JP5509198B2 - 分析方法、検体液の逆流防止方法およびバックグラウンド上昇の防止方法 - Google Patents

Description

本発明は、分析方法、検体液の逆流防止方法およびバックグラウンド上昇の防止方法に関する。

従来から、例えば、感染症の診断等において、細菌またはウイルス等の病原体の抗原を、免疫反応を利用して検出する検体分析用具が、普及している。前記検体分析用具では、イムノクロマトグラフィー法（免疫分析方法）が汎用されている。前記免疫分析方法は、前記抗原等の分析対象物に特異的に結合する物質（特異的結合物質）を用いた分析方法の一手法である。前記免疫分析方法では、簡便かつ迅速な分析が可能である。近年では、酵素を標識に用いた免疫分析方法（酵素免疫分析方法）も、開発されている（例えば、特許文献１参照）。

前記酵素免疫分析方法は、例えば、つぎのようにして行われる。すなわち、まず、鼻腔等から検体を採取して、前記検体を含む検体液を調製する。一方、検体分析用具を準備する。図６（a）および（ｂ）に、検体分析用具の一例を示す。図６（ａ）は、前記検体分析用具の平面図である。図６（ｂ）は、図６（ａ）のＩＩＩ−ＩＩＩ方向に見た断面図である。前記両図において、同一部分には、同一符号を付している。前記検体分析用具６０では、多孔質体の展開部材６１に、展開液供給部６２、検体供給部６３および検出部６４が、展開液の流れの上流から下流（前記両図において右側から左側）にかけて、前記順序で配置されている。前記検出部６４には、抗体が、固定化されている（固定化抗体）。

まず、前記検体供給部６３に、前記検体液を供給する。つぎに、前記展開液供給部６２に、展開液を供給する。前記展開部材６１において、酵素で標識された標識化抗体（酵素標識化抗体）の存在下、前記供給された展開液の展開により、前記供給された検体液が前記検出部６４に導入される。また、前記供給された展開液の展開により、基質が、前記展開液供給部６２から、前記検体供給部６３を経て、前記検出部６４に導入される。図６（ｃ）は、前記検出部６４における抗原の検出の一例を示す模式図である。同図において、図６（ａ）および（ｂ）と同一部分には、同一符号を付している。図６（ｃ）に示すように、前記検体中に分析対象物である抗原６６が存在すると、前記検出部６４において、前記酵素標識化抗体６５、前記抗原６６および前記固定化抗体６７の複合体６８が形成される。この状態で、前記複合体６８における前記酵素標識化抗体６５の酵素６９と、前記基質との反応による発色または発光等を検出することにより、前記抗原６６を検出する。

特許第３２４８４３６号公報

前記酵素免疫分析方法等の免疫分析方法には、バックグラウンドの上昇による検出感度の低下の問題がある。また、検体液量を増やした場合に、バックグラウンドの上昇が特に問題となる。バックグラウンド上昇の防止方法としては、例えば、検体液保持部材の使用、または展開部材を大きくする等の手段をとり得る。しかしながら、これらの手段は、コストがかかる。これらの問題は、検体に含まれる分析対象物である抗原に特異的に結合する抗体を用いる免疫反応を利用した免疫分析方法に限られず、検体に含まれる分析対象物に特異的に結合する物質（特異的結合物質）を用いる分析方法全般において起こり得る。

そこで、本発明は、コストをかけることなく、簡易な方法でバックグラウンドの上昇を防止可能な分析方法、検体液の逆流防止方法およびバックグラウンド上昇の防止方法を提供することを目的とする。

前記目的を達成するために、本発明の分析方法は、
展開部材に、展開液供給部、検体供給部および検出部が、展開液の流れの上流から下流にかけて、前記順序で配置された検体分析用具を用いる分析方法であって、
前記検出部には、検体中の分析対象物に特異的に結合する物質が固定化されており、
前記検体供給部に、前記検体を含む検体液を供給し、
前記展開液供給部に、前記検体液の供給に先立って展開液を供給し、
前記展開液供給部と前記検体供給部との間の距離が、１〜１００ｍｍの範囲であり、
前記分析対象物に特異的に結合する標識化物質の存在下、前記供給された展開液の前記展開部材における展開により、前記供給された検体液が前記検出部に導入され、
前記検出部において、前記固定化された特異的結合物質、前記分析対象物、および前記標識化された特異的結合物質の複合体が形成され、
前記複合体における前記標識の検出により、前記分析対象物の分析を行うことを特徴とする。

また、本発明の検体液の逆流防止方法は、
展開部材に、展開液供給部および検体供給部が、展開液の流れの上流から下流にかけて、前記順序で配置された検体分析用具を用い、
前記検体供給部に、検体を含む検体液を供給し、
前記展開液供給部に、前記検体液の供給に先立って展開液を供給し、
前記展開液供給部と前記検体供給部との間の距離が、１〜１００ｍｍの範囲であり、
前記供給された展開液の前記展開部材における前記上流から前記下流にかけた展開により、前記供給された検体液の前記上流への逆流を防止することを特徴とする。

また、本発明のバックグラウンド上昇の防止方法は、
展開部材に、展開液供給部、検体供給部および検出部が、展開液の流れの上流から下流にかけて、前記順序で配置された検体分析用具を用い、
前記検体供給部に、前記検体を含む検体液を供給し、
前記展開液供給部に、前記検体液の供給に先立って展開液を供給し、
前記展開液供給部と前記検体供給部との間の距離が、１〜１００ｍｍの範囲であり、
標識化された前記分析対象物に特異的に結合する物質の存在下、
前記供給された展開液の前記展開部材における前記上流から前記下流にかけた展開により、前記供給された検体液の前記上流への移動に起因する、前記検出部以外での前記標識の検出を防止することを特徴とする。

本発明によれば、コストをかけることなく、簡易な方法でバックグラウンドの上昇を防止可能である。

図１（ａ）は、本発明の一実施形態に用いる検体分析用具の一例の構成を示す平面図である。図１（ｂ）は、図１（ａ）に示す検体分析用具のＩ−Ｉ方向に見た断面図である。 図２（ａ）は、本発明の一実施形態に用いる検体分析用具のその他の例の構成を示す断面図である。図２（ｂ）は、本発明の一実施形態に用いる検体分析用具のさらにその他の例の構成を示す断面図である。 図３（ａ）から（ｃ）は、本発明の一実施形態における免疫分析方法を説明する断面図である。図３（ｄ）は、検出部における抗原の検出を示す模式図である。 図４（ａ）は、本発明の一実施形態に用いる検体分析用具のさらにその他の例の構成を示す平面図である。図４（ｂ）は、図４（ａ）に示す検体分析用具のＩＩ−ＩＩ方向に見た断面図である。 図５は、本発明の一実施形態に用いる検体分析用具のさらにその他の例の構成を示す平面図である。 図６（ａ）は、従来の酵素免疫分析方法に用いる検体分析用具の一例の構成を示す平面図である。図６（ｂ）は、図６（ａ）に示す検体分析用具のＩＩＩ−ＩＩＩ方向に見た断面図である。図６（ｃ）は、検出部における抗原の検出を示す模式図である。図６（ｄ）は、従来の酵素免疫分析方法を説明する断面図である。

本発明者等は、前記目的を達成するために一連の研究を重ねた。その結果、本発明者等は、特異的結合物質を用いる分析方法の一例である、従来の免疫分析方法におけるバックグラウンド上昇の原因を突き止めた。すなわち、従来の免疫分析方法では、検体液を展開液に先立って供給する。図６（ｄ）の断面図に基づき、従来の免疫分析方法における検体液の動きを説明する。同図において、図６（ａ）から（ｃ）と同一部分には、同一符号を付している。図６（ｄ）に示すように、検体液を供給すると（矢印ｆ）、前記展開部材６１の毛細管作用により、前記検体液は、検出部６４方向（矢印ｇ）だけでなく、展開液供給部６２方向（矢印ｈ）へ逆流する。この逆流により、標識化抗体の抗体と検体液中の抗原が反応してしまい、前記検出部６４以外での発色または発光等が起こり、バックグラウンドが上昇する。この検体液の逆流に起因するバックグラウンドの上昇は、特異的結合物質を用いる分析方法全般において発生する。この知見に基づき、本発明者等は、さらに研究を重ねた結果、展開液を、検体液に先立って供給すれば、検体液の展開液供給部方向への逆流を防止することが可能であることを見出し、本発明に至った。本発明によれば、展開部材を大きくする必要がなく、検体液保持部材も不要で、コストをかけることなく、かつ簡易にバックグラウンドの上昇を防止可能である。しかも、検体液量を増やした場合であっても、本発明では、バックグラウンドの上昇を防止可能であるから、例えば、分析精度のさらなる向上も可能である。

前記特異的結合物質は、例えば、分析対象物質に応じて適宜選択され、生体由来物質であってよいし、人工的に生成（合成）された物質であってもよい。前記特異的結合物質としては、例えば、抗体、抗原、プローブ等があげられる。

本発明の分析方法、検体液の逆流防止方法およびバックグラウンド上昇の防止方法における前記検体分析用具において、例えば、前記展開液供給部の一つに対し、複数の検体供給部および複数の検出部が設けられていてもよい。

本発明の分析方法、検体液の逆流防止方法およびバックグラウンド上昇の防止方法において、例えば、前記検体分析用具が、さらに、展開液供給口および検体供給口を有するケースを備え、前記展開部材が、前記ケース内に配置されていてもよい。

本発明の分析方法、検体液の逆流防止方法およびバックグラウンド上昇の防止方法において、例えば、前記検体分析用具が、さらに、第１の展開液受取パッドを備え、前記第１の展開液受取パッドが、前記展開液供給部より上流側に前記展開部材と接触して配置され、前記第１の展開液受取パッドへの前記展開液の供給により、前記展開液が前記展開部材へ展開されてもよい。

本発明の分析方法、検体液の逆流防止方法およびバックグラウンド上昇の防止方法において、例えば、前記検体分析用具が、さらに、第２の展開液受取パッドを備え、前記第２の展開液受取パッドが、前記検出部より下流側に前記展開部材と接触して配置されていてもよい。

本発明の分析方法、検体液の逆流防止方法およびバックグラウンド上昇の防止方法において、例えば、前記特異的結合物質が、抗原または抗体であってもよい。

本発明の検体液の逆流防止方法において、例えば、前記検体分析用具が、さらに、検出部を備え、前記検出部は、前記検体供給部より前記展開液の流れの下流に配置され、前記検出部には、検体中の分析対象物に特異的に結合する物質が固定化されており、前記分析対象物に特異的に結合する標識化物質の存在下、前記供給された展開液の前記展開部材における展開により、前記供給された検体液が前記検出部に導入され、前記検出部において、前記固定化された特異的結合物質、前記分析対象物、および前記標識化された特異的結合物質の複合体が形成され、前記複合体における前記標識の検出により、前記分析対象物の分析を行ってもよい。

本発明のバックグラウンド上昇の防止方法において、例えば、前記検出部には、検体中の分析対象物に特異的に結合する物質が固定化されており、前記分析対象物に特異的に結合する標識化物質の存在下、前記供給された展開液の前記展開部材における展開により、前記供給された検体液が前記検出部に導入され、前記検出部において、前記固定化された特異的結合物質、前記分析対象物、および前記標識化された特異的結合物質の複合体が形成され、前記複合体における前記標識の検出により、前記分析対象物の分析を行ってもよい。

つぎに、本発明の分析方法、検体液の逆流防止方法およびバックグラウンド上昇の防止方法について、前記特異的結合物質を用いた分析方法の一手法である、免疫分析方法を例にとり詳細に説明する。ただし、本発明は、下記の免疫分析方法のみに限定されない。なお、以下の図１から図６において、同一部分には同一符号を付している。また、図面においては、説明の便宜上、各部の構造は適宜簡略化して示す場合があり、各部の寸法等は、実際とは異なる場合がある。

（実施形態１）
本実施形態の分析方法は、前記「固定化された特異的結合物質」として固定化抗体を用い、前記「標識化された特異的結合物質」として、酵素を標識として用いた標識化抗体（酵素標識化抗体）を用いた免疫分析方法（酵素免疫分析方法）である。後述する実施形態２および３においても、同様である。

図１に、本実施形態の免疫分析方法に用いる検体分析用具の一例の構成を示す。図１（ａ）は、本実施形態に用いる検体分析用具の平面図である。図１（ｂ）は、図１（ａ）のＩ−Ｉ方向に見た断面図である。図示のとおり、この検体分析用具１０は、展開部材１１を備える。前記展開部材１１に、展開液供給部１２、検体供給部１３および検出部１４が、展開液の流れの上流から下流（前記両図において右側から左側）にかけて、前記順序で配置されている。この検体分析用具１０において、前記展開液供給部１２、前記検体供給部１３および前記検出部１４は、それぞれ、前記展開部材１１における所定の領域である。前記検出部１４には、抗体が固定化されている（固定化抗体）。この検体分析用具１０では、前記検出部１４は、一つであるが、これに限定されず、前記検出部は、例えば、分析する抗原の項目数等に応じて、複数であってもよい。

前記展開部材は、毛細管作用を奏する多孔質構造であればよい。前記展開部材の形成材料としては、例えば、多孔質膜、粒状物質または微粒子粉末等があげられる。前記多孔質膜としては、例えば、セルロース膜、酢酸セルロース、ニトロセルロース等のセルロース誘導体膜、ガラスフィルター、濾紙等があげられる。前記粒状物質または微粒子粉末としては、例えば、ポリマービーズ、ガラスビーズ、二酸化チタン、セルロース、塩類、疎水化多糖類等があげられる。前記展開部材の大きさは、特に制限されず、例えば、分析装置の規格等に応じて適宜設定できる。

前記固定化抗体は、検体中の分析対象物である抗原に結合する抗体であればよい。前記抗体は、後述する抗原等に応じて適宜設定できる。前記抗体は、例えば、生体由来の抗体であってもよいし、人工合成された抗体であってもよい。前記生体由来の抗体としては、例えば、免疫グロブリン(Ｉｇ)、抗体フラグメント、キメラ抗体等があげられる。前記免疫グロブリンとしては、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等があげられる。前記抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等があげられる。前記キメラ抗体としては、例えば、ヒト化抗体等があげられる。前記抗体は、例えば、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類、ヒト等の動物種由来のものでもよく、特に制限されない。また、前記抗体としては、例えば、前記動物種由来の血清から、従来公知の方法により作製してもよく、あるいは市販の各種抗体を利用してもよく、特に制限されない。前記抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれを用いてもよい。前記人工合成された抗体としては、例えば、アフィボディー等があげられる。前記検出部への抗体の固定化方法としては、例えば、塗布装置を用いて多孔質膜等の展開部材に、前記抗体を含む抗体液を塗布し、乾燥機等により風乾させる方法等があげられる。

本発明において、検体分析用具は、例えば、市販品を用いてもよく、自家製作してもよい。

本発明において、前記検体液は、検体を含んでいればよい。前記検体としては、特に制限されず、例えば、生体試料、食品等があげられる。前記検体は、液状のものであっても、固体状のものを緩衝液等に溶解、懸濁または分散等したものであってもよい。前記液状の生体試料としては、例えば、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、鼻腔ぬぐい液、鼻汁、咽頭ぬぐい液、含漱液、唾液、全血、血清、血漿、汗、尿等があげられる。前記固体状の生体試料としては、例えば、細胞、糞便等があげられる。前記食品としては、例えば、動物および植物等の食物、または加工食品等があげられる。前記緩衝液としては、特に制限されず、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等があげられる。前記緩衝液のｐＨは、特に制限されず、例えば、ｐＨ４〜１０の範囲であり、好ましくはｐＨ６〜９の範囲である。

本実施形態の免疫分析方法では、前記検体中の分析対象物は、前述の固定化抗体および前述の標識化抗体に結合する抗原である。前記抗原としては、特に制限されず、例えば、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＲＳウイルス、コロナウイルス、アストロウイルス、ノロウイルス、麻疹ウイルス、ロタウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−１）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヘルペスウイルス、マイコプラズマ、梅毒トレポネーマ、クラミジア・トラコマチス、結核菌、大腸菌群、Ａ群溶連菌、Ｂ群溶連菌、肺炎球菌、ブドウ球菌、ＭＲＳＡ、レジオネラ、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、ベロ毒素、サルモネラ、クロストリジウム・ディフィシル、ヘリコバクター・ピロリ、ＣＲＰ、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｃ抗原、ＨＢｃ抗体、ＨＢｅ抗原、ＨＢｅ抗体、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、トロポニンＴ、トロポニンＩ、ミオグロビン、Ｄ−ダイマー、便中ヘモグロビン、ヘモグロビンＡ１ｃ、ＩｇＥ抗体等の病原体抗原、抗体、癌マーカー、ホルモン等の生体成分、残留農薬、環境ホルモン、食品中のアレルギー物質等があげられる。

前記検体液は、例えば、緩衝液、界面活性剤、抗菌剤等を含んでもよい。前記緩衝液としては、特に制限されず、例えば、前述の緩衝液等があげられる。前記界面活性剤としては、特に制限されず、例えば、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤等があげられる。前記抗菌剤としては、特に制限されず、例えば、アジ化ナトリウム、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン等があげられる。

前記酵素標識化抗体は、前記検体中の分析対象物である抗原に結合する、酵素標識化された抗体であればよい。前記酵素標識化抗体の抗体としては、例えば、前述の固定化抗体の抗体として例示した抗体等があげられる。

前記酵素標識化抗体の酵素としては、特に制限されず、例えば、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等があげられる。前記酵素標識化抗体の調製方法は、特に制限されず、例えば、従来公知の方法を用いてもよい。

前記酵素標識化抗体は、例えば、前記検体液に含ませておいてもよいし、前記展開部材または別途設けたパッド等に、含浸させておいてもよい。ただし、例えば、前記パッド等を別途設けなくとも、より高感度な分析が可能であることから、前記検体液に前記酵素標識化抗体を含ませておくことが好ましい。

前記展開液としては、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等の緩衝液を用いてもよい。前記展開液には、例えば、安定化剤、抗菌剤等を適宜添加してもよい。また、前記展開液の供給量は、例えば、前記検体液の供給量等に応じて、適宜設定できる。

本実施形態の免疫分析方法では、前記展開液の展開により、基質は、前記展開液供給部から、前記検体供給部を経て、前記検出部に導入される。前記基質は、例えば、前記酵素に反応して発色または発光等するものであればよい。前記基質の種類は、特に制限されず、例えば、前記酵素標識化抗体における酵素の種類に応じて選択できる。具体例としては、例えば、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）、ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、４−メチルウムベリフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（４ＭＵＧ）、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’’−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＧＰＤ）等があげられる。

前記基質は、例えば、前記展開液および前記検体液の少なくとも一方に含ませておいてもよいし、前記展開部材等に含浸させておいてもよい。前記展開部材等に、前記基質を含浸させる場合は、例えば、前記基質を、前記展開部材の前記検体供給部と前記検出部との間、または前記展開液供給部と前記検体供給部との間等に含浸させておいてもよい。

つぎに、図３に基づき、本実施形態の免疫分析方法を説明する。図３（ａ）から（ｃ）は、検体分析用具の断面図である。図３（ｄ）は、検出部における抗原の検出を示す模式図である。

図３（ａ）に示すとおり、まず、前記展開液供給部１２に、前記展開液を供給する（矢印ａ）。供給された前記展開液は、矢印ｂに示すように、前記展開部材１１中に浸透する。前記展開部材１１中に浸透した前記展開液は、矢印ｃに示すように、前記展開部材１１中を前記検出部１４（同図において左方向）に向かって、前記展開部材１１の上流から下流へ展開する。この時、前記展開液供給部付近の前記展開部材中に、前記基質が含浸されている場合には、前記展開液の展開によって、前記基質が前記検出部に向かって移動する。前記基質は、供給前の展開液に配合していてもよい。

つぎに、図３（ｂ）に示すとおり、前記検体供給部１３に、前記検体液を供給する（矢印ｄ）。この時、供給された前記検体液は、前記展開部材の中で、全方向に展開しようとするが、図３（ｃ）に示すとおり、先立って供給された前記展開液の展開（矢印ｃ）により、矢印ｅに示すように、前記検体液の展開方向を、前記検出部１４に向かう方向にすることができ、前記展開部材１１の上流に位置する前記展開液供給部１２方向（同図において右方向）への逆流を防止することができる。なお、前記「逆流を防止する」とは、検体液の逆流を完全に防止する場合のみに限定されず、例えば、展開液の供給に先立って、検体供給部に検体液を供給する場合より、バックグラウンドの上昇を防止できる程度に、検体液の逆流を防止する場合を含む。前記酵素標識化抗体は、供給前の前記検体液に配合してもよいし、前記展開部材の前記検体供給部付近に含浸させておいてもよい。このようにして、前記展開部材１１において、前記酵素標識化抗体の存在下、前記展開液の展開（矢印ｃ）により、前記基質、前記検体液が前記検出部１４に導入される。

このようにして、図３（ｄ）に示すように、前記検出部１４において、前記固定化抗体１７、前記検体中の分析対象物である抗原１６、および前記酵素標識化抗体１５の複合体１８が形成される。前記検出部１４において、前記複合体１８（酵素標識化抗体１５）における酵素１９と前記基質との反応による発色または発光等を検出する。これにより、前記抗原１６を間接的に検出する。前記検出は、例えば、目視による判定で行ってもよいし、比色計、蛍光光度計、フォトンカウンター、感光フィルム等を用いることで行ってもよい。このようにして、前記供給された検体液の前記展開部材における上流側への移動に起因する、前記検出部１４以外での発色または発光等が防止される。この結果、バックグラウンドの上昇を防止して、高感度の免疫分析（定量分析、半定量分析、定性分析等）を行うことができる。なお、前記「バックグラウンド上昇を防止」とは、バックグラウンド上昇を完全に防止する場合のみに限定されず、例えば、展開液の供給に先立って、検体供給部に検体液を供給する場合より、バックグラウンドの上昇を防止する場合を含む。

前記展開液を前記検体液に先立って供給する場合、例えば、前記検体液を供給するタイミング（例えば、前記展開液が、前記検体供給部に達する直前に、検体液を供給する）等を検討することにより、さらに、前述の効果を向上させることができる。前記タイミングは、例えば、前記展開液供給部と前記検体供給部との間の距離、前記展開液の種類、または前記展開部材の種類、サイズ等により適宜設定できる。前記展開液供給部と前記検体供給部との間の距離が、１〜１００ｍｍの範囲である場合には、例えば、前記展開液の前記展開液供給部への供給から０〜４００秒間の経過後に、前記検体供給部に前記検体液を供給する。前記距離が、１０〜８０ｍｍの範囲である場合には、前記展開液の前記展開液供給部への供給から０〜３６０秒間の経過後に、前記検体供給部に前記検体液を供給することが好ましい。前記距離が、２０〜４０ｍｍの範囲の場合には、前記展開液の前記展開液供給部への供給から０〜１８０秒間の経過後に、前記検体供給部に前記検体液を供給することがより好ましい。前記距離が、３０ｍｍである場合には、前記展開液の前記展開液供給部への供給から３０秒の経過後に、前記検体供給部に前記検体液を供給することが特に好ましい。

また、本実施形態の免疫分析方法では、前述のように、前記検体液の展開液供給部方向への逆流を防止することができるため、例えば、検体液の量を多くすることも可能である。このようにすれば、例えば、分析精度をさらに向上させることも可能である。

本実施形態の免疫分析方法において、前記検体中の分析対象物が抗体である場合は、例えば、前記検出部が、前記固定化抗体に代えて、固定化抗原を含む形態であってもよい。これにより、前記酵素標識化抗体または酵素標識化抗原、前記検体中の分析対象物である抗体および前記固定化抗原の複合体が形成され、前記複合体における前記酵素と前記基質とが反応して、発色または発光等を生じる。この発色または発光等を検出することにより、前記抗体を間接的に検出することができる。前記検体中の分析対象物である抗体としては、特に制限されず、種々の抗体があげられる。前記固定化抗原の抗原としては、前記検体中の分析対象物である抗体に結合可能な抗原であればよい。前記酵素標識化抗体の抗体としては、前記検体中の分析対象物である抗体に結合する抗体であればよい。また、前記酵素標識化抗原の抗原としては、前記検体中の分析対象物である抗体に結合する抗原であればよい。なお、前記酵素標識化抗体における抗体の調製や標識化の方法は、従来公知の方法が適用でき、酵素としては、例えば、前述と同様である。前記酵素標識化抗原における抗原の調製や標識化の方法は、従来公知の方法が適用でき、酵素としては、例えば、前述と同様である。前記固定化抗原の作製方法は、例えば、従来公知の方法等があげられ、特に制限されない。また、前記固定化抗原の検出部への固定方法としては、例えば、従来公知の方法等を用いることができ、特に制限されない。

本実施形態の免疫分析方法に用いる検体分析用具は、前記展開液の展開を促進するために、例えば、展開液受取パッドおよび廃液吸収パッドを備えてもよい。また、本実施形態の免疫分析用具に用いる検体分析用具は、その形状を安定に保つために、例えば、支持体を備えてもよい。

図２（ａ）の断面図に、前記展開液受取パッド、前記廃液吸収パッドおよび前記支持体を備えた検体分析用具の一例の構成を示す。図示のとおり、この検体分析用具２０は、展開部材２１と、展開液受取パッド２２と、廃液吸収パッド２３と、支持体２４とを主要な構成部材として備える。前記展開液受取パッド２２は、前記展開部材２１の上流側（同図において右側）に接触して配置されている。前記廃液吸収パッド２３は、前記展開部材２１の前記検出部１４より下流側（同図において左側）に接触して配置されている。前記展開部材２１、前記展開液受取パッド２２および前記廃液吸収パッド２３は、前記支持体２４上に配置されている。これら以外の構成は、前述の検体分析用具１０と同様である。前記「展開液受取バッド」は、本発明の「第１の展開液受取パッド」に相当する。前記「廃液受取パッド」は、本発明の「第２の展開液受取パッド」に相当する。

前記展開液受取パッドおよび前記廃液吸収パッドの材質としては、特に制限されず、例えば、ポリエチレン、グラスファイバー、レーヨン、ナイロン、紙、セルロース等があげられる。前記展開液受取パッドの形状および大きさは、特に制限されず、例えば、前記展開部材の形状等に応じて適宜設定できる。

前記支持体の材質としては、特に制限されず、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリエステル、酢酸セルロース等があげられる。また、前記支持体の形状としては、特に制限されず、例えば、フィルム状、シート状、板状等があげられる。前記支持体の形状および大きさは、特に制限されず、前記展開部材等に応じて、適宜設定できる。

前記展開部材、前記展開液受取パッドおよび前記廃液吸収パッドは、例えば、常法により前記支持体上に配置することができる。具体的には、例えば、両面テープまたは接着剤等を用いて、前記支持体上に固定されてもよい。

この検体分析用具２０を用いた免疫分析方法では、例えば、展開部材２１の上流側に接触して配置された（展開部材２１と一体化した）前記展開液受取パッド２２に、前記展開液を供給してもよい。この場合、前記展開液受取パッド２２の一部が、前記展開液供給部１２となる。なお、前記展開液供給部１２は、前記展開液受取パッド２２における所定の領域である。このようにすることで、前記展開液は、前記展開液受取パッド２２を介して、前記展開部材２１へ展開される。これら以外は、前述の免疫分析方法と同様である。また、例えば、前記展開液受取パッド２２に、前記基質を含浸させておいてもよい。

（実施形態２）
図２（ｂ）の断面図に、本実施形態の免疫分析方法に用いる検体分析用具の一例の構成を示す。図示のとおり、この検体分析用具３０は、図２（ａ）に示す検体分析用具が、さらにケース３１を備える。前記展開部材２１、前記展開液受取パッド２２、前記廃液吸収パッド２３および前記支持体２４は、前記ケース３１内に配置されている。前記ケース３１は、展開液供給口３２、検体供給口３３および窓３４を有する。前記展開液供給口３２は、その下端部が、前記展開液供給部１２と接するように配置されている。前記検体供給口３３は、前記検体供給部１３の上方に配置されている。前記窓３４は、前記検出部１４の上方に配置されている。このような構成であれば、例えば、取り扱いが容易になり、検体分析用具の操作性が向上する。また、この検体分析用具３０では、前記展開液供給部１２（展開液受取パッド２２）は、前記展開液供給口３２の下端と接しているが、これに限定されない。

前記ケースの材質としては、特に制限されず、例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合合成樹脂等があげられる。前記ケースの形状および大きさは、特に制限されず、前記展開部材等の形状および大きさに応じて適宜設定できる。

つぎに、本実施形態の免疫分析方法を説明する。

本実施形態の免疫分析方法では、まず、前記展開液供給口３２に、前記展開液を供給することで、前記展開液供給部１２に前記展開液を供給する。つぎに、前記検体供給口３３に、前記検体液を供給することで、前記検体供給部１３に前記検体液を供給する。前記窓３４から前記検出部１４における検出結果を観察する。これら以外は、図２（ａ）に示した検体分析用具を用いた免疫分析方法と同様である。

（実施形態３）
本実施形態の免疫分析方法は、複数項目の分析が可能な検体分析用具を用いた例である。

図４に、本実施形態の免疫分析方法に用いる検体分析用具の一例の構成を示す。図４（ａ）は、本実施形態に用いる検体分析用具の平面図である。図４（ｂ）は、図４（ａ）のＩＩ−ＩＩ方向に見た断面図である。前記両図に示すとおり、この検体分析用具４０は、正方形状の展開部材４１を備える。前記展開部材４１の中心付近には、一つの展開液供給部４２が配置されている。前記展開液供給部４２に対し、前記展開液供給部４２を中心に、４つの検体供給部４３ａ、４３ｂ、４３ｃおよび４３ｄが、前記展開部材４１の四方（図４（ａ）における上下左右方向）の端面よりに配置され、さらに、その外側に、リング状の検出部４４が配置されている。この検体分析用具４０では、前記展開液供給部４２と検体供給部４３ａとを結ぶ直線の外側への延長線上に位置する前記検出部４４において、前記検体供給部４３ａに応じて、検出部４４ａが配置されている。前記展開液供給部４２と検体供給部４３ｂとを結ぶ直線の外側への延長線上に位置する前記検出部４４において、前記検体供給部４３ｂに応じて、検出部４４ｂが配置されている。前記展開液供給部４２と検体供給部４３ｃとを結ぶ直線の外側への延長線上に位置する前記検出部４４において、前記検体供給部４３ｃに応じて、検出部４４ｃが配置されている。前記展開液供給部４２と検体供給部４３ｄとを結ぶ直線の外側への延長線上に位置する前記検出部４４において、前記検体供給部４３ｄに応じて、検出部４４ｄが配置されている。前記各検出部４４ａ、４４ｂ、４４ｃおよび４４ｄには、それぞれ抗体が固定化されている（固定化抗体）。これら以外の構成は、図１および図２に示す検体分析用具と同様である。このような形態であれば、例えば、一度の分析で多項目の検出が可能となる。前記展開液供給部は、二つ以上であってもよく、その場合は、各展開液供給部の一つに対し、複数の検体供給部および複数の検出部が設けられていてもよい。

つぎに、図４（ａ）を参照して、本実施形態の免疫分析方法を説明する。

図４（ａ）に示すように、前記展開液供給部４２に、前記展開液を供給すると、前記展開液は、前記展開部材４１中を、矢印に示すように、前記各検体供給部４３ａ、４３ｂ、４３ｃおよび４３ｄを経て、検体等を伴って、前記各検出部４４ａ、４４ｂ、４４ｃおよび４４ｄに向かって、放射状に展開する。これら以外は、実施形態１または２に記載の免疫分析方法と同様である。

前記検体分析用具４０では、正方形状の展開部材４１に、リング状の検出部４４が配置されているが、これに限定されず、例えば、図５に示すように、十字状の展開部材を備えた形態であってもよい。この検体分析用具５０は、十字状の展開部材５１を備える。前記十字状の展開部材５１の中心付近には、一つの展開液供給部４２が配置されている。前記展開液供給部４２を中心に、４つの検体供給部４３ａ、４３ｂ、４３ｃおよび４３ｄが、前記展開部材５１の四方（同図において上下左右方向）の端面よりに配置されている。前記展開液供給部４２と検体供給部４３ａとを結ぶ直線の外側への延長線上には、検体供給部４３ａに応じて、検出部４４ａが配置されている。前記展開液供給部４２と検体供給部４３ｂとを結ぶ直線の外側への延長線上には、検体供給部４３ｂに応じて、検出部４４ｂが配置されている。前記展開液供給部４２と検体供給部４３ｃとを結ぶ直線の外側への延長線上には、検体供給部４３ｃに応じて、検出部４４ｃが配置されている。前記展開液供給部４２と検体供給部４３ｄとを結ぶ直線の外側への延長線上には、検体供給部４３ｄに応じて、検出部４４ｄが配置されている。これら以外の構成は、前述の検体分析用具４０と同様である。この検体分析用具５０を用いた免疫分析方法における展開液の展開は、前記検体分析用具４０を用いた免疫分析方法と同様である。

（実施形態４）
本実施形態の分析方法は、標識化抗体の標識として、着色不溶性担体粒子を用いた免疫分析方法である。

前記着色不溶性担体粒子としては、特に制限されず、例えば、着色ラテックス粒子、金属コロイド粒子、着色ポリメチルメタクリレート粒子、着色ポリ乳酸粒子、着色多孔性ガラス粒子、着色シリカ粒子、着色アガロース粒子、着色デキストラン粒子等があげられる。前記着色ラテックス粒子としては、特に制限されず、例えば、青色ラテックス粒子、赤色ラテックス粒子等があげられる。前記金属コロイド粒子としては、特に制限されず、例えば、金コロイド粒子、白金コロイド粒子等があげられる。

前記着色不溶性担体粒子を結合させた標識化抗体は、特に制限されず、例えば、前記着色不溶性担体粒子を緩衝液等に懸濁し、この懸濁液に前記抗体を加えて、前記両者を反応させることで調製できる。前記緩衝液としては、特に制限されず、例えば、前述の緩衝液等があげられる。

本実施形態の免疫分析方法では、例えば、前記着色不溶性担体粒子を結合させた標識化抗体を、前記検体液に含ませておいてもよいし、前記着色不溶性担体粒子を結合させた標識化抗体を、前記展開部材または別途設けたパッド等に含浸させておいてもよい。ただし、例えば、前記パッド等を別途設けなくても、より高感度な分析が可能であることから、前記検体液に前記着色不溶性担体粒子を結合させた標識化抗体を含ませておくことが好ましい。

本実施形態の免疫分析方法では、検出部において、前記着色不溶性担体粒子の凝集による着色を検出することにより、分析対象物である抗原を検出する。これら以外は、実施形態１から３に記載の免疫分析方法と同様である。なお、本実施形態では、基質は使用しない。前記検出は、例えば、目視による判定で行ってもよいし、比色計等を用いることで行ってもよい。

（実施形態５）
本実施形態の分析方法は、標識化抗体の標識として、蛍光色素を用いた免疫分析方法である。

前記蛍光色素としては、特に制限されず、例えば、ＦＩＴＣ等があげられる。蛍光色素で標識化された抗体または抗原によれば、例えば、前記固定化抗体、分析対象物である抗原および前記標識化抗体の複合体、または前記固定化抗原、分析対象の抗体および前記標識化抗体または前記標識化抗原の複合体を形成させ、前記複合体に励起光を照射することによって、前記標識化抗体または前記標識化抗原の蛍光色素の発光を検出することができる。

つぎに、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。ただし、本発明は、下記の実施例および比較例によって何ら限定ないし制限されない。

［実施例１］
〔検体分析用具の作製〕
下記の手順により、図２（ａ）に示す構成の検体分析用具２０を作製した。

（１）展開部材の作製
ニトロセルロース膜（ミリポア社製、商品名「ＨＡ１８０」）を、長さ５０ｍｍ、幅４ｍｍに切断し、これを展開部材２１とした。前記展開部材２１の一端（図２（ａ）おける右側端部）から３１ｍｍの位置に、卵白アレルゲン抽出蛋白質水溶液（１ｍｇ／ｍＬ（５ｍｍｏｌ／Ｌ）ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈後、透析した水溶液）を、幅１ｍｍとなるように塗布した。このようにして、前記展開部材２１表面に、抗体が固定化された検出部１４を形成した。

（２）展開液受取パッドの作製
セルロースパッド（ミリポア社製、商品名「ＡＰ２５」）を、長さ２０ｍｍ、幅４ｍｍに切断し、これを展開液受取パッド２２とした。前記展開液受取パッド２２の一端（図２（ａ）において右側端部）から１０ｍｍの位置に、基質として、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（２０ｍｇ／ｍＬ、ベーリンガーマンハイム社製、商品名「ＢＣＩＰ」）５μＬを塗布し、３７℃で１時間放置して乾燥させた。

（３）廃液吸収パッドの作製
セルロースパッド（ミリポア社製、商品名「ＡＰ２５」）を、長さ３０ｍｍ、幅４ｍｍに切断し、これを廃液吸収パッド２３とした。

（４）支持体の作製
バッキングシート（Ｂｉｏ Ｄｏｔ社製、ＰＥＴ）を、長さ８０ｍｍ、幅４ｍｍに切断し、これを支持体２４とした。

（５）検体分析用具の作製
前記支持体２４の一端（図２（ａ）における右側端部）から１０ｍｍの位置に前記展開部材２１を貼り付けた。つぎに、前記展開液受取パッド２２の一端（図２（ａ）における右側端部）を前記支持体２４の一端に固定し、前記展開液受取パッド２２の他端（図２（ａ）において左側端部）側を前記展開部材２１の上流側部分上に重ねた。つぎに、前記廃液吸収パッド２３の一端（図２（ａ）における左側端部）を前記支持体２４の他端（図２（ａ）における左側端部）に固定し、前記廃液吸収パッド２３の他端（図２（ａ）において右側端部）側を前記展開部材２１の他端（図２（ａ）における左側端部、検出部１４より下流側部分）上に重ねた。このようにして、本実施例の検体分析用具２０を作製した。前記展開液供給部１２は、前記展開液受取パッド２２の前記一端から５ｍｍの位置とした。前記検体供給部１３は、前記展開部材２１の前記一端から２５ｍｍの位置とした。前記展開液供給部１２と前記検体供給部１３との間の距離は、３０ｍｍとした。

〔検体分析用具を用いた免疫分析〕
（１）検体液の調製
１０μＬの卵白特異ＩｇＥ陽性血清に、６０μＬのアルカリホスファターゼ標識化抗体（酵素標識化抗体、１０μｇ、ヤギ由来）を含ませて、３通りの検体液１〜３を調製した。

（２）展開液の準備
０．１ｍｏｌ／Ｌ 炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）を調製した。この緩衝液を展開液とした。

（３）分析方法の実施
まず、前記展開液供給部１２に、１００μＬの前記展開液を供給した。つぎに、前記展開液の供給から３０秒程度経過後に、前記検体供給部１３に、１５μＬの前記検体液を供給した。その後、検出部の反射率を、免疫分析装置（アークレイ（株）製、商品名「スポットケムＩＬ ＳＬ−４７２０」）を用いて測定した。本実施例における３通りの検体についての反射率（％）を、下記表１に示す。なお、前記反射率が小さいほど、バックグラウンドの上昇が防止されていたこととなる。

［実施例２］
３０μＬの前記検体液を供給したこと以外は、実施例１と同様にして、検体分析を行った。本実施例における３通りの検体についての反射率（％）を、下記表１に示す。

［比較例１］
まず、前記検体供給部１３に、検体液１５μＬを供給した。つぎに、前記検体液の供給から３０秒程度経過後に、前記展開液供給部１２に、１００μＬの展開液を供給したこと以外は、実施例１と同様にして、検体分析を行った。本比較例における３通りの検体についての反射率（％）を、下記表１に示す。

［比較例２］
まず、前記検体供給部１３に、検体液３０μＬを供給した。つぎに、前記検体液の供給から３０秒程度経過後に、前記展開液供給部１２に、１００μＬの展開液を供給したこと以外は、実施例２と同様にして、検体分析を行った。本比較例における３通りの検体についての反射率（％）を、下記表１に示す。

（表１）
実施例１ 実施例２ 比較例１ 比較例２
検体液１ ４８．７ ４６．９ ５１．７ ９５．４
検体液２ ５８．０ ５７．３ ５９．５ ９９．１
検体液３ ６８．０ ６５．８ ６９．１ １００

（評価）
前記表１に示すとおり、前記展開液の供給後に、１５μＬの前記検体液を供給した実施例１では、同量の前記検体液を供給した後に、前記展開液の供給した比較例１と比較して、反射率が小さく、バックグラウンドの上昇が防止された。また、前記展開液の供給後に、３０μＬの前記検体液を供給した実施例２では、同量の前記検体液を供給した後に、前記展開液を供給した比較例２と比較して、反射率が小さく、バックグラウンドの上昇が防止された。また、実施例１および実施例２において、検体量を増やすことによるバックグラウンドの上昇が防止された。一方、比較例１および比較例２において、検体量を増やすことによりバックグラウンドが大幅に上昇した。

本発明は、例えば、全血、血清、血漿、唾液、尿、髄液等に含まれる特定物質の検出（定量分析、半定量分析、定性分析等）に好適に使用でき、臨床検査、生化学検査、医学研究等の分野に適用可能であり、その用途は制限されず、広い分野に適用可能である。

１０、２０、３０、４０、５０、６０ 検体分析用具
１１、２１、４１、５１、６１ 展開部材
１２、４２、６２ 展開液供給部
１３、４３ａ、４３ｂ、４３ｃ、４３ｄ、６３ 検体供給部
１４、４４、４４ａ、４４ｂ、４４ｃ、４４ｄ、６４ 検出部
１５、６５ 酵素標識化抗体
１６、６６ 抗原
１７、６７ 固定化抗体
１８、６８ 複合体
１９、６９ 酵素
２２ 展開液受取パッド
２３ 廃液吸収パッド
２４ 支持体
３１ ケース
３２ 展開液供給口
３３ 検体供給口
３４ 窓
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ 矢印

Claims (10)

1. 展開部材に、展開液供給部、検体供給部および検出部が、展開液の流れの上流から下流にかけて、前記順序で配置された検体分析用具を用いる分析方法であって、
   前記検出部には、検体中の分析対象物に特異的に結合する物質が固定化されており、
   前記検体供給部に、前記検体を含む検体液を供給し、
   前記展開液供給部に、前記検体液の供給に先立って展開液を供給し、
   前記展開液供給部と前記検体供給部との間の距離が、１〜１００ｍｍの範囲であり、
   前記分析対象物に特異的に結合する標識化物質の存在下、前記供給された展開液の前記展開部材における展開により、前記供給された検体液が前記検出部に導入され、
   前記検出部において、前記固定化された特異的結合物質、前記分析対象物、および前記標識化された特異的結合物質の複合体が形成され、
   前記複合体における前記標識の検出により、前記分析対象物の分析を行うことを特徴とする分析方法。
2. 前記検体分析用具において、前記展開液供給部の一つに対し、複数の検体供給部および複数の検出部が設けられている、請求項１記載の分析方法。
3. 前記検体分析用具が、さらに、展開液供給口および検体供給口を有するケースを備え、
   前記展開部材が、前記ケース内に配置されている、請求項１または２記載の分析方法。
4. 前記検体分析用具が、さらに、第１の展開液受取パッドを備え、
   前記第１の展開液受取パッドが、前記展開部材の上流側に接触して配置され、
   前記第１の展開液受取パッドへの前記展開液の供給により、前記展開液が前記展開部材へ展開される、請求項１から３のいずれか一項に記載の分析方法。
5. 前記検体分析用具が、さらに、第２の展開液受取パッドを備え、
   前記第２の展開液受取パッドが、前記検出部より下流側に前記展開部材と接触して配置されている、請求項１から４のいずれか一項に記載の分析方法。
6. 前記特異的結合物質が、抗原または抗体である、請求項１から５のいずれか一項に記載の分析方法。
7. 前記展開液の前記展開液供給部への供給から０〜４００秒間の経過後に、前記検体供給部に前記検体液を供給する、請求項１から６のいずれか一項に記載の分析方法。
8. 展開部材に、展開液供給部、検体供給部、及び検出部が、展開液の流れの上流から下流にかけて、前記順序で配置された検体分析用具を用い、
   前記検体供給部に、検体を含む検体液を供給し、
   前記展開液供給部に、前記検体液の供給に先立って展開液を供給し、
   前記展開液供給部と前記検体供給部との間の距離が、１〜１００ｍｍの範囲であり、
   前記供給された展開液の前記展開部材における前記上流から前記下流にかけた展開により、前記供給された検体液の前記上流への逆流を防止し、
   前記検出部には、検体中の分析対象物に特異的に結合する物質が固定化されており、
   前記分析対象物に特異的に結合する標識化物質の存在下、前記供給された展開液の前記展開部材における展開により、前記供給された検体液が前記検出部に導入され、
   前記検出部において、前記固定化された特異的結合物質、前記分析対象物、および前記標識化された特異的結合物質の複合体が形成され、
   前記複合体における前記標識の検出により、前記分析対象物の分析を行うことを特徴とする検体液の逆流防止方法。
9. 展開部材に、展開液供給部、検体供給部および検出部が、展開液の流れの上流から下流にかけて、前記順序で配置された検体分析用具を用い、
   前記検体供給部に、前記検体を含む検体液を供給し、
   前記展開液供給部に、前記検体液の供給に先立って展開液を供給し、
   前記展開液供給部と前記検体供給部との間の距離が、１〜１００ｍｍの範囲であり、
   標識化された前記分析対象物に特異的に結合する物質の存在下、
   前記供給された展開液の前記展開部材における前記上流から前記下流にかけた展開により、前記供給された検体液の前記上流への移動に起因する、前記検出部以外での前記標識の検出を防止することを特徴とするバックグラウンド上昇の防止方法。
10. 前記検出部には、検体中の分析対象物に特異的に結合する物質が固定化されており、
    前記分析対象物に特異的に結合する標識化物質の存在下、前記供給された展開液の前記展開部材における展開により、前記供給された検体液が前記検出部に導入され、
    前記検出部において、前記固定化された特異的結合物質、前記分析対象物、および前記標識化された特異的結合物質の複合体が形成され、
    前記複合体における前記標識の検出により、前記分析対象物の分析を行う、請求項９記
    載のバックグラウンド上昇の防止方法。
    

Images