JP5508850B2 - ホルミル基含有多孔質担体、それを用いた吸着体、およびそれらの製造方法 - Google Patents

ホルミル基含有多孔質担体、それを用いた吸着体、およびそれらの製造方法 Download PDF

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Description

本発明は各種吸着体、特に治療用（医療用）吸着体や抗体医薬品精製用吸着体に関する。
多孔質担体は各種吸着体として、例えば各種クロマトグラフィー用吸着体やアフィニティー吸着体として広く用いられている。なかでも、アフィニティー吸着体は、効率よく目的物を精製、または不要物濃度を低減できることから、医療用吸着体や抗体医薬品精製用吸着体として利用されてきている。特に、リウマチ、血友病、拡張型心筋症の治療用（医療用）吸着体として、プロテインＡをアフィニティーリガンドとして多孔質担体に固定化した吸着体が注目されている（例えば非特許文献１、非特許文献２）。
一方、免疫グロブリン（ＩｇＧ）を特異的に吸着、溶出できる吸着体として、プロテインＡをアフィニティーリガンドとして多孔質担体に固定化した吸着体（抗体医薬品精製用吸着体）が注目されている。プロテインＡをはじめとする、種々のアフィニティーリガンドを多孔質担体に固定化する方法としては、例えば非特許文献３の表８・１や図８・１５に示される臭化シアン法、トリクロロトリアジン法、エポキシ法、トレシルクロリド法等の、様々な固定化法の中から選択することができる。中でも、安全性の観点や、固定化反応の容易さ、比較的容易な方法で産生されたタンパク質やペプチドが使用できる等の理由から、多孔質担体のホルミル基と、アフィニティーリガンドのアミノ基との反応を固定化に用いることが、産業上好ましい。
ホルミル基を多孔質担体に導入する方法としては、ビシナルの水酸基を持つ多糖ゲルを過ヨウ素酸酸化法によって酸化し、糖鎖上にホルミル基を生成させる方法（以下糖鎖開裂型と略す）が挙げられる（例えば非特許文献４参照）。この方法を介して得られた吸着体は、リガンドの漏れ（リーク）が少ないという利点がある。また、非特許文献３の図８・１５に示されるような、グルタルアルデヒドを作用させる方法や、非特許文献３の図８・１５または非特許文献５の図２．１３に示されるような、エポキシ基の開環により得られるグリセリル基に過ヨウ素酸塩を作用させる方法等により得られる、各種スペーサーを介してホルミル基を導入する方法（以下、スペーサー型と略す）が挙げられる。このスペーサー型ホルミル基含有多孔質担体を用いた吸着体は、比較的、目的物の吸着量が大きい傾向にある。
また、治療用（医療用）吸着体の分野においては、直接血液灌流法（ＤＨＰ）での使用が望まれており、担体およびそれを用いた吸着体はＤＨＰでの使用に耐えうる強度を有していることが望まれている。一方、抗体医薬品市場は近年大きく成長しており、これに伴って、抗体医薬品精製の大スケール化及び高線速化が積極的に行われている。精製の大スケール化及び高線速化に伴って、精製に用いられる吸着体、つまりは多孔質担体の強度を大きくする必要が生じる場合がある。強度が小さい多孔質担体では、大スケール且つ高線速下で使用すると、多孔質担体の圧密化が起こり、液が流れなくなってしまう等の問題が起こる場合がある。従来、強度の大きい多孔質担体としては、例えば特許文献１に示されるようなシリカゲル系多孔質担体、例えば特許文献２に示されるようなアガロース系架橋多孔質担体、例えば特許文献３に示されるようなセルロース系多孔質担体およびセルロース系架橋多孔質担体等が知られている。
特開平６−２８１６３８ 特表２０００−５０８３６１ 特開平１−２１７０４１ Annals of the New York Academy of Sciences, 2005, Vol.1051, P635-646 American Heart Journal, Vol.152, Number 4, 2006 アフィニティークロマトグラフィー、笠井献一ら著、東京化学同人、１９９１年 Immunology, 20, 1061, 1971年 Immobilized Affinity Ligand Techniques, Greg T. Hermanson et al., 1992
一般的に、先に述べた糖鎖開裂型ホルミル基含有多孔質担体では、強い酸化反応により糖鎖が開裂し、多孔質担体の強度が弱くなり、高線速下での使用が困難な場合がある。しかも目的物である抗体の吸着量が比較的小さい傾向にあり、抗体精製を高速で行うことが容易ではない。一方、スペーサー型ホルミル基含有多孔質担体は、ホルミル基導入量が少ないと、治療中や、目的物の精製中に、アフィニティーリガンドが漏れ出て、患者の血液や精製品に混入してしまう場合があり、安全性や純度の観点から好ましくない。
また、強度が大きい多孔質担体とされているシリカゲル系多孔質担体は、精製目的物の吸着量が小さい傾向があり、またアルカリ条件で使用が困難な場合が多い。アガロース系架橋多孔質担体は架橋方法が煩雑である場合が多く、また高価である場合が多い。セルロース系多孔質担体、およびセルロース系架橋多孔質担体は、ガラス系多孔質担体やアガロース系架橋多孔質担体のような短所は少ないものの、最近の抗体医薬品精製で主流となりつつあるスケール及び線速においては、圧密化が生じる場合がある。
そこで、本発明は従来の技術が有する上記課題に鑑みてなされたものであり、治療や精製の安全性を高め、高速化を実現でき、さらには精製品の純度を高くしうる、高強度なホルミル基含有多孔質担体、およびそれを用いた吸着体、およびそれらの製造方法、およびそれらを用いた精製方法を低コストで提供することを目的とする。
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意研究の結果、本発明を完成するに至った。
即ち本発明は、ホルミル基を有する多孔質担体であって、スペーサーに、下記一般式（１）：
（式中、Ｒ1は−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−と一緒になって５員環または６員環構造をなす原子団を表す）で表される基から誘導し得る下記一般式（２）：
（式中、Ｒ1は前記と同じ）で表される部位を有することを特徴とするホルミル基含有多孔質担体である。
また本発明は、前記ホルミル基含有多孔質担体の製造方法であって、前記式（１）で表される基を有するスペーサーが導入された多孔質担体を前駆体として、当該５員環または６員環を開裂させることによって前記式（２）で表される基を生成させることを特徴とする製造方法である。
また本発明は、下記一般式（５）：
（式中、Ｒ2は水素原子又は水酸基の保護基を示す）で表される部位を有するホルミル基含有多孔質担体であって、該多孔質担体にリガンドを固定化した吸着体のリガンドのリーク量が１００ｐｐｍ以下であることを特徴とする、ホルミル基含有多孔質担体である。
また、本発明は、上記ホルミル基含有多孔質担体の製造方法であって、セルロース担体に過ヨウ素酸塩を作用させピラノース環を酸化開裂しホルミル基を導入することを特徴とする製造方法である。
また本発明は、上記のいずれかのホルミル基含有多孔質担体にアフィニティーリガンドを結合させた吸着体である。
更に本発明は、当該吸着体を用いる精製方法であり、好ましい態様としては、プロテインＡをアフィニティーリガンドとした吸着体を用いる免疫グロブリンの精製方法である。
本発明によれば、高強度のホルミル基含有多孔質担体が提供される。本発明のホルミル基含有多孔質担体は、吸着体に好適に用いることができ、目的物の吸着量が大きく、リガンドの漏れが少ない吸着体が得られる。また、本発明の吸着体によれば、治療や精製の安全性を高めることができ、治療や精製の高速化、高純度化をも提供することができる。
本発明者らは、アフィニティーリガンドを有する吸着体の調製に際して、下記一般式（１）で表される基から誘導される下記一般式（２）で表される部位を有するスペーサーが導入されたホルミル基含有多孔質担体を用いることによって、リガンドのリーク量が少なく、且つ目的物の吸着量が大きい吸着体が得られることを見出した。
式中、Ｒ1は、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−と一緒になって５員環または６員環構造をなす原子団を表す。
Ｒ1は前記式（１）中のＲ1に対応する。
また本発明のホルミル基含有多孔質担体は、アミノ基を含有するリガンドを固定化した場合に、前記ホルミル基と、リガンドのアミノ基が、一般式（３）または一般式（４）で表すことができる構造を形成しうることが、リガンドのリーク量がより少なくなるため好ましい。
前記式（３）及び（４）において、Ｎ原子ともに６員環または７員環構造をなす原子団であって、前記式（１）におけるＲ1に対応する。
ここで、各一般式中のＲ1には特に限定は無く、Ｒ1に含まれる原子種、原子の数、長さ、分岐数等に限定は無く、環状となっている部分や２重結合、および／または３重結合が存在していても良い。また、元素記号を記していない部分については、原子種、置換基の有無、結合数、２重結合および／または３重結合の有無等に限定は無く、２種以上の元素が含まれていても良い。また、各一般式中のいずれかの場所が、多孔質担体と結合、または他の化合物を介して多孔質担体に結合されているものとする。
本発明のホルミル基含有多孔質担体は、多孔質担体に一般式（１）で表される構造を有するスペーサーが導入された多孔質担体を前駆体とし、該前駆体担体を過ヨウ素酸酸化法等によって処理して、スペーサー構造を一般式（２）で表される構造に変換することによって得ることができる。
前駆体調製に際してスペーサーとして導入される化合物は、前記一般式（１）で表される５員環乃至６員環構造の構造を有する化合物であれば、特に限定なく用いることができる。このような環構造としては、シクロペンタンやシクロヘキサン等に代表される炭素のみで構成される５員環乃至６員環や、フラノースあるいはピラノース等に代表される、糖または糖類似物が挙げられるが、入手が容易である等の理由から、糖または糖類似物であることが好ましい。さらに、一般式（３）または一般式（４）の構造が得られやすいため、糖が還元糖であることがより好ましい。
また、前記一般式（１）で表される環構造を有する化合物としては、ホルミル基の導入方法として過ヨウ素酸酸化法等を用いる場合において、水酸基と結合している炭素原子が連続して存在している部分を有し、且つ連続する該炭素原子数が最大２であることが好ましい。これは、前記一般式（２）で表される構造の含有率が大きくなりやすく、アミノ基を含有するリガンドを固定化した場合に、一般式（３）または一般式（４）で表される構造を形成しやすくなるためである。
水酸基と結合している炭素原子が、３つ以上連続して存在している部分を有している糖または糖類似物であっても、該連続する炭素原子数が２である部分を他に有していれば、上記一般式（２）で表される構造の含有率が大きくなりやすく、アミノ基を含有するリガンドを固定化した場合に、一般式（３）または一般式（４）で表される構造を形成しやすくなるため好ましい。
なお、前記一般式（１）で表される環構造を有する化合物としてグルコースを用いると、過ヨウ素酸酸化法によってホルミル基を導入した場合、グルコースは水酸基と結合している炭素原子が３つ以上連続して存在している部分を有し、且つ該連続する炭素原子数が２である部分を他に有していないため、理論的には直鎖状のスペーサーが得られ、一般式（２）とは異なった構造となる確率が大きいと考えられる。ただし、多孔質担体への導入条件やホルミル基の導入条件によっては一般式（２）の構造を取る場合もあるので、グルコースの使用を否定するものではない。
多孔質担体に糖または糖類似物を導入する方法として、多孔質担体が有している官能基と、糖または糖類似物が有している官能基間の反応を利用することが好ましい。多孔質担体の官能基、糖または糖類似物の官能基については、それぞれ特に限定は無く、互いに反応しあう組み合わせを用いることが好ましく、間に他の化合物を介していることも好ましい。
エポキシ基および／またはホルミル基を導入した多孔質担体を中間体として利用する場合は、該糖または該糖類似物はエポキシ基および／またはホルミル基と反応しうる官能基を有していることが好ましい。
エポキシ基と反応する官能基としては、エポキシ基と反応するものであれば特に限定は無いが、一般的には水酸基、チオール基、アミノ基が挙げられる。エポキシ基を導入した多孔質担体を中間体として用いる場合は、該糖または該糖類似物はこれら官能基を少なくとも１種以上含有することが好ましい。より好ましい官能基は、後工程であるスペーサーのホルミル化に影響を与え難いことから、チオール基、アミノ基であり、入手の容易さからアミノ基であることが特に好ましい。
ホルミル基と反応する官能基としては、ホルミル基と反応するものであれば特に限定は無いが、一般的にはアミノ基が挙げられ、ホルミル基を導入した多孔質担体を中間体として用いる場合は、該糖または該糖類似物はアミノ基を含有することが好ましい。
すなわち、多孔質担体に導入される糖または糖類似物は、チオール基および／またはアミノ基を少なくとも１種以上含有することが、より好ましい。
アミノ基含有糖（アミノ糖）としては、特に限定は無いが、グルコサミン、ガラクトサミン、アンノサミン、ラクトサミン、フコサミン、マンノサミン、メグルミン、アロサミン、アルトロサミン、リボサミン、アラビノサミン、グロサミン、イドサミン、タロサミン、キシロサミン、リキソサミン、ソルボサミン、タガトサミン、サイコサミン、フルクトサミン、イミノシクリトール、ムコ多糖類、糖タンパク類、ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン、コンドロイチン４−硫酸、デルマタン硫酸、およびこれらのＤ体、Ｌ体、ラセミ体、これらを構成成分として含む多糖，ポリマー、糖脂質等の一種以上から選択されたもの、あるいはこれらの塩酸塩等の塩、等を挙げることができる。
なかでも、グルコサミン及びその誘導体がより好ましい。これは、上記一般式（２）で表すことができる構造が比較的効率良く得られやすく、アミノ基を含有するリガンドを固定化した場合に、一般式（３）または一般式（４）で表すことができる構造を形成しやすくなるためであり、また容易に入手できるためである。グルコサミンはＤ体、Ｌ体のいずれであってもよいが、Ｄ体であることがより好ましい。
また本発明に使用できるグルコサミンの製造方法は、特に限定は無いが、グルコース等を化学修飾することにより得られるものが好ましく、甲殻類等の甲羅、キチン、キトサン等の由来物であることがより好ましく、また植物性化合物等から得られうるグルコサミン、例えば、協和発酵社製のいわゆる発酵グルコサミンとして知られているもの等であることが特に好ましい。また本発明に使用できるグルコサミンは塩酸塩等の塩であることも、溶解性の観点から好ましい。
また、多孔質担体に導入される糖または糖類似物の導入量は、多孔質担体１ｍＬあたり、１μｍｏｌ以上５００μｍｏｌ以下であることが好ましい。糖または糖類似物の導入量が多孔質担体１ｍＬあたり、１μｍｏｌ以上であれば、吸着体として使用した場合に、目的物の吸着量が大きくなるため好ましく、５００μｍｏｌ以下であれば、本発明の多孔質担体の製造コストを抑制できるため好ましい。
糖または糖類似物のより好ましい導入量は多孔質担体１ｍＬあたり、３μｍｏｌ以上２５０μｍｏｌ以下、さらに好ましくは６μｍｏｌ以上１２５μｍｏｌ以下、特に好ましくは１０μｍｏｌ以上７０μｍｏｌ以下、最も好ましくは１０μｍｏｌ以上３０μｍｏｌ以下である。糖または糖類似物の導入量は、導入反応終了後の反応溶液中の糖または糖類似物の減少量を測定する方法、反応後の多孔質担体への滴定法（非水滴定等）や、元素分析法等によって、求めることができる。
多孔質担体に糖または糖類似物を導入する際、該糖または該糖類似物の使用量に特に限定は無いが、より適切な導入量を得るため、多孔質担体の当該官能基含量の０．０１倍モル以上であることが好ましく、廃液処理や効率の観点からは、１００倍モル以下であることが好ましい。より好ましくは０．１倍モル以上１０倍モル以下、さらに好ましくは０．５倍モル以上５倍モル以下、特に好ましくは１倍モル以上２．５倍モル以下である。
糖または糖類似物を多孔質担体に導入する際の溶媒については特に限定は無いが、水、ヘプタン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキソラン等の汎用有機溶媒や、エタノール、メタノール、プロパノール等のアルコールや、これらの２種以上の混合溶媒を用いることができる。
また、導入反応のｐＨについては特に限定は無いが、反応効率の観点から、ｐＨ３以上で反応させることが好ましく、官能基の失活や多孔質担体へのダメージが少ないという理由からｐＨ１３以下であることが好ましい。より好ましくはｐＨ４以上１２以下、さらに好ましくはｐＨ６以上１１以下、特に好ましくはｐＨ７以上１０以下、最も好ましくはｐＨ８以上１０以下である。
また、糖または糖類似物を導入する際の温度については特に限定は無いが、反応速度的に有利であるという理由から０℃以上であることが好ましく、安全性や担体へのダメージの観点から１００℃以下であることが好ましく、官能基が失活し難いという理由から７０℃以下であることがより好ましい。より好ましくは４℃以上６０℃以下、さらに好ましくは１０℃以上５０℃以下、特に好ましくは１５℃以上４０℃以下、最も好ましくは２５℃以上４０℃以下である。
また導入反応は攪拌または振とうしながら行うことが好ましく、その１分間当りの回転数または回数は、特に限定は無いが、均一攪拌が可能で、且つ担体に物理的なダメージが加わらないという理由から、１回以上１０００回以下であることが好ましく、より好ましくは１０回以上５００回以下、さらに好ましくは３０回以上３００回以下、特に好ましくは５０回以上２００回以下、最も好ましくは７５回以上１５０回以下であるが、各原料の比重の差や担体の強度に合わせて調整することが特に好ましい。
糖または糖類似物を多孔質担体に導入する反応時間については、特に限定は無いが、官能基の失活や担体へのダメージが少ないという理由から、０．２時間以上１００時間以下、より好ましくは０．５時間以上５０時間以下、さらに好ましくは１時間以上２４時間以下、特に好ましくは２時間以上２０時間以下、最も好ましくは３時間以上１２時間以下であるが、反応性や、ｐＨや、反応温度に合わせて調整することが好ましい。
多孔質担体に、糖または糖類似物を導入する方法は、特に限定は無いが、エポキシ基を導入した多孔質担体を中間体として利用することが好ましい。これは中間体である多孔質担体のエポキシ基と、糖または糖類似物を反応させる方法が、簡便で反応効率が良いため好ましいためと考えている。
多孔質担体にエポキシ基を導入する方法としては、特に限定は無いが、公知の技術を用いて行うことができる。
例えば、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジクロロヒドリン等のハロヒドリンや、レソルシノールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ヒドロゲナートビスフェノールＡジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンジグリシジルエーテル、ジグリシジルテレフタレート、ジグリシジルオルトフタレート、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル等の２官能以上のエポキシ化合物等の少なくとも１種を、多孔質担体に作用させてエポキシ基を導入することができる。これらの２官能以上のエポキシ化合物を作用させると、多孔質担体が架橋されて強度が強くなる場合があり、好ましい。
中でもコストや安全性の面から、エピクロロヒドリンを用いる事が好ましく、強度や水溶性の面から、グリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル等のグリシジルエーテル系化合物を用いる事がより好ましい。
これらエポキシ化剤の使用量に特に限定は無いが、より適切なエポキシ基導入量を得るため、担体の体積の０．０１倍以上であることが好ましく、および／または廃液処理や効率の観点から、多孔質担体の体積の１０倍以下であることが好ましく、より好ましくは０．０５倍以上５倍以下、さらに好ましくは０．１倍以上３倍以下、特に好ましくは０．１倍以上１倍以下、最も好ましくは０．１倍以上０．５倍以下である。
エポキシ化反応を行う際の溶媒については特に限定は無いが、水、ヘプタン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキソラン等の汎用有機溶媒や、エタノール、メタノール、プロパノール等のアルコールや、これらの２種以上の混合溶媒を用いることができる。
また、反応効率の観点から、アルカリ条件下で反応させることが好ましい。また、反応時間を短縮するため、ソディウムボロヒドリド等の還元剤を共存させることがより好ましい。
エポキシ化反応時の温度については特に問題は無いが、反応速度的に有利であるという理由から０℃以上であることが好ましく、および／または安全性や担体へのダメージの観点から１００℃以下であることが好ましく、エポキシ基が失活し難いという理由から７０℃以下であることがより好ましく、さらに好ましくは４℃以上６０℃以下、特に好ましくは２５℃以上５０℃以下、最も好ましくは２５℃以上４０℃以下である。
エポキシ基導入反応は攪拌または振とうしながら行うことが好ましく、その１分間当りの回転数または回数は特に限定は無いが、均一攪拌が可能で、且つ担体に物理的なダメージが加わらないという理由から１０回以上１０００回以下であることが好ましく、より好ましくは３０回以上５００回以下、特に好ましくは５０回以上３００回以下、最も好ましくは７５回以上１５０回以下であるが、各原料の比重の差や多孔質担体の強度に合わせて調整することが特に好ましい。
エポキシ化反応時間については、特に限定は無いが、エポキシ基の失活や担体へのダメージが少ないという理由から、ハロヒドリンを用いる場合は、１時間以上８時間以下、ビスエポキシド（ビスオキシラン）やポリエポキシド（ポリオキシラン）等の２官能以上のエポキシ化合物を用いる場合は、２時間以上、１５時間未満であることが好ましく、エポキシ化剤の反応性や、ｐＨや、反応温度に合わせて調整することがより好ましい。
また本発明の多孔質担体の中間体のエポキシ含量は、多孔質担体１ｍＬあたり２μｍｏｌ以上１５０μｍｏｌ以下であることが、好ましい。エポキシ基導入量が２μｍｏｌ以上であると、糖または糖類似物を導入しやすいため好ましく、１５０μｍｏｌ以下であると、糖または糖類似物と多孔質担体との多点結合や、抗体精製時の非特異吸着が抑制できるため好ましい。また理由は定かではないが、エポキシ基導入量が１５０μｍｏｌ以下であると、吸着体として利用する際、吸着量が大きくなるため好ましい。また本発明の多孔質担体の中間体のより好ましいエポキシ含量は、多孔質担体１ｍＬあたり５μｍｏｌ以上１００μｍｏｌ以下、特に好ましくは７．５μｍｏｌ以上５０μｍｏｌ以下、最も好ましくは１５μｍｏｌ以上３５μｍｏｌ以下である。
本発明では、多孔質担体に導入された上記一般式（１）で表される構造を有する糖または糖類似物を上記一般式（２）で表されるホルミル基に変換する。このような方法としては、過ヨウ素酸酸化法を挙げることができる。過ヨウ素酸ナトリウムや過ヨウ素酸カリウム等の過ヨウ素酸塩を作用させて、ホルミル基を導入することが好ましい。この方法を用いれば、アミノ基含有リガンドを固定化した場合に、一般式（３）または一般式（４）で示すことができる構造を形成しうるホルミル基が得られやすいため好ましい。
前述のエポキシ基を導入した多孔質担体を中間体として利用する場合や、後述するエポキシ基を官能基とする架橋剤を用いて多孔質担体を架橋する場合、グリセリル基、すなわちビシナルの水酸基が生じる傾向がある。よって、過ヨウ素酸酸化法を用いた場合、後にアミノ基を含有するリガンドを固定化すると、一般式（３）または一般式（４）で表すことができる構造を形成し難いホルミル基が生じる場合がある。このような観点から、糖または糖類似物を多孔質担体に導入する前に、当該グリセリル基を封止、または分解等により処理することが好ましい。
当該グリセリル基の処理方法としては特に限定は無いが、必要最小限のエピハロヒドリンや２官能以上のエポキシ化合物、架橋剤等を作用させる方法や、ヨウ化メチル、ヨウ化エチル、その他のヨウ化アルキル、ジブロモプロパン、その他のジブロモアルカン等の、ハロゲン化化合物を作用させてエーテル化やエステル化を行う方法等が挙げられる。
また、糖または糖類似物を多孔質担体に導入する前に、予め過ヨウ素酸塩等を作用させて、当該グリセリル基をホルミル基（すなわちモノホルミル基）に変化させる方法も好ましい。過ヨウ素酸塩を作用させてグリセリル基をモノホルミル基とした場合は、このモノホルミル基に直接、糖または糖類似物を導入することができるため、好ましい。
また当該モノホルミル基が過剰に存在する分に対して、モノエタノールアミンやグリシン等のアミノ基を有する化合物を作用さて封止することも好ましい。また当該モノホルミル基に、水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤を作用させる等して、モノホルミル基を水酸基に変化させる方法も好ましい。モノホルミル基を水酸基に変化させた場合は、当該水酸基に必要最小限のエピハロヒドリンや２官能以上のエポキシ化合物等を作用させて、エポキシ基を導入した中間体を作成した後、糖または糖類似物を導入する方法を採用することが好ましい。
また以上に述べた各種の方法を組み合わせるおよび／または繰り返すことも好ましい。すなわち、これら過ヨウ素酸塩で予め当該グリセリル基を処理することにより得られる、ホルミル基を導入した多孔質担体を、中間体として利用することが好ましい。
中でも、当該グリセリル基の処理方法としては、グリセリル基にハロゲン化アルコールや単官能エポキシ化合物を作用させることが特に好ましい。この方法を用いれば、多孔質担体の親水性が損なわれることが少なく、またグリセリル基の処理後も水酸基が残存するため、糖または糖類似物を導入できる活性部位が失われることが無く、また多孔質担体の基材にビシナルの水酸基が存在する場合においても、多孔質担体の強度が低下することが無いため、好ましい。
すなわち、ハロゲン化アルコールおよび／または単官能エポキシ化合物を作用させた多孔質担体を、中間体として用いることが好ましい。当該グリセリル基に作用させるハロゲン化アルコールとしては、特に限定は無いが、例えば、クロロメタノール、ブロモメタノール、ヨードメタノール、２−ヨードエタノール、２−クロロエタノール、２−ブロモエタノール、２−クロロ−１−プロパノール、３−クロロ−１−プロパノール、３−ブロモ−１−プロパノール、１，３−ジクロロ−２−プロパノール、１−クロロ−２−メチル−２−プロパノール、２−クロロエタノール、３−クロロプロパノール、４−クロロブタノール、５−クロロペンタノール、６−クロロヘキサノール、９−クロロノナノール、トリフルオロエタノール、トリクロロエタノール、２，２−ジクロロエタノール、１−クロロ−２−プロパノール、２，２−ジブロモエタノール、２，２，２−トリブロモエタノール、２−フルオロエタノール、２−クロロシクロヘキサノール、２−クロロシクロペンタノール、ｏ−，ｍ−及びｐ−クロロフェノール、ペンタフルオロプロパノール、テトラフルオロプロパノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ヘプタフルオロブタノール、ノナフルオロ−ｔ−ブタノール、オクタフルオロペンタノール、６−クロロ−１−ヘキサノール、６−ブロモ−１−ヘキサノール、４−クロロ−１−ブタノール、３−クロロ−２，２−ジメチル−１−プロパノール、テトラフルオロプロパノール、テトラフルオロブタノール、テトラフルオロペンタノール、テトラフルオロヘプタタノール、テトラフルオロオクタノール、ペンタフルオロプロパノール、ペンタフルオロブタノール、ペンタフルオロペンタノール、ペンタフルオロヘプタタノール、ペンタフルオロオクタノール、ヘキサフルオロプロパノール、ヘキサフルオロブタノール、ヘキサフルオロペンタノール、ヘキサフルオロヘプタタノール、ヘキサフルオロオクタノール、ヘプタフルオロプロパノール、ヘプタフルオロブタノール、ヘプタフルオロペンタノール、ヘプタフルオロヘプタタノール、ヘプタフルオロオクタノール、テトラクロロエタノール、クロロヘプタノール、２，２，２−トリクロロエタノール、トリブロモエタノール、１，３−ジクロロ−２−プロパノール、１，１，１−トリクロロ−２−プロパノール、ジ（ヨードヘキサメチレン）アミノイソプロパノール、トリブロモ−ｔ−ブチルアルコールアルキレンオキシド等を挙げることができ、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
より好ましいハロゲン化アルコールは、ヨウ化アルコールであり、中でもヨードメタノール、２−ヨードエタノールが、多孔質担体の疎水性が大きくなり難いため特に好ましい。
また、当該グリセリル基に作用させる単官能エポキシ化合物としては、特に限定は無いが、例えば、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、ブチレンオキシド、アミレンオキサイド、ヘキシレンオキサイド、テトヒドロフラン、４−ビニルシクロヘキセンモノエポキサイド、ノルボルネンモノエポキサイド、リモネンモノエポキサイド、フェニルグリシジルエーテル、モノエポキシ化４−ビニルシクロヘキセン、メチルグリシジルエーテル、エチルグリシジルエーテル、ブチルグリシジルエーテル、２−エチルヘキシルグリシジルエーテル、シクロヘキシルグリシジルエーテル、メトキシエチルグリシジルエーテル、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルグリシジルエーテル、ブチルグリシジルエーテル、２−エチルヘキシルグリシジルエーテル、アリールグリシジルエーテル、１，２−ブチレンオキシド、１，３−ブタジエンモノオキサイド、１，２−ドデシレンオキサイド、１，２−エポキシデカン、スチレンオキサイド、シクロヘキセンオキサイド、３−メタクリロイルオキシメチルシクロヘキセンオキサイド、３−ビニルシクロヘキセンオキサイド、４−ビニルシクロヘキセンオキサイド、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルグリシジルエーテル、ジブロモフェニルグリシジルエーテル等を挙げることができ、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
より好ましい単官能エポキシ化合物は、アルキレンオキシドであり、中でもエチレンオキシド、プロピレンオキシド、ブチレンオキシドが、多孔質担体の疎水性が大きくなり難いため特に好ましく、安全性の面からブチレンオキシドが最も好ましい。当該グリセリル基にハロゲン化アルコールや単官能エポキシ化合物を作用させる反応の条件や詳細な製造方法については、特に限定は無いが、前述のエポキシ基導入反応と同様に行うことができる。さらに、ＫＩやＢｕ４ＮＩ等のオニウム塩を触媒として作用させると、反応性が向上するため好ましい。
多孔質担体は治療用（医療用）吸着体をはじめとする各種クロマトグラフィー用吸着体やアフィニティー吸着体として広く用いられているが、特に抗体医薬品精製の分野においては、抗体医薬品市場の大きな伸びに伴って、精製の大スケール化及び高線速化が積極的に行われている。精製の大スケール化及び高線速化に伴って、精製に用いられる吸着体、つまりは多孔質担体の強度を大きくする必要が生じる場合がある。多孔質担体の強度を大きくする方法としては、特に限定は無く、多孔質担体のマトリックス含量（例えば樹脂含量）を大きくする方法等が好ましいが、多孔質担体の細孔径が小さくなり難いという利点から、架橋剤を作用させて多孔質担体の強度を大きくすることがより好ましい。つまり、本発明の多孔質担体は、架橋されていることが好ましい。
架橋剤や架橋反応条件に特に限定は無く、公知の技術を用いて行うことができる。例えば、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジクロロヒドリン等のハロヒドリンや、レソルシノールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ヒドロゲナートビスフェノールＡジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンジグリシジルエーテル、ジグリシジルテレフタレート、ジグリシジルオルトフタレート、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル等の２官能以上のエポキシ化合物を作用させることによって、架橋を行うことができる。
これら架橋剤を用いて、多孔質担体の強度を大きくする方法は特に限定は無いが、反応効率の観点から、これら架橋剤をアルカリ条件下で担体に作用させることが好ましい。架橋剤の投入方法には特に限定は無く、全使用量を反応初期から投入しても良いし、複数回に分けて反応を繰り返しても良く、また滴下ロート等を用いて、少量ずつ架橋剤を投入しても良く、また架橋剤が投入された反応容器に多孔質担体を投入しても良い。
架橋反応の溶媒については特に限定は無いが、水、ヘプタン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキソラン等の汎用有機溶媒や、エタノール、メタノール、プロパノール等のアルコールや、これらの２種以上の混合溶媒を用いることができる。また、反応効率を高めるため、ソディウムボロヒドリド等の還元剤を共存させることがより好ましい。
架橋反応時の温度については特に限定は無いが、反応速度的に有利であるという理由から０℃以上であることが好ましく、および／または安全性や多孔質担体へのダメージの観点から１００℃以下であることが好ましく、官能基が失活し難いという理由から７０℃以下であることがより好ましい。
架橋反応は攪拌または振とうしながら行うことが好ましく、その１分間当りの回転数または回数は、特に限定は無いが、均一攪拌が可能で、且つ多孔質担体に物理的なダメージが加わらないという理由から１分間あたり１回以上１０００回以下であることが好ましく、より好ましくは１０回以上５００回以下、さらに好ましくは３０回以上３００回以下、特に好ましくは５０回以上２００回以下、最も好ましくは７５回以上１５０回以下であるが、各原料の比重の差や多孔質担体の強度に合わせて調整することが、好ましい。
架橋反応時間については、特に限定は無いが、官能基の失活や担体へのダメージが少ないという理由から、ハロヒドリンを用いる場合は、１時間以上８時間以下、２官能以上のエポキシ化合物を用いる場合は、１時間以上、１５時間未満であることが好ましく、架橋剤の反応性や、ｐＨや、反応温度に合わせて調整することが、より好ましい。
本発明の多孔質担体の材質に特に限定は無いが、例えば、多糖類、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリビニルアルコール、およびこれらの誘導体等を挙げることができる。これらは、ヒドロキシエチルメタクリレート等のヒドロキシ基を有する高分子材料やポリエチレンオキサイド鎖を有する単量体と他の重合性単量体との共重合のようなグラフト共重合体等のコーティング層を有していてもよい。これらの中で多糖類や、ポリビニルアルコール等が、担体表面に活性基を導入しやすいため、好ましく用いることができる。
なかでも、本発明の多孔質担体は多糖類を含有することがより好ましい。多糖類は産業的に容易に得ることが可能であり、また生体に対する安全性が高いため好ましい。本発明の多孔質担体に用いることができる多糖類に特に限定は無いが、例えば、アガロース、セルロース、デキストリン、キトサン、キチン、及びこれらの誘導体等を挙げることができる。
また、本発明の多孔質担体は、セルロースおよび／またはセルロース誘導体を含有することがより好ましい。セルロースまたはセルロース誘導体を含有する多孔質担体は、機械的強度が比較的高く、強靱であるため破壊されたり微粒子を生じたりすることが少なく、カラムに充填した場合に液を高線速で流しても比較的圧密化し難いため好ましい。また、強度やコストの観点から本発明の多孔質担体の材質に最も好ましいのはセルロースである。
また本発明は、一般式（５）：
（式中、Ｒ２は水素原子又は水酸基の保護基を示す）で表される部位を有するホルミル基含有多孔質担体であって、該多孔質担体にリガンドを固定化した吸着体のリガンドのリーク量が１００ｐｐｍ以下であることを特徴とする、ホルミル基含有多孔質担体に関する。
本発明における水酸基の保護基Ｒ2としては、プロテクティブ グループス インオーガニック シンセシス（Protective Group in Organic Synthesis）第２版、ジョン ウィリー アンド サンズ（John Wiley ＆ Sons, Inc.）出版に記載の保護基から選ぶことができる。
水酸基の保護基Ｒ2としては、アシル基（炭素数１〜１０の鎖状もしくは分岐状のものであり、飽和、不飽和結合を含む、例えば、アセチル基）、アルキル基（炭素数１〜１０の鎖状もしくは分岐状のものであり、飽和、不飽和結合を含む、例えば、メチル基、エチル基）、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、シアノエチル基、アミノエチル基、ニトロ基、スルホ基、リン酸基などが挙げられる。
本発明者らは、一般式（５）で表される部位を有するホルミル基含有多孔質担体であって、該多孔質担体にリガンドを固定化した吸着体のリガンドのリーク量が１００ｐｐｍ以下であることを特徴とする、ホルミル基含有多孔質担体によって、リガンドの漏れが減少し、精製目的物の純度を高めることができることを見出した。なお、本発明において、リガンドのリーク量は精製目的物に対するリガンドの比と規定している。
また、本発明の多孔質担体は、セルロースおよび／またはセルロース誘導体を含有することがより好ましい。セルロースまたはセルロース誘導体を含有する多孔質担体は、機械的強度が比較的高く、強靱であるため破壊されたり微粒子を生じたりすることが少なく、カラムに充填した場合に液を高線速で流しても比較的圧密化し難いため好ましい。また、強度やコストの観点から本発明の多孔質担体の材質に最も好ましいのはセルロースである。
多孔質担体に一般式（５）で示した構造を形成するホルミル基を導入する方法としては、特に限定は無いが、過ヨウ素酸ナトリウムや過ヨウ素酸カリウム等の過ヨウ素酸塩を作用させることが好ましい。また、セルロース担体に過ヨウ素酸塩を作用させ、ピラノース環を酸化開裂し、ホルミル基を導入することがより好ましい。過ヨウ素酸塩を用いたホルミル化の条件としては、前述した一般式（１）で表される構造を一般式（２）で表される構造に変換する場合と同様である。
また、本発明の多孔質担体のホルミル基含量は、多孔質担体１ｍＬあたり１μｍｏｌ以上２００μｍｏｌ以下であることが好ましい。ホルミル基含量が多孔質担体１ｍＬあたり１μｍｏｌ以上であれば、アフィニティーリガンドを効率よく固定化でき、吸着体として用いた場合に、精製目的物の吸着量が大きくなるため好ましい。また、理由は定かではないが、驚くべきことに、ホルミル基含量が多孔質担体１ｍＬあたり２００μｍｏｌ以下であれば、精製目的物の吸着量が大きくなりやすいため、好ましい。また、過ヨウ素酸塩を作用させてホルミル基を導入する方法を用いる場合、多孔質担体１ｍＬあたりのホルミル基含量が２００μｍｏｌ以下であれば、多孔質担体の強度が大きくなりやすいため好ましい。
ホルミル基含量のより好ましい範囲は多孔質担体１ｍＬあたり２μｍｏｌ以上１００μｍｏｌ以下であり、さらに好ましくは４μｍｏｌ以上７０μｍｏｌ以下であり、特に好ましくは７μｍｏｌ以上４０μｍｏｌ以下であり、最も好ましくは、１０μｍｏｌ以上２５μｍｏｌ以下である。
ホルミル基含量は、例えば、ホルミル基導入反応の、時間、温度、過ヨウ素酸塩等のホルミル化剤の濃度などによって調整することができる。ホルミル基の含量は、多孔質担体に吸着するフェニルヒドラジン量として簡便に求めることができる。すなわち、ｐＨ８の０．１Ｍリン酸バッファーで置換した多孔質担体２ｍＬと、フェニルヒドラジンを溶解したｐＨ８の０．１Ｍリン酸バッファー溶液２ｍＬとを接触させ、４０℃で１時間攪拌し、ＵＶ測定により反応液の上清の２７８ｎｍ付近の吸収極大の吸光度を測定する。吸光度からフェニルヒドラジンの多孔質担体への吸着量を求め、これを多孔質担体のホルミル基の含量とみなす。この時、フェニルヒドラジンの投入量は予想ホルミル基含量の２倍モルとし、フェニルヒドラジンの投入量に対して、多孔質担体への吸着量が２５％以下、または７５％以上であった場合は、フェニルヒドラジンの投入量を見直し、再度測定を行う。
また、本発明の多孔質担体の樹脂含量は３％以上５０％以下であることが好ましい。樹脂含量が３％以上であれば、大スケール、高線速で精製を行っても圧密化を生じない多孔質担体が得られる。また、樹脂含量が５０％以下であると、精製目的物を通すことができる十分な孔を確保することができる。また、樹脂含量のより好ましい範囲は５％以上４０％以下、さらに好ましくは６％以上２０％以下であり、最も好ましくは６％以上１５％以下である。樹脂含量は、以下のように求めることができる。
１）多孔質担体を体積が減少しなくなるまで沈降させながら充填し、多孔質担体の体積が１ｍＬとなるよう多孔質担体量を調整する。
２）この多孔質担体のスラリーから、加熱中に水が突沸しない程度にまで水を除去し、１０５℃で１５時間加熱して乾燥させて、多孔質担体１ｍＬの乾燥重量（ｇ）を測定する
３）多孔質担体１ｍＬあたりの乾燥重量パーセント、つまり樹脂含量を計算する。樹脂含量（％）＝多孔質担体の乾燥重量（ｇ）／乾燥前の多孔質担体の体積（ｍＬ）×１００。
本発明の多孔質担体は、５％圧縮時の圧縮応力が０．００６ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０１５ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、及び１５％圧縮時の応力が０．０３ＭＰａ以上５ＭＰａ以下であることが好ましい。
多孔質担体の５％圧縮時の圧縮応力が０．００６ＭＰａ以上、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０１５ＭＰａ以上、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０３ＭＰａ以上であれば、高線速で通液しても圧密化を生じない多孔質担体が得られる。また、多孔質担体の５％圧縮時の圧縮応力が１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が５ＭＰａ以下であれば、脆性が向上し、微粒子発生が抑制できる。また、より好ましい圧縮応力は、５％圧縮時の圧縮応力が０．００８ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０２ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、及び１５％圧縮時の応力が０．０４ＭＰａ以上５ＭＰａ以下である。
ここで、５％圧縮時の圧縮応力とは、多孔質担体が圧縮されて、初期体積より体積が５％減少した時の応力、１０％圧縮時の圧縮応力とは、多孔質担体が圧縮されて、初期体積より体積が１０％減少した時の応力、１５％圧縮時の圧縮応力とは、多孔質担体が圧縮されて、初期体積より体積が１５％減少した時の応力である。初期体積とは、多孔質担体を含むスラリーに振動を与えながら、多孔質担体の体積が減少しなくなるまで沈降させて充填した状態の体積である。圧縮時の圧縮応力は、以下の方法で測定しうるものである。
１） 内径１５ｍｍのガラス製メスシリンダーに多孔質担体の５０ｖｏｌ％のスラリーを投入する。
２） ガラス製メスシリンダーに振動を与えながら、多孔質担体体積が減少しなくなるまで沈降させて充填し、多孔質担体体積が４ｍＬとなるよう多孔質担体量を調整する。この時の体積を初期体積とする。
３） 金属製ピストン（メスシリンダーの内壁と摩擦を生じず、且つ多孔質担体が漏れないように加工したもの）を、２０Ｎ用ロードセルを装着したオートグラフ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ製ＥＺ−ＴＥＳＴ）に取り付ける。
４） 多孔質担体の１２０ｖｏｌ％に相当する位置にピストンの底面を合わせる。
５） 気泡が入らないように、試験速度５ｍｍ／ｍｉｎでピストンを下降させ、多孔質担体を圧縮して体積を減少させる。
６）任意の点の圧縮応力を測定する。
また、本発明の多孔質担体は、体積平均粒径が２０μｍ以上３００μｍ以下であることが好ましい。多孔質担体の体積平均粒径が２０μｍ以上であれば、圧密化が起こり難いため好ましく、３００μｍ以下であれば吸着体に用いた場合の目的物の吸着量が大きくなるため好ましい。多孔質担体の体積平均粒径のより好ましい範囲は、４０μｍ以上２００μｍ以下であり、さらに好ましくは６０μｍ以上１５０μｍ以下であり、特に好ましくは７５μｍ以上１００μｍ以下であり、最も好ましくは８０μｍ以上９５μｍ以下である。体積平均粒径は、ランダムに選んだ１００個の多孔質担体の粒径を測定して求めることができる。個々の多孔質担体の粒径は、個々の多孔質担体の顕微鏡写真を撮影して電子データーとして保存し、粒径測定ソフトウェア（メディアサイバーネティックス社製イメージプロプラス）を用いて、測定することができる。
また、本発明者らは以上に述べた本発明の多孔質担体を用いた吸着体をも提供する。本発明の多孔質担体は吸着体に用いることができる。本発明の多孔質担体を用いることができる吸着体としては特に限定は無く、例えば、抗体精製用吸着体、抗体医薬品精製用吸着体、治療用（医療用）吸着体、アフィニティー吸着体、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー用の吸着体を挙げることができる。本発明の多孔質担体を吸着体として利用するためには、アフィニティーリガンドを多孔質担体に固定化することが多い。固定化できるアフィニティーリガンドに特に限定は無く、所望のアフィニティーリガンドを固定化することができ、治療用（医療用）吸着体や抗体医薬品精製用吸着体等に用いることができる。
また、本発明の吸着体のアフィニティーリガンドの導入量は、多孔質担体１ｍＬ当り、１ｍｇ以上１０００ｍｇ以下であることが好ましい。アフィニティーリガンドの導入量が多孔質担体１ｍＬ当り１ｍｇ以上であれば、目的物に対する吸着量が大きくなるため好ましく、１０００ｍｇ以下であれば、製造コストを抑制できるため好ましい。より好ましいアフィニティーリガンドの導入量は、多孔質担体１ｍＬ当り２ｍｇ以上１２０ｍｇ以下であり、さらに好ましくは３ｍｇ以上６０ｍｇ以下であり、特に好ましくは４ｍｇ以上３０ｍｇ以下であり、最も好ましくは５ｍｇ以上１５ｍｇ以下である。アフィニティーリガンドの導入量は、固定化反応後の反応液上清中のアフィニティーリガンド由来の吸光度を測定することによって求めることができる。また、元素分析法を用いて、アフィニティーリガンドの導入量を求めることができる。例えば、アミノ基含有アフィニティーリガンドであれば、吸着体のＮ含量分析を行うことにより、アフィニティーリガンドの導入量を測定することができる。また、アミノ基の量を滴定で定量し、リガンドの量を求めることもできる。
また、本発明の吸着体のアフィニティーリガンドの導入量は、多孔質担体１ｍＬ当り、０．０１μｍｏｌ以上３０μｍｏｌ以下であることが好ましい。アフィニティーリガンドの導入量が多孔質担体１ｍＬ当り０．０１μｍｏｌ以上であれば、精製目的物に対する吸着量が大きくなるため好ましく、３０μｍｏｌ以下であれば、製造コストを抑制できるため好ましい。より好ましいアフィニティーリガンドの導入量は、多孔質担体１ｍＬ当り０．０３μｍｏｌ以上３．６μｍｏｌ以下であり、さらに好ましくは０．７５μｍｏｌ以上１．８μｍｏｌ以下であり、特に好ましくは０．１μｍｏｌ以上０．９μｍｏｌ以下であり、最も好ましくは０．１５μｍｏｌ以上０．４５μｍｏｌ以下である。アフィニティーリガンドの導入量は、固定化反応後の反応液上清中のアフィニティーリガンド由来の吸光度を測定することによって求めることができる。また、元素分析法を用いて、アフィニティーリガンドの導入量を求めることができる。例えば、アミノ基含有アフィニティーリガンドであれば、吸着体のＮ含量分析を行うことにより、アフィニティーリガンドの導入量を測定することができる。また、アミノ基の量を滴定で定量し、リガンドの量を求めることもできる。
治療用（医療用）吸着体や抗体医薬品精製用吸着体などに用いられる場合のアフィニティーリガンドとしては、特に限定は無いが、例えば、抗体に特異性の高い抗原やタンパク質や、プロテインＧ、Ｌやその変異体、抗体結合活性を有するペプチド等を挙げることができる。特に、免疫グロブリン（ＩｇＧ）等を特異的に吸着、溶出できる吸着体として、プロテインＡをアフィニティーリガンドとして担体に固定化した吸着体が注目されている。プロテインＡを固定化した吸着体は、リウマチ、血友病、拡張型心筋症の治療用吸着体として注目されている。また、抗体医薬精製の分野においては、ＩｇＧ等の抗体の精製を大スケール、高速、及び低コストで行える吸着体が望まれている。このような観点から、本発明の吸着体は、アフィニティーリガンドとしてプロテインＡが導入された吸着体であることが好ましい。本発明に用いることができるプロテインＡには特に限定は無く、天然物、遺伝子組み換え物等を制限なく使用することができる。また、抗体結合ドメイン及びその変異体を含むものや、融合蛋白質等であってもよい。また、菌体抽出物もしくは培養上清より、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー及び膜分離技術を用いた分子量分画、分画沈殿法等の手法から選択される精製法を組合せ、および／または繰り返すことにより製造された、プロテインＡを用いることもできる。特に、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７や米国特許公報ＵＳ５１５１３５０に記載されている方法で得られたプロテインＡであることが好ましい。
プロテインＡをアフィニティーリガンドとして多孔質担体に導入する方法としては、多孔質担体が含有するホルミル基と、プロテインＡのアミノ基との反応を利用して固定化を行う方法が挙げられ、本発明に好ましく用いる事ができる。
また、本発明の吸着体は、これを用いて治療や精製を行った場合、吸着体から目的物中にリークしたリガンドの濃度が、１００ｐｐｍ以下であることが好ましい。本発明において、吸着体から目的物中にリークしたリガンドの濃度とは、目的物に対するリガンドの比と規定している。目的物中にリークしたリガンドの濃度が１００ｐｐｍ以下であれば、治療や精製の安全性を高めることができ、さらに目的物の純度を高めることができ、精製においては後工程の煩雑さが軽減されるため好ましい。より好ましい目的物中にリークしたリガンドの濃度は、０ｐｐｍ以上８０ｐｐｍ以下、さらに好ましくは０ｐｐｍ以上６０ｐｐｍ以下、特に好ましくは０ｐｐｍ以上４０ｐｐｍ以下、最も好ましくは０ｐｐｍ以上２０ｐｐｍ以下である。目的物中にリークしたリガンドの濃度は、Steindl F. et al., Journal of Immunological Methods, 235, (2000), 61-69に記載の方法で求めることができる。
本発明の吸着体のアフィニティーリガンドのリーク量をさらに低減するために、吸着体を洗浄することが好ましい。洗浄剤や洗浄方法に特に限定は無いが、水、酢酸、アルコール、各種有機溶剤、ｐＨ２〜５の液体、ｐＨ８〜１３の液体、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸２水素ナトリウム、緩衝剤、界面活性剤、尿素、グアニジン、グアニジン塩酸塩、その他の再生剤等の、少なくとも１種を含有する溶液等を通液、または投入して攪拌することが好ましい。また、これらの洗浄液は交互に用いたり、繰り返し用いると、リガンドのリーク量がさらに減少するため好ましい。
また、本発明の吸着体の、目的物の吸着量は、吸着体１ｍＬあたり１ｍｇ以上であることが好ましい。目的物の吸着量が、吸着体１ｍＬあたり１ｍｇ以上であれば、効率よく精製が行えるため好ましい。また目的物の吸着量が、吸着体１ｍＬあたり１０００ｍｇ以下であれば、吸着した目的物を吸着体から溶出しやすいため好ましい。より好ましい吸着体の、目的物の吸着量は、吸着体１ｍＬあたり５ｍｇ以上５００ｍｇ以下であり、さらに好ましくは１０ｍｇ以上２５０ｍｇ以下であり、特に好ましくは２０ｍｇ以上１５０ｍｇ以下であり、最も好ましくは３０ｍｇ以上８０ｍｇ以下である。目的物の吸着量は、ｐＨ７．４のリン酸バッファー（シグマ社製）で置換した吸着体０．５ｍＬに対し、７０ｍｇの目的物を３５ｍＬのｐＨ７．４のリン酸バッファー（シグマ社製）に溶解させた溶液を接触させ、２５℃で２時間攪拌した後、上清中の目的物の減少量を測定することにより求めることができる。
また、本発明の吸着体は、体積平均粒径が２０μｍ以上３００μｍ以下であることが好ましい。吸着体の体積平均粒径が２０μｍ以上であれば、圧密化が起こり難いため好ましく、３００μｍ以下であれば精製用吸着体に用いた場合の精製目的物の吸着量が大きくなるため好ましい。吸着体の体積平均粒径のより好ましい範囲は、４０μｍ以上２００μｍ以下であり、さらに好ましくは６０μｍ以上１５０μｍ以下であり、最も好ましくは７５μｍ以上１００μｍ以下である。
本発明の吸着体は、５％圧縮時の圧縮応力が０．００６ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０１５ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、及び１５％圧縮時の応力が０．０３ＭＰａ以上５ＭＰａ以下であることが好ましい。
本発明の吸着体は、前述したとおり、様々なアフィニティーリガンド固定化反応の中から、適切なものを都度選択して製造することができる。アフィニティーリガンドとしてタンパク質を用いる場合は、タンパク質が失活し難いという観点から、反応温度は反応液の融点以上１００℃以下が好ましく、より好ましくは融点以上７０℃以下、さらに好ましくは融点以上５０℃以下、特に好ましくは融点以上３０℃以下、最も好ましくは融点以上１５℃以下である。
また、アフィニティーリガンドとしてタンパク質を用いる場合の反応液のｐＨは、タンパク質が失活し難いという観点から、ｐＨ２以上１３未満であることが好ましく、より好ましくは、ｐＨ３以上１２未満、さらに好ましくは、ｐＨ４以上１１以下、特に好ましくは、ｐＨ５以上１１以下、最も好ましくは、ｐＨ６以上１１以下である。一方、ｐＨが大きくなるとアフィニティーリガンドの固定化量が大きくなりやすいという観点も加味すれば、反応液のｐＨは、ｐＨ７以上１１以下が好ましく、より好ましくは、ｐＨ８以上１１以下、さらに好ましくはｐＨ９以上１１以下、特に好ましくはｐＨ１０以上１１以下である。
アフィニティーリガンドの投入方法には特に限定は無く、全使用量を反応初期から投入しても良いし、複数回に分けて反応を繰り返しても良く、また滴下ロート等を用いて、少量ずつアフィニティーリガンドを投入しても良く、またアフィニティーリガンドが投入された反応容器に多孔質担体を投入しても良い。
アフィニティーリガンド固定化反応の溶媒については特に限定は無いが、水、ヘプタン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキソラン等の汎用有機溶媒や、エタノール、メタノール、プロパノール等のアルコールや、これらの２種以上の混合溶媒を用いることができる。
また、反応効率を上げる目的や、ｐＨの変動を抑制する等の目的で、炭酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩等の少なくとも１種以上を加えることも好ましい。これら塩類の反応液における好ましい濃度は０．００１Ｍ以上１０Ｍ以下、より好ましくは０．０１Ｍ以上５Ｍ以下、さらに好ましくは０．０５Ｍ以上１Ｍ以下、特に好ましくは０．１Ｍ以上０．５Ｍ以下である。
また、タンパク質等の高分子化合物をアフィニティーリガンドとして用いる場合、多孔質担体とアフィニティーリガンド間の多点結合を抑制する目的で、食塩等の塩類を加えることも好ましい。これら食塩等の塩類の反応液における好ましい濃度は０．００１Ｍ以上１０Ｍ以下、より好ましくは０．０１Ｍ以上５Ｍ以下、さらに好ましくは０．０５Ｍ以上１Ｍ以下、特に好ましくは０．１Ｍ以上０．５Ｍ以下である。
また、ホルミル基含有多孔質担体を用いる場合は、ソディウムボロヒドリドやトリメチルアミンボラン、ジメチルアミンボラン、ピコリンボラン、ピリジンボラン、ソディウムシアノボロヒドリド、ソディウムトリアセトキシボロヒドリド等の還元剤をアフィニティーリガンド固定化反応終了後に添加、または固定化反応時に共存させて、固定化を安定させることが好ましい。
また、アフィニティーリガンドの固定化終了後に、多孔質担体上に残存した活性基を不活性化させる目的で、封止剤を作用させることも好ましい。封止剤としては特に限定は無いが、多孔質担体上の活性基と反応する官能基を含有する低分子化合物であることが好ましく、例えば、多孔質担体上の活性基がエポキシ基やホルミル基の場合は、アミノ基を含有する低分子化合物を用いることが好ましく、これの一例として、グリシンやモノエタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等を挙げることができる。
アフィニティーリガンド固定化反応およびこれに関連する反応（例えば、還元反応や封止反応）は、攪拌または振とうしながら行うことが好ましく、その１分間当りの回転数または回数は、均一攪拌が可能で、且つ多孔質担体に物理的なダメージが加わらないという理由から１回以上１０００回以下であることが好ましく、より好ましくは１０回以上５００回以下、さらに好ましくは２５回以上３００回以下、特に好ましくは５０回以上１５０回以下、最も好ましくは７５回以上１３０回以下であるが、各原料の比重の差や多孔質担体の強度に合わせて調整することが特に好ましい。
アフィニティーリガンド固定化反応時間については、特に限定は無いが、アフィニティーリガンドの失活や担体へのダメージが少ないという理由から、０．１時間以上１０００時間以下であることが好ましく、より好ましくは０．５時間以上１００時間以下、さらに好ましくは１時間以上５０時間以下、特に好ましくは１．５時間以上２４時間以下、最も好ましくは３時間以上１２時間以下であるが、反応性や、ｐＨや、反応温度に合わせて調整することがより好ましい。
本発明の吸着体は、アフィニティークロマトグラフィーを用いた各種目的物の精製や、非特許文献３に示されるような各種精製方法や、治療用（医療用）吸着体に利用することができる。精製方法や治療方法には特に限定は無く、非特許文献１、２、３や、その他公知の方法を好適に用いる事ができる。
さらに、本発明の吸着体は、目的物の精製を大スケール、高速且つ低コストで行うことを可能とする。よって、本発明の吸着体を用いた精製や治療は、直径０．５ｃｍ以上及び高さ３ｃｍ以上のカラムを用いることが好ましい。直径が０．５ｃｍ以上及び高さ３ｃｍ以上であれば、精製や治療を効率よく行うことができる。また、精製や治療の精度や効率の観点から、カラムの大きさは直径２０００ｃｍ以下及び高さ５０００ｃｍ以下であることが好ましい。より好ましいカラムの大きさは直径２ｃｍ以上２００ｃｍ以下、高さ５ｃｍ以上３００ｃｍ以下であり、さらに好ましくは直径５ｃｍ以上１００ｃｍ以下及び高さ８ｃｍ以上１５０ｃｍ以下であり、特に好ましくは直径１０ｃｍ以上８５ｃｍ以下及び高さ１２ｃｍ以上８５ｃｍ以下であり、最も好ましくは直径２０ｃｍ以上８５ｃｍ以下及び高さ１４ｃｍ以上３５ｃｍ以下である。
また、本発明の吸着体を用いた治療や精製は、線速１００ｃｍ／ｈ以上で通液する工程を有することが好ましい。線速１００ｃｍ／ｈ以上で通液する工程を有していれば、治療や精製を効率よく行うことができるため好ましい。また治療や精製の精度や装置の耐久性の観点から、本発明の吸着体を用いた治療や精製は、線速１００００ｃｍ／ｈ以下で行うことが好ましい。より好ましい精製の線速は１５０ｃｍ／ｈ以上５０００ｃｍ／ｈ以下、さらに好ましくは２５０ｃｍ／ｈ以上２５００ｃｍ／ｈ以下、特に好ましくは５００ｃｍ／ｈ以上１５００ｃｍ／ｈ以下、最も好ましくは７００ｃｍ／ｈ以上１２００ｃｍ／ｈ以下である。
本発明の多孔質担体、およびそれを用いた吸着体、およびそれらの製造方法は、およびそれらを用いた治療方法ならびに精製方法は、本発明を用いない場合に比べて、治療や精製を安全に高速で行うことができ、純度が高く、また安全性の高い精製品を提供することができる。
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、反応仕込み時の多孔質担体の体積は、特に記載が無い限り、自然沈降体積である。自然沈降体積は、多孔質担体とＲＯ水（逆浸透膜精製水）のスラリーを、計量容器に投入し、振動の無い状態で２時間静置して求めたものである。また、官能基含量、ＩｇＧ吸着量における多孔質担体の体積は、特に記載が無い限り、多孔質担体とＲＯ水のスラリーを、計量容器に投入し、振動を与えながら、それ以上体積が減少しなくなるまで沈降させた状態の体積である。
（参考例１）
体積平均粒径が９２μｍ、樹脂含量が６％、排除限界分子量が５０００万の多孔質セルロース担体（チッソ社製ＣＫ−Ａ）７５ｍＬに、ＲＯ水を加えて全量を９５ｍＬとして、ポリ容器（サンプラテック社製２５０ｍＬ）に入れ、次いで２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製水酸化ナトリウムとＲＯ水で調整）２７ｍＬを加えて、４０℃で３０分加温した。液温が４０℃に加温された後、エピクロロヒドリン（和光純薬工業社製）９ｍＬを加えて、恒温振とう機（トーマス科学社製サーモスタティックウォーターバスＴ−２５）を用いて、４０℃で２時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。反応終了後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、エポキシ化多孔質担体を得た。得られたエポキシ化多孔質担体５．４ｍＬを、グラスフィルター（ＴＯＰ社製３Ｇ−２）上で１５分間吸引ろ過（サクションドライ）し、サクションドライ後の多孔質担体１．５ｇをスクリュー菅（マルエム社製）に秤量し、１．３Ｍチオ硫酸ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製チオ硫酸ナトリウムとＲＯ水で調整）４．５ｍＬを加えた。４５℃で３０分間加温した後、４５ｍＬのＲＯ水と共に１００ｍＬのガラス製ビーカーに移し、１％フェノールフタレイン溶液（和光純薬工業社製フェノールフタレインとエタノールで調整）を数滴添加した。０．０１Ｎ塩酸（和光純薬工業社製、容量分析用）で滴定し、エポキシ基含量を求めたところ、サクションドライ多孔質担体１ｇあたり１４μｍｏｌであった。
次いで、このエポキシ化多孔質担体５４ｍＬをｐＨ１０の０．５Ｍ炭酸バッファー（和光純薬工業社製の炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムと、ＲＯ水で調整）１６５ｍＬを用いて置換した。置換後のエポキシ化多孔質担体にｐＨ１０の０．５Ｍ炭酸バッファーを加えて全量を１０８ｍＬとして、ポリ容器（サンプラテック社製２５０ｍＬ）に入れ、さらにＤ（＋）−グルコサミン塩酸塩（和光純薬工業社製）を０．５１ｇ加え、恒温振とう機（トーマス科学社製サーモスタティックウォーターバスＴ−２５）を用いて、５０℃で４時間、１００回／分で振とうし、次いで室温で１２時間静置して反応させた。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、グルコサミン化多孔質担体を得た。
得られたグルコサミン化多孔質担体２５ｍＬにＲＯ水を加えて全量を３７ｍＬとして、ポリ容器（サンプラテック社製１００ｍＬ）に入れた。次に２８２ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業社製）を２５ｍＬのＲＯ水に溶解させ、この過ヨウ素酸ナトリウム水溶液をポリ容器に加えて、インキュベーター（イワキガラス社製インキュベーターＬＯＷ−ＴＥＭＰ ＩＣＢ−１５１Ｌ）中で、ミックスローター（井内盛栄堂社製バリアブルミックスローターＶＭＲ−５）を用いて、２５℃で１時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、ホルミル基含有多孔質担体を得た。得られたホルミル基含有多孔質担体のホルミル基含量を前述の方法で測定した結果、ホルミル基含量は多孔質担体１ｍＬあたり２１μｍｏｌであった。
このホルミル基含有多孔質担体１８．５ｍＬをグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で、ｐＨ１０の０．５Ｍリン酸＋０．１５Ｍ食塩バッファー（和光純薬工業社製リン酸水素２ナトリウム、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、ＲＯ水を用いて調整）５６ｍＬで置換した。置換後のホルミル基含有多孔質担体にｐＨ１０の０．５Ｍリン酸＋０．１５Ｍ食塩バッファーを加えて全量を３０，７ｍＬとして、ポリ容器（サンプラテック社製１００ｍＬ）に入れ、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７に記載の方法で作製されたプロテインＡの濃度が、５２．６ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ含有溶液（カネカ社製ＰＮＸＬ２８）を２．８１ｍＬ加え、インキュベーター（イワキガラス社製インキュベーターＬＯＷ−ＴＥＭＰ ＩＣＢ−１５１Ｌ）中で、ミックスローター（井内盛栄堂社製バリアブルミックスローターＶＭＲ−５）を用いて、４℃で１２時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。反応後の反応液のｐＨが８になるように４Ｍ塩酸（和光純薬工業社製塩酸とＲＯ水で調整）を用いて調整した後、水素化ホウ素ナトリウムを５２ｍｇ加えて、４℃で１時間、ゆるやかに振とうしながら反応させた。反応後、反応液の２７７ｎｍ付近の吸収極大の吸光度を測定した結果、アフィニティーリガンドであるプロテインＡの導入量が、多孔質担体１ｍＬ当り、６．６ｍｇであることがわかった。
反応後の多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ―２）上で、多孔質担体の１０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、次いで、３倍体積量の０．０１Ｍ塩酸（和光純薬工業社製塩酸とＲＯ水で調整）で置換した。次に、置換した多孔質担体に０．０１Ｍ塩酸を加えて全量を３７ｍＬとし、ポリ容器（サンプラテック社製１００ｍＬ）に入れ、ミックスローター（井内盛栄堂社製バリアブルミックスローターＶＭＲ−５）を用いて、室温で３０分間、１００回／分で振とうしながら、酸洗浄を行った。酸洗浄後、多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ―２）上で、多孔質担体の１０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、次いで、３倍体積量の０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製水酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム、ＲＯ水で調整）で置換した。
次に、置換した多孔質担体に０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液を加えて全量を３７ｍＬとし、ポリ容器（サンプラテック社製１００ｍＬ）に入れ、ミックスローター（井内盛栄堂社製バリアブルミックスローターＶＭＲ−５）を用いて、室温で２０分間、１００回／分で振とうしながら、アルカリ洗浄を行った。アルカリ洗浄後、多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ―２）上で、ＲＯ水を用いて、洗浄ろ液の電導度が５μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄し、目的とするプロテインＡを固定化した吸着体を得た。洗浄ろ液の電導度は、導電率計（ＥＵＴＥＣＨ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ製 ＥＣＴｅｓｔｒ１０ ｐｕｒｅ＋）で測定した。得られた吸着体の目的物であるＩｇＧの吸着量を前述の方法で求めた結果、吸着体１ｍＬあたり、４４ｍｇであることが分かった。
（参考例２）
Ｄ（＋）−グルコサミン塩酸塩（和光純薬工業社製）の代わりに発酵グルコサミンＫ（協和ウェルネス社製）を用いる以外は、参考例１と同様の方法にて、吸着体を得ることができた。
（参考例３）
体積平均粒径が９２μｍ、樹脂含量が６％、排除限界分子量が５０００万の多孔質セルロース担体（チッソ社製ＣＫ−Ａ）とＲＯ水の１：１スラリーを、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で１５分間吸引ろ過（サクションドライ）した。得られたサクションドライ済みの多孔質セルロース担体を２７．４ｇをポリ容器（サンプラテック社製１００ｍＬ）に投入し、これに０．６Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製水酸化ナトリウムとＲＯ水で調整）２７．４ｍＬを加え、４０℃で３０分加温した。液温が４０℃に加温された後、水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業社製）を５４．８ｍｇ、架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテルを含有するデナコールＥＸ−３１４（ナガセケムテックス社製）２７．４ｍＬの順に加え、恒温振とう機（トーマス科学社製サーモスタティックウォーターバスＴ−２５）を用いて、４０℃で５時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。反応終了後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で吸引ろ過しながら、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、架橋多孔質担体を得た。この架橋多孔質担体の５％圧縮時の圧縮応力は０．０２０ＭＰａ、１０％圧縮時の圧縮応力は０．０４９ＭＰａ、１５％圧縮時の圧縮応力は０．０８０ＭＰａであった。
得られた架橋多孔質担体にＲＯ水を加えて、全量を架橋多孔質担体の２倍体積量とし、ガラス製ビーカー（３００ｍＬ）に入れ、アルミ箔２枚で封をして、オートクレーブ（サクラ社製 高圧滅菌器ネオクレーブ）を用いて１２０℃で４０分間加温した。室温まで放冷した後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で多孔質担体の５倍体積量のＲＯ水で洗浄し、エポキシ基がグリセリル基に変化した架橋多孔質担体を得た。この洗浄後の架橋多孔質担体について、再度同様の方法で更に架橋反応を行った。その結果、得られた架橋多孔質担体の５％圧縮時の圧縮応力は０．０２６ＭＰａ、１０％圧縮時の圧縮応力は０．０６３ＭＰａ、１５％圧縮時の圧縮応力は０．１０３ＭＰａであった。
この架橋多孔質担体にＲＯ水を加えて、全量を架橋多孔質担体の２倍体積量とし、ガラス製ビーカー（３００ｍＬ）に入れ、アルミ箔２枚で封をして、オートクレーブ（サクラ社製 高圧滅菌器ネオクレーブ）を用いて１２０℃で４０分間加温した。室温まで放冷した後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で多孔質担体の５倍体積量のＲＯ水で洗浄し、エポキシ基がグリセリル基に変化した、架橋多孔質担体Ａを得た。
洗浄後の架橋多孔質担体１０ｍＬにＲＯ水を加えて全量を１２．６ｍＬとして、遠沈管（岩城硝子社製５０ｍＬ）に入れ、さらに２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製水酸化ナトリウムとＲＯ水で調整）３．７ｍＬをこれに加えて、４０℃で３０分加温した。液温が４０℃に加温された後、エピクロロヒドリン（和光純薬工業社製）を１．３ｍＬ加えて、恒温振とう機（トーマス科学社製サーモスタティックウォーターバスＴ−２５）を用いて、４０℃で２時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。反応終了後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、エポキシ化多孔質担体を得た。
このエポキシ化多孔質担体１０ｍＬをグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で、ｐＨ１０の０．５Ｍ炭酸バッファー（和光純薬工業社製の炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムと、ＲＯ水で調整）３０ｍＬを用いて置換した。置換後のエポキシ化多孔質担体にｐＨ１０の０．５Ｍ炭酸バッファーを加えて全量を２０ｍＬとして、遠沈管（岩城硝子社製５０ｍＬ）に入れ、さらにＤ（＋）−グルコサミン塩酸塩（和光純薬工業社製）を９５ｍｇ加え、恒温振とう機（トーマス科学社製サーモスタティックウォーターバスＴ−２５）を用いて、５０℃で４時間、１００回／分で振とうし、次いで室温で１２時間静置して反応させた。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、グルコサミン化多孔質担体を得た。
得られたグルコサミン化多孔質担体８．５ｍＬにＲＯ水を加えて、全量を１２．８ｍＬとして、遠沈管（岩城硝子社製５０ｍＬ）に入れた。次に９８ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業社製）を８．５ｍＬのＲＯ水に溶解させ、この過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を遠沈管に加えて、インキュベーター（イワキガラス社製インキュベーターＬＯＷ−ＴＥＭＰ ＩＣＢ−１５１Ｌ）中で、ミックスローター（井内盛栄堂社製バリアブルミックスローターＶＭＲ−５）を用いて、２５℃で１時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、ホルミル基含有多孔質担体を得た。得られたホルミル基含有多孔質担体のホルミル基含量を前述の方法で測定した結果、ホルミル基含量は多孔質担体１ｍＬあたり５６μｍｏｌであった。
このホルミル基含有多孔質担体７．４ｍＬをグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で、ｐＨ１０の０．５Ｍリン酸＋０．１５Ｍ食塩バッファー（和光純薬工業社製リン酸水素２ナトリウム、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、ＲＯ水を用いて調整）３０ｍＬで置換した。置換後のホルミル基含有多孔質担体にｐＨ１０の０．５Ｍリン酸＋０．１５Ｍ食塩バッファーを加えて、全量を１２．３ｍＬとして、遠沈管（岩城硝子社製５０ｍＬ）に入れ、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７に記載の方法で作製されたプロテインＡの濃度が、５２．６ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ含有溶液（カネカ社製ＰＮＸＬ２８）を１．１３ｍＬ加え、インキュベーター（イワキガラス社製インキュベーターＬＯＷ−ＴＥＭＰ ＩＣＢ−１５１Ｌ）中で、ミックスローター（井内盛栄堂社製バリアブルミックスローターＶＭＲ−５）を用いて、４℃で１２時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。反応後の反応液のｐＨが８になるように４Ｍ塩酸（和光純薬工業社製塩酸とＲＯ水で調整）を用いて調整した後、水素化ホウ素ナトリウムを２１ｍｇ加えて、４℃で１時間、ゆるやかに振とうしながら反応させた。反応後、反応液の２７７ｎｍ付近の吸収極大の吸光度を測定した結果、アフィニティーリガンドであるプロテインＡの導入量が、多孔質担体１ｍＬ当り、８ｍｇであることがわかった。
反応後の多孔質担体を参考例１と同様の方法で酸洗浄、アルカリ洗浄、ＲＯ水洗浄を行い、目的とするプロテインＡを固定化した吸着体を得た。得られた吸着体の目的物であるＩｇＧの吸着量を前述の方法で求めた結果、吸着体１ｍＬあたり、２６ｍｇであることが分かった。また、得られた吸着体の５％圧縮時の圧縮応力は０．０５３ＭＰａ、１０％圧縮時の圧縮応力は０．１１０ＭＰａ以上、１５％圧縮時の圧縮応力は０．１１０ＭＰａ以上、であった。
（参考例４）
架橋剤にジグリセロールポリグリシジルエーテルを含有するデナコールＥＸ−４２１（ナガセケムテックス社製）を用いた他は、参考例３と同様の方法で、架橋多孔質担体を得た。１回目の架橋反応で得られた多孔質担体の架橋多孔質担体の５％圧縮時の圧縮応力は０．０１８ＭＰａ、１０％圧縮時の圧縮応力は０．０４６ＭＰａ、１５％圧縮時の圧縮応力は０．０７５ＭＰａであった。２回目の架橋反応で得られた架橋多孔質担体の５％圧縮時の圧縮応力は０．０２１ＭＰａ、１０％圧縮時の圧縮応力は０．０５５ＭＰａ、１５％圧縮時の圧縮応力は０．０９５ＭＰａであった。
さらに、参考例３と同様の方法で、グルコサミン化多孔質担体を得て、次いでホルミル基含量が多孔質担体１ｍＬあたり５８μｍｏｌのホルミル基含有多孔質担体を得た。次いで参考例３と同様の方法で、アフィニティーリガンドであるプロテインＡ導入量が多孔質担体１ｍＬ当り８ｍｇで、目的物であるＩｇＧの吸着量が、吸着体１ｍＬあたり２５ｍｇの吸着体を得た。また、得られた吸着体の５％圧縮時の圧縮応力は０．０３９ＭＰａ、１０％圧縮時の圧縮応力は０．０８５ＭＰａ、１５％圧縮時の圧縮応力は０．１１０ＭＰａ以上、であった。
（実施例１）
参考例３と同様の方法で、架橋多孔質担体Ａを得た。架橋多孔質担体Ａのグリセリル基を処理するため、架橋多孔質担体Ａ２５．５ｍＬにＲＯ水を加えて全量を３８．３ｍＬとして、ポリ容器（サンプラテック社製１００ｍＬ）に入れ、２９３ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業社製）をＲＯ水に溶解させて２５．５ｍＬとした溶液を加え、インキュベーター（イワキガラス社製インキュベーターＬＯＷ−ＴＥＭＰ ＩＣＢ−１５１Ｌ）中で、ミックスローター（井内盛栄堂社製バリアブルミックスローターＶＭＲ−５）を用いて、２５℃で１時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。
次いで、得られた多孔質担体２５ｍＬにＲＯ水を加えて全量を３７．５ｍＬとして、ポリ容器（サンプラテック社製１００ｍＬ）に入れ、７２ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業社製）をＲＯ水に溶解させて２５ｍＬとした溶液を加え、インキュベーター（イワキガラス社製インキュベーターＬＯＷ−ＴＥＭＰ ＩＣＢ−１５１Ｌ）中で、ミックスローター（井内盛栄堂社製バリアブルミックスローターＶＭＲ−５）を用いて、２５℃で１時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、グリセリル基を処理した架橋多孔質担体Ｂを得た。架橋多孔質担体Ｂのホルミル基含量は、多孔質担体１ｍＬあたり６５μｍｏｌであった。
架橋多孔質担体Ｂ１１．４ｍＬを、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で、ｐＨ１０の０．２５Ｍリン酸バッファー（和光純薬工業社製リン酸水素２ナトリウム、水酸化ナトリウム、ＲＯ水を用いて調整）３５ｍＬで置換した。置換後の架橋多孔質担体Ｂに、置換に用いたのと同じバッファーを加えて全量を２２．８ｍＬとして、遠沈管（岩城硝子社製５０ｍＬ）に投入し、多孔質担体Ｂのホルミル基含量の１０倍モルの発酵グルコサミンＫ（協和ウェルネス社製）を加え、恒温振とう機（トーマス科学社製サーモスタティックウォーターバスＴ−２５）を用いて、５０℃５時間、１００回／分で振とうした。次いで反応液を室温まで冷却し、６５ｍｇの水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業社製）を加えて、１時間ゆるやかに攪拌しながら反応させた。反応後、多孔質担体を２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、グルコサミン化多孔質担体を得た。この多孔質担体のグルコサミン導入量は、多孔質担体１ｍＬあたり３３μｍｏｌであった。
このグルコサミン化多孔質担体を参考例１と同様の方法でホルミル化を行い、ホルミル基含量が多孔質担体１ｍＬあたり２３μｍｏｌであるホルミル基含有多孔質担体を得た。次いで参考例１と同様の方法でプロテインＡを固定化し、洗浄を行い、プロテインＡが多孔質担体１ｍＬあたり６．３ｍｇ固定化された吸着体を得た。得られた吸着体の目的物であるＩｇＧの吸着量を前述の方法で求めた結果、吸着体１ｍＬあたり、４５ｍｇであることが分かった。
（参考例５）
実施例１で得た多孔質担体Ｂ１２．５ｍＬにＲＯ水を加えて全量を２５ｍＬとして、遠沈管（岩城硝子社製５０ｍＬ）に入れ、次いで７１ｍｇの水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業社製）を添加し、室温でゆるやかに攪拌しながら１時間反応させた。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、ホルミル基を水酸基に変化させた架橋多孔質担体Ｃを得た。この架橋多孔質担体Ｃを出発担体とし、参考例１と同様の方法でエポキシ基を導入し、架橋多孔質担体Ｄを得た。炭酸バッファーの代わりに０．７Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製水酸化ナトリウムとＲＯ水で調整）を用い、Ｄ（＋）−グルコサミン塩酸塩（和光純薬工業社製）の代わりに発酵グルコサミンＫ（協和ウェルネス社製）を用い、反応を５０℃で５時間、次いで室温で一晩で行った以外は、参考例１と同様の方法にて、グルコサミン化多孔質担体を得た。このグルコサミン化多孔質担体を参考例１と同様の方法でホルミル化を行い、ホルミル基含量が多孔質担体１ｍＬあたり７．６μｍｏｌであるホルミル基含有多孔質担体を得た。次いで参考例１と同様の方法でプロテインＡを固定化し、洗浄を行い、プロテインＡが多孔質担体１ｍＬあたり５．３ｍｇ固定化された吸着体を得た。得られた吸着体の目的物であるＩｇＧの吸着量を前述の方法で求めた結果、吸着体１ｍＬあたり、４８ｍｇであることが分かった。
（参考例６）
参考例１と同様の方法でエポキシ化多孔質担体を得て、次いで炭酸バッファーの代わりに、０．７Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製水酸化ナトリウムとＲＯ水で調整）を用い、Ｄ（＋）−グルコサミン塩酸塩（和光純薬工業社製）の代わりに発酵グルコサミンＫ（協和ウェルネス社製）を用いた以外は、参考例５と同様の方法でグルコサミン化多孔質担体を得た。このグルコサミン化多孔質担体を用いて、参考例１と同様の方法にて、ホルミル基含有多孔質担体、吸着体を得た。
（参考例７）
０．７Ｍ水酸化ナトリウム水溶液の代わりに０．００７Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製水酸化ナトリウムとＲＯ水で調整）を用いる以外は、参考例５と同様の方法にて、ホルミル基含有多孔質担体、吸着体を得た。
（参考例８）
０．７Ｍ水酸化ナトリウム水溶液の代わりにｐＨ１０の０．５Ｍ炭酸バッファー（和光純薬工業社製の炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムと、ＲＯ水で調整）を用いる以外は、参考例５と同様の方法にて、ホルミル基含有多孔質担体、吸着体を得た。
（実施例２）
グルコサミン導入時の溶媒を、ｐＨ１０の０．２５Ｍリン酸バッファーの代わりに０．００７Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製水酸化ナトリウムとＲＯ水で調整）を用いる以外は、実施例１と同様の方法にて、ホルミル基含有多孔質担体、吸着体を得た。
（実施例３）
プロテインＡ固定化反応のバッファーのｐＨを１０から１１に変更する以外は、実施例１と同様の方法にて、吸着体を得た。
（参考例９）
プロテインＡ固定化反応のバッファーのｐＨを１０から１１に変更する以外は、参考例５と同様の方法にて、吸着体を得た。
（実施例４）
プロテインＡ固定化反応のバッファーのｐＨを１０から１１に変更する以外は、実施例２と同様の方法にて、吸着体を得た。
（実施例５）
参考例３と同様の方法で、５００ｍＬの架橋多孔質担体Ａを得た。この多孔質担体Ａを９０μｍのメッシュ（ＮＯＮＡＫＡ ＲＩＫＡＫＩ製、ワイヤ径６３μｍ）と分級機（筒井理化学器械社製３００−ＭＭ）を用いて、２時間、湿式分級を行い、体積平均粒径８３μｍの多孔質担体Ｄを得た。この多孔質担体Ｄを用いたことと、発酵グルコサミンＫを添加直後に、４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いて、反応液のｐＨを１０に調整したことと、グルコサミン化反応を４℃で行ったこと以外は、実施例１と同様の方法にて、グルコサミン固定化量が多孔質担体１ｍＬあたり２０μｍｏｌのグルコサミン化多孔質担体を得た。次いで、このグルコサミン化多孔質担体を用い、実施例１と同様の方法でホルミル基含有多孔質担体を得た。次いで、用いるバッファーをｐＨ１１の０．５Ｍリン酸＋０．１５Ｍ食塩バッファーに変更した以外は、実施例１と同様の方法でプロテインＡ固定化吸着体を得た。この吸着体のプロテインＡ固定化量は吸着体１ｍＬあたり７．５ｍｇであった。得られた吸着体の目的物であるＩｇＧの吸着量を前述の方法で求めた結果、吸着体１ｍＬあたり、５１ｍｇであることが分かった。
（実施例６）
多孔質担体Ｄの代わりに多孔質担体Ａを用いた以外は、実施例５と同様の方法で、ホルミル基含有多孔質担体、次いでプロテインＡ固定化吸着体を得た。
（実施例７）
多孔質担体Ｄの代わりに、多孔質担体Ａと多孔質担体Ｄを体積平均粒径が８６μｍになるように混合した多孔質担体Ｅを用いた以外は、実施例５と同様の方法で、ホルミル基含有多孔質担体、次いでプロテインＡ固定化吸着体を得た。
（実施例８）
発酵グルコサミンＫを添加直後に、４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いて、反応液のｐＨを８に調整したこと以外は、実施例５と同様の方法でグルコサミン化多孔質担体を得て、ホルミル基含有多孔質担体を得て、プロテインＡ固定化吸着体を得た。得られた吸着体の目的物であるＩｇＧの吸着量を前述の方法で求めた結果、吸着体１ｍＬあたり、４９ｍｇであることが分かった。
（実施例９）
多孔質担体Ｄの代わりに多孔質担体Ａを用いた以外は、実施例８と同様の方法で、ホルミル基含有多孔質担体、次いでプロテインＡ固定化吸着体を得た。
（実施例１０）
多孔質担体Ｄの代わりに、多孔質担体Ａと多孔質担体Ｄを体積平均粒径が８６μｍになるように混合した多孔質担体Ｅを用いた以外は、実施例９と同様の方法で、ホルミル基含有多孔質担体、次いでプロテインＡ固定化吸着体を得た。
（実施例１１）
実施例８と同様の方法でグルコサミン化多孔質担体を得て、次いで、添加する過ヨウ素酸ナトリウム水溶液の過ヨウ素酸ナトリウム濃度を実施例６の半分とした以外は、実施例６と同様の方法でホルミル化担体を得て、プロテインＡ固定化吸着体を得た。得られた吸着体の目的物であるＩｇＧの吸着量を前述の方法で求めた結果、吸着体１ｍＬあたり、５１ｍｇであることが分かった。
（比較例１）
体積平均粒径が９２μｍ、樹脂含量が６％、排除限界分子量が５０００万の多孔質セルロース担体（チッソ社製ＣＫ−Ａ）１７５ｍＬに、ＲＯ水を加えて全量を２２１ｍＬとして、ポリ容器（サンプラテック社製５００ｍＬ）に入れ、次いで２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製水酸化ナトリウムとＲＯ水で調整）６４ｍＬを加えて、４０℃で３０分加温した。液温が４０℃に加温された後、エピクロロヒドリン（和光純薬工業社製）１１ｍＬを加えて、恒温振とう機（トーマス科学社製サーモスタティックウォーターバスＴ−２５）を用いて、４０℃で２時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。反応終了後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、エポキシ化多孔質担体を得た。
得られたエポキシ化多孔質担体５．４ｍＬを、グラスフィルター（ＴＯＰ社製３Ｇ−２）上で１５分間吸引ろ過（サクションドライ）し、サクションドライ後の多孔質担体１．５ｇをスクリュー菅（マルエム社製）に秤量し、１．３Ｍチオ硫酸ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製チオ硫酸ナトリウムとＲＯ水で調整）４．５ｍＬを加えた。４５℃で３０分間加温した後、４５ｍＬのＲＯ水と共に１００ｍＬのガラス製ビーカーに移し、１％フェノールフタレイン溶液（和光純薬工業社製フェノールフタレインとエタノールで調整）を数滴添加した。０．０１Ｎ塩酸（和光純薬工業社製、容量分析用）で滴定し、エポキシ基含量を求めたところ、サクションドライ多孔質担体１ｇあたり７μｍｏｌであった。
次いで、得られたエポキシ化多孔質担体にＲＯ水を加えて、全量を架橋多孔質担体の２倍体積量とし、ガラス製ビーカー（１Ｌ）に入れ、アルミ箔２枚で封をして、オートクレーブ（サクラ社製 高圧滅菌器ネオクレーブ）を用いて１２０℃で４０分間加温した。室温まで放冷した後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で多孔質担体の５倍体積量のＲＯ水で洗浄し、エポキシ基がグリセリル基に変化した多孔質担体を得た。
洗浄後の多孔質担体８３ｍＬにＲＯ水を加えて全量を１２５ｍＬとして、ポリ容器（サンプラテック社製５００ｍＬ）に入れた。次に１１９ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業社製）を８３ｍＬのＲＯ水に溶解させ、この過ヨウ素酸ナトリウム水溶液をポリ容器に加えて、インキュベーター（イワキガラス社製インキュベーターＬＯＷ−ＴＥＭＰ ＩＣＢ−１５１Ｌ）中で、ミックスローター（井内盛栄堂社製バリアブルミックスローターＶＭＲ−５）を用いて、２５℃で１時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、ホルミル基含有多孔質担体を得た。得られたホルミル基含有多孔質担体のホルミル基含量を前述の方法で測定した結果、ホルミル基含量は多孔質担体１ｍＬあたり７μｍｏｌであった。
このホルミル基含有多孔質担体２１ｍＬをグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で、ｐＨ１０の０．５Ｍリン酸＋０．１５Ｍ食塩バッファー（和光純薬工業社製リン酸水素２ナトリウム、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、ＲＯ水を用いて調整）６３ｍＬで置換した。置換後のホルミル基含有多孔質担体にｐＨ１０の０．５Ｍリン酸＋０．１５Ｍ食塩バッファーを加え、全量を３５ｍＬとし、ポリ容器（サンプラテック社製１００ｍＬ）に入れ、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７に記載の方法で作製されたプロテインＡの濃度が、５２．６ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ含有溶液（カネカ社製ＰＮＸＬ２８）を３．１６ｍＬ加え、インキュベーター（イワキガラス社製インキュベーターＬＯＷ−ＴＥＭＰ ＩＣＢ−１５１Ｌ）中で、ミックスローター（井内盛栄堂社製バリアブルミックスローターＶＭＲ−５）を用いて、４℃で１２時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。反応後の反応液のｐＨが８になるように４Ｍ塩酸（和光純薬工業社製塩酸とＲＯ水で調整）を用いて調整した後、水素化ホウ素ナトリウムを５２ｍｇ加えて、４℃で１時間、ゆるやかに振とうしながら反応させた。反応後、反応液の２７７ｎｍ付近の吸収極大の吸光度を測定した結果、アフィニティーリガンドであるプロテインＡの導入量が、多孔質担体１ｍＬ当り、５．３ｍｇであることがわかった。
反応後の多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製２５Ｇ−２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄した後、多孔質担体にＲＯ水を加えて全量が多孔質担体の２倍となるようにして、ポリ容器（サンプラテック社製１００ｍＬ）に入れた。次いで、３．２６ｇの水素化ホウ素ナトリウムをＲＯ水に溶解させて２１ｍＬとし、この溶液の全量をポリ容器に５時間かけて少量ずつ添加した。反応後の多孔質担体を参考例１と同様の方法で、酸洗浄、アルカリ洗浄、ＲＯ水洗浄を行い、目的とするプロテインＡ固定化吸着体を得た。
得られた吸着体の目的物であるＩｇＧの吸着量を前述の方法で求めた結果、吸着体１ｍＬあたり、４６ｍｇであることが分かった。
（参考例１０）
体積平均粒径が９７μｍ、樹脂含量が１０％の多孔質セルロース担体（チッソ社製ＣＫ−Ｃ）を、９０μｍのメッシュ（ＮＯＮＡＫＡ ＲＩＫＡＫＩ製）で分級し、体積平均粒径が８５μｍの多孔質セルロース担体を得た。この担体３６２ｍＬに、ＲＯ水を加えて、全量を４８９ｍＬとして、セパラブルフラスコに入れ、これを２５℃の恒温槽（トーマス科学社製サーモスタティックウォーターバスＴ−２５）中に設置した。次に、過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業製）をＲＯ水に溶解させ、１１．４５ｍｇ／ｍｌの過ヨウ素酸ナトリウム溶液を作製し、３６２ｍＬをセパラブルフラスコに加え、２５℃で１時間、回転数１５０ｒｐｍで攪拌した（攪拌機はマゼラ Ｚを使用）。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、ホルミル基含有多孔質担体を得た。
得られたホルミル基含有多孔質担体のホルミル基含量を前述の方法で測定した結果、ホルミル基含量は多孔質担体１ｍＬあたり１６μｍｏｌであった。また、この担体の５％圧縮時の圧縮応力は０．００９ＭＰａ、１０％圧縮時の圧縮応力は０．０２６ＭＰａ、１５％圧縮時の圧縮応力は０．０４９ＭＰａ、であった。また、この担体の体積平均粒径は８４μｍであった。
このホルミル基含有多孔質担体３１５ｍＬをグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、ｐＨ１１の０．５Ｍリン酸＋０．１５Ｍ食塩バッファー（和光純薬工業社製リン酸水素２ナトリウム、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、ＲＯ水を用いて調整）１５００ｍＬで置換した。置換後のホルミル基含有多孔質担体とｐＨ１０の０．５Ｍリン酸＋０．１５Ｍ食塩バッファー全量で５２２ｍＬに調整し、セパラブルフラスコに入れ、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７に記載の方法で作製されたプロテインＡの濃度が、５１．６ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ含有溶液（カネカ社製ＰＮＸＬ２９）を４８．８４ｍＬ加え、恒温槽（トーマス科学社製サーモスタティックウォーターバスＴ−２５）中で、４℃で１２時間、回転数１００ｒｐｍで攪拌しながら反応させた（攪拌機はマゼラ Ｚを使用）。反応後の反応液のｐＨが８になるように４Ｍ塩酸（和光純薬工業社製塩酸とＲＯ水で調整）を用いて調整した後、水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業製）を０．８９ｇ加えて、４℃で１時間、ゆるやかに攪拌しながら反応させた。反応後、反応液の２７６ｎｍ付近の吸収極大の吸光度を測定した結果、アフィニティーリガンドであるプロテインＡの導入量が、多孔質担体１ｍＬ当り、４．６ｍｇであることがわかった。
反応後の多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質担体の１０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、次いで、３倍体積量の０．０１Ｍ塩酸（和光純薬工業社製塩酸とＲＯ水で調整）で置換した。次に、置換した多孔質担体に０．０１Ｍ塩酸を加えて全量を６３０ｍＬとし、セパラブルフラスコに入れ、室温で３０分間、攪拌しながら、酸洗浄を行った。酸洗浄後、多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ―２）上で、多孔質担体の１０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、次いで、３倍体積量の０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製水酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム、ＲＯ水で調整）で置換した。次に、置換した多孔質担体に０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液を加えて全量を６３０ｍＬとし、セパラブルフラスコに入れ、室温で２０分間、攪拌しながら、アルカリ洗浄を行った。アルカリ洗浄後、多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ―２）上で、ＲＯ水を用いて、洗浄ろ液の電導度が５μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄し、目的とするプロテインＡを固定化した吸着体を得た。
洗浄ろ液の電導度は、導電率計（ＥＵＴＥＣＨ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ製 ＥＣＴｅｓｔｒ１０ ｐｕｒｅ＋）で測定した。得られた吸着体の精製目的物であるＩｇＧの吸着量を前述の方法で求めた結果、吸着体１ｍＬあたり、５５ｍｇであることが分かった。
得られた吸着体の５％圧縮時の圧縮応力は０．００８ＭＰａ、１０％圧縮時の圧縮応力は０．０２３ＭＰａ、１５％圧縮時の圧縮応力は０．０４２ＭＰａ以上、であった。また、この吸着体の平均体積粒径は８６μｍであった。
（参考例１１）
平均粒径が９７μｍ、樹脂含量が１０％の多孔質セルロース担体（チッソ社製ＣＫ−Ｃ）２７．５ｍＬに、ＲＯ水を加えて、全量を４１．２５ｍＬとして、全量を１００ｍＬのポリ容器にうつした。次に、過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業製）をＲＯ水に溶解させ、１１．４５ｍｇ／ｍＬの過ヨウ素酸ナトリウム溶液を作製し、２７．５ｍＬをポリ容器に加え、インキュベーター（イワキガラス社製インキュベーターＬＯＷ−ＴＥＭＰ ＩＣＢ−１５１Ｌ）中で、ミックスローター（井内盛栄堂社製バリアブルミックスローターＶＭＲ−５）を用いて、２５℃で１時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。反応後、グラスフィルター上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、ホルミル基含有多孔質担体を得た。
得られたホルミル基含有多孔質担体のホルミル基含量を前述の方法で測定した結果、ホルミル基含量は多孔質担体１ｍＬあたり１５μｍｏＬであった。また、この担体の５％圧縮時の圧縮応力は０．０１２ＭＰａ、１０％圧縮時の圧縮応力は０．０２９ＭＰａ、１５％圧縮時の圧縮応力は０．０５２ＭＰａ、であった。また、この担体の体積平均粒径は１００μｍであった。
このホルミル基含有多孔質担体２５ｍＬをグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で、ｐＨ１１の０．５Ｍリン酸＋０．１５Ｍ食塩バッファー（和光純薬工業社製リン酸水素２ナトリウム、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、ＲＯ水を用いて調整）１２５ｍＬで置換した。置換後のホルミル基含有多孔質担体とｐＨ１１の０．５Ｍリン酸＋０．１５Ｍ食塩バッファー全量を４１．５ｍＬに調整し、ポリ容器（サンプラテック社製）に入れ、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７に記載の方法で作製されたプロテインＡの濃度が、５２．６ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ含有溶液（カネカ社製ＰＮＸＬ２８）を３．８０ｍＬ加え、インキュベーター（イワキガラス社製インキュベーターＬＯＷ−ＴＥＭＰ ＩＣＢ−１５１Ｌ）中で、ミックスローター（井内盛栄堂社製バリアブルミックスローターＶＭＲ−５）を用いて、４℃で１２時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。反応後の反応液のｐＨが８になるように４Ｍ塩酸（和光純薬工業社製塩酸とＲＯ水で調整）を用いて調整した後、水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業製）を０．０７１ｇ加えて、４℃で１時間、ゆるやかに攪拌しながら反応させた。反応後、反応液の２７６ｎｍ付近の吸収極大の吸光度を測定した結果、アフィニティーリガンドであるプロテインＡの導入量が、多孔質担体１ｍＬ当り、４．０ｍｇであることがわかった。反応後の多孔質担体を参考例１と同様の方法で、酸洗浄、アルカリ洗浄、ＲＯ水洗浄を行い、目的とするプロテインＡ固定化吸着体を得た。
洗浄ろ液の電導度は、導電率計（ＥＵＴＥＣＨ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ製 ＥＣＴｅｓｔｒ１０ ｐｕｒｅ＋）で測定した。得られた吸着体の精製目的物であるＩｇＧの吸着量を前述の方法で求めた結果、吸着体１ｍＬあたり、４６ｍｇであることが分かった。得られた吸着体の５％圧縮時の圧縮応力は０．０１７ＭＰａ、１０％圧縮時の圧縮応力は０．０３４ＭＰａ、１５％圧縮時の圧縮応力は０．０５４ＭＰａ以上、であった。また、この吸着体の体積平均粒径は１０１μｍであった。
（参考例１２）
体積平均粒径が９３μｍ、樹脂含量が６％の多孔質セルロース担体（チッソ社製ＣＫ−Ａ）５７ｍＬに、ＲＯ水を加えて、全量を８５．５ｍＬとして、全量を２５０ｍＬのポリ容器にうつした。次に、過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業製）をＲＯ水に溶解させ、１１．４５ｍｇ／ｍＬの過ヨウ素酸ナトリウム溶液を作製し、５７ｍＬをポリ容器に加え、インキュベーター（イワキガラス社製インキュベーターＬＯＷ−ＴＥＭＰ ＩＣＢ−１５１Ｌ）中で、ミックスローター（井内盛栄堂社製バリアブルミックスローターＶＭＲ−５）を用いて、２５℃で１時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。反応後、グラスフィルター上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、ホルミル基含有多孔質担体を得た。得られたホルミル基含有多孔質担体のホルミル基含量を前述の方法で測定した結果、ホルミル基含量は多孔質担体１ｍＬあたり５μｍｏＬであった。
このホルミル基含有多孔質担体５１ｍＬをグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で、ｐＨ１０の０．５Ｍリン酸＋０．１５Ｍ食塩バッファー（和光純薬工業社製リン酸水素２ナトリウム、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、ＲＯ水を用いて調整）２５５ｍＬで置換した。置換後のホルミル基含有多孔質担体とｐＨ１０の０．５Ｍリン酸＋０．１５Ｍ食塩バッファーを全量で８４．７ｍＬとし、これを２５０ｍＬのポリ容器に移し、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７に記載の方法で作製されたプロテインＡの濃度が、５２．６ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ含有溶液（カネカ社製ＰＮＸＬ２８）を７．７６ｍＬ加え、インキュベーター（イワキガラス社製インキュベーターＬＯＷ−ＴＥＭＰ ＩＣＢ−１５１Ｌ）中で、ミックスローター（井内盛栄堂社製バリアブルミックスローターＶＭＲ−５）を用いて、４℃で１２時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。反応後の反応液のｐＨが８になるように４Ｍ塩酸（和光純薬工業社製塩酸とＲＯ水で調整）を用いて調整した後、水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業製）を０．１４５ｇ加えて、４℃で、ゆるやかに攪拌しながら反応させた。１時間後、水素化ホウ素ナトリウムをさらに０．１４５ｇ加え４℃でゆるやかに攪拌した。この操作を繰り返し、合計水素化ホウ素ナトリウムを５回加えた。反応後、反応液の２７６ｎｍ付近の吸収極大の吸光度を測定した結果、アフィニティーリガンドであるプロテインＡの導入量が、多孔質担体１ｍＬ当り、５．４ｍｇであることがわかった。
反応後の多孔質担体を参考例１と同様の方法で、酸洗浄、アルカリ洗浄、ＲＯ水洗浄を行い、目的とするプロテインＡ固定化吸着体を得た。
洗浄ろ液の電導度は、導電率計（ＥＵＴＥＣＨ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ製 ＥＣＴｅｓｔｒ１０ ｐｕｒｅ＋）で測定した。得られた吸着体の精製目的物であるＩｇＧの吸着量を前述の方法で求めた結果、吸着体１ｍＬあたり、３５ｍｇであることが分かった。
（比較例２）
体積平均粒径が９３μｍ、樹脂含量が６％の多孔質セルロース担体（チッソ社製ＣＫ−Ａ）１７５ｍＬに、ＲＯ水を加えて全量を２２１ｍＬとして、ポリ容器（サンプラテック社製５００ｍＬ）に入れ、次いで２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製水酸化ナトリウムとＲＯ水で調整）６４ｍＬを加えて、４０℃で３０分加温した。液温が４０℃に加温された後、エピクロロヒドリン（和光純薬工業社製）１１ｍＬを加えて、恒温振とう機（トーマス科学社製サーモスタティックウォーターバスＴ−２５）を用いて、４０℃で２時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。反応終了後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、エポキシ化多孔質担体を得た。
得られたエポキシ化多孔質担体６．６ｍＬを、グラスフィルター（ＴＯＰ社製３Ｇ−２）上で１５分間吸引ろ過（サクションドライ）し、サクションドライ後の多孔質担体１．５ｇをスクリュー菅（マルエム社製）に秤量し、１．３Ｍチオ硫酸ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製チオ硫酸ナトリウムとＲＯ水で調整）４．５ｍＬを加えた。４５℃で３０分間加温した後、４５ｍＬのＲＯ水と共に１００ｍＬのガラス製ビーカーに移し、１％フェノールフタレイン溶液（和光純薬工業社製フェノールフタレインとエタノールで調整）を数滴添加した。０．０１Ｎ塩酸（和光純薬工業社製、容量分析用）で滴定し、エポキシ基含量を求めたところ、サクションドライ多孔質担体１ｇあたり７μｍｏｌであった。また、ゲル１ｍＬあたり５．７μｍｏＬであった。
次いで、得られたエポキシ化多孔質担体にＲＯ水を加えて、全量を架橋多孔質担体の２倍体積量とし、ガラス製ビーカー（１Ｌ）に入れ、アルミ箔２枚で封をして、オートクレーブ（サクラ社製 高圧滅菌器ネオクレーブ）を用いて１２０℃で４０分間加温した。室温まで放冷した後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で多孔質担体の５倍体積量のＲＯ水で洗浄し、エポキシ基がグリセリル基に変化した多孔質担体を得た。
洗浄後の多孔質担体８３ｍＬにＲＯ水を加えて全量を１２５ｍＬとして、ポリ容器（サンプラテック社製５００ｍＬ）に入れた。次に１１９ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業社製）を８３ｍＬのＲＯ水に溶解させ、この過ヨウ素酸ナトリウム水溶液をポリ容器に加えて、インキュベーター（イワキガラス社製インキュベーターＬＯＷ−ＴＥＭＰ ＩＣＢ−１５１Ｌ）中で、ミックスローター（井内盛栄堂社製バリアブルミックスローターＶＭＲ−５）を用いて、２５℃で１時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製２６Ｇ−２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、ホルミル基含有多孔質担体を得た。得られたホルミル基含有多孔質担体のホルミル基含量を前述の方法で測定した結果、ホルミル基含量は多孔質担体１ｍＬあたり７μｍｏｌであった。
このホルミル基含有多孔質担体２１ｍＬをグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ−２）上で、ｐＨ１０の０．５Ｍリン酸＋０．１５Ｍ食塩バッファー（和光純薬工業社製リン酸水素２ナトリウム、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、ＲＯ水を用いて調整）６３ｍＬで置換した。置換後のホルミル基含有多孔質担体にｐＨ１０の０．５Ｍリン酸＋０．１５Ｍ食塩バッファーを加え、全量を３５ｍＬとし、ポリ容器（サンプラテック社製１００ｍＬ）に入れ、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７に記載の方法で作製されたプロテインＡの濃度が、５２．６ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ含有溶液（カネカ社製ＰＮＸＬ２８）を３．１６ｍＬ加え、インキュベーター（イワキガラス社製インキュベーターＬＯＷ−ＴＥＭＰ ＩＣＢ−１５１Ｌ）中で、ミックスローター（井内盛栄堂社製バリアブルミックスローターＶＭＲ−５）を用いて、４℃で１２時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。反応後の反応液のｐＨが８になるように４Ｍ塩酸（和光純薬工業社製塩酸とＲＯ水で調整）を用いて調整した後、水素化ホウ素ナトリウムを５９ｍｇ加えて、４℃で１時間、ゆるやかに振とうしながら反応させた。反応後、反応液の２７７ｎｍ付近の吸収極大の吸光度を測定した結果、アフィニティーリガンドであるプロテインＡの導入量が、多孔質担体１ｍＬ当り、５．３ｍｇであることがわかった。
反応後の多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製２５Ｇ−２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄した後、多孔質担体にＲＯ水を加えて全量が多孔質担体の２倍となるようにして、ポリ容器（サンプラテック社製１００ｍＬ）に入れた。次いで、３．２６ｇの水素化ホウ素ナトリウムをＲＯ水に溶解させて２１ｍＬとし、この溶液の全量をポリ容器に５時間かけて少量ずつ添加した。反応後の多孔質担体を参考例１と同様の方法で、酸洗浄、アルカリ洗浄、ＲＯ水洗浄を行い、目的とするプロテインＡ固定化吸着体を得た。
得られた精製用吸着体の精製目的物であるＩｇＧの吸着量を前述の方法で求めた結果、吸着体１ｍＬあたり、４６ｍｇであることが分かった。
（リガンドのリーク量測定）
（溶液作製）
Ａ液としてｐＨ７．４リン酸バッファー（シグマ社製）、Ｂ液としてｐＨ３．５の３５ｍＭ酢酸ナトリウム（和光純薬工業社製の酢酸、酢酸ナトリウム、ＲＯ水で調整）、Ｃ液として１Ｍ酢酸（和光純薬工業社製酢酸とＲＯ水で調整）、Ｄ液として１ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ溶液（バクスター社製ガンマガードとＡ液で調整）、Ｅ液として６Ｍ尿素、Ｆ液としてＡ液に対して０．２ｖｏｌ％の界面活性剤（和光純薬工業社製ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）を添加した液、中和液として２Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（シグマ社製トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとＲＯ水で調整）を作製し、各溶液を使用前に脱泡した。
（充填、準備）
カラムクロマトグラフィー用装置として、Ｂｉｏｌｏｇｉｃ ＬＰシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用い、直径０．５ｃｍ、高さ１５ｃｍのカラムに２２μｍのメッシュを取り付け、参考例、実施例および比較例で得たプロテインＡ固定化吸着体をそれぞれ３ｍＬ入れ、線速４００ｃｍ／ｈで２０％エタノール水溶液（和光純薬工業社製エタノールとＲＯ水で調整）を１時間通液して充填した。フラクションコレクターに５ｍｌの採取用チューブをセットし、溶出液の採取用チューブについては、あらかじめ中和液を入れた。
参考例２〜９と実施例１〜１１の吸着体については、Ｆ液、Ｂ液、Ａ液、Ｃ液、Ｅ液の順に、各液を線速３００ｃｍ／ｈで吸着体の３倍量を通液した。この通液サイクルを６回繰り返した。
（ＩｇＧ精製）
Ａ液を９ｍＬ通液し、次いでＤ液をＵＶをモニターしながら、ＩｇＧが１０％破過するまで通液した。次いで、Ａ液を３０ｍＬ通液し、Ｂ液を３０ｍＬ通液してＩｇＧを溶出させた。次にＣ液を９ｍＬ，Ｅ液を９ｍＬ通液した。吸着体の充填終了後からの操作をさらに２回繰り返し、溶出液中のＩｇＧ量とリガンド量を測定した。
その結果、参考例１の吸着体を用いた場合は、精製ＩｇＧ中のＩｇＧに対するリガンド量は、１回目５１ｐｐｍ、２回目２４ｐｐｍ、３回目２０ｐｐｍ、平均値３２ｐｐｍであり、参考例２〜９と実施例１〜１１で作製した吸着体においては、いずれも１回目〜３回目の平均値が１００ｐｐｍ以下であった。比較例１の吸着体を用いた場合は、精製ＩｇＧ中のＩｇＧに対するリガンド量は、１回目１２２ｐｐｍ、２回目８７ｐｐｍ、３回目１１９ｐｐｍ、平均値１０９ｐｐｍであった。
また、参考例１０の吸着体を用いた場合は、精製ＩｇＧ中のＩｇＧに対するリガンド量は１回目７６ｐｐｍ、２回目５７ｐｐｍ、３回目５６ｐｐｍ、平均値６３ｐｐｍであり、参考例１１の吸着体を用いた場合は、精製ＩｇＧ中のＩｇＧに対するリガンド量は１回目５６ｐｐｍであり、参考例１２の吸着体を用いた場合は、精製ＩｇＧ中のＩｇＧに対するリガンド量は１回目４９ｐｐｍであった。一方、比較例２の吸着体を用いた場合は、１回目１２２ｐｐｍ、２回目８７ｐｐｍ、３回目１１９ｐｐｍ、平均値１０９ｐｐｍであった。
また、本測定に伴って得られた、吸着体１ｍＬあたりのＩｇＧ動的吸着量（５％ダイナミックバインディングキャパシティー）は、参考例１が１回目３６ｍｇ、２回目３５ｍｇ、３回目３５ｍｇ、比較例１は１回目３６ｍｇ、２回目３６ｍｇ、３回目３６ｍｇであり、また参考例１０＞参考例１１≒比較例２≧参考例１２であった。

Claims (18)

  1. ホルミル基含有多孔質担体の製造方法であって、
    原料多孔質担体にエピハロヒドリンまたは２官能以上のエポキシ化合物を作用させてエポキシ基を導入する工程；
    上記エポキシ基をビシナル水酸基に変化させる工程；
    上記工程により生じたビシナル水酸基に過ヨウ素酸塩を作用させてホルミル基にする工程；
    下記一般式（１）で表される基中の５員環または６員環構造を有する化合物を上記ホルミル基と反応させ、下記一般式（１）で表される基を導入する工程：
    （式中、Ｒ1は−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−と一緒になって５員環または６員環構造をなす原子団を表す）；
    上記基（１）に過ヨウ素酸塩を作用させ、下記一般式（２）：
    （式中、Ｒ1は前記と同じ）で表される部位に変換する工程を含むことを特徴とする製造方法。
  2. 前記式（１）で表される基が、担体１ｍＬ当り５μｍｏｌ以上である多孔質担体を前駆体とする請求項１に記載の製造方法。
  3. 過ヨウ素酸塩として過ヨウ素酸ナトリウムまたは過ヨウ素酸カリウムを作用させることにより、前記式（１）で表される基を前記式（２）で表される基に変換する請求項１または２に記載の製造方法。
  4. 前記式（１）において、Ｒ 1 と−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−とで形成される５員環構造または６員環構造が、糖または糖類似物である請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
  5. 前記式（１）のＲ 1 と−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−とで形成される５員環または６員環において、水酸基と結合している炭素原子が連続して存在している部分を有し、該連続する炭素原子数が最大２である請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
  6. 前記Ｒ 1 が少なくとも１つのチオール基またはアミノ基を含有する原子団である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 糖または糖類似物がグルコサミンである請求項４に記載の製造方法。
  8. ホルミル基の導入量が担体１ｍＬ当り、１μｍｏｌ以上２００μｍｏｌ以下である請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
  9. 多孔質担体が架橋されたものである請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
  10. 多孔質担体が多糖を含有するものである請求項１〜９のいずれか一項に記載の製造方法。
  11. 多糖がセルロースおよび／またはセルロース誘導体である請求項１０に記載の製造方法。
  12. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載の製造方法により製造されたホルミル基含有多孔質担体にアフィニティーリガンドを結合させた吸着体。
  13. アフィニティーリガンドの導入量が担体１ｍＬ当り、１ｍｇ以上１０００ｍｇ以下であることを特徴とする、請求項１２に記載の吸着体。
  14. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載の製造方法により製造されたホルミル基含有多孔質担体とアミノ基を有するアフィニティーリガンドを結合させて得られ、結合部位に下記一般式（３）または（４）：
    （式中、Ｒ1はＮ原子ともに６員環または７員環構造をなす原子団であって、前記式（１）におけるＲ1に対応する）で表される構造を有する、請求項１２または１３に記載の吸着体。
  15. アフィニティーリガンドとしてプロテインＡが導入されたことを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の吸着体。
  16. 吸着体から目的物中にリークしたリガンドの濃度が、１００ｐｐｍ以下であることを特徴とする、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の吸着体。
  17. 精製目的物の吸着量が吸着体１ｍＬあたり１ｍｇ以上であることを特徴とする、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の吸着体。
  18. 請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の吸着体を使用することを特徴とする、免疫グロブリンの精製方法。
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