JP5514399B2 - 無機硫黄化合物加水分解酵素の製造方法 - Google Patents
無機硫黄化合物加水分解酵素の製造方法 Download PDFInfo
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Eur. J. Biochem. 271, 272-280 (2004) Biosci. Biotechnol. Biochem. 60, 224-227 (1996) Eur. J. Biochem. 243, 678-683 (1997) Microbiology 143, 499-504 (1997) DNA Data Bank of Japan, Accession No.AB259312 Gene 67, 31-40 (1998)
1.無機硫黄化合物加水分解酵素をコードする遺伝子を組み込んだ宿主細胞を培養液中で培養することにより該無機硫黄化合物加水分解酵素を発現させ、製造する場合において、前記宿主細胞を、トリプトン、酵母エキス、グリセロールを含むTerrific Broth培地をpH 7.0〜7.4に調整し、さらにグルコースを添加した培養液中で培養する事を特徴とする、無機硫黄化合物加水分解酵素の製造方法。
2.Terrific Broth培地に添加するグルコース濃度が、20〜60 mMである、前項1に記載の製造方法。
3.宿主が、大腸菌である前項1または2に記載の製造方法。
4.発現した無機硫黄化合物加水分解酵素が封入体の場合に、該封入体を、塩酸グアニジンを含む溶液で可溶化した後、pH 1.5〜4.5の緩衝液で処理することにより発現無機硫黄化合物加水分解酵素をリフォールディングさせ、活性型無機硫黄化合物加水分解酵素を産生する、前項1〜3の何れかに記載の製造方法。
5.無機硫黄化合物加水分解酵素が、テトラチオン酸ハイドロラーゼである前項1〜4の何れかに記載の製造方法。
6.無機硫黄化合物加水分解酵素をコードする遺伝子が、以下より選択されるいずれかである前項1〜5の何れかに記載の製造方法:
1)配列表の配列番号1で示される塩基配列からなるDNA;
2)配列表の配列番号1で示される塩基配列のうち、1〜複数個の遺伝子が置換、欠失、挿入または付加といった変異された塩基配列を含み、実質的に無機硫黄化合物加水分解酵素を産生しうる塩基配列からなるDNA;
3)前記1)または2)に記載のDNAの相補鎖からなるDNA;
4)前記1)または2)に記載のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリッド形成しうるDNA;
5)前記1)または2)に記載のDNAとはハイブリッド形成しないが、遺伝子コドン縮重のため、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を産生しうる塩基配列からなるDNA。
7.前項1〜6のいずれか1に記載の製造方法に使用される培養液。
8.前項1〜6のいずれか1に記載の製造方法により得られた無機硫黄化合物加水分解酵素を用いて硫黄成分を処理することを特徴とする硫黄成分の加水分解処理方法。
9.前項8に記載の加水分解処理方法を含む硫黄成分の除去方法。
1)配列表の配列番号1で示される塩基配列からなるDNA。
2)配列表の配列番号1で示される塩基配列のうち、1〜複数個の遺伝子が置換、欠失、挿入または付加といった変異された塩基配列を含み、実質的に機硫黄化合物加水分解酵素を産生しうる塩基配列からなるDNA。
3)前記1)または2)に記載のDNAの相補鎖からなるDNA。
4)前記1)または2)に記載のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリッド形成しうるDNA。
5)前記1)または2)に記載のDNAとはハイブリッド形成しないが、遺伝子コドン縮重のため、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を産生しうる塩基配列からなるDNA。
テトラチオン酸ハイドロラーゼをコードする遺伝子はAf-tthで示され、その塩基配列は配列表の配列番号1に示され、すでにDDBJ, Accession No.AB259312(非特許文献5)にも登録されている。
トリプトン12 g、酵母エキス24 g、グリセロール4 mlを900 mlの脱塩水または水道水(tap Water)にてメスアップした。前記メスアップした溶液と0.9〜1.0 Mのリン酸カリウム緩衝液100 mlを別々に121℃、20分間オートクレーブ滅菌した。滅菌して室温まで冷却した後、両者をクリンベンチ内で無菌的に混合した(pH 7.0〜7.4)。終濃度が20〜60 mMとなるようにグルコースを添加し、さらにアンピシリンを終濃度50〜100 g/mlとなるように添加した。
形質転換した大腸菌を、Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)を終濃度1 mMで添加したTB 培養液中で室温36時間培養し、組換え目的酵素を誘導発現させた。
実施例1の組換え目的酵素を誘導発現した大腸菌を遠心分離により回収し、1.0 Mリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)にて洗浄した。洗浄菌体を同緩衝液に懸濁後、超音波などにより菌体を破砕し、BugBuster(TM)(タカラバイオ株式会社)を用いて菌体を溶解した。
なお、ウエスタンブロッティングには、後述の比較例1において発現させた組換えテトラチオン酸ハイドロラーゼを用いて作製した抗体を用いた。
最後に遠心分離によって上清を回収することで活性型の組換え目的酵素を確保した。
LB 培地においてAf-tthを導入した組換え大腸菌で、目的酵素の発現を試みた。培地をLB 培地とした他は、実施例1と同手法であった。
LB 培地での目的酵素の発現量は僅かではあったが、これを基に抗テトラチオン酸ハイドロラーゼ抗体を作製した。
実施例1および比較例1で得られた不溶性画分について、目的酵素の発現量をSDS-PAGEにより確認した。
その結果、比較例1の方法で発現させた場合は小スケール(5 ml程度)でのみ発現が認められたが、100 ml以上にスケールアップすると全く発現が認められなかった。一方、実施例1の方法で発現させた場合は、100 ml以上にスケールアップした場合でも組換え発現を可能とし、組換え型目的酵素を大量に獲得できるようになった。
実施例1で得た封入体の不溶性の目的酵素および実施例2によるリフォールディングにより得られた目的酵素について、加水分解能をトラチオン酸の加水分解反応による効果を、吸光度(A480nm)にて確認した(図4)。その結果、実施例1で得た不溶性目的酵素では加水分解活性は認められなかったが、実施例2で得られた目的酵素は加水分解能を有することが確認された。
反応機構は S4O6 2- + H2O -> S0 + S2O3 2- + SO4 2- +2H+ であることをHPLC分析によって確認した。
Claims (4)
- Acidithiobacillus属細菌由来のテトラチオン酸ハイドロラーゼをコードするDNAであって、以下に示す1)〜5)のいずれかのDNAを組み込んだ大腸菌を培養液中で培養することにより該テトラチオン酸ハイドロラーゼを発現させ、製造する場合において、前記大腸菌を、トリプトン、酵母エキス、グリセロールを含むTerrific Broth培地をpH 7.0〜7.4に調整し、さらにグルコースを添加した培養液中で培養し、発現したテトラチオン酸ハイドロラーゼが封入体の場合に、該封入体を、塩酸グアニジンを含む溶液で可溶化した後、pH 1.5〜4.5の緩衝液で処理することにより発現したテトラチオン酸ハイドロラーゼをリフォールディングさせる事を特徴とする、テトラチオン酸ハイドロラーゼの製造方法:
1)配列表の配列番号1で示される塩基配列からなるDNA;
2)配列表の配列番号1で示される塩基配列のうち、1〜複数個の塩基が置換、欠失、挿入または付加からなる変異された塩基配列を含み、テトラチオン酸ハイドロラーゼをコードする塩基配列からなるDNA;
3)前記1)または2)に記載のDNAの相補鎖からなるDNA;
4)前記1)または2)に記載のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリッド形成するDNA;
5)前記1)または2)に記載のDNAとはストリンジェントな条件下でハイブリッド形成しないが、遺伝子コドン縮重のため、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなるDNA。 - Terrific Broth培地に添加するグルコース濃度が、20〜60 mMである、請求項1に記載の製造方法。
- 封入体を、塩酸グアニジンを含む溶液で可溶化した後に処理する緩衝液が、0.1〜0.5 Mの硫酸アンモニウムを含むpH 1.5〜4.5の緩衝液である請求項1または2に記載の製造方法。
- 封入体を、塩酸グアニジンを含む溶液で可溶化した後に行う処理が、透析処理である請求項1〜3の何れかに記載の製造方法。
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