JP5555166B2 - 新規エピガロカテキンガレート３量体、およびエピガロカテキンガレート重合体を含むα−グルコシダーゼ阻害剤 - Google Patents

新規エピガロカテキンガレート３量体、およびエピガロカテキンガレート重合体を含むα−グルコシダーゼ阻害剤 Download PDF

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Description

本発明は、新規エピガロカテキンガレート３量体、およびエピガロカテキンガレート重合体を含むα−グルコシダーゼ阻害剤に関する。
α-グルコシダーゼ阻害物質は、小腸上皮上に局在するα-グルコシダーゼを阻害し、糖質の分解・吸収を抑制・遅延することにより、血糖値上昇抑制作用を有する。よって、α-グルコシダーゼ阻害物質は高血糖症状の慢性化に由来する、糖尿病や肥満症など種々の疾患に有用である。１９３３年に麦芽成分にα−グルコシダーゼ阻害活性が見出して以来、多くの小麦や豆類など植物由来のα−グルコシダーゼ阻害物質が発見されてきた。
１９６６年には、微生物代謝産物から、α−グルコシダーゼ阻害活性をもつノジリマイシンが単離され、構造決定された。この類縁化合物である１−デオキシノジリマイシンが桑葉の抽出物から得られ、α−グルコシダーゼ阻害活性を有することが知られており、その活性低下をさせないための抽出方法が開示されている（特許文献１）。
また、コタラヒムブツの根からの抽出物から単離されたスルフォキシドを有する１３員環シクリトール構造を持つものは、ＩＣ５０が０．０９３μＭと高いマルターゼ阻害活性を有することが報告されている（特許文献２）。
また、アサガオや紫さつまいもの根から単離されたアントシアニン化合物として、ジアシル化されたペラルゴニジン（ＩＣ５０は６０−１０７μＭ）、シアニジン（ＩＣ５０は１９３μＭ）、ペオニジンの３−ソフォロシド−５−グルコシド（ＩＣ５０は２００μＭ）は、マルターゼ阻害活性を有することが報告されている（非特許文献１）。また、茶葉中に含まれるテアシネンシンＡ（ＩＣ５０は１４２μＭのマルターゼ阻害活性）、ガロイル基を有するテアフラビン誘導体、エピアフゼレチンガレートを構成ユニットとして有するプロアントシアニジンなどに、マルターゼ阻害活性が認められている。しかし、ガロイル基を有するテアフラビン誘導体はＩＣ５０が１０〜１３６μＭのマルターゼ阻害活性を有するが、茶葉中の含有量は０．１〜０．２％と非常に少ない（非特許文献２）。
紅茶のテアフラビンおよび緑茶のカテキン類がα−グルコシダーゼ阻害活性を有することは報告されており（非特許文献２）、カテキン類の中では、３位にガロイル基をもつ（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（以下、「ＥＧＣＧ」ともいう）や（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート、テアフラビン類ではテアフラビン−３−Ｏ−ガレート、テアフラビン−３，３’−ジ−Ｏ−ガレートに活性が認められている。紅茶のα−グルコシダーゼ阻害活性については、その分画物などについても調べられており、発酵による重合の進んだ高分子画分にも活性があることが知られている（非特許文献３）。
特開２００７−６０９０８ 特開２００８−１３７９２５ 特開２００７−２３１００９
J. Agric. Food Chem.2001,49,1952-1956 J. Agric. Food. Chem., 55, 99-105, 2007 Chem. Pharm. Bull. 56(3)、266-272、2008
上記のように、α−グルコシダーゼ阻害活性を有する植物抽出物等に関しては報告がなされている。しかし、例えばある植物の抽出物で所望の効果があったとしても、その中に含まれる活性成分を明確にしない限り、天然物が起源であるので、安定的にα−グルコシダーゼ阻害剤を提供することは困難である。また、嗜好性の低い植物由来の阻害剤の場合、飲食物として利用するには、香味および安全性に影響を及ぼすことが予想される。
本発明者らは、飲食物として利用することを考慮し、日常飲用されている茶に含まれる成分に着目し鋭意検討したところ、ＥＧＣＧ重合体がα−グルコシダーゼの働きを抑制することを明らかにした。なかでも新規化合物である(2R,3R)-8-(((2R,3R)-8-(((2R,3R)-5,7-dihydroxy-3-(3,4,5-trihydroxybenzoyloxy)-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-6-yl)methyl)-5,7-dihydroxy-3-(3,4,5-trihydroxybenzoyloxy)-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-6-yl)methyl)-5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-3-yl 3,4,5-trihydroxybenzoate（以下、「ウーロンホモビスフラバン−トリマー−２」という）、(2R,3R)-8-(((2R,3R)-6-(((2R,3R)-5,7-dihydroxy-3-(3,4,5-trihydroxybenzoyloxy)-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-6-yl)methyl)-5,7-dihydroxy-3-(3,4,5-trihydroxybenzoyloxy)-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-8-yl)methyl)-5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-3-yl 3,4,5-trihydroxybenzoate（以下、「ウーロンホモビスフラバン−トリマー−４」という）、(2R,3R)-8-(((2R,3R)-8-(((2R,3R)-8-(((2R,3R)-5,7-dihydroxy-3-(3,4,5-trihydroxybenzoyloxy)-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-8-yl)methyl)-5,7-dihydroxy-3-(3,4,5-trihydroxybenzoyloxy)-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-6-yl)methyl)-5,7-dihydroxy-3-(3,4,5-trihydroxybenzoyloxy)-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-6-yl)methyl)-5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-3-yl 3,4,5-trihydroxybenzoate（以下、「ウーロンホモビスフラバン−テトラマー−１」という）、(2R,2'R,3R,3'R)-8,8'-(2R,2'R,3R,3'R)-8,8'-methylenebis(5,7-dihydroxy-3-(3,4,5-trihydroxybenzoyloxy)-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-8,6-diyl)bis(methylene)bis(5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)chroman-8,3-diyl) bis(3,4,5-trihydroxybenzoate)（以下、「ウーロンホモビスフラバン−テトラマー−２」という）に阻害活性が顕著であり、単量体であるＥＧＣＧや、ＥＧＣＧの２量体であるテアフラビン類やＴＳＮ−Ａより強い阻害活性を示した。特に、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−４、ウーロンホモビスフラバン−テトラマー−１はＥＧＣＧ単量体に比べ１０倍以上強い阻害活性が認められた。また２量体の中では、ＴＳＮ−Ｄ、ウーロンホモビスフラバン−Ｂが強いα−グルコシダーゼ阻害活性を有することを見出した。
これらの化合物は、小腸上皮上に局在するα-グルコシダーゼを阻害し、糖質の分解を抑えて吸収を抑制及び／又は遅延することにより、血糖値の上昇を抑制する。また何れの化合物も烏龍茶に含まれるカテキン（ＥＧＣＧ）重合体であることから、香味、安全性に優れており、長期摂取が可能である。これらの知見から、α−グルコシダーゼ阻害剤を飲食品などに添加することで、食事由来の糖分の吸収抑制、さらには高血糖症状の慢性化に起因する糖尿病の長期的な予防及び／又は治療を目的とした飲食品を提供することができることを見いだし、本発明を完成した。
すなわち本発明は、新規化合物である式１または式２：
Figure 0005555166
Figure 0005555166
 の化合物（ここで、ＲはガロイルまたはＨである）、またはその塩である。
さらに本発明は、式１または２の化合物またはその塩を含む飲食品または医薬組成物である。
また本発明は、ＥＧＣＧ２量体、３量体および／または４量体を有効成分とするα−グルコシダーゼ阻害剤である。また、本発明は、ＥＧＣＧ３量体および／または４量体を有効成分とするα−グルコシダーゼ阻害剤である。
また本発明は、ＥＧＣＧ２量体がテアシネンシン−Ｄおよび／またはウーロンホモビスフラバン−Ａであり、ＥＧＣＧ３量体がウーロンホモビスフラバン−トリマー−１、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−２、およびウーロンホモビスフラバン−トリマー−４から選択される一以上であり、ＥＧＣＧ４量体がウーロンホモビスフラバン−テトラマー−１および／またはウーロンホモビスフラバン−テトラマー−２である、ＥＧＣＧ２量体、３量体および／または４量体を有効成分とするα−グルコシダーゼ阻害剤である。さらに本発明は、ＥＧＣＧ３量体がウーロンホモビスフラバン−トリマー−４であり、ＥＧＣＧ４量体がウーロンホモビスフラバン−テトラマー−１である、ＥＧＣＧ３量体または４量体を有効成分とするα−グルコシダーゼ阻害剤である。
さらに本発明は、上記α−グルコシダーゼ阻害剤を添加した血糖値上昇抑制用組成物、または糖尿病予防及び／又は治療剤である。

本発明は、新規エピガロカテキンガレート３量体およびエピガロカテキンガレート重合体を含むα−グルコシダーゼ阻害剤である。これらのα-グルコシダーゼ阻害剤は、小腸上皮上に局在するα-グルコシダーゼを阻害し、糖質の分解を抑えて吸収を抑制及び／又は遅延することにより、血糖値の上昇を抑制する。よって、これらのα-グルコシダーゼ阻害剤を飲食品などに添加することで、食事由来の糖分の吸収抑制、さらには高血糖症状の慢性化に起因する糖尿病の長期的な予防及び／又は治療を目的とした飲食品を提供することができる。
図１は、化合物３の１ＨＮＭＲスペクトルを示す。 図２は、化合物３の１３ＣＮＭＲスペクトルを示す。 図３は、化合物４の１ＨＮＭＲスペクトルを示す。 図４は、化合物４の１３ＣＮＭＲスペクトルを示す。 図５は、化合物１の１ＨＮＭＲスペクトルを示す。 図６は、化合物１の１３ＣＮＭＲスペクトルを示す。 図７は、化合物２の１ＨＮＭＲスペクトルを示す。 図８は、化合物２の１３ＣＮＭＲスペクトルを示す。 図９は、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−２の構造を示す。 図１０は、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−４の構造を示す。 図１１は、ウーロンホモビスフラバン−テトラマー−１の構造を示す。 図１２は、ウーロンホモビスフラバン−テトラマー−２の構造を示す。

新規化合物
本発明は、ＥＧＣＧ３量体の新規化合物に関する。
本発明の化合物は、式１または式２：
Figure 0005555166
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 の化合物（ここで、ＲはガロイルまたはＨである）、またはその塩である。
式１または式２の化合物中には、構成単位のクロマン環の２位および３位に不斉中心が存在する。
式１の化合物はモノマーであるＥＧＣＧの結合様式に基づいて、ＥＧＣＧ６：８ＥＧＣＧ６：８ＥＧＣＧと表記することができる。式２の化合物はモノマーであるＥＧＣＧの結合様式に基づいて、ＥＧＣＧ８：８ＥＧＣＧ６：６ＥＧＣＧと表記することができる。
式１の化合物においてＲがガロイルの化合物は、本明細書でいうウーロンホモビスフラバン−トリマー−２である。また式２の化合物においてＲがガロイルの化合物は、本明細書でいうウーロンホモビスフラバン−トリマー−４である。ガロイル基は、加水分解によって除去することができる。そのような加水分解は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム及び炭酸ナトリウム等の塩基性化合物の水溶液を用いて、またはタンナーゼ活性を有する酵素等の加水分解酵素を用いて行なうことができる。このような加水分解では、通例、３個のガレート基のうち、１個、２個または３個が除去された複数種の化合物の混合物を与える。この場合、例えば、HP-20（三菱化学株式会社製）などのスチレン系吸着樹脂やShephadex LH-20のようなデキストラン系樹脂によるオープンカラムクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィー（HPLC）等、公知の精製方法を用いて、そのような混合物から各化合物を単離することができる。
本発明は式１または式２の化合物の塩にも関する。
そのような塩としては、式１または２の化合物から形成できる塩であれば特に制限はないが、医薬的に許容可能な塩が好ましい。
例えば、式１または２の化合物のリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等の、周期表の１族または２族の金属元素との金属塩が挙げられる。このような金属塩は、例えば、式１または２の化合物の水酸基（フェノール性水酸基、ＲのいずれかまたはすべてがＨの場合の水酸基）において形成することができる。
例えば、非プロトン性溶媒中、式１または２の化合物と、金属ナトリウムまたは水素化ナトリウムとを反応させて、水酸基（−ＯＨ）をナトリウムアルコキシド基（−ＯＮａ）に変換することによって、式１または２の化合物のナトリウム塩を製造することができる。そして、金属ナトリウムまたは水素化ナトリウムの使用量を調節することによって、式１または２の化合物に含まれる水酸基の総てをナトリウムアルコキシド基に変換することができ、また、水酸基の一部のみをナトリウムアルコキシド基に変換することもできる。
本発明の式１または２で表される化合物は以下のようにして製造することができる。
Ｒがいずれもガレート基である化合物は、ＥＧＣＧを溶媒中、酸の存在下でホルムアルデヒドと反応させることによって製造することができる。
反応に使用することができる溶媒としては、例えば、メタノール及びエタノール、n-プロパノール、iso−プロパノール等のアルコール類が挙げられる。溶媒の使用量については特に制限はないが、例えば、１質量部のＥＧＣＧに対して２０〜２００質量部の溶媒を用いることができる。
酸としては、例えば、塩酸、硫酸及び硝酸等の無機酸、及び、蟻酸、酢酸等の有機酸等を用いることができる。酸の使用量については特に制限はないが、例えば、１モルのＥＧＣＧに対して０．０１〜２モルの酸を用いることができる。
ホルムアルデヒドは、例えば、１モルのＥＧＣＧに対して１〜１００モルで用いることができる。
反応の温度及び時間は、用いる溶媒量等によって変わり得るが、例えば、反応温度は−１０〜５０℃、反応時間は０．２〜１２時間である。典型的には、反応温度は室温（２５℃程度）である。
ＲがいずれもＨ（水素原子）である式１または２の化合物は、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートの代わりに、（−）−エピガロカテキンを用いて、前記と同様にホルムアルデヒドと反応させることによって製造することができる。
（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートまたは（−）−エピガロカテキンとホルムアルデヒドとの反応によって得られる生成物は、通例、メチレン基によるクロマン環の連結様式が異なる化合物の少なくとも二種の化合物を含有するクロマン重合体化合物の混合物である。そして、例えば、HP-20（三菱化学株式会社製）などのスチレン系吸着樹脂やShephadex LH-20のようなデキストラン系樹脂によるオープンカラムクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィー（HPLC）等、公知の精製方法を用いて、そのような混合物から、式１または２の各化合物を単離することができる。
本発明の式１または２の化合物は新規化合物であるが、実施例に後述するとおり烏龍茶中に存在することが判明した。そのため、本発明化合物は、Camellia sinensisの葉を原料とする茶類、好ましくは烏龍茶や紅茶などの発酵茶あるいは焙じ茶などから抽出、精製することによって、単離することもできる。
新規ＥＧＣＧ３量体を含む飲食品、医薬組成物
本発明は、前記新規３量体またはその塩の少なくとも一種を含有する飲食品または医薬組成物に関する。
本発明化合物を含む飲料の例は、清涼飲料、茶飲料、液状強壮剤、健康飲料、栄養補給飲料、スポーツドリンク、炭酸飲料等（これらの飲料の濃縮原液及び調製用粉末を含む）であり、食品の例は、ガム、キャンディー、ゼリー、錠菓、健康食品、栄養補給食品、サプリメント等である。
本発明化合物を糖尿病予防薬等の医薬として用いる場合には、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤等の形態で提供される。本発明の化合物またはその塩をそのまま、あるいは水等で希釈して、経口的に投与できる。もしくはこれを公知の医薬用担体と共に製剤化することにより調製される。例えば、本発明化合物またはその塩をシロップ剤などの経口液状製剤として、またはエキス、粉末などに加工して、薬学的に許容される担体と配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤，散剤などの経口固形製剤として投与できる。薬学的に許容できる担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、液状製剤における溶剤、賦形剤、懸濁化剤、結合剤などとして配合される。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色料、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
本発明化合物を含む飲食品または医薬組成物には、本発明化合物を任意の濃度で含ませることができる。好ましくは、本発明化合物である前記新規３量体またはその塩の少なくとも一種を合わせて０．１８〜２０μｇ／ｍｌの濃度で含み、より好ましくは０．３〜１０μｇ／ｍｌの濃度で含む。
また、有効な用量は、患者の年齢及び体重、疾病の種類及び重篤度並びに投与の経路により適宜決定することができる。
ＥＧＣＧ２量体、３量体および／または４量体を有効成分とするα−グルコシダーゼ阻害剤
本発明は、ＥＧＣＧ重合体を有効成分とするα−グルコシダーゼ阻害剤である。より具体的には、ＥＧＣＧ２〜４量体を有効成分とするα−グルコシダーゼ阻害剤である。
有効成分であるＥＧＣＧ重合体、特にＥＧＣＧ２〜４量体は、上述の合成・精製方法または天然物からの分離精製方法によって得ることができる。
ＥＧＣＧ重合体とは、ＥＧＣＧが任意の形式で重合した化合物の総称として用いており、クロマン環の６位および／または８位でメチレン基を介して重合した２量体以上の化合物、テアシネンシン−Ａまたはテアシネンシン−ＤのようなB環の２‘位同志がＣ−Ｃ結合した結合様式で重合した２量体以上の化合物、ウーロンテアニンガレートのようなB環同志が縮合した結合様式で重合した２量体以上の化合物が含まれる。
ＥＧＣＧ２〜４量体としては、２量体のテアシネンシン−Ｄおよびウーロンホモビスフラバン−Ｂ、３量体のウーロンホモビスフラバン−トリマー−１、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−２、およびウーロンホモビスフラバン−トリマー−４、４量体のウーロンホモビスフラバン−テトラマー−１およびウーロンホモビスフラバン−テトラマー−２が挙げられる。その中で、特にウーロンホモビスフラバン−トリマー−４およびウーロンホモビスフラバン−テトラマー−１が高い活性を有する。
本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤には、有効成分であるＥＧＣＧ２〜４量体を任意の割合で含ませることができる。好ましくは、有効成分であるＥＧＣＧ２〜４量体を合わせて０．４５〜５０μｇ／ｍｌの濃度で含み、より好ましくは０．７〜２５μｇ／ｍｌの濃度で含む。
あるいは、本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤は、２量体のテアシネンシン−Ｄおよび／またはウーロンホモビスフラバン−Ｂを０．１〜２００μｇ／ｍｌの濃度、より好ましくは０．２５〜１２０μｇ／ｍｌの濃度で含む。または、本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤は、３量体のウーロンホモビスフラバン−トリマー−１、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−２、および／またはウーロンホモビスフラバン−トリマー−４を０．１８〜２０μｇ／ｍｌの濃度、より好ましくは０．３〜１０μｇ／ｍｌの濃度で含む。または、本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤は、４量体のウーロンホモビスフラバン−テトラマー−１および／またはウーロンホモビスフラバン−テトラマー−２を０．０６〜２０μｇ／ｍｌの濃度、より好ましくは０．１２〜１０μｇ／ｍｌの濃度で含む。
α−グルコシダーゼ阻害活性の測定は、背景技術に示した先行出願に記載されているいずれのα−グルコシダーゼ活性評価法によっても行われることができる。また、後述の実施例２に示した方法によっても評価することができる。常法により、阻害活性は酵素活性の５０％の阻害を与える試料量ＩＣ50で表すこともできる。
本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤は、従来知られている天然物由来のα−グルコシダーゼよりも少量で食事由来の澱粉、多糖に由来する糖分の分解を抑制し、吸収を抑えることができる。また何れの化合物も烏龍茶等に含まれるカテキン（ＥＧＣＧ）重合体であることから、香味、安全性に優れており、長期摂取が可能である。
ＥＧＣＧ２量体、３量体および／または４量体を有効成分とするα−グルコシダーゼ阻害剤を添加した血糖値上昇抑制用組成物、または糖尿病予防及び／又は治療剤
本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤を飲食品などに添加することで、食事由来の糖分の吸収抑制、さらには高血糖症状の慢性化に起因する糖尿病の長期的な予防及び／又は治療することを目的とした飲食品を提供することができる。
本発明の飲食品や医薬組成物には、有効成分であるＥＧＣＧ２〜４量体を任意の割合で含ませることができる。好ましくは、有効成分であるＥＧＣＧ２〜４量体を合わせて０．４５〜５０μｇ／ｍｌの濃度で含み、より好ましくは０．７〜２５μｇ／ｍｌの濃度、特に好ましくは０．７〜１０μｇ／ｍｌの濃度で含む。
あるいは、本発明の飲食品や医薬組成物は、２量体のテアシネンシン−Ｄおよび／またはウーロンホモビスフラバン−Ｂを０．１〜２００μｇ／ｍｌの濃度、より好ましくは０．２５〜１２０μｇ／ｍｌの濃度で含む。または、本発明の飲食品や医薬組成物は、３量体のウーロンホモビスフラバン−トリマー−１、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−２、および／またはウーロンホモビスフラバン−トリマー−４を０．１８〜２０μｇ／ｍｌの濃度、より好ましくは０．３〜１０μｇ／ｍｌの濃度で含む。または、本発明の飲食品や医薬組成物は、４量体のウーロンホモビスフラバン−テトラマー−１および／またはウーロンホモビスフラバン−テトラマー−２を０．０６〜２０μｇ／ｍｌの濃度、より好ましくは０．１２〜１０μｇ／ｍｌの濃度で含む。
本発明における有効成分の使用量は、使用方法によっても異なるが、α-グルコシダーゼ阻害作用が発揮される量であれば特に限定されず、例えば血糖値上昇抑制、糖尿病の予防及び／又は治療を目的とした飲食品を調製する場合には、本発明のα-グルコシダーゼ阻害剤を1日あたり１０μｇ〜６００ｍｇ、好ましくは５０μｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは１００μｇ〜１００ｍｇ程度摂取できるように配合することができる。
本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
ＥＧＣＧ重合体の合成および精製
ア．合成とオープンカラムによる分画：
６ｇのＥＧＣＧ（ロッシュ社。Ｔｅａｖｉｇｏ（登録商標））を０．０２Ｎ ＨＣｌを含む１２０ｍｌのエタノールに溶解し、４％ホルムアルデヒドのエタノール溶液１８０ｍｌを加え、室温で４時間、撹拌した。反応終了後、純水で１０倍に希釈し、吸着樹脂ＣＨＰ−２０Ｐカラム（６００ｍｌ、３７−７５μｍ、三菱化学株式会社）に負荷した。１２００ｍｌの水で洗浄後、９００ｍｌの２５％ＣＨ３ＣＮ、１２００ｍｌの３０％ＣＨ３ＣＮで順次溶出し、２５％ＣＨ３ＣＮ溶出画分は３００ｍｌずつ３フラクション（ｆｒ．１からｆｒ．３）に分け、３０％ＣＨ３ＣＮ溶出画分は３００ｍｌずつ４フラクション（ｆｒ．４からｆｒ．７）に分画した。
イ．分取ＨＰＬＣ条件：
ＣＨＰ−２０Ｐカラム精製で得られた分画物をさらに逆相の分取ＨＰＬＣで精製した。
＜条件＞
カラム： Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＨＧ−５（５ｃｍφｘ５０ｃｍ、野村化学株式会社）
移動相：Ａ：０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、Ｂ：９０％ＣＨ３ＣＮ，０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、３２ｍｌ／ｍｉｎ
グラジエントプログラム：Ｂ２０％アイソクラティック（３０ｍｉｎ）、Ｂ２０％→Ｂ４０％（１００ｍｉｎ）、Ｂ４０％アイソクラティック（２０ｍｉｎ）
検出：Ａ２８０ｎｍ
サンプル：ＣＨＰ−２０Ｐカラム精製で得られたｆｒ．２からｆｒ．７を、それぞれ２０％ＣＨ３ＣＮに溶解し、数回に分けて全量を負荷した。
上記の分析条件おいて、保持時間１０９分（化合物１）、１１３分（化合物２）、１２０分（化合物３）、１３０分（化合物４）、および保持時間８５分（化合物５）、保持時間１０６分（化合物６）、保持時間１０４分（化合物７）に相当する各ピークを集めた。
ウ．化合物の構造解析：
分取ＨＰＬＣで単離した化合物について、ＭＳおよびＮＭＲ測定を行った。このうち、化合物５〜７のＭＳをＱ−ＴＯＦ Ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社製、ＵＫ）により、ネガティブ、Ｖモードで測定したところ、それぞれｍ／ｚ９２７．１６０、９２７．１６３、１３９７．２４８の［Ｍ−Ｈ］−のイオンピークが認められた。また、化合物５のＮＭＲスペクトルデータは文献（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ ３７（１２），３２５５−３５６３（１９８９））に記載のウーロンホモビスフラバン−ＡのＮＭＲスペクトルデータと一致した。化合物６のＮＭＲスペクトルデータは文献（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ ３７（１２），３２５５−３５６３（１９８９））に記載のウーロンホモビスフラバン−ＢのＮＭＲスペクトルデータと一致した。さらに、化合物７は特許出願（ＷＯ２００５／１１６００５）中の段落番号００２９に化合物（４）として記載されているエピガロカテキン３量体（ウーロンホモビスフラバン−トリマー−１）のＮＭＲスペクトルと一致した。これらの結果から、化合物５は式３に示すウーロンホモビスフラバン−Ａと、化合物６は式４に示すウーロンホモビスフラバン−Ｂと、化合物７は式５に示すウーロンホモビスフラバン−トリマー−１と確認された。
Figure 0005555166
Figure 0005555166
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 化合物１から化合物４については、以下のＭＳ、ＮＭＲにより構造解析を行った。ＭＳはＱ−ＴＯＦ Ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社製、ＵＫ）でイオン源にＺスプレーイオンソースをつけたＥＳＩを用い、ネガティブ、Ｖモードで測定した。Ｃｏｎｅ ｖｏｌｔ．：４５Ｖ、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｖｏｌｔａｇｅ：３ＫＶ、Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ Ｔｅｍｐ：１８０℃、ロックスプレーによる質量補正を行い、リファレンスにはロイシンエンケファリン（ｍ／ｚ５５４．２６１５［Ｍ−Ｈ］−）を用いた。
その結果、化合物３はｍ／ｚ１３９７．２４７９［Ｍ−Ｈ］−の分子イオンを与え、分子式Ｃ６８Ｈ５４Ｏ３３（ｅｒｒ．：０．７ｐｐｍ）、化合物４はｍ／ｚ１３９７．２５０９［Ｍ−Ｈ］−の分子イオンを与え、分子式Ｃ６８Ｈ５４Ｏ３３（ｅｒｒ．：２．９ｐｐｍ）と算出され、ＥＧＣＧ３分子が２つのメチレンにより架橋された物質であると推定された。また、化合物１はｍ／ｚ１８６７．３１１２［Ｍ−Ｈ］−の分子イオンおよび２価の９３３．１５１７［Ｍ−２Ｈ］２−を与え、分子式Ｃ９１Ｈ７２Ｏ４４（ｅｒｒ．：−１１．０ｐｐｍ）、化合物２はｍ／ｚ１８６７．３１００［Ｍ−Ｈ］−の分子イオンおよび２価の９３３．１１５１［Ｍ−２Ｈ］２−を与え、分子式Ｃ９１Ｈ７２Ｏ４４（ｅｒｒ．：−１１．７ｐｐｍ）と算出され、ＥＧＣＧ４分子が３つのメチレンにより架橋された物質であると推定された。
ＮＭＲは、以下の条件で測定を行った。化合物３はＣＤ３ＯＨに溶解し、化合物４をＤＭＳＯ−ｄ６（（ＣＤ３）２ＳＯ）に溶解したものを測定サンプルとした。化合物３は、ＣＤ３ＯＨのプロトンと１３Ｃの残存ピークであるδ３．３０およびδ４８．９７を内部標準とし、化合物４は、ＤＭＳＯ−ｄ６の１Ｈの２．５０ｐｐｍと１３Ｃの残存ピークδ３９．４３を内部標準とした。測定項目は１ＨＮＭＲ、１３ＣＮＭＲ、１Ｈ｛１３Ｃ｝−ＨＳＱＣ、１Ｈ｛１３Ｃ｝−ＨＭＢＣ、ＴＯＣＳＹおよびＤＱＦ−ＣＯＳＹをＤＭＸ−７５０ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＢＲＵＫＥＲ ＢＩＯＳＰＩＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定した。ＮＭＲの結果、化合物３はＥＧＣＧ６：８ＥＧＣＧ６：８ＥＧＣＧで結合した化合物（ウーロンホモビスフラバン−トリマー−２）、化合物４はＥＧＣＧ８：８ＥＧＣＧ６：６ＥＧＣＧで結合した化合物（ウーロンホモビスフラバン−トリマー−４）であることが明らかとなった。ＥＧＣＧ間の６：８または８：８と記した結合はＥＧＣＧのＡ環の６位または８位の炭素が間にメチレン基を挟んで架橋した状態を表す。化合物３の１ＨＮＭＲ、１３ＣＮＭＲスペクトルは図１および２に、化合物４の１ＨＮＭＲ、１３ＣＮＭＲスペクトルは図３および４に示す。化合物３の構造は図９、化合物４の構造は図１０に示す。
化合物３：
ウーロンホモビスフラバン−トリマー−２（ＣＤ３ＯＨ中）の１ＨＮＭＲは、δ 6.95, 6.92, 6.90, 6.60, 6.54, 6.44, 6.08, 6.02, 5.57, 5.55, 5.49, 5.18, 5.12, 4.91, 3.86, 3.83, 3.81, 3.76, 3.03, 3.01, 2.94, 2.89, 2.89, 2.82,のシグナル、１３ＣＮＭＲは、δ 167.72, 167.46, 167.37, 156.29, 155.25, 155.08, 154.79, 154.43, 153.64, 152.91, 151.64, 151.20, 147.00, 146.93, 146.38, 146.38, 146.34, 146.29, 140.03, 139.89, 139.89, 134.65, 134.48, 133.85, 130.64, 129.29, 129.10, 121.33, 121.14, 121.14, 110.31, 110.24, 110.24, 109.19, 108.07, 107.42, 107.05, 107.02, 106.79, 106.10, 101.59, 101.00, 100.45, 97.23, 96.71, 80.07, 79.94, 78.45, 70.00, 69.32, 69.28, 27.21, 27.21, 26.81, 17.91, 17.91のシグナルが認められた。
化合物４：
ウーロンホモビスフラバン−トリマー−４（ＤＭＳＯ−ｄ６中）の１ＨＮＭＲは、δ 10.46, 9.18, 9.16, 9.16, 9.12, 9.06, 9.05, 8.90, 8.88, 8.84,8.72, 8.69, 8.69, 8.46, 8.34, 8.05, 8.02, 8.00, 6.81, 6.78, 6.78, 6.52, 6.47, 6.35, 6.03, 5.93, 5.48, 5.46, 5.39, 5.04, 4.95, 4.89, 4.05, 3.95, 3.56, 3.56, 3.06, 3.00, 2.98, 2.76, 2.71, 2.67のシグナル、１３ＣＮＭＲは、δ 165.11, 165.09, 164.99, 157.66, 154.29, 153.82, 153.48, 153.07, 152.68, 152.23, 152.18, 150.88, 145.56, 145.52, 145.50, 145.26, 145.24, 145.23, 138.43, 138.43, 138.39, 132.34, 132.23, 132.19, 128.34, 128.34, 128.23, 119.17, 119.12, 119.04, 110.35, 110.31, 110.29, 109.19, 108.59, 108.56, 108.51, 106.97, 106.63, 105.26, 105.26, 105.13, 104.73, 101.28, 99.44, 99.41, 98.21, 97.34, 97.15, 96.03, 79.48, 79.07, 78.47, 69.95, 69.39, 69.28, 27.18, 26.98, 26.58, 18.16, 17.13のシグナルが認められた。
また、化合物１および化合物２はＤＭＳＯ−ｄ６に溶解し、１Ｈと１３Ｃの残存ピークδ２．５０、δ３９．４３を内部標準としてＮＭＲ測定を行った。測定項目は１ＨＮＭＲ、１３ＣＮＭＲ、１Ｈ｛１３Ｃ｝−ＨＳＱＣ、１Ｈ｛１３Ｃ｝−ＨＭＢＣ、ＴＯＣＳＹおよびＤＱＦ−ＣＯＳＹをＤＭＸ−７５０ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＢＲＵＫＥＲ ＢＩＯＳＰＩＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定した。ＮＭＲの結果、化合物１はＥＧＣＧ８：８ＥＧＣＧ６：８ＥＧＣＧ６：８ＥＧＣＧで結合した化合物（ウーロンホモビスフラバン−テトラマー−１）、化合物２はＥＧＣＧ８：６ＥＧＣＧ８：８ＥＧＣＧ６：８ＥＧＣＧで結合した化合物（ウーロンホモビスフラバン−テトラマー−２）であることが明らかになった。ＥＧＣＧ間の６：８または８：８と記した結合はＥＧＣＧのＡ環の６位または８位の炭素が間にメチレン基を挟んで架橋した状態を表す。化合物1の１ＨＮＭＲ、１３ＣＮＭＲスペクトルは図５および６に、化合物２の１ＨＮＭＲ、１３ＣＮＭＲスペクトルは図７および８に示す。化合物１の構造は図１１、化合物２の構造は図１２に示す。
化合物１：
ウーロンホモビスフラバン−テトラマー−１は、１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６中）は、δ 10.34, 9.37, 9.17, 9.09, 9.01, 8.88, 8.75, 8.71, 8.68, 8.08, 8.04, 7.62, 6.81,6.77, 6.72, 6.55, 6.49, 6.39, 6.04, 5.86, 5.55, 5.47, 5.34, 5.23, 4.96, 4.79, 4.64, 4.04, 4.02, 3.92, 3.90, 3.85, 3.83, 3.73, 3.71, 3.64, 3.62, 3.54, 3.52, 3.07, 3.05, 2.96, 2.93, 2.74, 2.72, 2.70のシグナル、１３ＣＮＭＲは、δ165.29, 165.13, 165.02, 165.01,154.45, 154.44, 154.25, 152.33, 152.20, 151.97, 151.66, 151.62, 150.82, 150.66, 150.52, 149.66, 145.63, 145.56, 145.54, 145.50, 145.50, 145.27, 145.23, 145.18, 138.46, 138.38, 132.77, 132.26, 132.12, 128.50, 127.61, 119.20, 119.17, 118.96, 118.90, 108.73, 108.55, 107.05, 106.19, 105.19, 105.05, 104.31, 103.77, 99.01, 98.52, 77.44, 76.65, 76.51, 76.10, 67.53, 67.50, , 66.95, 66.63, 25.94, 25.63, 25.49, 25.30, 17.14, 16.74, 15.81のシグナルが認められた。
化合物２：
ウーロンホモビスフラバン−テトラマー−２は１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）は、δ 9.91, 9.25, 9.16, 8.09, 7.22, 6.81, 6.76, 6.74, 6.52, 5.94, 5.50, 5.38, 4.77, 4.52, 3.95, 3.95, 3.80, 3.54, 2.80, 2.74, 2.73, 2.67のシグナル、１３ＣＮＭＲは、δ 165.08, 165.01, 154.06, 152.83, 152.35, 151.45, 150.78, 150.26, 145.52, 145.52, 145.24, 145.18, 138.49, 138.44, 132.21, 132.10, 128.42, 127.63, 119.05, 118.95, 108.58, 108.46, 108.46, 106.95, 105.74, 104.92, 104.06, 98.32, 97.81, 76.59, 75.94, 66.69, 66.35,26.33, 25.26, 16.72, 15.99のシグナルが認められた。
上記の通り同定された各化合物の構造式を図９〜１２に示す。ウーロンホモビスフラバン−トリマー−２は図９、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−４は図１０、ウーロンホモビスフラバン−テトラマー−１は図１１、ウーロンホモビスフラバン−テトラマー−２は図１２に示す。
この合成、精製により得られた各化合物の収量は、ウーロンホモビスフラバン−Ａ（９８４ｍｇ）、ウーロンホモビスフラバン−Ｂ（３７４ｍｇ）、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−１（４６８ｍｇ）、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−２（７３ｍｇ）、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−４（１２ｍｇ）、ウーロンホモビスフラバン−テトラマー−１（１５ｍｇ）、ウーロンホモビスフラバン−テトラマー−２（４４ｍｇ）であった。
各種ＥＧＣＧ重合体のα−グルコシダーゼ阻害活性
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液は、０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏと０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを混合しｐＨ７．０に調整し、２ｇ／Ｌの牛血製アルブミン（ナカライテスク株式会社製、Ｆ−Ｖ、ｐＨ５．２、純度９６％）および０．２ｇ／ＬのＮａＮ３（ナカライテスク株式会社製、試薬特級）を添加した。酵素溶液は上記、緩衝液にα−グルコシダーゼ（和光純薬工業株式会社製、酵母由来、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）を０．５ｕｎｉｔｓ／ｍｇタンパク／ｍｌ（１００μｇ／２０ｍｌ）となるように溶解した。基質溶液は、上記、緩衝液にｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ナカライテスク株式会社製、試薬特級）を５ｍＭ（７．５２５ｍｇ／５ｍｌ）となるように溶解した。
評価に用いたサンプルのうち、テアシネンシン（ＴＳＮ）−ＡおよびＴＳＮ−Ｄは論文（Hashimoto, F. Nonaka, G. Nishioka, I. Chem. Pharm. Bull. 36 (5), 1676-1684 (1988)）に準じて、またウーロンテアニンガレート（oolongtheanin-gallate：以下「ＯＴＮＧ」という）は、論文J. Agric. Food Chem. 53, 4593-4598(2005)に記載の方法に準じて合成した。エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ）は、和光純薬工業製、１−デオキシノジリマイシン（1-deoxynojirimycin）塩酸塩はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製を、テアフラビン類は栗田工業製のテアフラビンズ（テアフラビン、テアフラビン−３ガレート、テアフラビン３’ガレート、テアフラビン３，３’−ジガレートの混合物）を用いた。またウーロンホモビスフラバン−Ａ、ウーロンホモビスフラバン−Ｂ、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−１、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−２、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−４、ウーロンホモビスフラバン−テトラマー−１およびウーロンホモビスフラバン−テトラマー−２は実施例１で合成・精製したものを用いた。
これらのサンプルを１０ｍｇ／ｍｌＤＭＳＯとなるように調製し、６段階に２倍希釈を行った。９６穴マイクロプレートを用い、サンプル溶液１０μＬに酵素液４５μＬを加え、３７℃で５分間、プレインキュベーションした後、基質溶液を４５μＬ加えＡ４０５ｎｍの吸光度を測定し、３７℃で５分間、インキュベーションした後、Ａ４０５ｎｍの吸光度を測定した。阻害率は、コントロールとしてサンプルのかわりにＤＭＳＯのみを添加したものとのＡ４０５ｎｍの差として算出し、各活性測定は２連で行った。
この結果、各化合物のα−グルコシダーゼ阻害活性をＩＣ５０値で示すと、表１のようになり、ウーロンホモビスフラバン−テトラマー−１、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−４は特に強い活性を示した。
Figure 0005555166
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる重合ポリフェノールの定量
トリマーおよびテトラマーのＬＣ−ＭＳ／ＭＳの測定条件とサントリー黒烏龍茶の定量
ＥＧＣＧ重合物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳの測定は、４０００ Ｑ ＴＲＡＰ（アプライド社製）で、ターボイオンスプレーを用い、以下の条件で測定した。Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ：４６ｅＶ（ｎｅｇａ．），Ｉｏｎｓｐｒａｙ ｖｏｌｔａｇｅ：４５００Ｖ，Ｔｅｍｐ：４５０℃。
各化合物のＭＲＭ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）における測定チャンネルはウーロンホモビスフラバン−トリマー類は、６９８．４０／１６８．９０（ｎｅｇａ．２価）で、標準物質にはウーロンホモビスフラバン−トリマー−１を用いた。ウーロンホモビスフラバン−テトラマー類は、９３３．１６／１６８．９０（ｎｅｇａ．２価）で標準物質にはウーロンホモビスフラバン−テトラマー−２を用いた。以下の測定条件で行った。
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ３０−ＵＧ−３（野村化学、３ｍｍφ×１５０ｍｍ）
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ、Ｃｏｌｕｍｎ Ｔｅｍｐ．：４０℃
移動相Ａ：０．１％ＨＣＯＯＨ／Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＨＣＯＯＨ／ＣＨ３ＣＮ
グラジエントプログラム：Ｂ９％（０ｍｉｎ）→Ｂ６０％（１７ｍｉｎ）→Ｂ８５％（１７．１ｍｉｎ）、Ｂ８５％（１７．１−１９ｍｉｎ）
これらの化合物は黒烏龍茶茶中に微量しか含まれないため、直接定量することは不可能であった。そこで、黒烏龍茶の調合液（殺菌前の溶液）をＣＨＰ−２０Ｐカラム（三菱化学株式会社）でステップワイズに分画し、各フラクションの定量を行った後、各フラクションに検出された濃度を合算して茶溶液中の濃度とした。黒烏龍茶中の濃度は、トリマー類は検出された５成分をウーロンホモビスフラバン−トリマー−１換算で合算し、１７２ｎｇ／ｍｌであった。テトラマー類は検出された４成分を合算し、ウーロンホモビスフラバン−テトラマー−２換算で５５ｎｇ／ｍｌであった。

Claims (3)

  1. エピガロカテキンガレート２量体、３量体および／または４量体を有効成分とするα−グルコシダーゼ阻害剤であって、
    エピガロカテキンガレート２量体がウーロンホモビスフラバン−Ｂであり、
    エピガロカテキンガレート３量体がウーロンホモビスフラバン−トリマー−１、ウーロンホモビスフラバン−トリマー−２、およびウーロンホモビスフラバン−トリマー−４から選択される一以上であり、
    エピガロカテキンガレート４量体がウーロンホモビスフラバン−テトラマー−１および／またはウーロンホモビスフラバン−テトラマー−２である、
    前記阻害剤。
  2. エピガロカテキンガレート３量体がウーロンホモビスフラバン−トリマー−４であり、エピガロカテキンガレート４量体がウーロンホモビスフラバン−テトラマー−１である、請求項１記載の阻害剤。
  3. 請求項１または２記載のα−グルコシダーゼ阻害剤を添加した血糖値上昇抑制用組成物。
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