JP2005003909A - 光学系の薄層斜光照明法 - Google Patents
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Abstract
【課題】顕微鏡と同等の光学系を用いて光を使って物質や分子の高感度検出と光学顕微鏡における低背景・高感度観察が可能な薄層斜光照明法を提供する。
【解決手段】試料における照明光の厚さをｄ、試料における照明光の入射角をθ、レンズ後焦点面における照明光の中心軸からの距離をＸ、照明光のレンズへの入射角をφ、照明光の対物レンズ入射の開き角の半分をδφとすると、試料における照明光の厚さをｄを与える式 ｄ＝２ｒ・ｃｏｓθにおいて、試料への照明光の入射角θはＸとφによって決まり、試料観察面での照射半径ｒはδφによって決まる値であることがわかる。従って、照明光の厚さｄを薄くすることは、ｃｏｓθおよびｒを小さくすること、また、レンズへの照明光入射位置を、試料への照明光入射角度に応じて変えることにより実現できる。
【選択図】 図２
【解決手段】試料における照明光の厚さをｄ、試料における照明光の入射角をθ、レンズ後焦点面における照明光の中心軸からの距離をＸ、照明光のレンズへの入射角をφ、照明光の対物レンズ入射の開き角の半分をδφとすると、試料における照明光の厚さをｄを与える式 ｄ＝２ｒ・ｃｏｓθにおいて、試料への照明光の入射角θはＸとφによって決まり、試料観察面での照射半径ｒはδφによって決まる値であることがわかる。従って、照明光の厚さｄを薄くすることは、ｃｏｓθおよびｒを小さくすること、また、レンズへの照明光入射位置を、試料への照明光入射角度に応じて変えることにより実現できる。
【選択図】 図２
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、物質や分子を光を使って高感度検出する顕微鏡と同等の光学系の薄層斜光照明法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、物質や分子を光を使って高感度検出する光学顕微鏡の照明技術は種々のものが提案されており、その内の幾つかを以下に説明する。図１０は、蛍光顕微鏡の照明として、現在一般的に使われている落射照明方法の概略図である。図に示すように、光源からの照射光６を、照射光５は反射し、蛍光は透過させるダイクロイックミラー７で反射させて、対物レンズ４の中央に入射し、オイル３、カバーガラス２を介して試料溶液１でなる試料観察面を照射するものである。
【０００３】
また、ガラス表面近傍のみを局所的に照明する方法として、全反射照明法がある。全反射した際に生じるエバネッセント光（深さ１００２００ｎｍ程度）を使って照明するものである。プリズムを使う方法と対物レンズを使う方法があるが、図１１に対物レンズ型全反射照明法の概略図を示す。対物レンズ４の開口数をＮＡ、試料溶液１の屈折率をｎとしたとき、開口数（ＮＡ）がＮＡ＞ｎの式を満たす対物レンズ４により全反射照明が可能となり、エバネッセント光５が得られる。この方法は、従来、極く限られた利用のみであったが、蛍光色素１分子を蛍光顕微鏡で観察する方法として有用であることが判明し、最近では１分子イメージング用に使用され始めている。
【０００４】
更に、本発明者が提案した既に特許されている光照射切り替え方法の概略を図１２に示す。１は試料溶液、２はカバーガラス、３はオイル、４は対物レンズ（レンズ群）、５は照射光、６は照射光、７はダイクロイックミラーである。落射照明から全反射照明の状態への変更を、ミラー等の光学部品を図１２（Ａ）→１２（Ｂ）→図１２（Ｃ）へと移動することのみで実現することができ、余分な光学系を必要とせず、簡単な原理で照射の切替を行えることができる。また、この方法では、入射光位置又は光源位置（例えば光ファイバーの出射位置）をずらすことによっても同等の状態変更を実現することができる（特許文献１参照。）。
【０００５】
また、他の方法として、通常の光学顕微鏡や落射照明法による蛍光顕微鏡において、セクショニング像や３次元画像を得る方法としては、焦点を連続的に変化させて得た連続画像からデコンボリューションによって計算する方法が用いられている。これは、試料上の１点から出た光の像が、焦点からはずれた時にどうなるかを予め知っておくことにより、計算によって元の３次元像を計算するものであるが、厚みのある試料や、明るい中にある暗い部分を観察する場合には、この方法では限界がある。
【０００６】
また、他の方法として、セクショニング像や３次元画像を用いる方法としては、現在、共焦点顕微鏡法が広く普及している。この方法は、高感度カメラに比べると感度が劣っており、特に蛍光試料の観察においては、レーザー光を１点に集光して照射するために、蛍光色素の退色が早くなったり、生物試料に損傷を与えるなどの難点がある。
【０００７】
【特許文献１】
特許第３０９３１４５号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
このように、従来の方法では、厚みのある試料や明るい中にある暗い部分の観察において、高感度、高Ｓ／Ｎ比を得ることができなかった。そこで本発明は、顕微鏡と同等の光学系を用いて光を使って物質や分子を高感度検出することを可能とし、光学顕微鏡における低背景・高感度のセクショニング像や３次元画像を得ることにより、高感度観察を可能にする光学系の薄層斜光照明法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、この発明の請求項１に係る光学系の薄層斜光照明法は、対物レンズあるいはコンデンサーレンズ等を用いたレンズ光学系の斜光照明で、試料への照明光入射角度をレンズ光軸に垂直に近くすることにより、薄い層状の光で試料を照明する薄層斜光照明法において、レンズへの照明光入射位置を、試料への照明光入射角度によって決まる値となるように構成した。
【００１０】
これにより、レンズを用いた斜光照明において、レンズへの照明光入射位置を、試料への照明光入射角度によって決まる値となるようにして照射領域を絞ることにより、薄い層状の光で試料を照明することができ、光学顕微鏡においては、低背景・高感度のセクショニング像や３次元画像を得ることができる。
【００１１】
この発明の請求項２に係る光学系の薄層斜光照明法は、対物レンズあるいはコンデンサーレンズ等を用いたレンズ光学系の斜光照明で薄い層状の光で試料を照明する薄層斜光照明法において、焦点位置を変えて異なる高さの試料面を観察する場合には、レンズへの照明光入射角度を、試料観察面の高さと試料への照明光入射角度に応じて変えるように構成した。
【００１２】
これにより、レンズの焦点位置を変えて、試料観察面のカバーガラス表面からの高さを変えても、レンズへの照明光の入射角度を試料観察面の高さと試料への照明光入射角度に応じて変えることにより、薄い層状の光で試料を照明することができ、光学顕微鏡においては、低背景・高感度のセクショニング像や３次元画像を得ることができる。
【００１３】
この発明の請求項３に係る光学系の薄層斜光照明法は、上記請求項１又は請求項２記載の光学系の薄層斜光照明法において、前記レンズとして、試料の屈折率よりも開口数が大きいレンズまたは試料の屈折率に起因する収差を補正したレンズを用いる構成した。
【００１４】
これにより、レンズの開口数が大きいほど、レンズへの照明入射角度φを大きくすることができ、試料観察面の高さＺを大きく、あるいは試料への照明光入射角度θを大きくできるので、その結果として、より高い位置Ｚまで観察できる、あるいは照明光の厚さを薄く、あるいは照射範囲を広くすることができる。更に、試料の屈折率よりもレンズの開口数の大きいレンズを用いることにより、この利点をさらに大きくすることができる。そして、試料の屈折率ｎとレンズ側の屈折率ｎ’の違いは球面収差が生じるが、この収差を補正したレンズを用いることにより薄層斜光照明の性能を良くすることができる。
【００１５】
この発明の請求項４に係る光学系の薄層斜光照明法は、上記請求項１乃至請求項３記載の光学系の薄層斜光照明法において、カメラ等の受光素子の受光面、あるいは結像レンズを傾けることにより、試料観察面を傾け、斜光照明光と試料観察面を平行若しくはほぼ平行にして観察可能にする構成とした。
【００１６】
この発明の請求項５に係る光学系の薄層斜光照明法は、上記請求項１乃至請求項３記載の光学系の薄層斜光照明法において、カメラ等の受光素子の受光面、あるいは結像レンズを傾けることにより、試料観察面を傾け、斜光照明光と試料観察面を平行若しくはほぼ平行にして観察可能にし、試料観察面を傾ける場合に、レンズに入射する照明光の形を細長くすることにより、試料を照明する薄層光を薄くし試料照明範囲を広くする構成とした。
【００１７】
これにより、試料観察面を傾けている場合には、観察視野の大きさは、カバーガラスに平行な面による照明光の断面形状の照明光進行方向の半径には依存せず、垂直な方向の半径によって決まるので、照明光進行方向に垂直な方向の半径は大きくし、照明光進行方向の半径は小さくした細長い形の入射光を用いると、観察視野を狭めることなく、照明光の厚さを薄くすることができる。
【００１８】
この発明の請求項６に係る光学系の薄層斜光照明法は、上記請求項１乃至請求項３記載の光学系の薄層斜光照明法において、複数の入射光の使用や、回転等による入射位置の移動によって、偏りのない薄層斜光照明を行う構成とした。
【００１９】
この発明の請求項７に係る光学系の薄層斜光照明法は、上記請求項１乃至請求項６の光学系が蛍光顕微鏡や暗視野顕微鏡などの光学顕微鏡、対物レンズを用いたレンズ光学系にも適用可能な構成とした。
【００２０】
これにより、光学顕微鏡はもとより各種の顕微鏡及び光を用いた検出において、低背景の画像及び低バックグラウンドのシグナルを得ることができる。その結果として、高感度・高いＳ／Ｎ比の画像及びシグナルを得ることができる。
【００２１】
この発明の請求項８に係る光学系の薄層斜光照明法は、蛍光顕微鏡、原子間力顕微鏡、トンネル顕微鏡、又はフォトトンネル顕微鏡の光学系において、薄層光照明を用いた顕微鏡観察を、焦点位置を移動させながら連続画像を得て、デコンボリューションによってセクショニング画像及び３次元画像を得る構成した。
【００２２】
これにより、薄層光照明を用いた顕微鏡観察から、焦点位置を移動させながら連続画像を得て、デコンボリューションによってセクショニング画像及び３次元画像を得ることができ、背景光が低く高画質である。また、試料の照明が薄い層状領域のみの局所的であるので、得られる蛍光像を高感度カメラであるイメージングインテンシファイアーＣＣＤによって観察することにより、蛍光色素１分子を可視化できる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明は、対物レンズあるいはコンデンサーレンズ等のレンズを用いたレンズ光学系の斜光照明において、試料を薄い層状の光で照明することにより、照明光のあたる領域が局所的に制限されて、背景光を低くすることができ、高感度で高いＳ／Ｎ比の画像およびシグナルを得ることができることに依拠するものである。光学系としては蛍光顕微鏡や暗視野顕微鏡などの光学顕微鏡はもとより、レンズを用いたレンズ光学系にも広く適用できるものである。次に、本発明の実施形態を図１乃至図９に基づいて以下に詳述する。
【００２４】
図１に照明光の厚さを求める原理を示す。図において、試料観察面８での照射半径をｒ、試料１における照明光５の厚さをｄ、試料１における照明光５の入射角（又は、照明光５とレンズ光軸とのなす角）をθとすると、
【数１】
ｄ＝２ｒ・ｃｏｓθ ・・・・・・・（１）
の関係式により、試料１における照明光５の厚さｄを求めることができる。
【００２５】
図２に光学系の対物レンズに関連する部分拡大図を示す。図において、１は試料媒体（溶液等）、２はカバーガラス、３はオイル、４はレンズ（レンズ群）、５は照射光である。光源からの照射光はダイクロイックミラー（図示なし）で直角に屈折されて照射光５となり、オイル３、カバーガラス２を経て試料媒体１に斜光照明される。
【００２６】
図２において、試料１における照明光５の厚さをｄ、試料１における照明光５の入射角をθ、レンズ４への照明光入射位置、即ち、レンズ後焦点面９における照明光５のレンズ光軸からの距離をＸ、照明光５のレンズへの入射角をφ、照明光のレンズ入射の開き角の半分をδφとすると、試料１における照明光５の厚さｄを与える式 ｄ＝２ｒ・ｃｏｓθにおいて、試料への照明光の入射角θはＸによって決まり、試料観察面での照射半径ｒはδφによって決まる値であることがわかる。従って、照明光の厚さｄを薄くすることは、ｃｏｓθおよびｒを小さくすることに より実現できる。
【００２７】
ｃｏｓθを小さくするには、θを９０度に近づければ良いが、そのためにＸを大きくする。即ち、対物レンズの縁に光を入射し、試料において対物レンズ光軸と垂直に近い角度で斜光照明をおこなう。
【００２８】
試料観察での照射半径ｒは、レンズへ４の入射の開き角２δφにより調節されるので、照射半径ｒを小さくするためには、δφを小さくすれば良い。その際、ｒを小さくすると観察視野が狭められるので、観察視野の許す範囲において、ｒを小さくする必要がある。
【００２９】
また、試料１の屈折率をｎ、レンズの焦点距離をｆとすると、試料１への照明光入射角θの照明は、レンズ４への照明光入射位置Ｘを次の関係式によって決まる値とすることにより得られる。従って、レンズ４への照明光入射位置Ｘを、試料１への照明光入射角度θによって決まるようにする必要がある。
【数２】
Ｘ＝ｎｆ・ｓｉｎθ ・・・・・・・（２）
尚、（２）式は理論的な式であり、実際的にはレンズ毎に補正した関係を用いる。
【００３０】
こうして、レンズを用いた斜光照明において、試料への照明光入射角度をレンズ光軸に垂直に近い角度にし、照射領域を絞ることにより、薄い層状の光で試料を照明することができ、かつ、レンズへの照明光入射位置を、試料への照明光入射角度θによって決まるようにする。そして、光学顕微鏡においては、低背景・高感度のセクショニング像や３次元画像を得ることができる。
【００３１】
次に、レンズの焦点位置を変えて、試料観察面のカバーガラス表面からの高さＺを変える場合について図３を参照して説明する。図３（Ａ）はレンズ４への照明光５の入射角φでは、試料観察面８のカバーガラス２表面からの高さはＺであることを示す。
【００３２】
図３（Ｂ）はレンズ４への照明光５の入射角が（φ＋△φ）では、試料観察面８のカバーガラス表面からの高さは（Ｚ＋△Ｚ）となることを示す。それ故、レンズ４の焦点位置を変えてもレンズへの照明光５の入射角φを変えることにより、同じ入射角θで試料１を照明することができる。
【００３３】
試料観察面８の高さＺが小さい時は、レンズへの照明光入射角度φは０度のままでも薄層照明が可能である。また、レンズへの照明光入射角度φを調整することにより、試料観察面８の高さＺを大きく、あるいは試料への照明光入射角度θを大きく、照明光の厚みｄを薄く、または照射範囲（直径２ｒ）を広くすることが可能となる。
【００３４】
そして、高さＺの試料面を観察する場合の照明は、レンズへの照明光入射角度φを、試料への照明光入射角度θ、レンズ焦点距離ｆ、試料の屈折率ｎ、レンズ側の屈折率ｎ’とレンズの特性とによって決まる数値をｋとすると、実際的には、１次近似によりφをＺに比例させる次の式で得られる。
【数３】
φ＝ｋ・Ｚ ・・・・・・・・（３）
より精度の高い数値が必要とされる場合には、２次以上の近似の関係式を用いることにする。
【００３５】
開口数の大きいレンズを用いるほど照明光を薄くできるが、試料の屈折率ｎよりも開口数ＮＡが大きいレンズを用いて、試料への照明光入射角度を更に光軸に垂直に近くすることで、より薄い光で照明することができる。レンズの開口数ＮＡが大きいほど、図２において照射光入射範囲Ｘを大きくすることができ、照明光の入射角θが大きくなるので、その結果として、照明光の厚さｄを薄く、あるいは照射光照射範囲２ｒを広くすることができる。
【００３６】
また、レンズの開口数が大きいほど、レンズへの照明入射角度φを大きくすることができるので、（３）式により、試料観察面８の高さＺを大きく、あるいは試料１への照明光入射角度θを大きくできるので、その結果として、より高い位置Ｚまで観察できる、あるいは照明光の厚さｄを薄く、あるいは照射範囲２ｒを広くすることができる。
【００３７】
更に、試料の屈折率よりもレンズの開口数の大きいレンズを用いることにより、この利点をさらに大きくすることができる。そして、試料の屈折率ｎとレンズ側の屈折率ｎ’の違いは球面収差が生じるが、この収差を補正したレンズを用いることにより薄層斜光照明の性能を良くすることができる。
【００３８】
次に、カメラ等の受光素子の受光面を傾ける場合、あるいは結像レンズを傾ける場合について図４を参照して説明する。図４において、１は試料媒体（溶液等）、２はカバーガラス、３はオイル、４はレンズ（レンズ群）、５は照射光、８は試料観察面、９は結像レンズ、１０はカメラ等の受光素子１１である。図では、レンズ系を単純化して描いているが、実際には中間にレンズ群が入って構成されている。
【００３９】
図４（Ａ）はカメラ等の受光素子１０の受光面を傾けることにより、試料観察面８を傾け、斜光照明光５と試料観察面８を平行、若しくはほぼ平行にして観察することができることを示している。
【００４０】
また、図４（Ｂ）は結像レンズ９を傾けることにより、試料観察面８を傾け、斜光照明光５と試料観察面８を平行もしくはほぼ平行にして観察することができることを示している。結像レンズ９を傾ける方法では、中間の光学系の変更によっても同等のことを行うことができる。
【００４１】
更に、図４（Ａ）の試料観察面８を傾ける場合に、対物レンズ４に入射する照明光の形を細長くし、試料を照明する薄層光をさらに薄くすることができる。このことを図５を参照して説明する。符号は上述の例と同一である。
【００４２】
図５（Ａ）は図２と同じ構成であるので説明は省略する。図５（Ｂ）は試料領域の照射光を上側からみた拡大図である。照明光の厚さｄを与える式 ｄ＝２ｒ・ｃｏｓθにおける、ｒはカバーガラスに平行な面による照明光の断面形状の、照明 光進行方向の半径である。試料観察面を傾けている場合には、観察視野の大きさはｒには依存せず、ｒに垂直な方向の半径ｒ’によって決まる。従って、ｒ’は大きくし、ｒは小さくした細長い形の入射光を用いると、観察視野を狭めることなく、照明光の厚さｄを薄くすることができる。
【００４３】
こうして、薄層光照明を用いた顕微鏡観察から、焦点位置を移動させながら連続画像を得て、デコンボリューションによってセクショニング画像及び３次元画像を得ることができる。そして、本発明によると従来法とは違って、背景光が低く高画質であることに加え、試料の照明が薄い層状領域のみの局所的である。
【００４４】
それ故に、試料観察面近傍の領域のみをデコンボリューションの計算対象とすれば良いという計算上・画質上ともに大きな利点がある。従って、厚みのある試料の観察、明るい中にある暗い部分の観察、１分子観察のような高感度観察の、セクショニング画像及び３次元画像を行うことを可能にする。
【００４５】
更に、図６のように、複数の入射光または回転対称な入射光の使用や、回転等による入射位置の移動によって、複数の照明光５，５’が得られ、偏りのない薄層光照明を行うことができる。
【００４６】
次に、本発明を適用して蛍光顕微鏡に薄層斜光照明法を用いた例を図７に示す。図において、符号は上述の例と同一物のものには同一符号を付しており、１１は受光素子（カメラ）、１２は光学フィルタ、１３はミラー、１４は集光用レンズ、Ｒは照明レーザー光の可変絞りの内径である。レーザー光を照明光として用い、集光用レンズ１４によってレンズ４の後焦点面９にレーザー光を集光し、試料１における照明光を平行光にする。
【００４７】
可変絞り径Ｒを変えて入射開き角２δφを変化させ、照射半径ｒを調節する。ミラー１３と集光用レンズ１４を一体としてｔｘ方向に移動させることにより、入射位置Ｘを調節する。次に、ミラー１３へのレーザー光の入射位置をｔφ方向に移動すると、集光用レンズ１４を通過後の光路の傾きが変化するので、ｔφによってレンズ４への入射角φを調節する。以上の調節によって、試料１における照明光の層の厚さ ｄ＝２ｒ・ｃｏｓθを数ミクロンに設定することができる。
【００４８】
実施例を挙げると、油浸１００倍 ＮＡ１．４の対物レンズを用い、試料観察面における照射領域の直径２ｒ＝３０μｍの時、試料における入射角θ＝８０．４°でｄ＝５μｍ、入射角θ＝８４．３°でｄ＝３μｍとなる。油浸６０倍 ＮＡ１．４の対物レンズを用い、試料観察面における照射領域の直径２ｒ＝４５μｍの時、試料における入射角θ＝８６．２°でｄ＝３μｍとなる。
【００４９】
こうして、薄層斜光照明によって得られる蛍光像を、高感度カメラであるイメージングインテンシファイアーＣＣＤによって観察することにより、蛍光色素１分子を可視化できる。
【００５０】
また、他の適用例として、蛍光顕微鏡において、試料観察面を傾け、照明光を細長くし、高ＮＡ対物レンズを用いて、薄層照明光を薄くする例を説明する。図７の蛍光顕微鏡において、図４（Ｂ）の結像レンズを傾ける方法により試料観察面を傾け、図５の細長い照明光を使う方法を用いる。
【００５１】
カバーガラスでの照明光の断面形状は、短径２ｒ＝３０μｍ、長径２ｒ’＝１００μｍにする。このようにすれば、１辺１００μｍの観察視野を得ることができ、観察視野を狭めることなく、照明光の厚みを薄くできる。
【００５２】
式 ｄ＝２ｒ・ｃｏｓθから、試料における照明光の層の厚さｄは、油浸６０倍 ＮＡ１．４の対物レンズを用いると、２ｒ＝３０μｍ、試料における照明光の入射角θ＝８６°でｄ＝２μｍとなる。但し、厚さｄが光の波長（可視光で０．４〜０．７μｍ）に近くなるため、回折現象により光の層の上下に光の広がりが見られ始める。
【００５３】
更に、ＮＡの大きい油浸６０倍 ＮＡ１．４５の対物レンズを用いると、試料における入射角θ＝８７．９°、即ち、カバーガラスとのなす角が３°となり、照明光とカバーガラスとがほとんど平行になる。このように平行に近づけることにより、結像レンズを傾けることによる画質への影響が無視できるようになる。光の厚さｄに関しては、理論的には２μｍより薄くなるが、回折光による厚みの広がりも強くなる。
【００５４】
本発明の光学系の薄層斜光照明と従来の斜光照明法による照明光の厚みを実測比較すると、図８の表に示すように、例えば開口数ＮＡ＝１．４の対物レンズを用いた場合、従来の斜光照明法による照明光の厚みの約半分の厚みが得られた。
【００５５】
図９には、レンズへの照明入射角度と試料観察面の高さとの関係を例示したものであり、グラフ中の数値２ｒは、試料観察面での照射領域の直径である。図９（Ａ）は油浸１００倍 ＮＡ１．４の対物レンズを用い、照明光の厚みｄ＝３μｍの例である。図９（Ｂ）は油浸６０倍 ＮＡ１．４の対物レンズを用い、照明光の厚みｄ＝３μｍの例である。図９（Ｃ）は油浸６０倍 ＮＡ１．４の対物レンズを用い、照明光の厚みｄ＝５μｍの例である。
【００５６】
本発明の薄層斜光照明法を用いた蛍光顕微鏡観察によって、細胞内においても明瞭な１分子イメージングが実現した。その結果、分子１個の動きや変化を直接観察できるようになった。それと共に、分子１個の蛍光強度を得ることによって、蛍光強度から細胞内における分子数を定量することも実現できた。更に、分子数の定量から細胞内における分子間相互作用の結合分子数と結合の強さを求めることを実現できた。
【００５７】
現在、ナノテクノロジーのバイオへの応用が強い興味を集めているが、１分子レベルの高感度検出を可能にする本発明の薄層斜光照明法は、この分野における重要な要素技術になるものと考えられる。また、顕微鏡技術としても、新しい顕微鏡法として発展することが期待される。
【００５８】
【発明の効果】
以上のように、本発明の光学系の薄層斜光照明法は、対物レンズを用いた斜光照明において、薄い層状の光で試料を照明することにより、光学顕微鏡はもとより各種の顕微鏡及び光を用いた検出において、低背景の画像及び低バックグラウンドのシグナルを得ることができる。その結果として、高感度・高いＳ／Ｎ比の画像及びシグナルを得ることができる。
【００５９】
また、薄層光照明を用いた顕微鏡観察から、焦点位置を移動させながら連続画像を得て、デコンボリューションによってセクショニング画像及び３次元画像を得ることができ、背景光が低く高画質である。また、試料の照明が薄い層状領域のみの局所的であるので、得られる蛍光像を高感度カメラで観察することにより、蛍光色素１分子を可視化できると共に、分子１個の蛍光強度を得ることによって、蛍光強度から細胞内における分子数を定量することも実現できる。更に、分子数の定量から細胞内における分子間相互作用の結合分子数と結合の強さを求めることを実現できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の照明光の厚さを求める原理図。
【図２】光学系の対物レンズに関連する部分拡大図。
【図３】対物レンズの焦点位置を変える方法の概略図。
【図４】受光素子の受光面あるいは結像レンズを傾ける方法の概略図。
【図５】対物レンズに入射する照明光の形を細長くする方法の概略図。
【図６】複数の入射光または回転対称な入射光を使用する方法の概略図。
【図７】蛍光顕微鏡の薄層斜光照明法の概略図。
【図８】本発明方法と従来方法の照明光の厚さの比較表。
【図９】レンズへの照明入射角度と試料観察面の高さとの関係図。
【図１０】従来の蛍光顕微鏡の落射照明法の概略図。
【図１１】従来の対物レンズ型全反射照明法の概略図。
【図１２】光照射切り替え方法の概略図。
【符号の説明】
１ 試料媒体（溶液等）
２ カバーガラス
３ オイル
４ 対物レンズ（レンズ群）
５，６ 照射光
７ ダイクロイックミラー
８ 試料観察面
９ 結像レンズ
１０
１１ 受光素子（カメラ）
１２ 光学フィルタ
１３ ミラー
１４ 集光用レンズ
【発明の属する技術分野】
本発明は、物質や分子を光を使って高感度検出する顕微鏡と同等の光学系の薄層斜光照明法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、物質や分子を光を使って高感度検出する光学顕微鏡の照明技術は種々のものが提案されており、その内の幾つかを以下に説明する。図１０は、蛍光顕微鏡の照明として、現在一般的に使われている落射照明方法の概略図である。図に示すように、光源からの照射光６を、照射光５は反射し、蛍光は透過させるダイクロイックミラー７で反射させて、対物レンズ４の中央に入射し、オイル３、カバーガラス２を介して試料溶液１でなる試料観察面を照射するものである。
【０００３】
また、ガラス表面近傍のみを局所的に照明する方法として、全反射照明法がある。全反射した際に生じるエバネッセント光（深さ１００２００ｎｍ程度）を使って照明するものである。プリズムを使う方法と対物レンズを使う方法があるが、図１１に対物レンズ型全反射照明法の概略図を示す。対物レンズ４の開口数をＮＡ、試料溶液１の屈折率をｎとしたとき、開口数（ＮＡ）がＮＡ＞ｎの式を満たす対物レンズ４により全反射照明が可能となり、エバネッセント光５が得られる。この方法は、従来、極く限られた利用のみであったが、蛍光色素１分子を蛍光顕微鏡で観察する方法として有用であることが判明し、最近では１分子イメージング用に使用され始めている。
【０００４】
更に、本発明者が提案した既に特許されている光照射切り替え方法の概略を図１２に示す。１は試料溶液、２はカバーガラス、３はオイル、４は対物レンズ（レンズ群）、５は照射光、６は照射光、７はダイクロイックミラーである。落射照明から全反射照明の状態への変更を、ミラー等の光学部品を図１２（Ａ）→１２（Ｂ）→図１２（Ｃ）へと移動することのみで実現することができ、余分な光学系を必要とせず、簡単な原理で照射の切替を行えることができる。また、この方法では、入射光位置又は光源位置（例えば光ファイバーの出射位置）をずらすことによっても同等の状態変更を実現することができる（特許文献１参照。）。
【０００５】
また、他の方法として、通常の光学顕微鏡や落射照明法による蛍光顕微鏡において、セクショニング像や３次元画像を得る方法としては、焦点を連続的に変化させて得た連続画像からデコンボリューションによって計算する方法が用いられている。これは、試料上の１点から出た光の像が、焦点からはずれた時にどうなるかを予め知っておくことにより、計算によって元の３次元像を計算するものであるが、厚みのある試料や、明るい中にある暗い部分を観察する場合には、この方法では限界がある。
【０００６】
また、他の方法として、セクショニング像や３次元画像を用いる方法としては、現在、共焦点顕微鏡法が広く普及している。この方法は、高感度カメラに比べると感度が劣っており、特に蛍光試料の観察においては、レーザー光を１点に集光して照射するために、蛍光色素の退色が早くなったり、生物試料に損傷を与えるなどの難点がある。
【０００７】
【特許文献１】
特許第３０９３１４５号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
このように、従来の方法では、厚みのある試料や明るい中にある暗い部分の観察において、高感度、高Ｓ／Ｎ比を得ることができなかった。そこで本発明は、顕微鏡と同等の光学系を用いて光を使って物質や分子を高感度検出することを可能とし、光学顕微鏡における低背景・高感度のセクショニング像や３次元画像を得ることにより、高感度観察を可能にする光学系の薄層斜光照明法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、この発明の請求項１に係る光学系の薄層斜光照明法は、対物レンズあるいはコンデンサーレンズ等を用いたレンズ光学系の斜光照明で、試料への照明光入射角度をレンズ光軸に垂直に近くすることにより、薄い層状の光で試料を照明する薄層斜光照明法において、レンズへの照明光入射位置を、試料への照明光入射角度によって決まる値となるように構成した。
【００１０】
これにより、レンズを用いた斜光照明において、レンズへの照明光入射位置を、試料への照明光入射角度によって決まる値となるようにして照射領域を絞ることにより、薄い層状の光で試料を照明することができ、光学顕微鏡においては、低背景・高感度のセクショニング像や３次元画像を得ることができる。
【００１１】
この発明の請求項２に係る光学系の薄層斜光照明法は、対物レンズあるいはコンデンサーレンズ等を用いたレンズ光学系の斜光照明で薄い層状の光で試料を照明する薄層斜光照明法において、焦点位置を変えて異なる高さの試料面を観察する場合には、レンズへの照明光入射角度を、試料観察面の高さと試料への照明光入射角度に応じて変えるように構成した。
【００１２】
これにより、レンズの焦点位置を変えて、試料観察面のカバーガラス表面からの高さを変えても、レンズへの照明光の入射角度を試料観察面の高さと試料への照明光入射角度に応じて変えることにより、薄い層状の光で試料を照明することができ、光学顕微鏡においては、低背景・高感度のセクショニング像や３次元画像を得ることができる。
【００１３】
この発明の請求項３に係る光学系の薄層斜光照明法は、上記請求項１又は請求項２記載の光学系の薄層斜光照明法において、前記レンズとして、試料の屈折率よりも開口数が大きいレンズまたは試料の屈折率に起因する収差を補正したレンズを用いる構成した。
【００１４】
これにより、レンズの開口数が大きいほど、レンズへの照明入射角度φを大きくすることができ、試料観察面の高さＺを大きく、あるいは試料への照明光入射角度θを大きくできるので、その結果として、より高い位置Ｚまで観察できる、あるいは照明光の厚さを薄く、あるいは照射範囲を広くすることができる。更に、試料の屈折率よりもレンズの開口数の大きいレンズを用いることにより、この利点をさらに大きくすることができる。そして、試料の屈折率ｎとレンズ側の屈折率ｎ’の違いは球面収差が生じるが、この収差を補正したレンズを用いることにより薄層斜光照明の性能を良くすることができる。
【００１５】
この発明の請求項４に係る光学系の薄層斜光照明法は、上記請求項１乃至請求項３記載の光学系の薄層斜光照明法において、カメラ等の受光素子の受光面、あるいは結像レンズを傾けることにより、試料観察面を傾け、斜光照明光と試料観察面を平行若しくはほぼ平行にして観察可能にする構成とした。
【００１６】
この発明の請求項５に係る光学系の薄層斜光照明法は、上記請求項１乃至請求項３記載の光学系の薄層斜光照明法において、カメラ等の受光素子の受光面、あるいは結像レンズを傾けることにより、試料観察面を傾け、斜光照明光と試料観察面を平行若しくはほぼ平行にして観察可能にし、試料観察面を傾ける場合に、レンズに入射する照明光の形を細長くすることにより、試料を照明する薄層光を薄くし試料照明範囲を広くする構成とした。
【００１７】
これにより、試料観察面を傾けている場合には、観察視野の大きさは、カバーガラスに平行な面による照明光の断面形状の照明光進行方向の半径には依存せず、垂直な方向の半径によって決まるので、照明光進行方向に垂直な方向の半径は大きくし、照明光進行方向の半径は小さくした細長い形の入射光を用いると、観察視野を狭めることなく、照明光の厚さを薄くすることができる。
【００１８】
この発明の請求項６に係る光学系の薄層斜光照明法は、上記請求項１乃至請求項３記載の光学系の薄層斜光照明法において、複数の入射光の使用や、回転等による入射位置の移動によって、偏りのない薄層斜光照明を行う構成とした。
【００１９】
この発明の請求項７に係る光学系の薄層斜光照明法は、上記請求項１乃至請求項６の光学系が蛍光顕微鏡や暗視野顕微鏡などの光学顕微鏡、対物レンズを用いたレンズ光学系にも適用可能な構成とした。
【００２０】
これにより、光学顕微鏡はもとより各種の顕微鏡及び光を用いた検出において、低背景の画像及び低バックグラウンドのシグナルを得ることができる。その結果として、高感度・高いＳ／Ｎ比の画像及びシグナルを得ることができる。
【００２１】
この発明の請求項８に係る光学系の薄層斜光照明法は、蛍光顕微鏡、原子間力顕微鏡、トンネル顕微鏡、又はフォトトンネル顕微鏡の光学系において、薄層光照明を用いた顕微鏡観察を、焦点位置を移動させながら連続画像を得て、デコンボリューションによってセクショニング画像及び３次元画像を得る構成した。
【００２２】
これにより、薄層光照明を用いた顕微鏡観察から、焦点位置を移動させながら連続画像を得て、デコンボリューションによってセクショニング画像及び３次元画像を得ることができ、背景光が低く高画質である。また、試料の照明が薄い層状領域のみの局所的であるので、得られる蛍光像を高感度カメラであるイメージングインテンシファイアーＣＣＤによって観察することにより、蛍光色素１分子を可視化できる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明は、対物レンズあるいはコンデンサーレンズ等のレンズを用いたレンズ光学系の斜光照明において、試料を薄い層状の光で照明することにより、照明光のあたる領域が局所的に制限されて、背景光を低くすることができ、高感度で高いＳ／Ｎ比の画像およびシグナルを得ることができることに依拠するものである。光学系としては蛍光顕微鏡や暗視野顕微鏡などの光学顕微鏡はもとより、レンズを用いたレンズ光学系にも広く適用できるものである。次に、本発明の実施形態を図１乃至図９に基づいて以下に詳述する。
【００２４】
図１に照明光の厚さを求める原理を示す。図において、試料観察面８での照射半径をｒ、試料１における照明光５の厚さをｄ、試料１における照明光５の入射角（又は、照明光５とレンズ光軸とのなす角）をθとすると、
【数１】
ｄ＝２ｒ・ｃｏｓθ ・・・・・・・（１）
の関係式により、試料１における照明光５の厚さｄを求めることができる。
【００２５】
図２に光学系の対物レンズに関連する部分拡大図を示す。図において、１は試料媒体（溶液等）、２はカバーガラス、３はオイル、４はレンズ（レンズ群）、５は照射光である。光源からの照射光はダイクロイックミラー（図示なし）で直角に屈折されて照射光５となり、オイル３、カバーガラス２を経て試料媒体１に斜光照明される。
【００２６】
図２において、試料１における照明光５の厚さをｄ、試料１における照明光５の入射角をθ、レンズ４への照明光入射位置、即ち、レンズ後焦点面９における照明光５のレンズ光軸からの距離をＸ、照明光５のレンズへの入射角をφ、照明光のレンズ入射の開き角の半分をδφとすると、試料１における照明光５の厚さｄを与える式 ｄ＝２ｒ・ｃｏｓθにおいて、試料への照明光の入射角θはＸによって決まり、試料観察面での照射半径ｒはδφによって決まる値であることがわかる。従って、照明光の厚さｄを薄くすることは、ｃｏｓθおよびｒを小さくすることに より実現できる。
【００２７】
ｃｏｓθを小さくするには、θを９０度に近づければ良いが、そのためにＸを大きくする。即ち、対物レンズの縁に光を入射し、試料において対物レンズ光軸と垂直に近い角度で斜光照明をおこなう。
【００２８】
試料観察での照射半径ｒは、レンズへ４の入射の開き角２δφにより調節されるので、照射半径ｒを小さくするためには、δφを小さくすれば良い。その際、ｒを小さくすると観察視野が狭められるので、観察視野の許す範囲において、ｒを小さくする必要がある。
【００２９】
また、試料１の屈折率をｎ、レンズの焦点距離をｆとすると、試料１への照明光入射角θの照明は、レンズ４への照明光入射位置Ｘを次の関係式によって決まる値とすることにより得られる。従って、レンズ４への照明光入射位置Ｘを、試料１への照明光入射角度θによって決まるようにする必要がある。
【数２】
Ｘ＝ｎｆ・ｓｉｎθ ・・・・・・・（２）
尚、（２）式は理論的な式であり、実際的にはレンズ毎に補正した関係を用いる。
【００３０】
こうして、レンズを用いた斜光照明において、試料への照明光入射角度をレンズ光軸に垂直に近い角度にし、照射領域を絞ることにより、薄い層状の光で試料を照明することができ、かつ、レンズへの照明光入射位置を、試料への照明光入射角度θによって決まるようにする。そして、光学顕微鏡においては、低背景・高感度のセクショニング像や３次元画像を得ることができる。
【００３１】
次に、レンズの焦点位置を変えて、試料観察面のカバーガラス表面からの高さＺを変える場合について図３を参照して説明する。図３（Ａ）はレンズ４への照明光５の入射角φでは、試料観察面８のカバーガラス２表面からの高さはＺであることを示す。
【００３２】
図３（Ｂ）はレンズ４への照明光５の入射角が（φ＋△φ）では、試料観察面８のカバーガラス表面からの高さは（Ｚ＋△Ｚ）となることを示す。それ故、レンズ４の焦点位置を変えてもレンズへの照明光５の入射角φを変えることにより、同じ入射角θで試料１を照明することができる。
【００３３】
試料観察面８の高さＺが小さい時は、レンズへの照明光入射角度φは０度のままでも薄層照明が可能である。また、レンズへの照明光入射角度φを調整することにより、試料観察面８の高さＺを大きく、あるいは試料への照明光入射角度θを大きく、照明光の厚みｄを薄く、または照射範囲（直径２ｒ）を広くすることが可能となる。
【００３４】
そして、高さＺの試料面を観察する場合の照明は、レンズへの照明光入射角度φを、試料への照明光入射角度θ、レンズ焦点距離ｆ、試料の屈折率ｎ、レンズ側の屈折率ｎ’とレンズの特性とによって決まる数値をｋとすると、実際的には、１次近似によりφをＺに比例させる次の式で得られる。
【数３】
φ＝ｋ・Ｚ ・・・・・・・・（３）
より精度の高い数値が必要とされる場合には、２次以上の近似の関係式を用いることにする。
【００３５】
開口数の大きいレンズを用いるほど照明光を薄くできるが、試料の屈折率ｎよりも開口数ＮＡが大きいレンズを用いて、試料への照明光入射角度を更に光軸に垂直に近くすることで、より薄い光で照明することができる。レンズの開口数ＮＡが大きいほど、図２において照射光入射範囲Ｘを大きくすることができ、照明光の入射角θが大きくなるので、その結果として、照明光の厚さｄを薄く、あるいは照射光照射範囲２ｒを広くすることができる。
【００３６】
また、レンズの開口数が大きいほど、レンズへの照明入射角度φを大きくすることができるので、（３）式により、試料観察面８の高さＺを大きく、あるいは試料１への照明光入射角度θを大きくできるので、その結果として、より高い位置Ｚまで観察できる、あるいは照明光の厚さｄを薄く、あるいは照射範囲２ｒを広くすることができる。
【００３７】
更に、試料の屈折率よりもレンズの開口数の大きいレンズを用いることにより、この利点をさらに大きくすることができる。そして、試料の屈折率ｎとレンズ側の屈折率ｎ’の違いは球面収差が生じるが、この収差を補正したレンズを用いることにより薄層斜光照明の性能を良くすることができる。
【００３８】
次に、カメラ等の受光素子の受光面を傾ける場合、あるいは結像レンズを傾ける場合について図４を参照して説明する。図４において、１は試料媒体（溶液等）、２はカバーガラス、３はオイル、４はレンズ（レンズ群）、５は照射光、８は試料観察面、９は結像レンズ、１０はカメラ等の受光素子１１である。図では、レンズ系を単純化して描いているが、実際には中間にレンズ群が入って構成されている。
【００３９】
図４（Ａ）はカメラ等の受光素子１０の受光面を傾けることにより、試料観察面８を傾け、斜光照明光５と試料観察面８を平行、若しくはほぼ平行にして観察することができることを示している。
【００４０】
また、図４（Ｂ）は結像レンズ９を傾けることにより、試料観察面８を傾け、斜光照明光５と試料観察面８を平行もしくはほぼ平行にして観察することができることを示している。結像レンズ９を傾ける方法では、中間の光学系の変更によっても同等のことを行うことができる。
【００４１】
更に、図４（Ａ）の試料観察面８を傾ける場合に、対物レンズ４に入射する照明光の形を細長くし、試料を照明する薄層光をさらに薄くすることができる。このことを図５を参照して説明する。符号は上述の例と同一である。
【００４２】
図５（Ａ）は図２と同じ構成であるので説明は省略する。図５（Ｂ）は試料領域の照射光を上側からみた拡大図である。照明光の厚さｄを与える式 ｄ＝２ｒ・ｃｏｓθにおける、ｒはカバーガラスに平行な面による照明光の断面形状の、照明 光進行方向の半径である。試料観察面を傾けている場合には、観察視野の大きさはｒには依存せず、ｒに垂直な方向の半径ｒ’によって決まる。従って、ｒ’は大きくし、ｒは小さくした細長い形の入射光を用いると、観察視野を狭めることなく、照明光の厚さｄを薄くすることができる。
【００４３】
こうして、薄層光照明を用いた顕微鏡観察から、焦点位置を移動させながら連続画像を得て、デコンボリューションによってセクショニング画像及び３次元画像を得ることができる。そして、本発明によると従来法とは違って、背景光が低く高画質であることに加え、試料の照明が薄い層状領域のみの局所的である。
【００４４】
それ故に、試料観察面近傍の領域のみをデコンボリューションの計算対象とすれば良いという計算上・画質上ともに大きな利点がある。従って、厚みのある試料の観察、明るい中にある暗い部分の観察、１分子観察のような高感度観察の、セクショニング画像及び３次元画像を行うことを可能にする。
【００４５】
更に、図６のように、複数の入射光または回転対称な入射光の使用や、回転等による入射位置の移動によって、複数の照明光５，５’が得られ、偏りのない薄層光照明を行うことができる。
【００４６】
次に、本発明を適用して蛍光顕微鏡に薄層斜光照明法を用いた例を図７に示す。図において、符号は上述の例と同一物のものには同一符号を付しており、１１は受光素子（カメラ）、１２は光学フィルタ、１３はミラー、１４は集光用レンズ、Ｒは照明レーザー光の可変絞りの内径である。レーザー光を照明光として用い、集光用レンズ１４によってレンズ４の後焦点面９にレーザー光を集光し、試料１における照明光を平行光にする。
【００４７】
可変絞り径Ｒを変えて入射開き角２δφを変化させ、照射半径ｒを調節する。ミラー１３と集光用レンズ１４を一体としてｔｘ方向に移動させることにより、入射位置Ｘを調節する。次に、ミラー１３へのレーザー光の入射位置をｔφ方向に移動すると、集光用レンズ１４を通過後の光路の傾きが変化するので、ｔφによってレンズ４への入射角φを調節する。以上の調節によって、試料１における照明光の層の厚さ ｄ＝２ｒ・ｃｏｓθを数ミクロンに設定することができる。
【００４８】
実施例を挙げると、油浸１００倍 ＮＡ１．４の対物レンズを用い、試料観察面における照射領域の直径２ｒ＝３０μｍの時、試料における入射角θ＝８０．４°でｄ＝５μｍ、入射角θ＝８４．３°でｄ＝３μｍとなる。油浸６０倍 ＮＡ１．４の対物レンズを用い、試料観察面における照射領域の直径２ｒ＝４５μｍの時、試料における入射角θ＝８６．２°でｄ＝３μｍとなる。
【００４９】
こうして、薄層斜光照明によって得られる蛍光像を、高感度カメラであるイメージングインテンシファイアーＣＣＤによって観察することにより、蛍光色素１分子を可視化できる。
【００５０】
また、他の適用例として、蛍光顕微鏡において、試料観察面を傾け、照明光を細長くし、高ＮＡ対物レンズを用いて、薄層照明光を薄くする例を説明する。図７の蛍光顕微鏡において、図４（Ｂ）の結像レンズを傾ける方法により試料観察面を傾け、図５の細長い照明光を使う方法を用いる。
【００５１】
カバーガラスでの照明光の断面形状は、短径２ｒ＝３０μｍ、長径２ｒ’＝１００μｍにする。このようにすれば、１辺１００μｍの観察視野を得ることができ、観察視野を狭めることなく、照明光の厚みを薄くできる。
【００５２】
式 ｄ＝２ｒ・ｃｏｓθから、試料における照明光の層の厚さｄは、油浸６０倍 ＮＡ１．４の対物レンズを用いると、２ｒ＝３０μｍ、試料における照明光の入射角θ＝８６°でｄ＝２μｍとなる。但し、厚さｄが光の波長（可視光で０．４〜０．７μｍ）に近くなるため、回折現象により光の層の上下に光の広がりが見られ始める。
【００５３】
更に、ＮＡの大きい油浸６０倍 ＮＡ１．４５の対物レンズを用いると、試料における入射角θ＝８７．９°、即ち、カバーガラスとのなす角が３°となり、照明光とカバーガラスとがほとんど平行になる。このように平行に近づけることにより、結像レンズを傾けることによる画質への影響が無視できるようになる。光の厚さｄに関しては、理論的には２μｍより薄くなるが、回折光による厚みの広がりも強くなる。
【００５４】
本発明の光学系の薄層斜光照明と従来の斜光照明法による照明光の厚みを実測比較すると、図８の表に示すように、例えば開口数ＮＡ＝１．４の対物レンズを用いた場合、従来の斜光照明法による照明光の厚みの約半分の厚みが得られた。
【００５５】
図９には、レンズへの照明入射角度と試料観察面の高さとの関係を例示したものであり、グラフ中の数値２ｒは、試料観察面での照射領域の直径である。図９（Ａ）は油浸１００倍 ＮＡ１．４の対物レンズを用い、照明光の厚みｄ＝３μｍの例である。図９（Ｂ）は油浸６０倍 ＮＡ１．４の対物レンズを用い、照明光の厚みｄ＝３μｍの例である。図９（Ｃ）は油浸６０倍 ＮＡ１．４の対物レンズを用い、照明光の厚みｄ＝５μｍの例である。
【００５６】
本発明の薄層斜光照明法を用いた蛍光顕微鏡観察によって、細胞内においても明瞭な１分子イメージングが実現した。その結果、分子１個の動きや変化を直接観察できるようになった。それと共に、分子１個の蛍光強度を得ることによって、蛍光強度から細胞内における分子数を定量することも実現できた。更に、分子数の定量から細胞内における分子間相互作用の結合分子数と結合の強さを求めることを実現できた。
【００５７】
現在、ナノテクノロジーのバイオへの応用が強い興味を集めているが、１分子レベルの高感度検出を可能にする本発明の薄層斜光照明法は、この分野における重要な要素技術になるものと考えられる。また、顕微鏡技術としても、新しい顕微鏡法として発展することが期待される。
【００５８】
【発明の効果】
以上のように、本発明の光学系の薄層斜光照明法は、対物レンズを用いた斜光照明において、薄い層状の光で試料を照明することにより、光学顕微鏡はもとより各種の顕微鏡及び光を用いた検出において、低背景の画像及び低バックグラウンドのシグナルを得ることができる。その結果として、高感度・高いＳ／Ｎ比の画像及びシグナルを得ることができる。
【００５９】
また、薄層光照明を用いた顕微鏡観察から、焦点位置を移動させながら連続画像を得て、デコンボリューションによってセクショニング画像及び３次元画像を得ることができ、背景光が低く高画質である。また、試料の照明が薄い層状領域のみの局所的であるので、得られる蛍光像を高感度カメラで観察することにより、蛍光色素１分子を可視化できると共に、分子１個の蛍光強度を得ることによって、蛍光強度から細胞内における分子数を定量することも実現できる。更に、分子数の定量から細胞内における分子間相互作用の結合分子数と結合の強さを求めることを実現できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の照明光の厚さを求める原理図。
【図２】光学系の対物レンズに関連する部分拡大図。
【図３】対物レンズの焦点位置を変える方法の概略図。
【図４】受光素子の受光面あるいは結像レンズを傾ける方法の概略図。
【図５】対物レンズに入射する照明光の形を細長くする方法の概略図。
【図６】複数の入射光または回転対称な入射光を使用する方法の概略図。
【図７】蛍光顕微鏡の薄層斜光照明法の概略図。
【図８】本発明方法と従来方法の照明光の厚さの比較表。
【図９】レンズへの照明入射角度と試料観察面の高さとの関係図。
【図１０】従来の蛍光顕微鏡の落射照明法の概略図。
【図１１】従来の対物レンズ型全反射照明法の概略図。
【図１２】光照射切り替え方法の概略図。
【符号の説明】
１ 試料媒体（溶液等）
２ カバーガラス
３ オイル
４ 対物レンズ（レンズ群）
５，６ 照射光
７ ダイクロイックミラー
８ 試料観察面
９ 結像レンズ
１０
１１ 受光素子（カメラ）
１２ 光学フィルタ
１３ ミラー
１４ 集光用レンズ
Claims (8)
- 対物レンズあるいはコンデンサーレンズ等を用いたレンズ光学系の斜光照明で、試料への照明光入射角度をレンズ光軸に垂直に近くすることにより、薄い層状の光で試料を照明する薄層斜光照明法において、レンズへの照明光入射位置を、試料への照明光入射角度によって決まる値とすることを特徴とする光学系の薄層斜光照明法。
- 対物レンズあるいはコンデンサーレンズ等を用いたレンズ光学系の斜光照明で薄い層状の光で試料を照明する薄層斜光照明法において、焦点位置を変えて異なる高さの試料面を観察する場合には、レンズへの照明光入射角度を、試料観察面の高さと試料への照明光入射角度に応じて変えることを特徴とする光学系の薄層斜光照明法。
- 前記レンズとして、試料の屈折率よりも開口数が大きいレンズまたは試料の屈折率に起因する収差を補正したレンズを用いることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の光学系の薄層斜光照明法。
- カメラ等の受光素子の受光面、あるいは結像レンズを傾けることにより、試料観察面を傾け、斜光照明光と試料観察面を平行若しくはほぼ平行にして観察可能にすることを特徴とする請求項１乃至請求項３記載の光学系の薄層斜光照明法。
- 試料観察面を傾ける場合に、レンズに入射する照明光の形を細長くすることにより、試料を照明する薄層光を薄くし試料照明範囲を広くすることを特徴とする請求項４記載の光学系の薄層斜光照明法。
- 複数の入射光の使用や、回転等による入射位置の移動によって、偏りのない薄層斜光照明を行うことを特徴とする請求項１乃至請求項３記載の光学系の薄層斜光照明法。
- 光学系が蛍光顕微鏡や暗視野顕微鏡などの光学顕微鏡、対物レンズを用いたレンズ光学系であることを特徴とする請求項１乃至請求項６記載の光学系の薄層斜光照明法。
- 薄層光照明を用いた顕微鏡観察において、焦点位置を移動させながら連続画像を得て、デコンボリューションによってセクショニング画像及び３次元画像を得ることを特徴とする請求項７記載の光学系の薄層斜光照明法。
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