JP5430188B2 - 細胞画像解析装置及び細胞の画像を撮像する方法 - Google Patents
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Description
しかし、一方で、蛍光物質、発光物質等は、細胞、特に、生細胞に対して、有毒物質や刺激物として機能し、正確な解析結果を阻害する原因となる場合がある。
そこで、近年、蛍光物質や発光物質等を介して細胞に刺激を与えることなく、極力自然な状態で、細胞の様子や増殖、形態などを観察、解析することが非常に重要であると考えられている。
特許文献1に記載の顕微鏡は、光源と、光源からの光を観察物体に導く照明光学系と、照明光学系の瞳位置に配置される開口と、開口を通過した光により照明された観察物体の像を合焦位置からずれた位置で観察するための観察光学系を備えている。
また、本発明による細胞の画像を撮像する方法は、撮像光学系と撮像素子を有し、容器内に存在する無染色の透明な細胞を撮像する細胞撮像手段と、前記細胞撮像手段を介して撮像した細胞の画像を用いて、個々の細胞の領域を特定しながら、該細胞に関する所定の特徴量を自動解析する細胞画像解析手段を有する細胞画像解析装置における前記細胞撮像手段を用いて行う、細胞の画像を撮像する方法であって、前記細胞画像解析手段が個々の細胞の領域を特定しながら、該細胞に関する所定の特徴量を自動解析するために用いる画像として、無染色の透明な個々の細胞の内側領域がぼやけ、且つ、前記個々の細胞の輪郭部分が明瞭になる焦点位置でのみ前記細胞を撮像し且つ所定の記憶領域に記憶することにより、前記個々の細胞の像の輪郭部分を強調した画像のみを得ることを特徴としている。
また、本発明の細胞の画像を撮像する方法においては、前記個々の細胞の内側領域に存在する細胞小器官の位置とは別の位置に焦点をあわせることで前記個々の細胞の内側領域をぼやかすのが好ましい。
また、本発明の細胞の画像を撮像する方法においては、前記細胞が存在する容器の底面から前記個々の細胞の厚みに応じて設定した所定量移動させた位置に焦点をあわせることで前記個々の細胞の内側領域をぼやかすのが好ましい。
図1は本発明の細胞画像解析装置の概略構成を示すブロック図である。
本発明の細胞画像解析装置は、図1に示すように、細胞撮像手段1と、細胞画像解析手段2と、細胞輪郭強調手段3を有する。
細胞撮像手段1は、撮像光学系1aと撮像素子1bを有し、撮像位置に配置された図1において不図示の容器内に存在する細胞を撮像する。
細胞画像解析手段2は、細胞撮像手段1を介して撮像した細胞の画像を用いて、個々の細胞の領域を特定しながら、細胞に関する所定の特徴量を自動解析する。
細胞輪郭強調手段3は、細胞撮像手段1の撮像位置に配置された容器内に存在する個々の細胞の像の輪郭部分を自動的に強調する。
または、細胞輪郭強調手段3は、細胞撮像手段1の撮像位置に配置された容器内に存在する個々の細胞の輪郭部分が強調されるように、細胞を照明する細胞輪郭強調照明手段3bをさらに含んで構成するとより好ましい。
具体的には、細胞輪郭強調位置合焦手段3aは、例えば、撮像光学系1aの焦点を、先ず、細胞撮像手段1の撮像位置に配置された容器内に存在する個々の細胞の内側領域に位置合わせし、次いで、個々の細胞の内側領域の像がぼやけ、且つ、個々の細胞の輪郭部分の像が明瞭になる位置まで、撮像光学系1aの光軸方向に沿って所定量移動させるように構成する。
または、細胞輪郭強調位置合焦手段3aは、例えば、撮像光学系1aの焦点を、先ず、細胞撮像手段1の撮像位置に配置された容器の底面に位置合わせし、次いで、容器内に存在する個々の細胞の厚みに応じて、撮像光学系1aの光軸方向に沿って所定量移動させるように構成する。
このため、従来、このような無染色状態の細胞の解析を正確に行う場合には、画像解析装置を介して細胞の画像を自動的に解析するのではなくて、顕微鏡観察において目視で個々の細胞を認識して解析する方法を採らざるを得なかった。これらの解析は、通常、解析者が、肉眼で、個々の細胞をカウントしたり、細胞グロース、形態を測る等して行われる。しかし、このような目視による手法を用いたのでは、細胞の解析に多大な労力・時間がかかるため、細胞解析を行うことが可能な細胞数が少数に限られたものとなってしまう上、解析者にかかる肉体的負担が非常に大きなものとなる。
このため、本発明の細胞画像解析装置によれば、蛍光物質などの染色手段を用いることなく明視野で、また、細胞を生きたままで解析する場合、人間の肉眼による観察を行わずに装置を介して細胞の撮像から個々の細胞認識まで自動的に行うことが可能となり、解析者にかかる肉体的負担や、処理時間を格段に削減することができ、一定の時間当たりに解析できる細胞数が増加し、しかも、細胞の解析を正確に行うことができるようになる。
図2は本発明の一実施形態にかかる細胞画像解析装置全体の概略構成を示す説明図である。
本実施形態の細胞画像解析装置は、図1における細胞撮像手段1が、対物レンズ1a1と結像レンズ1a2を備えた顕微鏡撮像光学系1aと、CCDやCMOS等の固体撮像素子1bを有して構成されている。対物レンズ1a1は、不図示の電動制御機構により、焦点合わせのために光軸方向に移動可能になっている。結像レンズ1a2は、容器4内に存在する無染色の透明な細胞5の像を固体撮像素子1bの撮像面に結像させる。そして、細胞撮像手段1は、撮像位置に配置された、容器4内に存在する細胞5を撮像する。
より詳しくは、細胞輪郭強調位置合焦手段3aは、まず、自動合焦機構を介して撮像光学系1aの焦点を個々の細胞5の内側の小器官へ合わせる自動合焦処理を行い、次いで、個々の細胞5の輪郭部分の像が強調されるように、撮像光学系1aの焦点を、所定のオフセット量だけ光軸方向にシフトする処理を行う。
細胞解析においては、先ず解析対象となる細胞サンプルを用意する。次いで、細胞サンプルを複数の視野に区分けして撮像する。次いで、それぞれの撮像画像を解析し、各画像に映っている複数の細胞を個々の細胞領域に切り分けて認識する。次いで、領域が認識された各細胞に対して、例えば、細胞の大きさ(面積)の平均などの所定の統計的な処理を行う。
細胞に対する全ての視野の撮像処理を終了後、細胞画像解析手段2が、細胞5の画像より画像中の各細胞の領域を認識し、次いで、領域が認識された各細胞に対し、解析者を介して予め設定された、例えば、細胞の総数、細胞の大きさ(面積)の平均、各細胞の自家蛍光量の総量などのパラメタに基づいて、統計的な処理を行う。
画像解析装置を用いて、細胞を正確に自動解析するには、細胞の画像を画像解析したときに各細胞の領域を特定して個々の細胞を正確に認識できる必要がある。
しかし、従来、画像解析装置を用いて細胞の画像から細胞解析を自動的に行った場合、例えば、図13(a)に示すように、1つの細胞を複数の細胞と誤認識してしまう、或いは、図13(b)に示すように、複数の細胞を1つの細胞として誤認識してしまう等、個々の細胞の領域を誤認識し易いという問題があった。
例えば、細胞核のように、円形あるいは楕円形のような比較的に規則的な形態をとる細胞に対しては、比較的容易に個々の細胞を認識することができる。
一方、細胞質や細胞膜のような不定形の形態をとる細胞に対しては、個々の細胞の認識が困難な場合が多い。このような不定形の形態をとる細胞は、接着細胞(通常の細胞)や、浮遊細胞(血球細胞など)等に分類することができる、このうち、接着細胞は、容器の底面等に接着して、特に複雑な形態をとる。
しかし、核染色に用いる蛍光物質等の染色物質は、毒性のあるものが多く、細胞を生きたままの状態で観察するような場合には使用することができない。
このため、生細胞の解析を行う場合には、無染色での細胞の画像を用いて個々の細胞を認識することが必要となる。
ここで、個々の細胞における境界候補は、画像内において輝度差の大きい箇所を選ぶことによって抽出する。例えば、白黒の画像において白と黒のコントラストがある部分は“線”として現れる。そのような箇所を個々の細胞における境界候補として抽出する。
本実施形態の細胞画像撮像装置における細胞輪郭強調手段3の細胞輪郭強調位置合焦手段3aでは、図5(b)に示す個々の細胞の底や個々の細胞の上部に撮像光学系1aの焦点が合うように、容器の底面から光軸方向に撮像光学系1aの焦点を移動させたときのシフト量Z2,Z3をオフセット量としている。
まず、解析者が、細胞を入れた容器4を電動XYステージ6に載置し、細胞画像解析装置を駆動する。すると、コントローラ10を介して、電動XYステージ6が容器4を細胞撮像手段1の撮像位置に搬送する(ステップS1)。
次いで、自動合焦機構が、撮像光学系1aの焦点を容器4の底面に合うように、撮像光学系1aの対物レンズ1a1を光軸方向に移動させるハードウェアAF(オートフォーカス)動作を、撮像光学系1aの焦点を容器4の底面に合うまで繰り返し行なう(ステップS2〜ステップS4)。なお、規定回数内のハードウェアAF動作において、容器4の底面に焦点が合わない場合は警告を出力して処理を終了する(ステップS5)。
次いで、例えば、図7を用いて後述するオフセット設定処理によってパーソナルコンピュータ12の記憶領域に記憶されている所定のオフセット設定値に基づき、撮像光学系1aの対物レンズ1a1を、自動合焦機構によるオートフォーカスAF動作を介して得られた撮像光学系1aの容器4底面への合焦位置から光軸方向へ、そのオフセット量だけ移動させる(ステップS6)。
次いで、細胞撮像手段1が、撮像位置に位置する容器4に入れられた細胞5の透過照明画像を撮像する(ステップS7)。
次いで、撮像した画像をパーソナルコンピュータ12の記憶領域に保存する(ステップS8)。
これらの容器4の細胞撮像手段1の撮像位置への搬送(ステップS1)〜撮像した画像の所定の記憶領域への保存(ステップS8)を、全ての細胞の撮像領域に対して行なう(ステップS9)。
図7に本実施形態の細胞画像撮像装置におけるオフセット量を撮像した細胞画像から自動的に設定する処理手順の一例を示す。
まず、解析者が、細胞を入れた容器4を電動XYステージ6に載置し、細胞画像解析装置を駆動する。すると、コントローラ10を介して、電動XYステージ6が容器4を細胞撮像手段1の撮像位置に搬送する(ステップS11)。
次いで、自動合焦機構が、撮像光学系1aの焦点を容器4の底面に合うように、撮像光学系1aの対物レンズ1a1を光軸方向に移動させる、ハードウェアAF(オートフォーカス)動作を、撮像光学系1aの焦点を容器4の底面に合うまで繰り返し行なう(ステップS12〜ステップS14)。なお、規定回数内のハードウェアAF動作において、容器4の底面に焦点が合わない場合は警告を出力して処理を終了する(ステップS15)。
次いで、細胞撮像手段1が、撮像位置に位置する容器4に入れられた細胞5の透過照明画像を撮像する(ステップS16)。
次いで、細胞画像解析装置は撮像された画像から細胞における境界の候補領域となる輪郭を抽出し、その輪郭の個数に応じて、所定のスコア判定を行う。スコア判定は、例えば、所定のコントラストを有する輪郭の個数が減ってきた場合に、高スコアとする(ステップS17)。そして、細胞画像解析装置は、抽出された輪郭のスコアが最大値となる(ステップS18)まで、撮像光学系1aの対物レンズ1a1を光軸方向に所定量移動し(ステップS19)、細胞撮像手段1による細胞5の撮像(ステップS16)〜細胞輪郭の抽出、所定のスコア判定(ステップS17)を繰り返す。
そして、細胞画像解析装置は、抽出された輪郭のスコアが最大値となった(ステップS18)とき、自動合焦機構によるオートフォーカスAF動作を介して得られた撮像光学系1aの容器4底面の合焦位置からの光軸方向の移動量(オフセット量)をパーソナルコンピュータ12の記憶領域に記憶する(ステップS20)。
これにより、本実施形態の細胞画像撮像装置におけるオフセット量の自動設定処理が終了する。
図8は個々の細胞5に対する撮像光学系1aの合焦位置と、細胞画像解析手段2による個々の細胞輪郭の認識状態及び認識結果との関係を示す写真で、(a)は撮像光学系1aの焦点が個々の細胞5の輪郭に位置するときの認識状態(左側の図)及び認識結果(右側の図)を示す図、(b)は撮像光学系1aの焦点が個々の細胞5内の小器官に位置するときの認識状態(左側の図)及び認識結果(右側の図)を示す図、(c)は撮像光学系1aの焦点が個々の細胞5内の小器官に位置するときの認識状態(左側の図)及び認識結果(右側の図)を示す図である。図9は個々の細胞5に対する撮像光学系1aの合焦位置と、細胞画像解析手段2による個々の細胞輪郭の認識との関係を模式的に示す図で、(a)は撮像光学系1aの焦点が個々の細胞5内の小器官に位置するとき(左側の図)、及びそのときの細胞画像解析手段2による個々の細胞輪郭の認識状態(右側の図)を示す図、(b)は撮像光学系1aの焦点が個々の細胞5の輪郭強調点に位置するとき(左側の図)、及びそのときの細胞画像解析手段2による個々の細胞輪郭の認識状態(右側の図)を示す図である。
一方、撮像光学系1aの焦点が個々の細胞5の輪郭(又は輪郭強調点)に位置するときは、図8(a)、図9(b)に示すように、個々の細胞の境界領域を正確に認識することができる。
例えば、図10に示すように、個々の細胞内の小器官の位置とは別な位置に、撮像光学系1aの焦点を合わせることで個々の細胞内の小器官を見づらくする方法がある。撮像光学系1aの焦点が個々の細胞内の小器官とは別の位置に合うように、対物レンズ1a1を光軸方向に所定量移動すると、図10(a)に示すように個々の細胞内の小器官がぼやけて見づらくなり、相対的に個々の細胞の輪郭領域が見やすくなる。また、対物レンズ1a1の移動量を大きくすると、図10(b)に示すように個々の細胞全体の像がぼやけてくるが、個々の細胞には所定の厚みがあるので、個々の細胞の輪郭を認識することは可能である。
偏射照明を用いると、入射角度の調節それ自体、あるいは撮像光学系1aの焦点位置を変えることとの組み合わせにより、個々の細胞5の輪郭が強調されるようになる。
即ち、偏射照明は“影”をつけて対象を見えやすくするための照明方法である。影は照明対象物の“高さ”に比例する。
そこで、本実施形態の細胞画像解析装置では、細胞輪郭強調照明手段3bを介して偏斜照明を行い、光の角度を大きくすると影が伸びる原理を用いて、個々の細胞5の輪郭部分を強調している。特に、個々の細胞の輪郭領域は、個々の細胞内の小器官より高いので、偏斜照明で細胞を照明すると、個々の細胞の輪郭部分が、黒い輪のように影を作って強調される。図11は個々の細胞に対する通常の照明と偏斜照明を模式的に示す説明図、図12は本実施形態の細胞画像解析装置における細胞輪郭強調照明手段3bを介して偏斜照明の照明角度を変えて照明したときの個々の細胞の輪郭部分の影のでき方を模式的に示す説明図で、(a)は傾斜角度を小さくして照明した状態及びそのときにできる個々の細胞輪郭の影を示す図、(b)は傾斜角度を大きくして照明した状態及びそのときにできる個々の細胞輪郭の影を示す図である。
1a 撮像光学系
1a1 対物レンズ
1a2 結像レンズ
1b 固体撮像素子
2 細胞画像解析手段
3 細胞輪郭強調手段
3a 細胞輪郭強調位置合焦手段
3b 細胞輪郭強調照明手段
4 容器
5 細胞
6 電動XYステージ
8 照明光源(偏斜照明装置)
10 コントローラ
11 カメラコントローラ
12 パーソナルコンピュータ
13 モニター
Claims (8)
- 撮像光学系と撮像素子を有し、容器内に存在する無染色の透明な細胞を撮像する細胞撮像手段と、前記細胞撮像手段を介して撮像した細胞の画像を用いて、個々の細胞の領域を特定しながら、該細胞に関する所定の特徴量を自動解析する細胞画像解析手段を有する細胞画像解析装置であって、
前記細胞撮像手段の撮像位置に配置された前記容器内に存在する個々の細胞の像の輪郭部分を自動的に強調する細胞輪郭強調手段を有し、
前記細胞輪郭強調手段が、前記撮像光学系の焦点を、前記細胞撮像手段の撮像位置に配置された前記容器内に存在する個々の細胞の輪郭部分が強調される位置に自動的に位置合わせする細胞輪郭強調位置合焦手段であり、
前記細胞撮像手段は、前記細胞輪郭強調手段により個々の細胞の像の輪郭部分が強調された、前記容器内に存在する無染色の透明な細胞のみを撮像し且つ所定の記憶領域に記憶し、
前記細胞画像解析手段は、前記細胞撮像手段を介して撮像され且つ前記所定の記憶領域に記憶された、個々の細胞の像の輪郭部分が強調された、前記容器内に存在する無染色の透明な細胞の画像を用いて、個々の細胞の領域を特定しながら、該細胞に関する所定の特徴量を自動解析することを特徴とする細胞画像解析装置。 - 前記細胞輪郭強調手段が、前記細胞撮像手段の撮像位置に配置された前記容器内に存在する個々の細胞の像の輪郭部分が強調されるように、該細胞を照明する細胞輪郭強調照明手段をさらに含んでいることを特徴とする請求項1に記載の細胞画像解析装置。
- 前記細胞輪郭強調位置合焦手段は、前記撮像光学系の焦点を、前記細胞撮像手段の撮像位置に配置された前記容器内に存在する個々の細胞の内側領域に位置合わせし、次いで、該個々の細胞の内側領域がぼやけ、且つ、該個々の細胞の輪郭部分が明瞭になる位置まで、該撮像光学系の光軸方向に沿って所定量移動させることを特徴とする請求項1又は2に記載の細胞画像解析装置。
- 前記細胞輪郭強調位置合焦手段は、前記撮像光学系の焦点を、前記細胞撮像手段の撮像位置に配置された前記容器の底面に位置合わせし、次いで、該容器内に存在する個々の細胞の厚みに応じて、該撮像光学系の光軸方向に沿って所定量移動させることを特徴とする請求項1又は2に記載の細胞画像解析装置。
- 前記細胞輪郭強調照明手段が、偏斜照明装置であることを特徴とする請求項2、請求項2に従属する請求項3又は4に記載の細胞画像解析装置。
- 撮像光学系と撮像素子を有し、容器内に存在する無染色の透明な細胞を撮像する細胞撮像手段と、前記細胞撮像手段を介して撮像した細胞の画像を用いて、個々の細胞の領域を特定しながら、該細胞に関する所定の特徴量を自動解析する細胞画像解析手段を有する細胞画像解析装置における前記細胞撮像手段を用いて行う、細胞の画像を撮像する方法であって、
前記細胞画像解析手段が個々の細胞の領域を特定しながら、該細胞に関する所定の特徴量を自動解析するために用いる画像として、無染色の透明な個々の細胞の内側領域がぼやけ、且つ、前記個々の細胞の輪郭部分が明瞭になる焦点位置でのみ前記細胞を撮像し且つ所定の記憶領域に記憶することにより、前記個々の細胞の像の輪郭部分を強調した画像のみを得ることを特徴とする、細胞の画像を撮像する方法。 - 前記個々の細胞の内側領域に存在する細胞小器官の位置とは別の位置に焦点をあわせることで前記個々の細胞の内側領域をぼやかす請求項6に記載の方法。
- 前記細胞が存在する容器の底面から前記個々の細胞の厚みに応じて設定した所定量移動させた位置に焦点をあわせることで前記個々の細胞の内側領域をぼやかす請求項6に記載の方法。
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