
・Ｃ末端、Ｎ末端に加え、ｌｏｏｐ領域のようなタンパク質構造中の揺らぎの大きな部位も修飾対象となりうる。
・結合する核酸の塩基配列および長さには、特に制限がない。
The method for forming an enzyme multi-labeled nucleic acid probe using the nucleic acid detection kit according to this embodiment has the following characteristics and merits as compared with the conventional method.
The target labeling enzyme is an enzyme having a lysine (Lys) residue or primary amine or glutamine (Gln) residue that can be recognized by TGase, a lysine (Lys) residue or primary that can be recognized by TGase Any enzyme capable of introducing an amine or glutamine (Gln) residue is included. In addition, large proteinaceous tags such as intein are not required.
-The enzyme modification site is not limited to the C-terminus. Any site where a TGase active Lys residue or Gln residue is present or a tag having such a Lys residue or Gln residue can be introduced can be modified.
-In addition to the C-terminal and N-terminal, sites with large fluctuations in the protein structure such as the loop region can also be modified.
-There is no restriction | limiting in particular in the base sequence and length of the nucleic acid to couple | bond.
＜標的核酸の検出方法＞
本実施形態に係る核酸検出用キットを用いた標的核酸の検出方法は、構成単位として例えば上記式（１）〜（５）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸が複数個導入されている核酸である核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンのうち少なくとも２つに、リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する標識酵素などの標識化合物が結合されて構成されているマルチラベル化核酸プローブであって、標識部分が容易に検出可能な性質を有し、かつ核酸部分が標的核酸に特異的に結合可能な塩基配列を有するものであるマルチラベル化核酸プローブを調製し、マルチラベル化核酸プローブと対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させ、結合しているマルチラベル化核酸プローブを、酵素部分などの標識部分により検出する工程を含む。
<Detection method of target nucleic acid>
In the method for detecting a target nucleic acid using the nucleic acid detection kit according to the present embodiment, for example, a nucleic acid into which a plurality of enzyme substrate-modified nucleoside triphosphates represented by the above formulas (1) to (5) are introduced as a structural unit At least two of the glutamine (Gln) residue, lysine (Lys) residue or primary amine in the nucleic acid probe are lysine (Lys) residue or primary amine or glutamine (Gln) residue A multi-labeled nucleic acid probe constructed by binding a labeling compound such as a labeling enzyme, wherein the labeling moiety has an easily detectable property and the nucleic acid moiety can specifically bind to the target nucleic acid A multi-labeled nucleic acid probe having a sequence is prepared. Specifically bound, the multilabeled nucleic acid probe that is bound, comprising the step of detecting the label moiety such as an enzyme moiety.
本実施形態に係る標的核酸の検出方法は、標的核酸の定性、定量、識別、染色、局在化の調査などの目的で用いることができる。 The method for detecting a target nucleic acid according to this embodiment can be used for the purpose of qualitative, quantitative, identification, staining, localization investigation of the target nucleic acid.
この方法においては、上記マルチラベル化核酸プローブが用いられるが、核酸部分は、標的核酸に特異的に結合可能な核酸配列を有するものとする。酵素部分などの標識部分は、容易に検出可能な性質を有するものである。この方法において、標的核酸を含む標的分子は、核酸、比較的低分子の有機化合物（ＡＴＰ）、タンパク質、ペプチド、金属イオン、複雑な構造を持つ多量体、ウイルスなどでありうる。検出対象は、（ｉ）ＤＮＡ転写膜、または（ｉｉ）細胞もしくは個体組織切片などである。 In this method, the multi-labeled nucleic acid probe is used, and the nucleic acid portion has a nucleic acid sequence that can specifically bind to the target nucleic acid. Labeling moieties such as enzyme moieties are those that are readily detectable. In this method, the target molecule including the target nucleic acid may be a nucleic acid, a relatively small organic compound (ATP), a protein, a peptide, a metal ion, a multimer having a complex structure, a virus, or the like. The detection target is (i) a DNA transfer membrane, or (ii) a cell or individual tissue section.
検出対象が（ｉ）の場合、標的核酸は、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡまたはゲノム断片ＤＮＡなどであり、（ｉｉ）の場合、標的核酸は、細胞または個体組織中に含まれる核酸（ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）などである。本方法は、従来法、例えばジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識化プローブを用いる方法に比較して、種々の点で優れている。例えば、ＤＩＧ法では、核酸プローブのＤＩＧ修飾および標識化された抗ＤＩＧ抗体が必要であり、それに伴う煩雑な洗浄操作が必要となるが、本実施形態に係る核酸検出用キットを用いて得たマルチラベル化核酸プローブを用いれば、ＤＩＧ標識化プローブおよび標識化抗ＤＩＧ抗体が不要になるため、試薬、手間および時間を大幅に削減することが可能となる。また、１つの認識部位（核酸）に対して複数のシグナル増幅部位（酵素など）を配置しているため、検出感度の向上が可能になる。 When the detection target is (i), the target nucleic acid is DNA amplified by PCR or genomic fragment DNA, and in the case of (ii), the target nucleic acid is a nucleic acid (mRNA or DNA contained in a cell or individual tissue). ) Etc. This method is superior in various respects as compared with the conventional method, for example, a method using a digoxigenin (DIG) labeled probe. For example, the DIG method requires a DIG modification of the nucleic acid probe and a labeled anti-DIG antibody, which requires a complicated washing operation, and was obtained using the nucleic acid detection kit according to the present embodiment. When a multi-labeled nucleic acid probe is used, a DIG-labeled probe and a labeled anti-DIG antibody are not necessary, so that the reagent, labor, and time can be greatly reduced. Further, since a plurality of signal amplification sites (such as enzymes) are arranged for one recognition site (nucleic acid), detection sensitivity can be improved.
この方法においては、標的核酸に、マルチラベル化核酸プローブを供し、標的核酸とマルチラベル化核酸プローブの標的核酸相補的配列を有する部分とをハイブリダイズさせるが、このハイブリダイズのための条件は、当業者であれば、用いる核酸部分の長さ、塩基配列などに応じて、適宜設計することができる。 In this method, the target nucleic acid is provided with a multilabeled nucleic acid probe, and the target nucleic acid is hybridized with a portion having a target nucleic acid complementary sequence of the multilabeled nucleic acid probe. The conditions for the hybridization are as follows: A person skilled in the art can design appropriately according to the length, base sequence, etc. of the nucleic acid moiety used.
本実施形態に係る標的核酸の検出方法において、異なる標識酵素、異なる蛍光色素などの異なる標識部分を有する複数のマルチラベル化核酸プローブを準備して、同時に複数の標的核酸を検出してもよい。 In the method for detecting a target nucleic acid according to this embodiment, a plurality of multi-labeled nucleic acid probes having different labeling portions such as different labeling enzymes and different fluorescent dyes may be prepared, and a plurality of target nucleic acids may be detected simultaneously.
また、本実施形態において、標的核酸の検出方法は、
（ａ）基材表面に固定化された核酸、
（ｂ）固定化された固定化核酸の全部または一部に相補的な配列（固定化核酸相補的配列）、および標的核酸に特異的に結合可能な配列（標的核酸特異的配列）を有するアプタマ核酸、
（ｃ）構成単位として上記式（１）〜（５）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸が複数個導入されている核酸である核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンのうち少なくとも２つに、リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する標識酵素などの標識化合物が結合されて構成されているマルチラベル化核酸プローブであって、標識部分が容易に検出可能な性質を有し、及び／又は核酸部分がアプタマ核酸の標的核酸特異的配列の全部または一部に相補的な配列を有するものであるマルチラベル化核酸プローブ、
を調製し、
（Ａ）固定化核酸に、アプタマ核酸を供し、固定化核酸とアプタマ核酸の固定化核酸相補的配列を有する部分とをハイブリダイズさせることにより、アプタマ核酸を固定化し、
（Ｂ）固定化された固定化アプタマ核酸に、標的核酸を含む標的分子を含む可能性のある試料を供し、標的分子が存在する場合には標的核酸とアプタマ核酸の標的核酸分子特異的配列を有する部分とを結合させ、かつ上記マルチラベル化核酸プローブを供し、標的分子が存在しない場合にはマルチラベル化核酸プローブの核酸部分とアプタマ核酸とをハイブリダイズさせることにより、タンパク質を固定化し、
（Ｃ）固定化された酵素部分の有無またはその量を酵素の性質に基づいて検出することにより、試料中の標的分子を検出する工程を含む。
In the present embodiment, the method for detecting a target nucleic acid includes:
(A) a nucleic acid immobilized on the substrate surface,
(B) an aptamer having a sequence complementary to all or part of the immobilized immobilized nucleic acid (immobilized nucleic acid complementary sequence) and a sequence capable of specifically binding to the target nucleic acid (target nucleic acid specific sequence) Nucleic acid,
(C) A glutamine (Gln) residue or lysine (Lys) residue in a nucleic acid probe which is a nucleic acid into which a plurality of enzyme substrate-modified nucleoside triphosphates represented by the above formulas (1) to (5) are introduced as structural units Multilabeling in which a labeling compound such as a lysine (Lys) residue or a labeling enzyme having a primary amine or glutamine (Gln) residue is bound to at least two of the groups or primary amines Multi-label which is a nucleic acid probe, wherein the labeling portion has a property that can be easily detected and / or the nucleic acid portion has a sequence complementary to all or part of the target nucleic acid-specific sequence of the aptamer nucleic acid Nucleic acid probe,
Prepare
(A) Immobilizing the aptamer nucleic acid by subjecting the immobilized nucleic acid to an aptamer nucleic acid and hybridizing the immobilized nucleic acid and a portion having an immobilized nucleic acid complementary sequence of the aptamer nucleic acid;
(B) A sample that may contain a target molecule containing a target nucleic acid is provided to the immobilized immobilized aptamer nucleic acid, and when the target molecule is present, a target nucleic acid molecule-specific sequence of the target nucleic acid and the aptamer nucleic acid The protein is immobilized by hybridizing the nucleic acid part of the multilabeled nucleic acid probe and the aptamer nucleic acid when the target molecule is not present,
(C) A step of detecting a target molecule in the sample by detecting the presence or absence of the immobilized enzyme moiety or its amount based on the nature of the enzyme.
この方法における基材表面への核酸の固定化のためには、従来技術、例えばＤＮＡマイクロアレイなどを調製する際に用いられる技術を適用することができる。「基材」は、ガラス、シリコンなどのプラスチック製の、チップ、ビーズ、ウェル、プレートなどの形態とすることができ、核酸は、従来技術を用いて、基材表面に非共有結合（静電結合）的に、または共有結合で固定することができる。あらかじめ調製した核酸を基材に固定化してもよく、基材上で直接核酸を合成してもよい。簡便には、アビジンなどで被覆された市販のプレートを用い、ビオチン化した所望のＤＮＡを固定することができる。 For immobilization of nucleic acids on the substrate surface in this method, conventional techniques such as those used in preparing DNA microarrays can be applied. The “substrate” may be in the form of a chip, bead, well, plate, or the like made of plastic such as glass or silicon, and the nucleic acid is non-covalently bonded (electrostatic) to the substrate surface using conventional techniques. It can be fixed (bonded) or covalently. A nucleic acid prepared in advance may be immobilized on a substrate, or the nucleic acid may be directly synthesized on the substrate. For convenience, biotinylated desired DNA can be immobilized using a commercially available plate coated with avidin or the like.
この方法ではさらに、固定化核酸の全部または一部に相補的な配列（固定化核酸相補的配列）、および標的分子を含まれる標的核酸に特異性的に結合可能な配列（標的核酸特異的配列）を有する核酸（アプタマ核酸）が用いられる。標的分子は、核酸、比較的低分子の有機化合物、タンパク質、ペプチド、金属イオン、複雑な構造を持つ多量体、ウイルスなどでありうる。標的核酸特異的配列を有する部分は、従来技術、例えばＳＥＬＥＸ（試験管内人工進化法）工程を用いることにより産生することができ、また標的分子に対して非常に高い標的親和性及び特異性を有するものとすることができる。標的核酸特異的配列を有する部分は、修飾ヌクレオチドで構成されていてもよい。 The method further includes a sequence complementary to all or part of the immobilized nucleic acid (immobilized nucleic acid complementary sequence) and a sequence capable of specifically binding to the target nucleic acid containing the target molecule (target nucleic acid-specific sequence). ) Is used (aptamer nucleic acid). Target molecules can be nucleic acids, relatively small organic compounds, proteins, peptides, metal ions, multimers with complex structures, viruses, and the like. The portion having the target nucleic acid specific sequence can be produced by using conventional techniques such as SELEX (In-vitro Artificial Evolution) process and has very high target affinity and specificity for the target molecule Can be. The portion having the target nucleic acid specific sequence may be composed of modified nucleotides.
この方法においては、上記マルチラベル化核酸プローブが用いられるが、核酸部分は、アプタマ核酸の標的核酸特異的配列の全部または一部に相補的な配列を有するものとする。酵素部分などの標識部分は、容易に検出可能な性質を有するものである。この方法において、標的核酸を含む標的分子は、核酸、比較的低分子の有機化合物（ＡＴＰ）、タンパク質、ペプチド、金属イオン、複雑な構造を持つ多量体、ウイルスなどでありうる。検出対象は、（ｉ）ＤＮＡ転写膜、または（ｉｉ）細胞もしくは個体組織切片などである。 In this method, the multi-labeled nucleic acid probe is used, and the nucleic acid portion has a sequence complementary to all or a part of the target nucleic acid-specific sequence of the aptamer nucleic acid. Labeling moieties such as enzyme moieties are those that are readily detectable. In this method, the target molecule including the target nucleic acid may be a nucleic acid, a relatively small organic compound (ATP), a protein, a peptide, a metal ion, a multimer having a complex structure, a virus, or the like. The detection target is (i) a DNA transfer membrane, or (ii) a cell or individual tissue section.
この方法においては、固定化核酸に、アプタマ核酸を供し、固定化核酸とアプタマ核酸の固定化核酸相補的配列を有する部分とをハイブリダイズさせることにより、アプタマ核酸を固定化するが、このハイブリダイズのための条件は、当業者であれば、用いる核酸部分の長さ、塩基配列などに応じて、適宜設計することができる。 In this method, aptamer nucleic acid is immobilized on an immobilized nucleic acid by hybridizing an immobilized nucleic acid and a portion having an immobilized nucleic acid complementary sequence of the aptamer nucleic acid. Those skilled in the art can appropriately design the conditions according to the length of the nucleic acid part used, the base sequence, and the like.
また、この方法においては、次いで固定化アプタマ核酸に、標的分子を含む可能性のある試料を供し、標的分子が存在する場合には標的分子とアプタマ核酸の標的核酸特異的配列を有する部分とを結合させ、さらにマルチラベル化核酸プローブを供し、標的分子が存在しない場合にはマルチラベル化核酸プローブの核酸部分とアプタマ核酸とをハイブリダイズさせる。試料は、細胞もしくは組織抽出液、体液などでありうる。 In this method, a sample that may contain the target molecule is then provided to the immobilized aptamer nucleic acid. When the target molecule is present, the target molecule and the portion having the target nucleic acid-specific sequence of the aptamer nucleic acid are In addition, a multilabeled nucleic acid probe is provided, and when no target molecule is present, the nucleic acid portion of the multilabeled nucleic acid probe and the aptamer nucleic acid are hybridized. The sample can be a cell or tissue extract, body fluid, and the like.
さらにこの方法においては、固定化された酵素部分の有無またはその量を酵素の性質に基づいて検出することにより、試料中の標的分子を検出することができる。 Further, in this method, the target molecule in the sample can be detected by detecting the presence or the amount of the immobilized enzyme moiety based on the nature of the enzyme.
アプタマ核酸においては、固定化核酸相補的配列を有する部分と、標的核酸特異的配列を有する部分とは、重複してもよく、連続してもよく、また適当なスペーサを介して両者が存在するように設計することができる。標的核酸特異的配列を有する部分（アプタマ領域）が分子認識のためにある立体構造をとることを考慮すると、該部分は、固定化核酸相補的配列を有する部分とは少なくとも重複しないようにするのがよい。 In aptamer nucleic acids, the portion having an immobilized nucleic acid complementary sequence and the portion having a target nucleic acid-specific sequence may overlap or be continuous, and both may exist via an appropriate spacer. Can be designed as Considering that the part having the target nucleic acid specific sequence (aptamer region) takes a certain three-dimensional structure for molecular recognition, the part should be at least not overlapped with the part having the immobilized nucleic acid complementary sequence. Is good.
アプタマ核酸は、固定化核酸相補的配列および標的核酸特異的配列以外に、所望の場合にはマルチラベル化核酸プローブと適切にハイブリダイズするための配列をさらに含んでいてもよい。マルチラベル化核酸プローブの核酸部分は、アプタマ核酸の標的分子特異的配列の全部または一部に相補的な配列を有するが、この特異的配列の全部または一部に相補的な配列からなる領域が長い（標的核酸特異的配列と重複が多い）と、かえってアプタマ核酸とはハイブリダイズできない場合が生じうる。また短い（重複が少ない）と、標的分子が存在し、アプタマ核酸と結合している場合にも、マルチラベル化核酸プローブとアプタマ核酸とがハイブリダイズしてしまう場合が生じうる。当業者であれば、このようなことを考慮して、固定化核酸、アプタマ核酸、マルチラベル化核酸プローブの核酸部分を、適宜設計することができる。 In addition to the immobilized nucleic acid complementary sequence and the target nucleic acid specific sequence, the aptamer nucleic acid may further include a sequence for appropriately hybridizing with the multilabeled nucleic acid probe, if desired. The nucleic acid portion of the multilabeled nucleic acid probe has a sequence complementary to all or part of the target molecule-specific sequence of the aptamer nucleic acid, but a region consisting of a sequence complementary to all or part of this specific sequence is present. If the length is long (there is a lot of overlap with the target nucleic acid-specific sequence), there may be a case where the aptamer nucleic acid cannot be hybridized. Moreover, if the target molecule is present and bound to the aptamer nucleic acid, the multi-labeled nucleic acid probe and the aptamer nucleic acid may be hybridized if the short (there is little overlap). A person skilled in the art can appropriately design the nucleic acid portion of the immobilized nucleic acid, the aptamer nucleic acid, or the multilabeled nucleic acid probe in consideration of the above.
また、本実施形態に係る標的核酸の検出方法は、核酸部分が標的核酸に特異的に結合可能な塩基配列を有するものである、構成単位として、例えば上記式（１）〜（５）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸が複数個導入されている核酸である核酸プローブと、対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させた後、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンと、リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有し標識部分を含む標識化合物のリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基とを反応させて、容易に検出可能な性質を有する複数の標識部分を導入し、結合している核酸プローブを、標識部分により検出する工程を含む（図３参照）。 In addition, the method for detecting a target nucleic acid according to the present embodiment is represented by the above formulas (1) to (5), for example, as structural units whose nucleic acid portion has a base sequence that can specifically bind to the target nucleic acid. A nucleic acid probe, which is a nucleic acid into which a plurality of enzyme substrate-modified nucleoside triphosphates are introduced, and a target nucleic acid present in the target are specifically bound to each other by a nucleic acid portion, and then transglutaminase (TGase) is used. The nucleic acid probe has a glutamine (Gln) residue or lysine (Lys) residue or primary amine and a lysine (Lys) residue or primary amine or glutamine (Gln) residue and includes a labeling moiety It reacts with the lysine (Lys) residue or primary amine or glutamine (Gln) residue of the labeled compound, and has a property that can be easily detected. Of the labeling moiety is introduced, the nucleic acid probes are attached, comprising the step of detecting the labeling moiety (see FIG. 3).
この方法においては、上記核酸プローブが用いられるが、核酸部分は、標的核酸に特異的に結合可能な核酸配列を有するものとする。また、標識部分は、容易に検出可能な性質を有するものである。 In this method, the nucleic acid probe is used, and the nucleic acid portion has a nucleic acid sequence that can specifically bind to the target nucleic acid. The label portion has a property that can be easily detected.
本方法は、従来法、例えばジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識化プローブを用いる方法に比較して、種々の点で優れている。例えば、ＤＩＧ法では、核酸プローブのＤＩＧ修飾および標識化された抗ＤＩＧ抗体が必要であり、それに伴う煩雑な洗浄操作が必要となるが、本実施形態に係る核酸プローブを用いれば、ＤＩＧ標識化プローブおよび標識化抗ＤＩＧ抗体が不要になるため、試薬、手間および時間を大幅に削減することが可能となる。また、１つの認識部位（核酸）に対して複数のシグナル増幅部位（標識部分）を配置することにより、検出感度の向上が可能になる。 This method is superior in various respects as compared with the conventional method, for example, a method using a digoxigenin (DIG) labeled probe. For example, in the DIG method, DIG modification of a nucleic acid probe and a labeled anti-DIG antibody are required, and a complicated washing operation is required, but if the nucleic acid probe according to this embodiment is used, DIG labeling is performed. Since the probe and the labeled anti-DIG antibody are not necessary, it is possible to greatly reduce the reagent, labor and time. Further, by arranging a plurality of signal amplification sites (labeled portions) for one recognition site (nucleic acid), detection sensitivity can be improved.
例えば、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＧｌｎなどのＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎが複数箇所に導入された核酸プローブＺ−ＱＧ ＲＮＡに、ＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓを導入した酵素、蛍光色素などの標識化合物を結合させる。 For example, using a TGase such as MTG, a labeling compound such as an enzyme or a fluorescent dye in which TGase recognition Lys is introduced is bound to a nucleic acid probe Z-QG RNA in which TGase recognition Gln such as MTG recognition Gln is introduced at a plurality of locations. .
本実施形態に係る核酸検出用キットの構成の一例は、例えば、下記（１）〜（３）の各セットを含むものである。
（１）ｄＡＴＰと溶媒とを含むｄＡＴＰ含有溶液、ｄＣＴＰと溶媒とを含むｄＣＴＰ含有溶液、ｄＧＴＰと溶媒とを含むｄＧＴＰ含有溶液、ｄＴＴＰと溶媒とを含むｄＴＴＰ含有溶液、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰと溶媒とを含むＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰ含有溶液のＺ−ＱＧ ＤＮＡラベリングセット（Ｚ−ＱＧ デオキシリボヌクレオチドセット）。各溶液の濃度は、例えば、１ｍＭ〜１００ｍＭである。ｄＴＴＰとＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰとは適切な比率（例えば、モル比で６：４）で混合されていてもよい。
（２）ＡＴＰと溶媒とを含むＡＴＰ含有溶液、ＣＴＰと溶媒とを含むＣＴＰ含有溶液、ＧＴＰと溶媒とを含むＧＴＰ含有溶液、ＵＴＰと溶媒とを含むＵＴＰ含有溶液、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰと溶媒とを含むＺ−ＱＧ−ＵＴＰ含有溶液のＺ−ＱＧ ＲＮＡラベリングセット（Ｚ−ＱＧ リボヌクレオチドセット）。各溶液の濃度は、例えば、１ｍＭ〜１００ｍＭである。ＵＴＰとＺ−ＱＧ−ＵＴＰとは適切な比率（例えば、モル比で６：４）で混合されていてもよい。
（３）標識部分としてＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ等の超好熱菌由来の標識酵素等を含む標識化合物と溶媒とを含む標識化合物含有溶液、ＭＴＧと溶媒とを含むＭＴＧ含有溶液、反応バッファ、コントロール用ＤＮＡ（Ｚ−ＱＧ標識済ＤＮＡ）、コントロール用ＲＮＡ（Ｚ−ＱＧ標識済ＲＮＡ）の標識セット。
An example of the configuration of the nucleic acid detection kit according to this embodiment includes, for example, the following sets (1) to (3).
(1) dATP-containing solution containing dATP and solvent, dCTP-containing solution containing dCTP and solvent, dGTP-containing solution containing dGTP and solvent, dTTP-containing solution containing dTTP and solvent, Z-QG-dUTP and solvent A Z-QG DNA labeling set (Z-QG deoxyribonucleotide set) of a solution containing Z-QG-dUTP. The concentration of each solution is, for example, 1 mM to 100 mM. dTTP and Z-QG-dUTP may be mixed in an appropriate ratio (for example, 6: 4 in molar ratio).
(2) ATP-containing solution containing ATP and solvent, CTP-containing solution containing CTP and solvent, GTP-containing solution containing GTP and solvent, UTP-containing solution containing UTP and solvent, Z-QG-UTP and solvent Z-QG RNA labeling set (Z-QG ribonucleotide set) of a Z-QG-UTP-containing solution. The concentration of each solution is, for example, 1 mM to 100 mM. UTP and Z-QG-UTP may be mixed in an appropriate ratio (for example, 6: 4 in molar ratio).
(3) A labeled compound-containing solution containing a labeling compound containing a labeling enzyme derived from a hyperthermophile such as NK14-PfuAP and a solvent as a labeling part, an MTG-containing solution containing an MTG and a solvent, a reaction buffer, and a control DNA (Z-QG labeled DNA), labeled set of control RNA (Z-QG labeled RNA).
本実施形態に係る核酸検出用キットの構成の他の例は、例えば、下記（１）〜（３）の各セットを含むものである。
（１）ｄＡＴＰとｄＣＴＰとｄＧＴＰとｄＴＴＰとＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰと溶媒とを含むＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰ含有溶液のＺ−ＱＧ ＤＮＡラベリング混合物セット（Ｚ−ＱＧ デオキシリボヌクレオチドミックス）。各成分の濃度は、例えば、１ｍＭ〜１００ｍＭであり、ＰＣＲに用いやすい２ｍＭまたは汎用性が高い１００ｍＭである。
（２）ＡＴＰとＣＴＰとＧＴＰとＵＴＰとＺ−ＱＧ−ＵＴＰと溶媒とを含むＺ−ＱＧ−ＵＴＰ含有溶液のＺ−ＱＧ ＲＮＡラベリング混合物セット（Ｚ−ＱＧ リボヌクレオチドミックス）。各溶液の濃度は、例えば、１ｍＭ〜１００ｍＭであり、ＲＮＡ合成に用いやすい２０ｍＭである。
（３）標識部分としてＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ等の超好熱菌由来の標識酵素等を含む標識化合物とＭＴＧと反応バッファと溶媒とを含む標識化合物／ＭＴＧ含有溶液、コントロール用ＤＮＡ（Ｚ−ＱＧ標識済ＤＮＡ）、コントロール用ＲＮＡ（Ｚ−ＱＧ標識済ＲＮＡ）の標識セット。ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰおよびＭＴＧは、反応に適した終濃度の例えば２倍の濃度とし、Ｚ−ＱＧ核酸と例えばモル比で１：１で混合することにより反応させる。
Other examples of the configuration of the nucleic acid detection kit according to this embodiment include, for example, the following sets (1) to (3).
(1) A Z-QG DNA labeling mixture set (Z-QG deoxyribonucleotide mix) of a Z-QG-dUTP-containing solution containing dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Z-QG-dUTP and a solvent. The concentration of each component is, for example, 1 mM to 100 mM, 2 mM that is easy to use for PCR, or 100 mM that is highly versatile.
(2) Z-QG RNA labeling mixture set (Z-QG ribonucleotide mix) of a Z-QG-UTP-containing solution containing ATP, CTP, GTP, UTP, Z-QG-UTP and a solvent. The concentration of each solution is, for example, 1 mM to 100 mM, and 20 mM that is easy to use for RNA synthesis.
(3) Labeled compound / MTG-containing solution containing labeled compound containing labeled enzyme derived from hyperthermophile such as NK14-PfuAP, MTG, reaction buffer and solvent, DNA for control (Z-QG labeled) DNA), a control set of RNA for control (Z-QG labeled RNA). NK14-PfuAP and MTG are reacted at a final concentration suitable for the reaction, for example, twice, and mixed with the Z-QG nucleic acid at a molar ratio of 1: 1, for example.
溶媒としては、例えば、水や、メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒等が挙げられる。これらのうち、安定性等の点から水が好ましい。また、水としては、蒸留水、イオン交換水等の純水、超純水等が用いられる。 Examples of the solvent include water and alcohol solvents such as methanol and ethanol. Of these, water is preferable from the viewpoint of stability and the like. As water, pure water such as distilled water or ion exchange water, ultrapure water, or the like is used.
本実施形態に係る核酸検出用キットにおける各溶液のｐＨは、例えば、ｐＨ４〜１０の範囲であり、ｐＨ５〜８の範囲が好ましい。ｐＨがこの範囲外の場合は、ＭＴＧによるラベル化効率が低下する場合がある。 The pH of each solution in the nucleic acid detection kit according to the present embodiment is, for example, in the range of pH 4 to 10, and preferably in the range of pH 5 to 8. When the pH is outside this range, the labeling efficiency by MTG may be lowered.
ｐＨ調整剤としては、アルカリ性から酸性の溶液または緩衝溶液等が挙げられる。ｐＨ調整用の溶液または緩衝溶液としては、例えば、塩酸、炭酸、酢酸、リン酸、ホウ酸水溶液、酢酸ナトリウム緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液、コハク酸緩衝液、２−ヒドロキシ−１，２，３−プロパントリカルボン酸緩衝液、モノフタル酸カリウム緩衝液、２−（Ｎ−モルノホリノ）エタンスルホン酸緩衝液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、イミダゾール緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、マロン酸緩衝液、乳酸緩衝液、Ｎ−メチルジエタノールアミン、ヒスチジン緩衝液、ピリジン酢酸緩衝液、酢酸トリエタノールアミン緩衝液、３−モルホリノプロパンスルホン酸緩衝液（ＭＯＰＳバッファ：３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｂｕｆｆｅｒ）等が挙げられ、これらを単独または混合物として用いることができる。これらのうち、トリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液が好ましい。 Examples of the pH adjuster include alkaline to acidic solutions or buffer solutions. Examples of the pH adjustment solution or buffer solution include hydrochloric acid, carbonic acid, acetic acid, phosphoric acid, boric acid aqueous solution, sodium acetate buffer, trishydroxymethylaminomethane buffer, succinic acid buffer, 2-hydroxy-1, 2,3-propanetricarboxylic acid buffer, potassium monophthalate buffer, 2- (N-mornophorino) ethanesulfonic acid buffer, 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine ethanesulfonic acid buffer, sodium phosphate Buffer, potassium phosphate buffer, sodium bicarbonate buffer, imidazole buffer, sodium citrate buffer, malonic acid buffer, lactate buffer, N-methyldiethanolamine, histidine buffer, pyridine acetate buffer, triacetate Ethanolamine buffer, 3-morpholinopropanesulfonic acid buffer (MOPS buffer) File: 3-Morpholinopropanesulfonic acid buffer) and the like, these can be used alone or as a mixture. Of these, trishydroxymethylaminomethane buffer and 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid buffer are preferred.
本実施形態に係る核酸検出用キットは、検出感度を向上させるために、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）、コバルトイオン（Ｃｏ２＋）、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）等の２価の陽イオンを含んでもよく、２価の陽イオンと溶媒とを含む陽イオン含有溶液を含んでもよい。これらのうち、系内で凝集や沈殿が生じにくい等の点からマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）が好ましい。２価の陽イオンは、ＴＧａｓｅによるラベル化反応のときに添加してもよいし、酵素の発色反応等のときに添加してもよい。 The nucleic acid detection kit according to the present embodiment is divalent such as magnesium ion (Mg 2+ ), calcium ion (Ca 2+ ), cobalt ion (Co 2+ ), and zinc ion (Zn 2+ ) in order to improve detection sensitivity. Or a cation-containing solution containing a divalent cation and a solvent. Of these, magnesium ions (Mg 2+ ) are preferable from the viewpoint that aggregation and precipitation are less likely to occur in the system. The divalent cation may be added during the labeling reaction with TGase, or may be added during the enzyme coloring reaction or the like.
本実施形態に係る核酸検出用キットにおいて、検出感度を向上させるために、核酸プローブと標識化合物との比率が１：２（モル比）以上となるようにすることが好ましい。また、本実施形態に係る核酸検出用キットにおいて、検出感度を向上させるために、ラベル化反応のときの標識化合物と２価の陽イオンとの比率（モル比）は、１：１〜１：３００の範囲であることが好ましい。また、酵素の発色反応のときの発色液中のマグネシウムイオン等の２価の陽イオンの濃度が、５０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲になるようにすることが好ましい。 In the nucleic acid detection kit according to this embodiment, in order to improve detection sensitivity, the ratio of the nucleic acid probe to the labeling compound is preferably 1: 2 (molar ratio) or more. In the nucleic acid detection kit according to this embodiment, in order to improve detection sensitivity, the ratio (molar ratio) between the labeled compound and the divalent cation during the labeling reaction is 1: 1 to 1: A range of 300 is preferable. Moreover, it is preferable that the concentration of divalent cations such as magnesium ions in the color developing solution during the color development reaction of the enzyme is in the range of 50 mM to 100 mM.
本実施形態に係る核酸検出用キットは、その他に例えば、反応で残存したＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰ、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰ等を除去するカラム、試薬等を含むＺ−ＱＧ精製セット；反応で残存した標識化合物等を除去してマルチラベル化核酸プローブを精製するためのカラム、試薬等を含む標識化合物精製セット；標識核酸に適したブロッキング剤を含む標識核酸用ブロッキング剤セット；標識核酸に適したハイブリダイゼーション溶液を含む標識核酸用ハイブリダイゼーション溶液セット等を含んでもよい。 The nucleic acid detection kit according to the present embodiment is, for example, a Z-QG purification set including a column, a reagent, etc. for removing Z-QG-dUTP, Z-QG-UTP, etc. remaining in the reaction; Label compound purification set including a column, reagent, etc. for removing the labeled compound and the like to purify the multi-labeled nucleic acid probe; Blocking agent set for labeled nucleic acid including a blocking agent suitable for the labeled nucleic acid; High suitable for the labeled nucleic acid A hybridization solution set for labeled nucleic acid containing a hybridization solution may be included.
マルチラベル化核酸プローブを精製するカラムとしては、ゲルろ過クロマトグラフィ方式のものが好ましい。これによりバックグラウンドが低減される。核酸の精製方法として一般的な手法としては、例えば、フェノール抽出によるタンパク質の除去、エタノール沈殿やイソプロパノール沈殿等のアルコール沈殿、電気泳動後にゲルを切り出してシリカカラム等を用いて精製、限外ろ過膜による精製等が挙げられる。しかし、フェノール抽出やアルコール沈殿はマルチラベル化核酸プローブがタンパク質との複合体を形成しているために困難であり、ＭＴＧ反応液等の中の核酸濃度がｎｇ／ｍＬオーダーと低い場合にはアルコールを用いても沈殿しにくく、シリカ樹脂や限外ろ過膜を用いてもマルチラベル化核酸プローブの回収が困難である。 The column for purifying the multi-labeled nucleic acid probe is preferably a gel filtration chromatography type column. This reduces the background. General methods for nucleic acid purification include, for example, protein removal by phenol extraction, alcohol precipitation such as ethanol precipitation or isopropanol precipitation, gel extraction after electrophoresis, and purification using a silica column, ultrafiltration membrane, etc. For example. However, phenol extraction and alcohol precipitation are difficult because the multi-labeled nucleic acid probe forms a complex with the protein. If the nucleic acid concentration in the MTG reaction solution is as low as ng / mL, alcohol It is difficult to precipitate even when using a silica gel, and it is difficult to recover a multi-labeled nucleic acid probe even when using a silica resin or an ultrafiltration membrane.
ゲルろ過方式の精製において、直鎖状核酸がゲルを素通りし、球状タンパク質がゲル中へ保持されるような条件がよい。すなわち、ゲルろ過方式のカラムとしては、ゲルの孔サイズが直鎖状核酸より小さく、球状タンパク質より大きいこと（例えば、１０−５００．２／ｎｍ程度）が好ましい。また、標識化合物除去のために十分なカラム容量であること（例えば、０．２００−１ｍＬ）が好ましい。カラム容量が小さすぎると、保持できなかった標識化合物が溶出してくる場合があり、カラム容量が大きいときには反応液が希釈されてしまう場合がある。 In the purification by gel filtration method, it is preferable that the linear nucleic acid passes through the gel and the globular protein is retained in the gel. That is, as a gel filtration type column, it is preferable that the pore size of the gel is smaller than that of the linear nucleic acid and larger than the globular protein (for example, about 10-500.2 / nm). Moreover, it is preferable that it is a column capacity sufficient for labeling compound removal (for example, 0.200-1 mL). If the column volume is too small, the labeled compound that could not be retained may be eluted, and if the column volume is large, the reaction solution may be diluted.
本実施形態に係る核酸検出用キットに含まれるＺ−ＱＧ ＤＮＡラベリングセットは、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ等を用いたＰＣＲ時に、ｄＮＴＰの代わりに用いてＰＣＲ産物にＺ−ＱＧ−ｄＮＴＰを取込ませることにより、Ｚ−ＱＧ核酸プローブを調製するのに用いられる。また、例えば、Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅにより核酸プローブの３’端を伸長させさる際に、ｄＮＴＰの代わりに用いてＺ−ＱＧ−ｄＮＴＰを取込ませることにより、Ｚ−ＱＧ核酸プローブを調製するのに用いられる。その他、例えば、核酸修飾酵素などにより通常のｄＮＴＰの代わりに用いてＺ−ＱＧ−ｄＮＴＰを取込ませることにより、Ｚ−ＱＧ核酸を調製するのに用いられる。 The Z-QG DNA labeling set included in the nucleic acid detection kit according to the present embodiment is used in place of dNTP, for example, at the time of PCR using Taq polymerase or the like, and allows Z-QG-dNTP to be incorporated into the PCR product. To prepare a Z-QG nucleic acid probe. In addition, for example, when extending the 3 ′ end of a nucleic acid probe by Terminal Transfer, it is used to prepare a Z-QG nucleic acid probe by incorporating Z-QG-dNTP instead of dNTP. . In addition, for example, Z-QG nucleic acid is used by preparing Z-QG nucleic acid by incorporating Z-QG-dNTP using a nucleic acid modifying enzyme or the like instead of ordinary dNTP.
本実施形態に係る核酸検出用キットに含まれるＺ−ＱＧ ＲＮＡラベリングセットは、例えば、ＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロ転写反応を行う際に、ＮＴＰの代わりに用いて、Ｚ−ＱＧ−ＮＴＰが取込まれたＲＮＡを合成するのに用いられる。 The Z-QG RNA labeling set included in the nucleic acid detection kit according to the present embodiment is used instead of NTP, for example, when performing in vitro transcription reaction with RNA polymerase using DNA as a template, and Z-QG-NTP Is used to synthesize the incorporated RNA.
本実施形態に係る核酸検出用キットに含まれる標識セットは、例えば、Ｚ−ＱＧ ＤＮＡラベリングセット、Ｚ−ＱＧ ＲＮＡラベリングセットを用いて調製したＺ−ＱＧ標識核酸に、標識化合物を結合させる際に用いられる。また、Ｚ−ＱＧ標識核酸に標識化合物を結合させることにより、任意の配列を持った核酸を検出するマルチラベル化核酸プローブとして用いることができる。 The label set included in the nucleic acid detection kit according to the present embodiment is, for example, when a labeled compound is bound to a Z-QG labeled nucleic acid prepared using a Z-QG DNA labeling set or a Z-QG RNA labeling set. Used. Moreover, it can be used as a multi-labeled nucleic acid probe for detecting a nucleic acid having an arbitrary sequence by binding a labeled compound to a Z-QG labeled nucleic acid.
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, although an example and a comparative example are given and the present invention is explained more concretely in detail, the present invention is not limited to the following examples.
（実施例１）
＜Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの合成・精製＞
Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの合成スキームは、図４に示す通りである。まず１００ｍＭ Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１００ｍＭ Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、５０ｍＭ Ｚ−ＱＧを、室温（調製した日は２７．０℃）でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４ｍＬ中で２０時間反応させることにより、ＮＨＳ化Ｚ−ＱＧ（５０ｍＭ）を調製した（この段階で５００μＬずつに分注し、−８０℃で保存）。その後、２５ｍＭのＮＨＳ化Ｚ−ＱＧと５ｍＭの５−（３−ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ）−ＵＴＰ（以下、ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ＵＴＰと略記、ＳＩＧＭＡ社製）とを、１００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）とＤＭＦの混合溶媒（ｖ／ｖ＝１／１）０．３２ｍＬ中において２５℃で１２時間反応させた。反応終了後、サンプルを超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）で１０倍希釈し、ＨＰＬＣ（日本分光製）（高速液体クロマトグラフ・ポンプ：ＴＲＩ ＲＯＴＡＲ−Ｖ型、バリアブル・ループ・インジェクタ：ＶＬ−６１３型、紫外可視分光検出器：ＵＶＩＤＥＣ−１００−ＩＶ型）によって精製を行った。ＨＰＬＣの測定条件は表１の通りとした。生成物の同定は、レーザーイオン化飛行時間型質量分析装置であるＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（島津製作所製 ＡＸＩＭＡ（登録商標）−ＣＦＲ Ｐｌｕｓ）によって行った。なお、サンプル調製手順は、まず、試料１μＬをＭＡＬＤＩ用試料プレートの上に滴下し、次にその上から、マトリックス溶液；２，５−ジヒドロキ安息香酸（ＤＨＢ）の１０ｍｇ／ｍｌ溶液（超純水）を滴下し、その後、風乾して、得られた試料プレートをＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ装置のイオン源内に導入して計測した。
(Example 1)
<Synthesis and purification of Z-QG-UTP>
The synthesis scheme of Z-QG-UTP is as shown in FIG. First, 100 mM N, N′-diisopropylcarbodiimide (DIC), 100 mM N-hydroxysuccinimide (NHS), 50 mM Z-QG was prepared at room temperature (27.0 ° C. on the day of preparation), and 4 mL of N, N-dimethylformamide (DMF). NHS-ized Z-QG (50 mM) was prepared by reacting for 20 hours in the flask (dispensed in 500 μL portions at this stage and stored at −80 ° C.). Then, 25 mM NHSated Z-QG, 5 mM 5- (3-aminoallyl) -UTP (hereinafter abbreviated as aminoallyl-UTP, manufactured by SIGMA), 100 mM borate buffer (pH 8.8) and DMF The mixture was reacted in a mixed solvent (v / v = 1/1) 0.32 mL at 25 ° C. for 12 hours. After completion of the reaction, the sample was diluted 10-fold with ultrapure water (Milli-Q), and HPLC (manufactured by JASCO) (high performance liquid chromatograph pump: TRI ROTAR-V type, variable loop injector: VL-613 type) And UV-visible spectroscopic detector: UVIDEC-100-IV type). The HPLC measurement conditions were as shown in Table 1. The product was identified by MALDI TOF-MS (AXIMA (registered trademark) -CFR Plus, manufactured by Shimadzu Corporation), which is a laser ionization time-of-flight mass spectrometer. The sample preparation procedure is as follows. First, 1 μL of a sample is dropped on a sample plate for MALDI, and then a matrix solution; a 10 mg / ml solution of 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) (ultra pure water) ) And then air-dried, and the obtained sample plate was introduced into the ion source of the MALDI TOF-MS apparatus and measured.
Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰを合成した後、表１に示す条件で逆相ＨＰＬＣを行った際の結果を図５に示す。 FIG. 5 shows the results when reverse-phase HPLC was performed under the conditions shown in Table 1 after the synthesis of Z-QG-UTP.
そこで、保持時間１８．８分のピークを回収してＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った（図６参照）。その結果、８５６．８９のピークが確認され、理論分子量の８５７．１３と良く一致した結果が得られたため、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの合成が示された。 Therefore, a peak having a retention time of 18.8 minutes was collected and subjected to MALDI TOF-MS analysis (see FIG. 6). As a result, a peak at 856.89 was confirmed, and the result was in good agreement with the theoretical molecular weight of 857.13, indicating the synthesis of Z-QG-UTP.
＜Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの合成・精製＞
まず、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４ｍＬ中にて、１００ｍＭ Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１００ｍＭ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、５０ｍＭ Ｚ−ＱＧを、室温（調製した日は１８〜２２℃程度）で２０時間反応させることによって、ＮＨＳ化Ｚ−ＱＧ（５０ｍＭ）を調製した。一方、５０ｍＭ ５−（３−ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ）−ｄＵＴＰ（以下、ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰと略記、ＳＩＧＭＡ社製）を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液（Ａｍｂｉｏｎ製）１６μＬと２００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）４０μＬ、滅菌水１６μＬとを混合し、１０ｍＭ ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰ溶液を８０μＬ調製した。この溶液に対して、上記で調製したＮＨＳ化Ｚ−ＱＧ溶液を８０μＬ添加し、２５℃で一晩反応させた。反応終了後、サンプルを超純水で１０倍希釈し、ＨＰＬＣ（日本分光製、高速液体クロマトグラフ・ポンプ：ＴＲＩ ＲＯＴＡＲ−Ｖ型、バリアブル・ループ・インジェクタ：ＶＬ−６１３型、紫外可視分光検出器：ＵＶＩＤＥＣ−１００−ＩＶ型）によって、表２に示す条件で精製を行った。生成物の同定はＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（ＢＲＵＫＥＲ ＤＡＬＴＯＮＩＣＳ製、ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩＩ）によって行った。結果を図７に示す。この際、３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ）をマトリックスとして使用した。
<Synthesis and purification of Z-QG-dUTP>
First, in 4 mL of N, N-dimethylformamide (DMF), 100 mM N, N′-diisopropylcarbodiimide (DIC), 100 mM N-hydroxysuccinimide (NHS), and 50 mM Z-QG were obtained at room temperature (the day of preparation was 18 NHS-ized Z-QG (50 mM) was prepared by reacting at about -22 ° C for 20 hours. Meanwhile, 16 μL of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) solution (manufactured by Ambion) containing 50 mM 5- (3-aminoallyl) -dUTP (hereinafter abbreviated as “aminoallyl-dUTP”, manufactured by SIGMA) and 200 mM borate buffer (pH 8) .8) 40 μL and 16 μL of sterilized water were mixed to prepare 80 μL of a 10 mM aminoallyl-dUTP solution. To this solution, 80 μL of the NHS-modified Z-QG solution prepared above was added and reacted at 25 ° C. overnight. After completion of the reaction, the sample was diluted 10 times with ultrapure water, and HPLC (manufactured by JASCO, high-performance liquid chromatograph pump: TRI ROTAR-V type, variable loop injector: VL-613 type, UV-visible spectroscopic detector : UVIDEC-100-IV type) under the conditions shown in Table 2. The product was identified by MALDI TOF-MS (manufactured by BRUKER DALTONICS, autoflex III). The results are shown in FIG. At this time, 3-hydroxypicolinic acid (3-HPA) was used as a matrix.
Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰを合成した後、逆相ＨＰＬＣを行った際の結果を図８に示す。ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰの場合（図９参照）と比較して、疎水側に新たなピークが出現しており、このピークがＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰであると推測された。そこで、保持時間１９．１分のピークを回収してＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った。その結果、図７に示すように、８４１．４６のピークが確認され、理論分子量の８４２．１３と良く一致した結果が得られたため、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの合成が示された。 FIG. 8 shows the results when reverse phase HPLC was performed after the synthesis of Z-QG-dUTP. Compared to the case of aminoallyl-dUTP (see FIG. 9), a new peak appeared on the hydrophobic side, and this peak was assumed to be Z-QG-dUTP. Therefore, a peak having a retention time of 19.1 minutes was collected and subjected to MALDI TOF-MS analysis. As a result, as shown in FIG. 7, a peak of 841.46 was confirmed, and the result was in good agreement with the theoretical molecular weight of 842.13, indicating the synthesis of Z-QG-dUTP.
＜ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰの調製＞
遺伝子工学的手法により、Ｎ末端にＭＴＧが認識するＫを含んだペプチドタグ（ＭＫＨＫ（ＧＧＧＳ）２ＧＳ）を導入したＮＫ１４−ＰｆｕＡＰを調製した。
<Preparation of NK14-PfuAP>
NK14-PfuAP into which a peptide tag (MKHK (GGGS) 2 GS) containing K recognized by MTG was introduced at the N-terminus was prepared by genetic engineering techniques.
＜各溶液の調製＞
表３（下記（１）），表４（下記（２）），表５（下記（３））に示す組成で、以下の溶液を調製した。
（１）ｄＡＴＰと溶媒とを含むｄＡＴＰ含有溶液
ｄＣＴＰと溶媒とを含むｄＣＴＰ含有溶液
ｄＧＴＰと溶媒とを含むｄＧＴＰ含有溶液
ｄＴＴＰと溶媒とを含むｄＴＴＰ含有溶液
Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰと溶媒とを含むＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰ含有溶液
（２）ＡＴＰと溶媒とを含むＡＴＰ含有溶液
ＣＴＰと溶媒とを含むＣＴＰ含有溶液
ＧＴＰと溶媒とを含むＧＴＰ含有溶液
ＵＴＰと溶媒とを含むＵＴＰ含有溶液
Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰと溶媒とを含むＺ−ＱＧ−ＵＴＰ含有溶液
（３）ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰと溶媒とを含むＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ含有溶液
ＭＴＧと溶媒とを含むＭＴＧ含有溶液
反応バッファ
<Preparation of each solution>
The following solutions were prepared with the compositions shown in Table 3 (below (1)), Table 4 (below (2)), and Table 5 (below (3)).
(1) dATP-containing solution containing dATP and solvent dCTP-containing solution containing dCTP and solvent dGTP-containing solution containing dGTP and solvent dTTP-containing solution containing dTTP and solvent Z-QG-dUTP containing Z and solvent -QG-dUTP-containing solution (2) ATP-containing solution containing ATP and solvent CTP-containing solution containing CTP and solvent GTP-containing solution containing GTP and solvent UTP-containing solution containing UTP and solvent Z-QG-UTP -QG-UTP-containing solution containing NP14 and solvent (3) NK14-PfuAP-containing solution containing NK14-PfuAP and solvent MTG-containing solution containing MTG and solvent Reaction buffer
＜マルチラベル化核酸プローブの調製＞
まず、マウス由来のＳｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）をコードする遺伝子中の約３００ｂｐをＰＣＲ増幅するプライマを設計した。次に、ＰＣＲ反応液の全ｄＴＴＰのうちの４０％をＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰに置き換えて反応液を調製してＰＣＲを行うことによって、Ｚ−ＱＧ ４０％ＤＮＡを得た。Ｚ−ＱＧ ４０％ＤＮＡに９５℃、５分間の熱変性を施し、Ｚ−ＱＧ ４０％ＤＮＡ ２５ｎｇ／μＬ、ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ ０．２ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＧ ５．０Ｕｎｉｔ／ｍＬの条件で、３７℃で３時間反応を行い、Ｚ−ＱＧ ４０％マルチラベル化核酸プローブを調製した。
<Preparation of multi-labeled nucleic acid probe>
First, a primer for PCR amplification of about 300 bp in the gene encoding mouse-derived Sonic hedgehog (Shh) was designed. Next, 40% of the total dTTP in the PCR reaction solution was replaced with Z-QG-dUTP to prepare a reaction solution, and PCR was performed to obtain Z-QG 40% DNA. Z-QG 40% DNA was heat denatured at 95 ° C. for 5 minutes, and Z-QG 40% DNA 25 ng / μL, NK14-PfuAP 0.2 mg / mL, MTG 5.0 Unit / mL at 37 ° C. Reaction was performed for 3 hours to prepare a Z-QG 40% multilabeled nucleic acid probe.
＜メンブランの作製＞
Ｎｙｂｏｎｄ Ｎ＋（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のプロトコールに準じてメンブランを作製した。アプライ前にＤＮＡを９５℃、５分で熱変性した。メンブランを８０℃で２時間ベーキングした。
<Membrane production>
A membrane was prepared according to the protocol of Nybond N + (GE Healthcare Bioscience). The DNA was heat denatured at 95 ° C. for 5 minutes before application. The membrane was baked at 80 ° C. for 2 hours.
＜プレハイブリダイゼーション＞
ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のキットに付随するハイブリダイゼーションバッファを用いて、プレハイブリダイゼーション（５５℃、１時間）を行った。
<Prehybridization>
Prehybridization (55 ° C., 1 hour) was performed using a hybridization buffer attached to a kit of AlkPhos Direct (manufactured by GE Healthcare Bioscience).
＜ハイブリダイゼーション＞
ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のキットに付随するハイブリダイゼーションバッファを用いて、ハイブリダイゼーション（５５℃、Ｏ／Ｎ、プローブ濃度１０ｎｇ／ｍＬ）を行った。Ｗａｓｈ ＢｕｆｆｅｒＩでメンブランを洗浄（５５℃、１０分間×２回）した。Ｗａｓｈ ＢｕｆｆｅｒＩＩでメンブランを洗浄（室温、５分間×２回）した。
<Hybridization>
Hybridization (55 ° C., O / N, probe concentration 10 ng / mL) was performed using a hybridization buffer attached to a kit of AlkPhos Direct (manufactured by GE Healthcare Bioscience). The membrane was washed with Wash Buffer I (55 ° C., 10 minutes × 2 times). The membrane was washed with Wash Buffer II (room temperature, 5 minutes × twice).
＜検出＞
発光基質をメンブラン上に１ｍＬ滴下し、ハイブリバックにくるんでインキュベート（室温、５分間）した。化学発光装置（化学発光装置（ＢＩＯ ＲＡＤ社製、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋)）にセットし、１時間露光した。発光基質として、Ｉｍｍｕｎ−Ｓｔａｒ（商標） Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）添付の発光基質を用いた。結果を図１０（ａ）に示す。
<Detection>
1 mL of a luminescent substrate was dropped on the membrane and incubated in a hybrid bag (room temperature, 5 minutes). It was set in a chemiluminescence device (chemiluminescence device (BIO RAD, ChemiDoc XRS +)) and exposed for 1 hour. As the luminescent substrate, a luminescent substrate attached to Immun-Star (trademark) Chemiluminescent Protein Detection Kit (manufactured by BIO RAD) was used. The results are shown in FIG.
（比較例１）
ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ（商標、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のキットに付随する試薬にて調製したプローブを用いた以外は、実施例１と同様にして評価した。結果を図１０（ｂ）に示す。
(Comparative Example 1)
Evaluation was carried out in the same manner as in Example 1 except that a probe prepared with a reagent attached to a kit of AlkPhos Direct (trademark, manufactured by GE Healthcare Bioscience) was used. The results are shown in FIG.
（実施例２）
ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰの濃度を変え、検出を行った。結果を図１１に示す。
(Example 2)
Detection was performed by changing the concentration of NK14-PfuAP. The results are shown in FIG.
Ｚ−ＱＧ ４０％ＤＮＡ濃度 １０ｎｇ／ｕＬ、ＰｆｕＡＰ濃度 ４ｍｇ／ｍＬ以上（モル比でＺ−ＱＧ：ＰｆｕＡＰ＝１：３０以上）でラベル化したプローブにて、発色法にて０．１ｐｇの検出感度を達成した。 Z-QG 40% DNA concentration 10 ng / uL, PfuAP concentration 4 mg / mL or more (Z-QG: PfuAP = 1: 30 or more in molar ratio), 0.1 pg detection sensitivity by color development method Achieved.
（実施例３）
実施例１と同様にしてＺ−ＱＧ ４０％マルチラベル化核酸プローブを調製し、反応液を以下の手順で精製し、未精製のもの、１回精製したものについて、実施例１と同様にしてハイブリダイゼーション、検出を行った。結果を図１２に示す。
(Example 3)
A Z-QG 40% multilabeled nucleic acid probe was prepared in the same manner as in Example 1, and the reaction solution was purified by the following procedure. Unpurified and purified once, as in Example 1. Hybridization and detection were performed. The results are shown in FIG.
＜精製の手順＞
ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−４００ ＨＲ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、２７−５１４０−０１）の下を折り、フタを開けて、カラムに添付されている２ｍＬチューブにセットして７３５×ｇで１分間遠心処理した。カラムを新しい１．５ｍＬチューブにセットし、ＭＴＧ反応液１００μＬをゲル上部に置いて７３５×ｇで４分間遠心処理した。溶出したマルチラベル化核酸プローブ溶液を４℃で保存した。核酸の溶出量はおよそ５０％、未反応のタンパク質の溶出量はおよそ１０％未満であった。
<Purification procedure>
Fold the bottom of MicroSpin S-400 HR Columns (GE Healthcare Biosciences, 27-5140-01), open the lid, set in a 2 mL tube attached to the column, and centrifuge at 735 xg for 1 minute Processed. The column was set in a new 1.5 mL tube, and 100 μL of the MTG reaction solution was placed on the top of the gel and centrifuged at 735 × g for 4 minutes. The eluted multilabeled nucleic acid probe solution was stored at 4 ° C. The elution amount of nucleic acid was about 50%, and the elution amount of unreacted protein was less than about 10%.
＜核酸濃度の定量＞
１×ＴＥバッファ（ｐＨ８．０）にて、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（タカラバイオ社製、Ｆ０５２３）を１０，０００倍に希釈した。ＰＣＲまたはＲｕｎ−ｏｆｆ転写反応により得られた核酸を精製し、０，１，３，１０ｎｇ／μＬの水溶液を１０μＬずつ調製した。この核酸を熱変性後、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ溶液９９０μＬに添加して蛍光強度を測定し（励起波長／蛍光波長：４８０ｎｍ／５２０ｎｍ）、検量線を作成した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ溶液９９０μＬにプローブ精製溶液を１０μＬ添加し、蛍光を測定して検量線から濃度を算出した。タンパク質濃度はＢＣＡ法により定量した。
<Quantification of nucleic acid concentration>
SYBR Green II (manufactured by Takara Bio Inc., F0523) was diluted 10,000 times with 1 × TE buffer (pH 8.0). Nucleic acids obtained by PCR or Run-off transcription reaction were purified, and 10 μL of 0, 1, 3, 10 ng / μL aqueous solutions were prepared. After heat denaturation of this nucleic acid, it was added to 990 μL of SYBR Green II solution, and the fluorescence intensity was measured (excitation wavelength / fluorescence wavelength: 480 nm / 520 nm) to prepare a calibration curve. 10 μL of the probe purification solution was added to 990 μL of the SYBR Green II solution, the fluorescence was measured, and the concentration was calculated from the calibration curve. The protein concentration was quantified by the BCA method.
図１２からわかるように、マルチラベル化核酸プローブをゲルろ過方式のカラムで精製することにより、バックグラウンドが低減された。 As can be seen from FIG. 12, the background was reduced by purifying the multilabeled nucleic acid probe with a gel filtration column.
（実施例４）
＜Ａｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰの合成＞
まず、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１５０μＬ中にて、５０ｍＭ Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、５０ｍＭ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、２５ｍＭ Ａｃ−ＰＬＱＭＲを、４℃で１６時間反応させることによって、ＮＨＳ化ＰＬＱＭＲ（２５ｍＭ）を調製した。一方、２０ｍＭ ５−（３−ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ）−ｄＵＴＰ（ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰ、ＳＩＧＭＡ社製）を含む１００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）の溶液１００μＬに対して、上記で調製したＮＨＳ化ＰＬＱＭＲ溶液を１００μＬ添加し、２５℃で１２時間反応させた。反応終了後、サンプルを超純水で１０倍希釈し、ＨＰＬＣ（日本分光製、高速液体クロマトグラフ・ポンプ：ＴＲＩ ＲＯＴＡＲ−Ｖ型、バリアブル・ループ・インジェクタ：ＶＬ−６１３型、紫外可視分光検出器：ＵＶＩＤＥＣ−１００−ＩＶ型）によって、表６に示す条件で精製を行った。生成物の同定はＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（ＢＲＵＫＥＲ ＤＡＬＴＯＮＩＣＳ製、ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩＩ）によって行った。この際、３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ）をマトリックスとして使用した。
Example 4
<Synthesis of Ac-PLQMR-dUTP>
First, 50 mM N, N′-diisopropylcarbodiimide (DIC), 50 mM N-hydroxysuccinimide (NHS), and 25 mM Ac-PLQMR are reacted at 4 ° C. for 16 hours in 150 μL of N, N-dimethylformamide (DMF). By this, NHS-modified PLQMR (25 mM) was prepared. On the other hand, with respect to 100 μL of a 100 mM borate buffer solution (pH 8.8) containing 20 mM 5- (3-aminoallyl) -dUTP (aminoallyl-dUTP, manufactured by SIGMA), 100 μL of the NHS-modified PLQMR solution prepared above is used. The mixture was added and reacted at 25 ° C. for 12 hours. After completion of the reaction, the sample was diluted 10 times with ultrapure water, and HPLC (manufactured by JASCO, high-performance liquid chromatograph pump: TRI ROTAR-V type, variable loop injector: VL-613 type, UV-visible spectroscopic detector : UVIDEC-100-IV type) under the conditions shown in Table 6. The product was identified by MALDI TOF-MS (manufactured by BRUKER DALTONICS, autoflex III). At this time, 3-hydroxypicolinic acid (3-HPA) was used as a matrix.
Ａｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰを合成した後、逆相ＨＰＬＣを行った際の結果を図１３に示す。ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰの場合（図１４参照）と比較して、疎水側に新たなピークが出現しており、このピークがＡｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰであると推測された。そこで、保持時間１０．９分のピークを回収してＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った。その結果、図１５に示すように、１１９３．２６のピークが確認され、理論分子量と良く一致した結果が得られたため、Ａｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰの合成が示された。 FIG. 13 shows the results when reverse phase HPLC was performed after the synthesis of Ac-PLQMR-dUTP. Compared to the case of aminoallyl-dUTP (see FIG. 14), a new peak appeared on the hydrophobic side, and this peak was assumed to be Ac-PLQMR-dUTP. Therefore, a peak having a retention time of 10.9 minutes was collected and subjected to MALDI TOF-MS analysis. As a result, as shown in FIG. 15, a peak of 1193.26 was confirmed, and the results were in good agreement with the theoretical molecular weight, indicating the synthesis of Ac-PLQMR-dUTP.
＜各溶液の調製＞
表７に示す組成で、以下の溶液を調製した。
ｄＡＴＰと溶媒とを含むｄＡＴＰ含有溶液
ｄＣＴＰと溶媒とを含むｄＣＴＰ含有溶液
ｄＧＴＰと溶媒とを含むｄＧＴＰ含有溶液
ｄＴＴＰと溶媒とを含むｄＴＴＰ含有溶液
Ａｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰと溶媒とを含むＡｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰ含有溶液
<Preparation of each solution>
The following solutions were prepared with the compositions shown in Table 7.
dATP containing solution containing dATP and solvent dCTP containing solution containing dCTP and solvent dGTP containing solution containing dGTP and solvent dTTP containing solution containing dTTP and solvent Ac-PLQMR- containing Ac-PLQMR-dUTP and solvent dUTP-containing solution
＜マルチラベル化核酸プローブの調製＞
まず、マウス由来のＳｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）をコードする遺伝子中の約３００ｂｐをＰＣＲ増幅するプライマを設計した。次に、ＰＣＲ反応液の全ｄＴＴＰのうちの８０％をＡｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰに置き換えて反応液を調製してＰＣＲ（表８参照、９４℃×２ｍｉｎ＋（９４℃×２０ｓｅｃ，５４℃×２０ｓｅｃ，７２℃×３０ｓｅｃ）×４０サイクル）を行うことによって、Ａｃ−ＰＬＱＭＲ ８０％ＤＮＡを得た。結果を図１６に示す。
<Preparation of multi-labeled nucleic acid probe>
First, a primer for PCR amplification of about 300 bp in the gene encoding mouse-derived Sonic hedgehog (Shh) was designed. Next, 80% of the total dTTP in the PCR reaction solution was replaced with Ac-PLQMR-dUTP to prepare a reaction solution, and PCR (see Table 8, 94 ° C. × 2 min + (94 ° C. × 20 sec, 54 ° C. × 20 sec, Ac-PLQMR 80% DNA was obtained by performing (72 ° C. × 30 sec) × 40 cycles). The results are shown in FIG.
Claims (7)
（式（５）中、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、エテニレン基、−（Ｃ ２ Ｈ ４ Ｏ） ｎ −または−（Ｃ ３ Ｈ ６ Ｏ） ｎ −（ここで、ｎ＝２，４，８，１２，２４）基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であり、Ｚは、ジニトロフェニル基またはＬ−３，４−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基であり、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基である。また、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。） A nucleic acid detection kit comprising an enzyme substrate-modified nucleoside triphosphate represented by the following formula (5) and transglutaminase (TGase) .
(In formula (5), X and Y are each independently an ethenylene group, — (C 2 H 4 O) n — or — (C 3 H 6 O) n — (where n = 2, 4). , 8, 12, 24) which may be substituted with an alkylene group having 1 to 48 carbon atoms or an alkenylene group having 2 to 48 carbon atoms, and Z is a dinitrophenyl group or L-3,4-dihydroxy group. An alkyl group having 1 to 48 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 48 carbon atoms, an aryl group having 6 to 48 carbon atoms, an aryloxy group having 6 to 48 carbon atoms, and 7 carbon atoms, which may be substituted with a phenyl group An arylalkyl group having ˜48 or an arylalkyloxy group having 7 to 48 carbon atoms, B is a hydrogen atom or a hydroxyl group, and Y and Z are independently substituted at least one by an amino acid other than Lys. Even It has.)
前記Ｘはエテニレン基、Ｙはメチレン基であり、Ｚはベンジルオキシ基であることを特徴とする核酸検出用キット。 The nucleic acid detection kit according to claim 1 ,
The kit for nucleic acid detection, wherein X is an ethenylene group, Y is a methylene group, and Z is a benzyloxy group.
酵素と、蛍光色素と、放射性同位体を含む化合物と、磁気的に検出可能な化合物と、熱的に検出可能な化合物と、電気的に検出可能な化合物とのうち少なくとも１つである標識部分を含む標識化合物を含み、前記標識化合物がリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有することを特徴とする核酸検出用キット。 A nucleic acid detection kit according to claim 1 or 2 ,
And enzyme is at least one of a fluorescent dye, a compound comprising a radioactive isotope, a magnetically detectable compound, and thermally detectable compound, an electrically detectable compound labeled look containing a labeled compound comprising a moiety, the labeled compound is lysine (Lys) residue or a nucleic acid detection kit, characterized in that it comprises a primary amine.
前記リシン（Ｌｙｓ）残基が、ＭＴＧに認識されるアミノ酸配列中に存在することを特徴とする核酸検出用キット。 A nucleic acid detection kit according to claim 3 ,
A kit for detecting nucleic acid, wherein the lysine (Lys) residue is present in an amino acid sequence recognized by MTG.
前記標識部分が、酵素および蛍光色素のうち少なくとも１つであることを特徴とする核酸検出用キット。 The nucleic acid detection kit according to claim 3 or 4 ,
The nucleic acid detection kit, wherein the labeling part is at least one of an enzyme and a fluorescent dye.
前記酵素が、超好熱菌由来の酵素であることを特徴とする核酸検出用キット。 A nucleic acid detection kit according to any one of claims 3 to 5 ,
A nucleic acid detection kit, wherein the enzyme is an enzyme derived from a hyperthermophilic bacterium.
前記Ｂが水素原子の場合には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのうち少なくとも１つ、前記Ｂがヒドロキシル基の場合には、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰのうち少なくとも１つを含むことを特徴とする核酸検出用キット。 A nucleic acid detection kit according to any one of claims 1 to 6 ,
When B is a hydrogen atom, it contains at least one of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, and when B is a hydroxyl group, it contains at least one of ATP, CTP, GTP, and UTP. Nucleic acid detection kit.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010049631A JP5704481B2 (en) | 2010-01-22 | 2010-03-05 | Nucleic acid detection kit |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010011720 | 2010-01-22 | ||
| JP2010011720 | 2010-01-22 | ||
| JP2010049631A JP5704481B2 (en) | 2010-01-22 | 2010-03-05 | Nucleic acid detection kit |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2011169878A JP2011169878A (en) | 2011-09-01 |
| JP5704481B2 true JP5704481B2 (en) | 2015-04-22 |
Family
ID=44684138
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010049631A Active JP5704481B2 (en) | 2010-01-22 | 2010-03-05 | Nucleic acid detection kit |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5704481B2 (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5509440B2 (en) * | 2012-06-22 | 2014-06-04 | 国立大学法人九州大学 | Method for producing protein-nucleic acid complex and method for detecting target |
| WO2024034371A1 (en) * | 2022-08-10 | 2024-02-15 | 株式会社島津製作所 | Measurement method |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3732145A1 (en) * | 1987-09-24 | 1989-04-06 | Merck Patent Gmbh | METHOD AND REAGENT FOR CARRYING OUT HYBRIDIZATION REACTIONS |
| JPH0889278A (en) * | 1994-09-29 | 1996-04-09 | Ajinomoto Co Inc | Modified protein for introducing gene and its production |
| GB9602028D0 (en) * | 1996-02-01 | 1996-04-03 | Amersham Int Plc | Nucleoside analogues |
| NZ507848A (en) * | 1996-10-28 | 2005-01-28 | Univ Washington | Method of increasing the mutation rate of a virus in a non-human by administering an RNA nucleoside analogue to a virally infected cell |
| US5986086A (en) * | 1997-06-20 | 1999-11-16 | Amersham Pharmacia Biotech Inc. | Non-sulfonated cyanine dyes for labeling nucleosides and nucleotides |
| FR2769315B1 (en) * | 1997-10-03 | 2001-06-08 | Cis Bio Int | FLUORESCENT CONJUGATES OF NUCLEOSIDES OR NUCLEOTIDES, PROCESS FOR THEIR PREPARATION AND THEIR USE |
| JP2000300287A (en) * | 1999-03-15 | 2000-10-31 | Shinichiro Nishimura | Introduction of sugar chain by using transglutaminase |
| JP2001288197A (en) * | 2000-04-10 | 2001-10-16 | Fuji Photo Film Co Ltd | Fluorescent nucleotide |
| MY134070A (en) * | 2001-01-22 | 2007-11-30 | Isis Pharmaceuticals Inc | Nucleoside derivatives as inhibitors of rna-dependent rna viral polymerase |
| DE10120797B4 (en) * | 2001-04-27 | 2005-12-22 | Genovoxx Gmbh | Method for analyzing nucleic acid chains |
| JP4604201B2 (en) * | 2006-08-02 | 2011-01-05 | 国立大学法人九州大学 | Site-specific linkage of foreign molecules to proteins and their use |
| JP5146785B2 (en) * | 2008-07-24 | 2013-02-20 | 国立大学法人九州大学 | Enzyme substrate modified nucleoside triphosphate derivatives |
| JP4621926B2 (en) * | 2008-07-24 | 2011-02-02 | 国立大学法人九州大学 | Enzyme substrate-modified nucleoside triphosphate, nucleic acid probe, multilabeled nucleic acid probe, method for producing multilabeled nucleic acid probe, and method for detecting target nucleic acid |
-
2010
- 2010-03-05 JP JP2010049631A patent/JP5704481B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2011169878A (en) | 2011-09-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4621926B2 (en) | Enzyme substrate-modified nucleoside triphosphate, nucleic acid probe, multilabeled nucleic acid probe, method for producing multilabeled nucleic acid probe, and method for detecting target nucleic acid | |
| US6723509B2 (en) | Method for 3′ end-labeling ribonucleic acids | |
| Riedl et al. | Labelling of nucleosides and oligonucleotides by solvatochromic 4-aminophthalimide fluorophore for studying DNA–protein interactions | |
| US10526652B2 (en) | Modified nucleotides methods and kits | |
| JP4604201B2 (en) | Site-specific linkage of foreign molecules to proteins and their use | |
| US8536323B2 (en) | Modified nucleotides | |
| EP2669291A1 (en) | Modified Nucleotides Methods and Kits | |
| JP5704481B2 (en) | Nucleic acid detection kit | |
| JP5509440B2 (en) | Method for producing protein-nucleic acid complex and method for detecting target | |
| Leone et al. | Glyoxal‐Linked Nucleotides and DNA for Bioconjugations and Crosslinking with Arginine‐Containing Peptides and Proteins | |
| JP5146785B2 (en) | Enzyme substrate modified nucleoside triphosphate derivatives | |
| JP4518754B2 (en) | Nucleotide chain modification method | |
| US20200399683A1 (en) | Composition and Methods For Affinity Directed Enrichment of Rare Species | |
| JP5569768B2 (en) | Nucleoside triphosphate derivative, nucleic acid probe, multi-labeled nucleic acid probe, and method for detecting target nucleic acid | |
| JPH01500353A (en) | Nucleic acid detection probe containing 2'-deoxyadenosine derivative | |
| JP6146797B2 (en) | HER2 protein detection probe, method for producing HER2 protein detection probe, and method for detecting HER2 protein | |
| Englert et al. | Aptamer-based proximity labeling guides covalent RNA modification | |
| JPWO2006106930A1 (en) | Nucleic acid probe containing Eu3 + complex and nucleic acid analysis method using the same | |
| JP2003246794A (en) | Nucleotide chain modification method | |
| JP2006132980A (en) | Method for fixing protein | |
| Koorsen | The association of the secondary DNA-binding site of linker histone H5 in a nucleosome | |
| WO2016148556A1 (en) | Analysis of single-stranded rna |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130208 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140701 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140828 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150203 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150213 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5704481 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |