JP5569768B2 - ヌクレオシド三リン酸誘導体、核酸プローブ、マルチラベル化核酸プローブおよび標的核酸の検出方法 - Google Patents
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(式(1)中、Xは、エチニル基またはアジド基を有する置換基、Wは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(2)中、X1およびX2のうち少なくとも1つは、エチニル基またはアジド基を有する置換基で残りは水素原子を表し、Wは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(3)中、Xは、エチニル基またはアジド基を有する置換基、Wは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(4)中、Xは、エチニル基またはアジド基を有する置換基、Wは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、エチニル基またはアジド基を有する。エチニル基またはアジド基を有するヌクレオシド三リン酸誘導体としては、エチニル基またはアジド基を有する、ウリジン三リン酸(uridine triphosphate:UTP)誘導体、アデノシン三リン酸(adenosine triphosphate:ATP)誘導体、グアノシン三リン酸(guanosine triphosphate:GTP)誘導体、シチジン三リン酸(cytidine triphosphate:CTP)誘導体、デオキシウリジン三リン酸(deoxyuridine triphosphate:dUTP)誘導体、デオキシアデノシン三リン酸(deoxyadenosine triphosphate:dATP)誘導体、デオキシグアノシン三リン酸(deoxyguanosine triphosphate:dGTP)誘導体、デオキシシチジン三リン酸(deoxycytidine triphosphate:dCTP)誘導体などが挙げられる。本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体において、エチニル基またはアジド基は、例えば、ウラシル、アデニン、グアニン、シトシンの部分に直接または置換基を介して結合されている。
(式(1)中、Xは、エチニル基またはアジド基を有する置換基、Wは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(2)中、X1およびX2のうち少なくとも1つは、エチニル基またはアジド基を有する置換基で残りは水素原子を表し、Wは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(3)中、Xは、エチニル基またはアジド基を有する置換基、Wは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(4)中、Xは、エチニル基またはアジド基を有する置換基、Wは水素原子またはヒドロキシル基を表す。)
(式(5)中、YおよびZは、それぞれ独立して2価の連結基を表す。)
(式(6)中、YおよびZは、それぞれ独立して2価の連結基を表す。)
本実施形態に係る核酸プローブは、構成単位として、前記ヌクレオシド三リン酸誘導体を調製したのち、このヌクレオシド三リン酸誘導体が複数個導入されている核酸であり、核酸部分が、検出対象である標的核酸の標的分子特異的配列の全部または一部に相補的な配列を有するものである。
本実施形態に係るマルチラベル化核酸プローブは、上記核酸プローブにおける構成単位であるヌクレオシド三リン酸誘導体のアルキン(エチニル基)と、アジド基を有し標識部分を含む標識化合物のアジド基との反応により、複数の標識部分が導入されているものである。例えば、アルキン(エチニル基)が複数箇所に導入された核酸プローブであるアルキン化RNAに、標識蛍光色素を導入したアジド化合物、標識酵素を導入したアジド化合物などを結合させることによって、RNAと標識部分が1:nであるマルチラベル化核酸プローブを創製することができる(図2)。核酸プローブにおけるエチニル基と標識化合物のアジド基との簡易な反応によって、簡単かつ短時間に複数の化合物を結合させることができる。
(式(7)中、Rは、標識部分を少なくとも1つ含む置換基であり、nは1以上である。nは、例えば、1〜30である。)
(式(8)中、Rは、標識部分を少なくとも1つ含む置換基であり、mは1以上である。mは、例えば、1〜30である。)
(式(9)中、Aは、標識部分を表し、nは1〜24を表す。)
本実施形態に係る標的核酸の検出方法は、構成単位として上記ヌクレオシド三リン酸誘導体が複数個導入されている核酸である核酸プローブにおけるアルキン(エチニル基)と、アジド基を有し標識部分を含む標識化合物のアジド基との反応、または、核酸プローブにおけるアジド基と、エチニル基を有し標識部分を含む標識化合物のエチニル基との反応により、複数の標識部分が導入されているマルチラベル化核酸プローブであって、標識部分が容易に検出可能な性質を有し、かつ核酸部分が標的核酸に特異的に結合可能な塩基配列を有するものであるマルチラベル化核酸プローブを準備し、マルチラベル化核酸プローブと対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させ、結合しているマルチラベル化核酸プローブを、標識部分により検出する工程を含む(図6参照)。
<アルキン化UTPの合成・精製>
アルキン化UTPの合成スキームは、図5に示す通りである。
核酸プローブ(アルキン化RNA)をT7 polymeraseを用いて、表2の反応条件で調製した(配列番号1)。反応は、37℃で2時間反応させて行った。アルキン化UTPの導入量を0%、40%、80%と変えて核酸プローブの調製を行った。
(1)NHS化アジドの調製
まず、100mMのN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC、和光純工業株式会社製)、100mMのN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS、キシダ化学株式会社製)、50mMのO−(2−Azidoethyl)−O−[2−(diglycolyl−amino)ethyl]heptaethylene glycol(シグマ・アルドリッチ社製)を、室温(調製した日は20℃)でジメチルスルホキシド(DMSO、キシダ化学株式会社製)2mL中で20時間反応させることにより、O−(2−Azidoethyl)−O−[2−(diglycolyl−amino)ethyl]heptaethylene glycolをNHS化した(NHS化アジド)。
10mMのNHS化アジドと、5mg/mL(100μM)の大腸菌由来アルカリホスファターゼ(AP、和光純薬工業株式会社製)とを、50mM ホウ酸緩衝液(pH8.8)中において、室温(調製した日は20℃)で一晩(16時間)反応させ、アジド化されたAlkaline phosphatase(アジド化AP)を得た。なお、APをアジド化する際、AP(8μM)と反応させるNHS化アジドの量を等量(8μM)、10倍量(80μM)、100倍量(800μM)と3段階に設定した。以下、下記の通り表記する。
1倍量のNHS化アジドでアジド化したAP : 1×アジド化AP
10倍量のNHS化アジドでアジド化したAP : 10×アジド化AP
100倍量のNHS化アジドでアジド化したAP : 100×アジド化AP
Protein Standard(Bovine Serum Albumin、シグマ・アルドリッチ社製)を0.1mg/mL〜1.0mg/mLの6段階に水で希釈したものと、各アジド化APを水で5倍希釈したものを、96穴プレート(ポリソープ、Nunc社製)にそれぞれ10μLずつ添加し、そこにビシンコニン酸溶液(シグマ・アルドリッチ社製)と硫酸銅溶液(Copper(II) sulfate solution、シグマ・アルドリッチ社製)を50:1で混合した調製液を200μL添加して、37℃で30分反応させた。反応終了後、プレートリーダ(Power Wave X、BIO−TEK INSTRUMENTS社製)で562nmの吸光度を測定した。Protein Standardの結果より検量線を作成して各アジド化APの濃度を定量した結果、1×アジド化APは2.2mg/mL、10×アジド化APは2.29mg/mL、100×APは2.23mg/mLであった。
各アジド化APを10mMホウ酸緩衝液で2.8μMに希釈したものを、APの基質である1mM 4−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム・6水和物(以下p−NPP、1M Tris−HCl pH8.0で調製)990μLに10μL添加し(アジド化APの終濃度28nM)、25℃で80秒間反応させ、p−NPPがAPによって脱リン酸化されて生じるp−ニトロフェノールの410nmの吸光度を測定することによって、APの酵素活性を評価した。対照サンプルとしてアジド化してないAPも測定した。
(1)アルキン化BSAの調製
まず、100mM N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC、和光純工業株式会社製)、100mM N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS、キシダ化学株式会社製)、50mM 4−ペンチン酸(シグマ・アルドリッチ社製)を撹拌しながら室温(調製した日は20℃)で20時間反応させることにより、NHS化アルキンを調製した。その後、7.5μM BSAと1mM NHS化アルキンを100mMホウ酸緩衝液(pH8.8)中で室温(調製した日は20℃)下で16時間撹拌した。反応後はPD−10カラムで精製し、限外濾過カラムで濃縮した後、BCA法でアルキン化BSAの濃度を定量した。
Protein Standard(Bovine Serum Albumin、シグマ・アルドリッチ社製)を0.1mg/mL〜1.0mg/mLの6段階に水で希釈したものと、アルキン化BSAを水で5倍希釈したものを、96穴プレート(ポリソープ、Nunc社製)にそれぞれ10μLずつ添加し、そこにビシンコニン酸溶液(シグマ・アルドリッチ社製)と硫酸銅溶液(Copper(II) sulfate solution、シグマ・アルドリッチ社製)を50:1で混合した調製液を200μL添加して37℃で30分反応させた。反応終了後、プレートリーダ(Power Wave X、BIO−TEK INSTRUMENTS社製)で562nmの吸光度を測定した。Protein Standardの結果より検量線を作成してアルキン化BSAの濃度を定量した結果、4.65mg/mLであった。
各アジド化AP(1×アジド化AP、10×アジド化AP、100×アジド化AP)10μg、アルキン化BSA 10μg、硫酸銅(CuSO4)1mM、Tris[(1−benzyl−1H−1,2,3−triazol−4−yl)methyl]amine(TBTA、シグマ・アルドリッチ社製)0.1mM、アスコルビン酸ナトリウム 1mMの条件の下、TBS(Tris−buffered saline)緩衝液(pH7.7)中で25℃、16時間反応させた。反応後、12%アクリルアミドゲルでSDS−PAGEを行い、CBB染色で染色した。
10mM各ホウ酸緩衝液(pH8.8)で0.5mg/mL(10μM)に希釈したアジド化AP 50μL、4%炭酸水素ナトリウム溶液 50μL、0.1% 2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム(TNBS)溶液50μLを96穴プレート(ポリソープ、Nunc社製)に入れ、40℃で2時間振盪しながら反応させた後、2%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)50μLと1M塩酸25μLを添加して反応を停止した。その後、プレートリーダ(Power Wave X、BIO−TEK INSTRUMENTS社製)で340nmの吸光度を測定した。
それぞれ調製したアルキン化RNAとアジド化APとを、Huisgen環化反応により結合させ、マルチラベル化核酸プローブを調製した。アルキン化RNAとして、アルキン化UTP導入量が0%(Negative control)、40%、80%(それぞれ、40%アルキン化RNA、80%アルキン化RNAと表記)のものを用い、アジド化APとして、1×アジド化AP、10×アジド化AP、100×アジド化APを用いた。反応条件を表4に示す。反応は、25℃で6時間あるいは16時間反応させて行った。サブマリン型電気泳動装置によるアガロース電気泳動の結果を図14に示す。
ドットブロットにより、Huisgen環化反応により調製したマルチラベル化核酸プローブの検出感度の評価を行った。なお、ハイブリダイセーション時の各種溶液組成およびプロトコールは、市販の検出キットAlkphos Direct(GEヘルスケアバイオサイエンス製)に準拠した。ターゲットRNAとして、プローブと相補的なRNA(センス鎖)を用いた。
RNA polymeraseにより転写を行うことによって、センス鎖RNA、アンチセンス鎖RNAを調製した。標的核酸(ターゲット)としては、マウス中にて発現パターンが既知であるSonic hedgehog(SHH)というタンパク質をコードするmRNA(shh)をモデルとした。そこでまず、SHHをコードした遺伝子を含むプラスミドをテンプレートとしてPCRを行い、長さ約1000bpのDNA断片を得た。この際、上流にはT3プロモータ、下流にはT7プロモータが含まれるようにプライマ設計を施した。次に得られたPCR産物を基に、T3 polymerase(センス鎖(S) 調製用)を用いてRNA合成を行い、T3 polymeraseで転写反応を行ってセンス鎖配列を調製した(配列番号2)。同様にT7 polymerase(アンチセンス鎖(AS) 調製用)を用いてRNA合成を行い、T7 polymeraseにで転写反応を行ってアンチセンス鎖配列を合成した(配列番号3)。条件は以下の表3に示す。反応は37℃で2時間行い、得られたセンス鎖RNA、アンチセンス鎖はエタノール沈殿によって回収し、TEバッファ20μLで縣濁した。RNase inhibitorとDTTを添加し、RNaseによる分解を抑えた。
転写反応後、Nano DropにてRNA濃度を測定した。その結果、センス鎖は1019ng/μL、アンチセンス鎖は815ng/μLであった。
まず、ターゲットとなるセンス鎖RNA、アンチセンス鎖RNAを100fg/μL〜50ng/μLの7段階の濃度に滅菌水を用いて希釈したものを、それぞれ1μLずつプラスのチャージを持つメンブレン(Hybond N+、GEヘルスケアバイオサイエンス社製)にアプライした。その後、80℃で2時間ベーキングした。
上記検出用メンブレンの作製で作製したメンブレンをキットに添付されているハイブリダイゼーションバッファに移し、55℃で30分間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、上述したマルチラベル化核酸プローブを濃度が50ng/mLとなるように添加して55℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後、メンブレンをWashIバッファ(表6)に移し、55℃で振とうしながら15分洗浄した。この操作を2回繰り返した。その後、WashIIバッファ(表7)にて洗浄した。この操作を2回繰り返した。
NTMTxバッファ(表8)で室温、5分間洗浄したメンブレンをStaining溶液(375μg/mL NBT+188μg/mL BCIP in NTMTx)に移し、室温で4時間、遮光下で発色させた。結果を図15に示す。なお、NBTとは、Nitro blue tetrazolium chlorideの略称であり、BCIPは、5−Bromo−4−chloro−3−indolyl phosphate,toluidine saltのことである。
Claims (7)
- 下記式(1)で示されることを特徴とするヌクレオシド三リン酸誘導体。
(式(1)中、Xは、式(5)で示される置換基を表し、式(5)中、Yはプロペニレン基、Zは炭素数1〜48のアルキレン基、Wはヒドロキシル基を表す。)
- 構成単位として、請求項1に記載のヌクレオシド三リン酸誘導体が複数個導入されている核酸であり、
前記核酸がRNAであることを特徴とする核酸プローブ。 - 請求項2に記載の核酸プローブにおけるエチニル基と、アジド基を有し標識部分を含む標識化合物のアジド基との反応により、複数の標識部分が導入されていることを特徴とするマルチラベル化核酸プローブ。
- 請求項3に記載のマルチラベル化核酸プローブであって、
前記標識部分が、酵素および蛍光色素のうち少なくとも1つであることを特徴とするマルチラベル化核酸プローブ。 - 請求項4に記載のマルチラベル化核酸プローブであって、
前記酵素が、超好熱菌由来の酵素であることを特徴とするマルチラベル化核酸プローブ。 - 標的核酸の検出方法であって、
請求項3〜5のいずれか1項に記載のマルチラベル化核酸プローブと、対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させ、結合している前記マルチラベル化核酸プローブを、前記標識部分により検出することを特徴とする標的核酸の検出方法。 - 標的核酸の検出方法であって、
請求項2に記載の核酸プローブと、対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させた後、
前記核酸プローブにおけるエチニル基と、アジド基を有し標識部分を含む標識化合物のアジド基とを反応させて複数の標識部分を導入し、結合している前記核酸プローブを、前記標識部分により検出することを特徴とする標的核酸の検出方法。
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